Módulo 4 - celulaUACM
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CÉLULA I/Origen y evolución de la célula 1 2. ORIGEN Y EVOLUCIÓN DE LA CÉLULA ORGANIZACIÓN CELULAR Todos los organismos vivos están compuestos por células. Aunque algunos están constituidos por una sola célula y otros por billones de ellas, incluso los organismos más complejos se originan de una sola célula, el huevo fertilizado. En la mayor parte de los organismos multicelulares, incluido el ser humano, una célula se divide y forma dos y cada una de éstas a su vez se divide una y otra vez, dando lugar finalmente a los tejidos complejos y a los órganos y sistemas de un organismo desarrollado. Al igual que los ladrillos de un edificio, las células son los bloques de construcción de un organismo. La célula es la unidad más pequeña de materia viva capaz de llevar a cabo todas las actividades necesarias para el mantenimiento de la vida. Tiene todos los componentes físicos y químicos necesarios para su propio mantenimiento, crecimiento y división. Cuando cuentan con los nutrientes necesarios y un medio adecuado, algunas células son capaces de seguir vivas en un recipiente de laboratorio por años y años. Ningún componente celular es capaz de cumplir su función fuera del entorno celular. TEORIA CELULAR La idea de que las células son las unidades fundamentales de la vida es parte de la llamada teoría celular. Dos científicos alemanes, el botánico Matthias Schleiden, en 1838, y el zoólogo Theodor Schwann, en 1839, fueron los primeros en señalar que las plantas y animales estaban compuestos de grupos de células y que éstas eran la unidad básica de los organismos vivos. En 1855 Rudolph Virchow amplió esta teoría, estableciendo que sólo se formaban células nuevas a partir de una célula preexistente, es decir que las células no se forman por generación espontánea a partir de materia sin vida (idea que se había originado en los escritos de Aristóteles y que había perdurado a través de los siglos). En 1880 otro famoso biólogo, August Weismann, añadió un importante corolario a lo establecido por Virchow: todas las células que existen actualmente tienen sus orígenes en células ancestrales. La teoría celular de nuestra época incluye las ideas expuestas por los mencionados investigadores: 1. Todos los seres vivos están compuestos de células y productos celulares. 2. Sólo se forman células nuevas a partir de células preexistentes. 3. Todas las células actuales son descendientes de células ancestrales. Se pueden encontrar evidencias de que las células descienden de células ancestrales al observar las similitudes entre las complejas moléculas de proteína que se observan en todas las células. Un ejemplo de ello son los citocromos1 que se encuentran tanto en bacterias como en plantas y animales. Los citocromos de todas las células no sólo son iguales en estructura, sino que también desempeñan funciones casi idénticas en células de especies completamente distintas. Otro ejemplo, en este caso limitado a organismos autótrofos, son las clorofilas, básicamente iguales en bacterias fotosintéticas, cianobacterias, algas, musgos, helechos, coníferas y plantas con flores. El hecho de que todas las células tengan moléculas similares de tal complejidad es un indicio de que las células "modernas" se han originado de un pequeño grupo de células ancestrales. DESDE LAS MOLÉCULAS HASTA LA PRIMERA CÉLULA En condiciones prebióticas se pueden formar moléculas biológicas simples Las condiciones que reinaban en la Tierra durante los primeros mil millones de años son aún tema de discusión. ¿Estaba inicialmente fundida la superficie terrestre? ¿Contenía la atmósfera amoníaco, o metano? No obstante, parece existir acuerdo en que la Tierra era un lugar violento, con erupciones volcánicas, 1 Proteínas ligadas a una estructura (“hemo”) que contiene hierro y que entre otras funciones participan en el transporte de electrones durante la respiración celular. Gonzalo Vázquez Palacios relámpagos y lluvias torrenciales. Prácticamente no existía oxígeno libre, ni tampoco una capa de ozono que absorbiera la intensa radiación ultravioleta del sol. Es probable que bajo estas condiciones se produjeran moléculas orgánicas, es decir, moléculas simples que contienen carbono. La prueba más clara de ello procede de experimentos de laboratorio en los que se calentaron en presencia de agua mezclas de dióxido de carbono (CO2), metano (CH4), amoníaco (NH3) e hidrógeno mlecular (H2), aplicándoles descargas eléctricas o radiación ultravioleta. Se pudo observar que los gases reaccionaban formando pequeñas moléculas orgánicas tales como cianuro de hidrógeno (HCN) y formaldehído (H2CO), los que en solución acuosa generaron las cuatro clases principales de pequeñas moléculas orgánicas encontradas en las células: aminoácidos, nucleótidos, azúcares y ácidos grasos. Aunque estos experimentos no pueden reproducir con total exactitud las condiciones primitivas de la Tierra, ponen de manifiesto el hecho de que la formación de moléculas orgánicas es sorprendentemente fácil. Por otra parte, la Tierra en formación tenía inmensas ventajas sobre cualquier experimentador humano, ya que era muy grande y podía producir una amplia gama de condiciones, pero sobre todo disponía de mucho más tiempo: cientos de millones de años. En tales circunstancias, parece muy posible que, en algún lugar y en algún momento determinados, muchas de las moléculas orgánicas simples que se encuentran en las células actuales se acumularan en concentraciones elevadas y dieran lugar a biopolímeros tales como las proteínas, los polisacáridos y los ácidos nucleicos. Cualesquiera que hayan sido los pasos preliminares de la evolución, cuando las moléculas de ARN llegaron a ser capaces de dirigir la síntesis de proteínas tuvieron a su disposición un enorme taller de herramientas químicas. Entonces fue posible, en principio, sintetizar enzimas que pudieran catalizar una amplia gama de reacciones químicas, incluida la síntesis de más proteínas y más moléculas de ARN. La naturaleza potencialmente explosiva de un proceso autocatalítico de este tipo puede ser observada hoy en día en el ciclo vital de algunos virus bacterianos: después de penetrar en una bacteria, estos virus dirigen la síntesis de proteínas que catalizan selectivamente su propia replicación, de modo que en un breve lapso ocupan toda la célula. Las membranas definieron la primera célula La síntesis proteica controlada por los ácidos nucleicos fue indudablemente uno de los acontecimientos cruciales que condujeron a la formación de la primera célula. Otro de estos acontecimientos trascendentes fue el desarrollo de una membrana limitante. Las proteínas sintetizadas bajo el control de un determinado tipo de ARN no facilitaban la reproducción del mismo, a menos que fueran retenidas en sus proximidades. Del mismo modo, si surgía una variante de ARN que producía un tipo superior de enzima, esta nueva enzima no podía contribuir selectivamente a la supervivencia de ese tipo superior de ARN: ello explicaría la aparición de la primera membrana. Todas las células actuales están rodeadas por una membrana plasmática compuesta esencialmente de fosfolípidos y proteínas. Al microscopio electrónico, estas membranas aparecen como láminas de aproximadamente 7 nanómetros2 de grosor, con un aspecto triestratificado característico, debido al empaquetamiento cola-con-cola de las moléculas de fosfolípidos. Se ha sugerido que las moléculas de fosfolípidos del caldo prebiótico se ensamblaron espontáneamente formando estructuras membranosas, algunas de las cuales incluyeron una mezcla autoreplicante de ARN y moléculas de proteína que dieron lugar a la primera célula. Las células procarióticas son estructuralmente simples pero bioquímicamente diversas Si bien no existen datos fósiles que registren los orígenes de la primera célula, los organismos actuales y los experimentos realizados proporcionan pruebas bastante convincentes de que los rasgos principales de esta historia evolutiva son correctos. La síntesis prebiótica de pequeñas moléculas, la autorreplicación de las moléculas de ARN, la traducción de las secuencias de ARN a secuencias de aminoácidos y el ensamblaje de las moléculas lipídicas para formar compartimientos rodeados de membrana, todo esto debió ocurrir durante la génesis de la primera célula hace unos 3,5 ó 4 mil millones de años. 2 Un nanómetro (nm) = 10-9 m CÉLULA I/Origen y evolución de la célula 3 Resulta útil comparar esta primera célula hipotética con las células actuales más sencillas, los micoplasmas. Los micoplasmas son microorganismos parecidos a bacterias, pero carecen de pared celular y normalmente llevan una vida parasitaria en estrecha asociación con células vegetales y animales. Algunos tienen un diámetro de aproximadamente 0,3 μm y contienen suficiente ácido nucleico para codificar la síntesis de unas 750 proteínas diferentes, que puede ser el número mínimo de proteínas que una célula necesita para sobrevivir. Microscopías electrónicas de Mycoplasma pneumoniae, causante de neumonías. Las células carecen de pared celular y están limitadas por una membrana citoplasmática que tiene estructura trilaminar. Una importante diferencia entre la célula primitiva tal como la hemos descrito y un micoplasma (o, de hecho, cualquier otra célula actual) estriba en que la información hereditaria está almacenada en el ADN y no en el ARN. Se cree que todos los organismos que viven actualmente sobre la Tierra derivan de una única célula primitiva nacida hace varios miles de millones de años. Un hito importante a lo largo de este camino evolutivo se produjo hace 1.500 millones de años, cuando ocurrió la transición desde las células pequeñas con una estructura interna relativamente sencilla –los denominados procariotas, que incluyen además de los micoplasmas a los diversos tipos de bacterias– hasta las células eucarióticas, mayores y radicalmente más complejas, tal como las que encontramos en los animales y plantas superiores. Las bacterias son también organismos muy sencillos. Se trata de células habitualmente esféricas o alargadas, por lo general con un diámetro de varios μm. A menudo poseen una envoltura protectora resistente, denominada pared celular, por debajo de la cual una membrana plasmática rodea a un único compartimiento citoplasmático que tiene ADN, ARN, proteínas y pequeñas moléculas. Al microscopio electrónico, este interior celular aparece como una matriz más o menos uniforme. Las bacterias son pequeñas y se pueden multiplicar rápidamente, dividiéndose simplemente en dos. En condiciones óptimas, una misma célula procariótica se puede dividir cada 20 minutos, y por lo tanto dar lugar a más de 4 mil millones de células (un número cercano al de la población humana mundial actual) en menos de 11 horas. La capacidad de dividirse con rapidez permite que las poblaciones de bacterias se adapten rápidamente a los cambios de su ambiente. En la Naturaleza, las bacterias viven en una gran variedad de nichos ecológicos. Se pueden Gonzalo Vázquez Palacios reconocer dos grupos distintos: las eubacterias, que son las formas más habituales y viven en el suelo, el agua y los organismos vivos, y las arquebacterías, que se encuentran en ambientes tan incómodos como ciénagas, profundidades marinas, aguas salobres y aguas termales de variado grado de temperatura y de acidez. Existen especies de bacterias que pueden utilizar prácticamente cualquier tipo de molécula orgánica como alimento, incluidos azúcares, aminoácidos, grasas, hidratos de carbono, polipéptidos y polisacáridos. Algunas son capaces incluso de obtener del aire tanto los átomos de carbono (del dióxido de carbono atmosférico) como los átomos de nitrógeno molecular (N2). A pesar de su simplicidad relativa, las bacterias han sobrevivido durante más tiempo que cualquier otro organismo y todavía constituyen el tipo de células más abundante de la Tierra. Entre los protistas se encuentran las células más complejas conocidas La complejidad que puede alcanzar una célula eucariótica se pone de manifiesto sobre todo en el Reino Protistas. Los protistas son eucariotas unicelulares de vida libre, que muestran una asombrosa variedad de formas y comportamientos distintos: pueden ser fotosintetizadores o carnívoros, móviles o sedentarios. A menudo su anatomía es compleja e incluye estructuras tales como cerdas sensoriales, fotorreceptores, flagelos, apéndices a modo de patas, partes bucales, flechas urticantes y haces contráctiles parecidos a músculos. Aunque son células aisladas, pueden ser tan complicadas y versátiles como muchos organismos pluricelulares. Pero naturalmente los protistas representan el primer paso de la evolución eucariótica. Se alcanzaron niveles superiores y no mediante la concentración en una sola célula de todo tipo de complejidades, sino por medio de la distribución del trabajo entre diferentes tipos de células. Aparecieron los organismos pluricelulares, en los que células estrechamente emparentadas pasaron a diferenciarse unas de otras, desarrollando características distintivas, formando así las piezas especializadas de una gran empresa cooperativa. Diversos tipos celulares especializados de un mismo animal o planta superior, a menudo aparecen radicalmente distintos. Esto puede parecer paradójico, ya que todas las células de un organismo pluricelular están estrechamente relacionadas al haberse formado a partir de una misma célula precursora (cigota), resultante de la fusión de las gametas femenina y masculina. Un origen común implica poseer una información genética similar. ¿Cómo aparecen, entonces, las diferencias? En algunos casos, la especialización celular implica la pérdida de material genético: un ejemplo extremo lo constituyen los eritrocitos de los mamíferos, que en el transcurso de la diferenciación pierden por completo el núcleo. Pero la inmensa mayoría de las células de la mayor parte de especies animales y vegetales conservan toda la información genética contenida en la cigota. La especialización no depende de la pérdida o adquisición de genes, sino de variaciones en la expresión génica, es decir del hecho de que algunos genes se expresen en algunas células y otros en otras. Incluso las bacterias no producen simultáneamente todos sus tipos de proteínas, sino que son capaces de ajustar el nivel de síntesis a las condiciones externas. Las proteínas específicamente necesarias para el metabolismo de la lactosa, por ejemplo, son producidas por algunas especies de bacterias sólo cuando pueden disponer de este azúcar. Otras bacterias detienen la mayor parte de los procesos metabólicos normales cuando las condiciones son desfavorables, y forman esporas, que presentan una pared externa resistente, impermeable, y un citoplasma de composición alterada. Las células eucarióticas han desarrollado mecanismos mucho más complejos para controlar la expresión génica. Los grupos de genes son activados o inhibidos en respuesta a señales tanto externas como internas. Tanto la composición de las membranas como el citoesqueleto, los productos secretados e incluso el metabolismo deben variar de manera coordinada cuando las células se diferencian. Comparemos, por ejemplo, una célula de músculo esquelético, especializada en la contracción, con un osteoblasto, que segrega la matriz dura del hueso del mismo animal. Tales transformaciones radicales del carácter celular reflejan cambios estables de la expresión génica. Los controles que hacen posible estos cambios han evolucionado en los eucariotas hasta un grado no alcanzado por los procariotas. CÉLULAS EUCARIÓTICAS Y PROCARIÓTICAS Los organismos pueden clasificarse en dos grupos fundamentalmente diferentes, según la estructura y complejidad de sus células. Los organismos eucariotes son aquellos que contienen una estructura CÉLULA I/Origen y evolución de la célula 5 llamada núcleo que se encuentra limitado por una membrana específica (la “envoltura nuclear”). El núcleo sirve para mantener el material genético, el ADN, separado del resto de los componentes celulares. Las células de procariotes (que significa "antes del núcleo") carecen de núcleo y generalmente son más pequeñas que las eucarióticas. El ADN de las células procarióticas está confinado a una o más regiones nucleares, que a veces se denominan nucleoides, pero los nucleoides no están limitados por una membrana independiente. En algunas células procarióticas la membrana plasmática puede plegarse hacia adentro y forma un complejo de membranas internas en donde se llevarían a cabo las reacciones de transformación de energía. Algunas células procarióticas también tienen una pared celular o membrana externa, que es una estructura que encierra a toda la célula, incluida la membrana plasmática. El término eucariote significa “núcleo verdadero” y se refiere a que el material genético, el ADN, está incluido en un estructura especializada (el “núcleo”), que está limitada por la envoltura nuclear. Estas células también presentan varios organelos limitados por membranas que dividen el citoplasma celular en compartimientos adicionales. En el cuadro se resumen los distintos tipos de organelos que suelen encontrarse en las células eucarióticas. Algunos organelos sólo se presentan en ciertas variedades celulares específicas. Por ejemplo, los cloroplastos, que atrapan la luz solar para conversión de energía, se hallan en las protistas células que realizan fotosíntesis (plantas o algas). Estructura Núcleo celular Núcleo Nucleolo Cromosomas Descripción Función Gran estructura rodeada por una doble membrana; contiene al nucleolo y los cromosomas Zona de diferentes características de tinción, carece de membrana limitante. Compuestos de un complejo de ADN y proteínas, llamado cromatina; se observan en forma de estructuras en cilindro durante la división celular Control de la célula Sistema de membranas de la célula Membrana limitante de la célula viva Membrana celular (membrana plasmática) Red de membranas internas que se extienden a Retículo través del citoplasma endoplásmico (RE) Liso (REL) Rugoso (RER) Carece de ribosomas en su superficie externa Los ribosomas tapizan su superficie externa Ribosomas Aparato de Golgi gránulos compuestos de RNA y proteínas; algunos unidos al ER, otros libres en el citoplasma Compuesto de saculaciones membranosas planas Lisosomas Sacos membranosos (en animales) Vacuolas Sacos membranosos (sobre todo en plantas, hongos y algas) Sacos membranosos que contienen una gran diversidad de enzimas Microcuerpos (p.ej. peroxisomas) Organelos transductores de energía Sacos que constan de dos membranas: la Mitocondrias Lugar de síntesis ribosómica; ensamble de subunidades ribosómicas Contiene genes (unidades de información hereditaria que gobiernan la estructura y la actividad celular) Contiene al citoplasma; regula el paso de materiales hacia dentro y fuera de la célula; ayuda a mantener la forma celular; comunica a la célula con otras Sitio de síntesis de lípidos y de proteínas de membrana; origen de vesículas intracelulares de transporte, que acarrean proteínas en proceso de secreción. Biosíntesis de lípidos; desintoxicación de medicamentos Fabricación de muchas proteínas destinadas a secreción o incorporación en membranas Síntesis de polipéptidos Modifica, empaca (para secreción) y distribuye proteínas a vacuolas y a otros organelos Contiene enzimas que degradan material ingerido, las secreciones y desperdicios celulares Transporta y almacena material ingerido, desperdicios y agua Sitio de muchas reacciones metabólicas del organismo Lugar de la mayor parte de las reacciones de la respiración celular; transformación en ATP de la energía proveniente de glucosa o lípidos Sistemas de tres membranas; contienen clorofila en La clorofila captura energía luminosa; se producen ATP y las membranas tilacoideas internas otros compuestos energéticos que después se utilizan en la conversión de CO2 en glucosa membrana interna está plegada en crestas Cloroplastos Citoesqueleto Microtúbulos Microfilamentos Tubos huecos formados por subunidades de tubulina Proporcionan soporte estructural; intervienen en el movimiento y división celulares; forman parte de los cilios, flagelos y centríolos Estructuras sólidas, cilíndricas, formados por actina Proporcionan soporte estructural; participan en el movimiento de las células y organelos, así como en la Gonzalo Vázquez Palacios división celular Durante la división celular en animales se forma un huso mitótico entre ambos centríolos; en animales puede iniciar y organizar la formación de microtúbulos; no existen en las plantas superiores Locomoción de algunos organismos unicelulares; desplazamiento de materiales en la superficie celular de algunos tejidos Centríolos Par de cilindros huecos cerca del centro de la célula; cada centríolo consta de nueve grupos de tres microtúbulos (estructura 9 x 3) Cilios Proyecciones más o menos cortas que se extienden de la superficie celular, cubiertos por la membrana plasmática; compuestos de dos microtúbulos centrales y nueve pares periféricos (estructura 9 + 2) Proyecciones largas formadas por dos microtúbulos Locomoción de las células espermáticas y de algunos centrales y nueve periféricos (estructura9 + 2); se organismos unicelulares extienden desde la superficie celular; recubiertos por membrana plasmática Flagelos El origen de los eucariotes3 Las células eucarióticas seguramente evolucionaron a partir de sus ancestros procarióticos, ¿pero cómo lo hicieron? Esta pregunta ha sido difícil de responder, ya que las formas intermedias de esa transición no han sobrevivido ni dejado restos fósiles que aporten pistas directas. Uno sólo puede ver el producto eucariótico final, que es considerablemente diferente a una célula procariótica. Las células eucarióticas son mucho más grandes que las procarióticas (alrededor de 10.000 veces en volumen) y su depósito de material genético es mucho más organizado. En los procariotes el archivo genético total consiste de un simple cromosoma hecho de una cuerda de ADN circular que está en estrecho contacto con el resto de la célula. En cambio, en los eucariotes la mayor parte del ADN está contenido en cromosomas de mayor grado de estructuración, que están agrupados dentro de una cavidad central bien definida, el núcleo celular. La región que circunda al núcleo (el citoplasma) está particionado por membranas en una elaborada red de compartimientos (organoides) que cumplen una multitud de funciones. Los biólogos sospechaban desde hace mucho tiempo que las mitocondrias y los cloroplastos descendían de bacterias que habían sido adoptadas como endosimbiontes (del griego: “vivir juntos adentro”) por algunas células huésped ancestrales. La evidencia más convincente es la presencia en dichos organelos de un sistema genético vestigial, pero aún funcional. Este sistema incluye genes basados en ADN, los medios para replicar este ADN y todas las herramientas moleculares para construir las moléculas proteicas codificadas en dicho ADN. Estos endosimbiontes habrían sido originalmente ingeridos por una célula huésped inusualmente grande (un fagocito precursor de los eucariotes). Se sabe que muchas células eucarióticas, como los glóbulos blancos, atrapan procariotes. Por lo general, los procariotes así atrapados son muertos y digeridos. Algunas veces escapan de la destrucción y mutilan o matan a sus captores. En raras ocasiones tanto el captor como la víctima sobreviven en un estado de mutua tolerancia que puede dar lugar a una mutua asistencia y, eventualmente, a una mutua dependencia. Las mitocondrias y los cloroplastos podrían así haber llegado a ser huéspedes permanentes de la célula hospedante. Si esta última conjetura es real, la adopción de endosimbiontes debe haber sido posterior a que un ancestro procariótico de los eucariotes evolucionara hasta convertirse en un fagocito primitivo (del griego, “célula devoradora”), es decir una célula capaz de engullir cuerpos voluminosos, tales como bacterias. Y si este arcaico antepasado era similar a los modernos fagocitos, debió haber sido mucho más grande que su presa y estar limitado por una membrana flexible que le permitiera englobar objetos extracelulares grandes. Es interesante señalar que la génesis del núcleo también podría ser explicado, al menos esquemáticamente, como el resultado de la internalización de una parte de la membrana externa. En los procariotes el cromosoma circular que contiene al ADN está unido a la membrana celular. El plegamiento interno de una parte de la membrana celular podría haber creado un saco intracelular llevando el cromosoma en su superficie. Esta estructura pudo haber sido la semilla del núcleo eucariótico, que está circundado por una doble membrana formada por partes achatadas del sistema de membranas 3 De Duve, C. “The borning of complex cells”.Scientific American, 274 (4): 38-45, April 1996 CÉLULA I/Origen y evolución de la célula 7 intracelular que se fusionan para dar una envoltura esférica Características diferenciales de las células vegetales Aunque las plantas y los animales son eucariotes, las células vegetales difieren de las células animales en varios aspectos: Aunque todas las células están delimitadas por membranas plasmáticas, las células vegetales están rodeadas además de una pared rígida que contiene celulosa y otros polisacáridos, además de otros componentes. Esta pared permite mantener altas concentraciones de solutos si que se produzca la ruptura de las células. Las células vegetales contienen plástidos, estructuras delimitadas por una doble membrana, que producen y almacenan nutrientes o pigmentos. Los más comunes y abundantes son los cloroplastos. Casi todas las células vegetales tienen un compartimiento grande o varios pequeños, Ilamados vacuolas, que se utilizan en el transporte y almacenamiento de nutrientes, agua y productos de desecho. Las células de plantas complejas carecen de ciertos organelos, como los centríolos y los lisosomas. LOS VIRUS: UNIDADES DE INFORMACIÓN GENÉTICA Los virus son complejos supramacromoleculares que pueden autorreplicarse en las células huésped adecuadas. Consisten en una molécula de ácido nucleico (ADN o ARN) rodeada por una envoltura protectora o cápside, formada por proteínas y, en algunos casos, por otra envoltura membranosa. Fuera de las células huésped donde se multiplican, los virus son simples partículas denominadas viriones, de forma y composición regulares y que pueden ser cristalizadas. Aparentemente, todos los tipos de células, tanto procarióticas como eucarióticas, son susceptibles de infección por virus específicos. Una vez que un virus o su ácido nucleico penetra en una célula huésped específica se convierte en un parásito intracelular. El ácido nucleico del virus es el mensaje genético que específica la estructura del virión, utilizando las enzimas y los ribosomas del huésped para producir muchas partículas víricas hijas. Como resultado de ello, se pueden generan cientos de partículas de virus a partir de un único virión infectante de la célula huésped. En algunos sistemas huésped-virus, los virus de la progenie escapan a través de la membrana plasmática del huésped. Otros virus provocan la lisis celular (ruptura de la membrana y muerte de la célula huésped) para ser liberados. La estrategia que utilizan los virus para multiplicarse varía de acuerdo al tipo de virus, lo que determina, a su vez, el lugar dentro de la célula en que se replica y transcribe su genoma. En los virus con genoma de ADN, el ADN del virus se replica y también se transcribe a ARN mensajero (ARNm). El ARNm codifica enzimas virales, proteínas de la cubierta viral y, en algunos casos, proteínas reguladoras que controlan la expresión del genoma de la célula hospedadora. El virus realiza sus actividades biosintéticas con el equipamiento de la célula hospedadora. En la mayoría de los virus de ARN, el ARN viral se replica y actúa directamente como ARNm. Otros, en cambio, llevan en la partícula viral una enzima propia que les permite sintetizar los ARNm, usando como molde el ARN viral, ya que éste no puede funcionar como mensajero. En otro tipo de virus de ARN, el ARN viral se transcribe a ADN, a partir del cual se transcribe luego el ARNm. Este fenómeno de transcripción inversa es característico de los retrovirus, tanto de los que causan cáncer como del virus HIV, responsable del SIDA (Síndrome de InmunoDeficiencia Adquirida). Se conocen centenares de virus diferentes, cada uno de ellos más o menos específico para una célula huésped, que puede ser animal, vegetal o bacteriana. Los virus específicos de bacterias se denominan bacteriófagos o simplemente fagos. Algunos virus sólo contienen un tipo de proteína en su cápside, como por ejemplo el virus del mosaico del tabaco, un virus simple de plantas que fue el primero en ser cristalizado. Otros virus contienen docenas o centenares de clases Gonzalo Vázquez Palacios diferentes de proteínas. Se han cristalizado incluso algunos de estos virus grandes y complejos y se conocen por tanto sus estructuras moleculares en detalle. Los virus difieren mucho en tamaño. El bacteriófago X174, uno de los más pequeños, tiene un diámetro de 18 nm. El virus de la viruela es uno de los más grandes; sus viriones son casi tan grandes como las bacterias más pequeñas. Los virus se diferencian también en su forma y en la complejidad de su estructura. Para realizar estudios comparativos, sólo disponemos de virus aislados hace no más de 80 años. Por lo tanto, para elaborar una hipótesis sobre el origen de los virus, solo podemos hacer extrapolaciones hacia atrás, basándonos en el estudio detallado de las características de los virus actuales. Existen tres teorías principales que explicarían el origen de los virus. Una de ellas, la teoría regresiva, propone a los virus como formas degeneradas de parásitos intracelulares. Otra teoría postula que los virus se habrían originado a partir de componentes celulares normales (ADN o ARN) que habrían adquirido la capacidad de replicarse en forma autónoma y de evolucionar independientemente. La tercera teoría se relaciona con la hipótesis de un mundo prebiótico basado en ARN. METODOLOGÍA PARA EL ESTUDIO DE LAS CÉLULAS ¿Por qué son tan pequeñas las células? La mayor parte de las células son microscópicas, pero su tamaño varía en un rango muy amplio. Algunas células bacterianas pueden apreciarse en un buen microscopio óptico, en tanto que ciertas células animales tienen un tamaño que permite apreciarlas a simple vista. Por ejemplo, las células del huevo humano tienen el tamaño del punto final de esta oración. Las células más grandes corresponden a células de los huevos de las aves, pero su tamaño es atípico porque casi toda su masa está ocupada por nutrientes que forman la yema, que no es una parte funcional de la célula. El tamaño y la forma de una célula se relaciona con las funciones que ésta realiza. Algunas células como las amebas y los leucocitos pueden variar su forma a medida que se trasladan, los espermatozoides tienen una cola larga en forma de látigo que ayuda en la locomoción y las células nerviosas poseen extremos delgados y largos que les permiten transmitir mensajes a través de grandes distancias a los sitios más alejados del organismo. Otras células, como las epiteliales, son casi rectangulares y se unen a otras como si fueran ladrillos de una construcción, hasta formar estructuras laminares. Si se considera lo que una célula tiene que hacer para mantenerse y crecer podrán entenderse las razones por las que una célula es tan pequeña. En principio, debe incorporar nutrientes y otros materiales a través de la membrana plasmática; una vez incorporadas, estas sustancias deben transportarse al sitio donde serán utilizadas. Por otra parte, los productos orgánicos de desecho originados en diversas reacciones metabólicas deben trasladarse fuera de la célula antes de que se acumulen en concentraciones tóxicas. En los organismos multicelulares, algunas células deben además exportar sustancias que utilizarán otras células. Debido a que las células son pequeñas, son relativamente cortas las distancias que las moléculas deben recorrer dentro de ellas, lo cual permite acelerar diversas reacciones químicas. Además, debido a que las moléculas esenciales y los productos de desecho deben pasar a través de la membrana celular, cuanto más superficie tenga una célula más rápido pasará a través de ella una cantidad determinada de moléculas. Esto significa que la relación entre el área superficial de una célula y su volumen es un factor crítico en la determinación de su tamaño. Si se considera una célula de forma cúbica se comprueba fácilmente que al aumentar de tamaño el volumen crece más rápidamente que la superficie. El cubo de 4 cm de lado, los 8 cubos de 2 cm de lado y los 64 cubos de 1 cm de lado tienen el mismo volumen total. Sin embargo, a medida que el cubo se divide en unidades más pequeñas, la cantidad total de superficie se incrementa, al igual que la CÉLULA I/Origen y evolución de la célula 9 relación superficie a volumen. Por ejemplo, la superficie total de los sesenta y cuatro cubos de 1 cm de lado es 4 veces mayor que la superficie del cubo de 4 cm de lado y la relación superficie a volumen en cada cubo de 1 cm de lado es 4 veces mayor que la del cubo de 4 centímetros de lado. El hecho de que el volumen de una célula aumente más rápidamente que el área superficial cuando esta célula crece, es una limitante del crecimiento celular. Por encima del tamaño celular límite, las moléculas requeridas para mantener una célula no pueden transportarse dentro de ésta con la rapidez suficiente como para satisfacer sus requerimientos. De modo similar, las células más pequeñas tienen una mayor relación de superficie a volumen que las células más grandes. Esto significa no sólo más superficie de membrana a través de la cual los materiales pueden entrar en la célula o salir de ella, sino también menos materia viva para atender y distancias más cortas a recorrer por los materiales en el interior de la célula. Microscopía Una de las principales herramientas para el estudio de las células es el microscopio. De hecho, la célula fue descrita por vez primera por Robert Hooke en 1665, cuando examinaba una pieza de corcho en un microscopio elaborado por él mismo. A pesar de creerlo, Hooke no contempló células vivas en el corcho, sino que observó las paredes celulares de las células sin vida del corcho. Versiones refinadas del microscopio óptico, que utiliza luz visible como fuente de iluminación, junto con el desarrollo de determinadas sustancias químicas orgánicas que tiñen de forma específica diferentes estructuras celulares, permitieron a los biólogos descubrir, a principios de siglo, que las células contienen un grupo de estructuras internas llamadas organelos 4 (que literalmente significa órganos pequeños). En la actualidad sabemos que cada organelo desarrolla funciones específicas importantes para la existencia de la célula. El desarrollo de colorantes vitales fue esencial para estos descubrimientos, ya que el interior de la célula es transparente cuando se observa con un microscopio óptico. Sin embargo, la mayor parte de los procedimientos para preparar y teñir las células también provocaban la muerte de ésta. La posibilidad de que algunos de los componentes celulares pudieran perderse o distorsionarse durante la preparación de los especimenes a observar siempre preocupó a los microscopistas. El único camino para evitar el problema es examinar a las células mientras están vivas, sin fijación ni congelamiento. Para este propósito los microscopios ópticos con sistemas especiales son sumamente útiles. OBSERVACIÓN DE MATERIALES BIOLÓGICOS La observación directa de los materiales biológicos, está limitada por la capacidad del ojo humano para percibir pequeños detalles. El máximo poder de resolución del ojo humano está dado por la capacidad de diferenciar dos puntos que se hallan separados por 0,1 mm y colocados a 25 cm de distancia del ojo, que es la distancia óptima de visión distinta (menor distancia que no produce fatiga visual). En general las células son muy pequeñas para ser observadas a simple vista, lo que obliga diseñar instrumentos ópticos capaces de proporcionar imágenes considerablemente agrandadas de los objetos. Considerando el tamaño de las estructuras que componen la materia viva y su dependencia con los instrumentos ópticos, aquéllas se diferencian en: a) macroscópicas, b) microscópicas y c) submicroscópicas. Visibles a simple vista DIMENSIONES DE LAS ESTRUCTURAS No visibles a simple vista 4 Estructuras macroscópicas (mm) Poco aumento: lupa simple (hasta 20 X) Mayor aumento: lupa binocular (30-50 X) Estructuras microscópicas ( m) Gran aumento: microscopio común: (hasta 1500-2000 X) Estructuras submicroscópicas (nm) Ultraestructura: microscopio electrónico de transmisión (hasta 100.000 X) Son bastante frecuentes en la literatura biológica los sinónimos organelas, orgánulos u organoides Gonzalo Vázquez Palacios MICROSCOPIOS Se denomina así a todo aparato óptico o lente o sistema de lentes que interpuesto entre un objeto próximo al ojo y éste, permite observar al objeto de un tamaño mayor y percibir detalles no visibles a simple vista. Se considera lente a todo sistema óptico transparente limitado por dos o más superficies curvas, o una curva y otra plana que tienen un eje común. En el caso de los microscopios interesan las lentes convexas, que dan imágenes agrandadas. Pueden distinguirse dos tipos de imágenes: reales y virtuales. Las imágenes reales son las que se forman sobre una pantalla. Las imágenes virtuales son las que percibe directamente el ojo humano. Existen dos tipos de microscopios: simples y compuestos MICROSCOPIO SIMPLE Lupa Simple Está formada por una lente biconvexa o planoconvexa o por varias lentes adosadas que actúan como una sola. El objeto debe hallarse entre el foco y la lente, formándose una imagen virtual, derecha y mayor. El material en observación puede ser aumentado hasta 20 veces (máximo aumento = 20 X). Son generalmente de uso manual. Lupa Binocular Está constituida por dos sistemas de lentes con prismas que están montados en una estructura fija. Sus cualidades son relieve, claridad y profundidad del campo. Máximo aumento = 30-50 X. MICROSCOPIO COMPUESTO Llamado así porque posee dos sistemas de lentes, situados sobre el mismo eje: una lente que produce una imagen (objetivo) y un par de lentes que amplían esa imagen (oculares). Consta de tres partes principales: base, platina y tubo. La base es pesada y sirve de soporte a todo el microscopio. Se articula con el brazo, del cual puede asirse el microscopio. Su misión es sostener el tubo que contiene la parte óptica. En la parte inferior del brazo se encuentra la platina o plataforma donde se ubican las preparaciones y posee un orificio por donde pasan los rayos luminosos. El preparado puede desplazarse sobre la platina en dos sentidos perpendiculares entre sí, mediante el carro o charriot, accionado por dos tornillos colocados lateralmente. Para desplazar el tubo en sentido vertical existen dos tornillos: el macrométrico produce desplazamientos rápidos dando un enfoque aproximado y el micrométrico, de movimientos lentos, permite el enfoque de precisión. El revólver es una pieza colocada en la parte inferior del tubo que lleva enroscados los objetivos y permite cambiarlos rápidamente. Como se ha mencionado, el microscopio compuesto posee dos sistemas de lentes centradas sobre un mismo eje óptico. La lente próxima al objeto se llama objetivo y posee una distancia focal muy corta y da una imagen real, mayor e invertida. La lente próxima al ojo es el ocular, cuya función es agrandar la imagen proporcionada por el objetivo y transformarla en imagen virtual. Por lo tanto, la imagen final obtenida con el microscopio es virtual, mayor e invertida respecto al objeto. El ocular es un sistema sencillo constituido por dos lentes convexas (que actúan como una sola) sujetas por una montura metálica, que se introduce en la parte superior del tubo. Permite aumentos pequeños: 6X, 10X, 16X. El objetivo está formado por varias lentes (hasta diez) que actúan como una sola, centradas por sus ejes ópticos. Un aspecto destacable de un objetivo es la luminosidad: cuanto mayor sea el aumento utilizado más oscura se ve la imagen. Para un mismo aumento, cuanto mayor sea la apertura numérica mayor es el número de rayos que entran al objetivo y más luminosa es la imagen obtenida. CÉLULA I/Origen y evolución de la célula 11 La distancia frontal es la distancia que separa la lente frontal del objetivo de la preparación, cuando la imagen está enfocada. Si es mayor se facilita el enfoque. El poder de resolución es la capacidad de dar imágenes bien definidas de puntos adyacentes, mostrándolos como diferentes y separados. Depende de la apertura numérica y de la longitud de onda de la luz empleada. Es importante tener en cuenta que la función principal del microscopio no es dar imágenes de mayor tamaño, sino permitir la observación de detalles finos de estructura. Ejemplo: dos puntos A y B al aumento X1 dan las imágenes A1 y B1; al aumento mayor X2 existe mayor distancia entre las imágenes A2 y B2, pero las imágenes se superponen y el ojo las ve como una sola. Existen objetivos a seco y de inmersión. Difieren en la naturaleza del medio interpuesto entre la lente frontal del objetivo y la preparación. En los objetivos a seco, el medio es aire (n = 1), en tanto que en los de inmersión se interpone un medio con n próximo al del vidrio, aceite de inmersión (n = 1,5 ó 1,6). La inmersión impide la desviación de los rayos más oblicuos, pudiendo así penetrar en el objetivo, siendo posible obtener conos luminosos más extensos, con lo que aumenta el ángulo de apertura y se mejora el poder de resolución. Al emplear objetivos de gran aumento es necesario obtener grandes conos luminosos y por lo tanto es necesario recurrir al empleo de condensadores, formados por una o varias lentes. Producen un agrandamiento de la sección del cono de luz, dando así mayor claridad a la imagen. El más común es el de Abbé. Dentro de los accesorios de iluminación debemos mencionar al espejo, que capta los rayos luminosos dirigiéndolos a través del condensador hacia el objeto. Tiene una cara plana (para objetivos de poco aumento) y una cara cóncava (proporciona fuerte iluminación para objetivos de gran aumento). El diafragma se encuentra colocado por encima del espejo y por debajo del condensador. Consta de un conjunto de pequeñas láminas de acero que pueden acercarse o alejarse entre ellas, limitando un orificio de diámetro variable y modificando en consecuencia las dimensiones del cono luminoso. La fuente de iluminación puede ser directamente la luz de día o natural, pero es muy poco usada en microscopía, ya que no sirve para aumentos grandes. Las fuentes luminosas artificiales deben enviar un cono luminoso homogéneo y ser capaces de cubrir todo el ángulo de apertura del condensador. Algunos microscopios están iluminados con una lámpara independiente y un espejo. Actualmente se ha reemplazado por bombitas incluidas en el pie del microscopio. En algunos microscopios la iluminación está dada por lámparas que proporcionan luz de composición espectral determinada. EXAMEN CITOLOGICO La morfología celular puede estudiarse utilizando dos métodos: examen inmediato y examen mediato. Examen Inmediato Este tipo de examen consiste en la observación del material (célula o tejido) aislado, al estado viviente. El examen inmediato puede realizarse al estado fresco, por tratamiento previo con líquidos adicionales o con colorantes vitales. Observación al estado fresco. Es el método más simple, de fácil uso, que permite apreciar exactamente la morfología y los movimientos. Su aplicación está restringida, ya que se deben usar materiales delgados y transparentes, no permite realizar observaciones muy prolongadas y muestra pocos detalles de estructura. Algunas veces se debe emplear líquidos fisiológicos (solución Ringer - líquido de Tyrode) para mantener vivas a las células. Si la observación debe ser prolongada, conviene recurrir a la cámara húmeda, que consiste en un porta grueso con una excavación en el centro sobre la que se invierte un cubre con una gota de líquido fisiológico, en el que se suspendió el material a examinar. En este tipo de examen se puede usar el microscopio compuesto o algunas de sus adaptaciones. Gonzalo Vázquez Palacios Observación con tratamiento previo con líquidos adicionales. Se puede considerar una técnica intermedia entre el examen mediato y el inmediato, ya que consiste en el uso de líquidos que modifican las propiedades ópticas de las células. Por ejemplo una mezcla de alcohol-agua-glicerina, ácido acético, etc. Observación con colorantes vitales. Se hace uso de estos colorantes con el objeto de estudiar las estructuras sin producir la muerte ni generar artificios de tinción (falsas estructuras generadas por el agregado del colorante). Un colorante vital se fija sobre los elementos celulares de un ser vivo sin ejercer acción nociva sobre él ni sobre sus células o tejidos; se diferencia de otros colorantes en que no reacciona químicamente con los componentes celulares, sino que se acumula en ciertas porciones de los mismos. Un colorante vital debe reunir las siguientes condiciones: debe ser poco o nada tóxico, debe utilizarse en soluciones muy diluidas y debe ser soluble en agua. Ejemplos: rojo neutro, azul de metileno, azul Nilo, azul de cresilo, violeta de cresilo, violeta de metilo y verde jano. Examen Mediato La observación al estado vivo resulta insuficiente para lograr el conocimiento de la célula, dado que sus partes constituyentes poseen más o menos el mismo índice de refracción. Para subsanar este inconveniente, hay que colorear la célula, a fin de suplir las escasas diferencias de contraste. Para poder colorear una célula es necesario efectuar previamente una fijación, de acuerdo al colorante que se vaya a utilizar y seguir una serie de pasos diferentes según se trate de un tejido blando o de un material lo suficientemente rígido como para ser cortado directamente. Puede implicar diversas etapas: fijación, inclusión, corte, desparafinización e hidratación y coloración. Fijación La fijación es una operación destinada a conservar la estructura celular tanto como sea posible. La mayor parte de los procedimientos para preparar y teñir las células también provocan la muerte de ésta. Los fijadores establecen entrecruzamientos entre sus macromoléculas, de modo que queden en su posición original, y también hacen a las células permeables a los colorantes. El objeto de la fijación es, entonces, producir una precipitación o coagulación completa de las proteínas celulares, conservando el aspecto original. Es fácil concluir que la fijación es teóricamente imperfecta. Hay fijadores físicos y químicos: entre los primeros se encuentran el frío y el calor. El frío endurece, pero no fija en el verdadero sentido, sólo suspende las alteraciones debidas a la necrosis. El calor seco se aplica solamente a frotis, con buenos resultados. Para realizar un frotis se coloca la muestra en un portaobjetos y con el borde de otro portaobjetos colocado en forma oblicua se extiende la muestra hasta casi el final, como se muestra en la figura. Entre los fijadores químicos pueden citarse los ácidos minerales (ácido crómico, ácido ósmico, etc.), los ácidos orgánicos (ácido acético, ácido pícrico, etc. ), las sales metálicas de metales pesados: (bicromatos, cloruro mercúrico, etc.) y los reductores orgánicos (alcohol etílico, metanol, formol, acetona, etc.). Inclusión Por lo general el material fijado debe ser cortado a fin de darle espesor adecuado (unos pocos micrones) que permita su observación al microscopio. Con excepción de algunos materiales de origen vegetal, que por sí ya presentan una consistencia adecuada, el resto deberá ser endurecido transitoriamente para que resista la manipulación del corte sin alteraciones. Por consiguiente, la inclusión tiene por finalidad encerrar el objeto en una masa plástica, que lo penetre íntimamente hasta la profundidad de los elementos celulares más delicados. Para la microscopía óptica en general se emplea la parafina (mezcla de hidrocarburos saturados y no saturados, de punto de fusión entre 35 y 65 ºC). Como la parafina es insoluble en agua y alcohol, para CÉLULA I/Origen y evolución de la célula 13 realizar la impregnación de una pieza es necesario deshidratarla con alcohol y penetrarla luego con una sustancia que actúe como intermediaria entre ésta y la parafina, de acuerdo a los siguientes pasos: Deshidratación: con alcohol de graduación creciente (hasta 100º) Impregnación por un disolvente de la parafina: tolueno o xilol Impregnación por parafina Inclusión definitiva. El material se retira del último baño de parafina y se traslada a un molde lleno con parafina fundida, que se deja enfriar. Si es necesario se orienta la pieza con una aguja, sosteniéndola hasta que la parafina se endurezca. Queda un bloque de parafina encerrando al tejido y se suele pegar a un taco de madera para sostenerlo. Corte Para efectuar cortes histológicos, se utiliza un micrótomo. Existen distintos tipos de micrótomos: el micrótomo de mano consiste en un pequeño aparato que permite sostener el material en un cilindro prensor, en cuya parte superior existe una platina sobre la cual se hace deslizar la navaja. Se emplea en histología vegetal. En el micrótomo automático (micrótomo de Minot) se realizan cortes del bloque o taco de parafina que contiene el tejido y se adhieren a la superficie de portaobjetos limpios. Desparafinización e hidratación En los casos en que se han realizado tacos de parafina para incluir el material, para poder colorearlo es necesario quitarle la parafina y rehidratarlo. Para ello se sigue el camino inverso a la deshidratación: se van sumergiendo los portas con cortes en líquidos intermedios que disolverán la parafina y luego en alcoholes de graduación decreciente, comenzando con el alcohol absoluto, hasta sumergirlo finalmente en agua. Coloración Como último paso del examen se procede a colorear el material, eligiendo el colorante o la combinación de colorantes que sean adecuados para los componentes celulares que se desee observar y teniendo en cuenta el fijador que fue usado en el primer paso. La coloración es la propiedad que poseen ciertas sustancias de ejercer una absorción selectiva sobre la luz. Dicho de otra manera, un cuerpo se ve coloreado porque transmite, por transparencia o difusión, las radiaciones complementarias de aquellas que absorben. La constitución química determina la naturaleza de la absorción. Los colorantes pueden ser clasificados tanto desde un punto de vista químico como histológico. En el primer caso se agrupan de acuerdo a su constitución; en el segundo se los clasifica en: colorantes naturales, extraídos de animales y vegetales (tales como carmín, hematoxilina y orceína) y colorantes artificiales. Desde el punto de vista químico se conocen dos tipos de colorantes según su afinidad por las distintas partes celulares o por los grupos moleculares particulares que ellas contienen: colorantes nucleares o básicos, en los que el componente coloreado activo es una base coloreada, y colorantes citoplasmáticos o ácidos, caracterizados por un ácido coloreado. Es muy raro que se utilicen los ácidos o las bases libres, porque son muy poco solubles. De allí que, en general, los colorantes básicos son sales de bases coloreadas y un ácido incoloro (por ejemplo azul de metileno). En los colorantes ácidos ocurre lo contrario: así, en la eosina el colorante es el ácido eosínico. Otros autores distinguen además los colorantes neutros, en los cuales el ácido y la base están coloreados; tal es el caso del eosinato de azul de metileno que es muy usado en hematología. Microscopio de Fondo Oscuro Es una modificación del microscopio óptico compuesto, que se basa en la reflexión total de la luz. Se logra de manera sencilla observar algunas de las características de células no teñidas, utilizando la luz dispersada por sus diversos componentes. El microscopio de fondo oscuro tiene un condensador diferente al convencional, de forma que la luz se refleja totalmente, quedando el campo totalmente oscuro. Un objeto, tal como una célula, colocado en ese campo dispersa la luz en todas direcciones; parte de esa luz dispersada es captada por el objetivo, que tiene un diafragma especial. Por lo tanto, la célula aparece como un objeto luminoso sobre un fondo negro. Gonzalo Vázquez Palacios Microscopio de Contraste de Fases y de Contraste de Interferencia Diferencial de Nomarski Recientemente se diseñaron modelos más complejos de microscopios ópticos en los que se usan ondas de luz interferentes para resaltar las estructuras celulares internas. Con el microscopio de contraste de fases y el microscopio de contraste de interferencia diferencial de Nomarski es posible observar algunas de las estructuras celulares internas sin tinción. Uno de los hechos más sorprendentes que pueden evidenciarse con estos instrumentos es que las células vivas contienen numerosas estructuras internas que se mueven y cambian de forma y localización constantemente. Cuando la luz pasa a través de una célula viva, la fase de la onda luminosa cambia en función del índice de refracción de la estructura celular: la luz que pasa a través de una parte relativamente gruesa o densa, como el núcleo, es retardada, por lo que su fase estará desviada con respecto a la de otra onda que pase a través de una sección más delgada de citoplasma. El microscopio de contraste de fases y el microscopio de contraste de interferencia diferencial de Nomarski explotan los efectos de interferencia producidos cuando las dos ondas emergen del preparado, generando así una imagen de la estructura celular dada por zonas más brillantes (cuando dos ondas están en fase el resultado es una onda de mayor amplitud y en consecuencia más brillante) y otras más opacas (cuando dos ondas están desfasadas, lo que trae como consecuencia que la zona se vea más opaca). Capacidad de ampliación y poder de resolución de los instrumentos ópticos Hay dos características que determinan la claridad con que puede ser visto un objeto pequeño. Una de ellas es la capacidad de ampliación del instrumento, que es la relación del tamaño de la imagen vista con el microscopio y el tamaño real del objeto. Los mejores microscopios ópticos permiten una ampliación no mayor de 1.000 veces, mientras que un microscopio electrónico puede elevarla hasta 250.000 veces o más. La otra característica, todavía más importante, es el poder de resolución o posibilidad de observar detalles finos. Se define como la mínima distancia a la cual dos puntos pueden distinguirse como tales y no como un punto borroso. El poder de resolución depende de las lentes y de la longitud de onda de la fuente de iluminación: cuanto más corta sea la longitud de onda mayor será el poder de resolución. La luz visible utilizada por los microscopios ópticos tiene una longitud de onda que va de 400 a 700 nanómetros (nm); esto limita la resolución del microscopio óptico a detalles no menores al diámetro de una pequeña célula bacteriana. Microscopio electrónico de transmisión Las células y sus componentes son tan pequeños que los microscopios ópticos comunes sólo pueden distinguir los detalles gruesos de las estructuras celulares. En la mayor parte de los casos todo lo que puede observarse es el contorno de las estructuras y su capacidad de teñirse por alguna sustancia y no por otra. No fue sino hasta que se desarrolló el microscopio electrónico, cuyo empleo se difundió más CÉLULA I/Origen y evolución de la célula 15 ampliamente en los años „50, que los investigadores estuvieron en condiciones de estudiar los detalles finos o ultraestructura de las células. Mientras que el mejor microscopio óptico tiene un poder de resolución 500 veces mayor al del ojo humano, el del microscopio electrónico es 10.000 veces mayor. Esto se debe a que los electrones tienen una longitud de onda del orden de 0,1 a 0,2 nm. Aunque esto implica que el límite de resolución del microscopio electrónico se acerca al diámetro de una molécula de agua, es difícil alcanzar tal resolución con material biológico. Sin embargo, sí puede alcanzarse tal resolución cuando se examinan moléculas aisladas, como proteínas o ADN. La imagen formada por el microscopio electrónico no puede observarse directamente. El haz de electrones consta de electrones con carga, desviados por un campo magnético, de manera similar a la forma en que la luz es refractada por los lentes de un microscopio óptico. Para llevar a cabo estudios de microscopía de transmisión electrónica (TEM, transmission electron microscopy), dado que el espécimen está expuesto a muy alto vacío, los tejidos son usualmente fijados primero con glutaraldehído, que provoca el entrecruzamiento entre moléculas de proteínas vecinas y luego con tetróxido de osmio (OsO4), que estabiliza las bicapas lipídicas y las proteínas. Dado que los electrones tienen muy bajo poder penetrante se deben preparar secciones extraordinariamente finas (50 a 100 nm de espesor, alrededor de 1/200 del espesor de una célula normal). Esto se logra deshidratando el espécimen e impregnándolo con una resina polimérica que forma un block de plástico. Este block es cortado luego con una cuchilla ultrafina de vidrio o diamante. Se hacen secciones seriadas y se montan en una rejilla metálica circular para ser vistas en el microscopio. El haz electrónico se hace pasar luego a través de la muestra y se dirige a una placa fotográfica o a una pantalla. Las fotografías de microscopía electrónica representan sólo un delgado corte transversal de la célula; para reconstruir de algún modo la imagen tridimensional del interior de la célula es necesario estudiar muchas imágenes de cortes consecutivos (llamados cortes seriados) a través de la misma. Existen técnicas de microscopía electrónica que proporcionan información de otros aspectos de la ultraestructura celular. La criofractura permite visualizar el interior de las membranas, congelando las células con N2 líquido en presencia de un anticongelante para evitar la distorsión por los cristales de hielo y luego se corta según un plano que atraviese la bicapa lipídica. Las caras de fractura se metalizan con platino y al microscopio electrónico se visualizan las proteínas transmembrana como pequeñas protuberancias. El grabado por congelación implica la congelación, fractura y luego descongelamiento de la superficie por sublimación del agua en el vacío y luego las zonas de la célula expuestas son sombreadas con un metal. Permite revelar la organización tridimensional de las estructuras del interior celular. También por microscopía electrónica se puede visualizar la forma de las macromoléculas aisladas si previamente se las sombrea con un metal pesado que da una imagen con apariencia tridimensional; para el caso de muestras gruesas se puede eliminar el material orgánico y queda la réplica metálica de la superficie de la muestra. Microscopio electrónico de barrido En otra variedad de microscopía electrónica, llamada microscopía electrónica de barrido (SEM, scanning electron microscopy) el haz de electrones no pasa a través de la muestra, sino que la misma se recubre con una película delgada de oro. Cuando el haz choca contra varios puntos en la superficie de la muestra, se emiten electrones secundarios cuya intensidad de emisión varía con el contorno de la Gonzalo Vázquez Palacios superficie. Los patrones de emisión de los electrones secundarios se registran y dan lugar a una imagen tridimensional de la superficie de la muestra. Este tipo especial de micrografía proporciona información respecto a la forma y a las características externas de la muestra, que no pueden obtenerse mediante microscopía de transmisión electrónica. Microscopio de fluorescencia Las moléculas fluorescentes absorben luz a una longitud de onda menor y emiten luz en una longitud de onda mayor (de menor energía); a veces absorben en el ultravioleta o violeta lejano y emiten en el visible. En Biología se usan colorantes fluorescentes como la fluoresceína que es excitada por la luz azul y emite luz amarillo-verdosa, o la rodamina que es excitada por luz verde-amarilla y emite fluorescencia roja y el DAPI5 que se excita con luz ultravioleta y emite en el azul. Estos colorantes se pueden unir covalentemente a una proteína, un ácido nucleico, u otras moléculas, que por lo tanto pueden ser detectadas en las células. Para la visualización de las moléculas fluorescentes se utiliza el microscopio de fluorescencia, que es un microscopio óptico dotado de una luz muy potente y de un filtro (de excitación) que permite seleccionar la longitud de onda que excita a los reactivos fluorescentes y de otro filtro (de barrera) que deja pasar solamente luz de longitud de onda que corresponde a la fluorescencia producida por las sustancias a las que se unieron los colorantes fluorescentes 6. Ahora se ha desarrollado un microscopio más avanzado, el microscopio de barrido confocal de fluorescencia. Utiliza un rayo láser y métodos electrónicos de procesamiento de la imagen que permiten enfocar un determinado plano de una muestra, eliminando la luz que proviene de otros planos, fuera de foco, superiores o inferiores a ése. Se obtiene una imagen nítida de cada plano y luego una computadora integra todos los planos, dando una imagen tridimensional. Este microscopio proporciona imágenes detalladas de secciones del interior de una estructura intacta, objetos tridimensionales complejos Esquema del camino que sigue la luz (camino óptico) de un como las redes de fibras del citoesqueleto o la microscopio de fluorescencia convencional. Se aprecia la ubicación de los filtros de excitación y de barrera. disposición de los cromosomas en el núcleo. FRACCIONAMIENTO CELULAR Si bien mediante la microscopía se puede determinar la disposición de los organelos y de los grandes agregados macromoleculares en las células y tejidos, muchos estudios bioquímicos requieren la obtención aislada de aquellas estructuras. Es así como surge el fraccionamiento celular, procedimiento que permite la separación de organelos y macromoléculas por ultracentrifugación. Para ello las células de una población purificada debe disgregarse en forma cuidadosa y controlada, ya sea por shock osmótico controlado, ultrasonido, haciéndolas pasar a través de un pequeño orificio o moliéndolas. Estos tratamientos rompen las membranas plasmáticas y otras membranas, pero dejan intactos los núcleos y la mayoría de los organelos. Luego la mezcla del homogenado se somete a centrifugación por rotación en una ultracentrífuga. Cuanto mayor sea el número de revoluciones por minuto, mayor será la fuerza centrífuga ejercida. Esto permite separar los diversos componentes celulares mediante centrifugación diferencial; de acuerdo a sus tamaños y densidades sedimentarán a diferentes velocidades. En un primer paso, a una El 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) forma complejos fluorescentes con el ADN, con gran especificidad para los pares de bases AT y AU, incrementando notablemente la fluorescencia del ADN. 6 En la dirección de internet http://www.cienciahoy.org/hoy64/tridimensional.htm puede consultarse un interesante artículo sobre microscopía de fluorescencia (Ciencia Hoy, Vol. 11, Nº 64, agosto-septiembre de 2001) 5 CÉLULA I/Origen y evolución de la célula 17 velocidad relativamente baja, sedimentarán células enteras, núcleos, restos de membranas y los componentes del citoesqueleto. Sometiendo a mayor velocidad al sobrenadante, se obtiene un “pellet” (sedimento) con la fracción que contiene mitocondrias, lisosomas y, peroxisomas. A una velocidad alta y con mayor tiempo de centrifugación se separa la fracción que contiene las vesículas membranosas del retículo endoplásmico, llamadas microsomas, y otras vesículas pequeñas. Finalmente a muy alta velocidad y después de largo tiempo de centrifugación se obtienen ribosomas y grandes macromoléculas; quedando un sobrenadante que contiene otras biomoléculas, como por ej. proteínas solubles. La obtención de estas estructuras aisladas tiene fundamentalmente por objeto estudios bioquímicos relacionados con ellas, como por ejemplo estudiar la respiración celular, alguna vía metabólica que ocurra en la fracción microsomal, etc. La centrifugación diferencial permite obtener un fraccionamiento inicial del contenido celular, que luego puede purificarse con más precisión mediante una centrifugación isopícnica o en gradiente de densidad. En este método se coloca en un tubo de ultracentrífuga una sustancia, tal como sacarosa o cloruro de cesio, en un gradiente de densidad, preparado con un aparato especial de mezclado (un formador de gradientes), de forma que la densidad aumenta desde la superficie hasta el fondo. Cuando se coloca una mezcla de componentes celulares sobre este gradiente de densidad y se centrifuga a alta velocidad, los distintos tipos de componente se separan en distintas bandas en las regiones del gradiente con igual densidad. Las fracciones celulares purificadas se recuperan con sólo punzar la base del tubo para recolectar las muestras. La velocidad a la que sedimenta cada uno de los componentes depende fundamentalmente de su tamaño y de su forma, y suele expresarse como coeficiente de sedimentación S. Actualmente las ultracentrífugas pueden alcanzar velocidades superiores a 80.000 rpm y producir fuerzas de más de 500.000 veces la de la gravedad; así se pueden separar entre sí en función de su tamaño incluso las macromoléculas pequeñas como los ARNt y las enzimas sencillas. USO DE RADIOISÓTOPOS Y AUTORRADIOGRAFÍA Los radioisótopos se utilizan para marcar moléculas en las células y los organismos y de este modo seguir el curso de casi todos los procesos celulares. Un experimento típico consiste en añadir a las células un precursor marcado con un radioisótopo. Las moléculas radiactivas se mezclarán con las moléculas preexistentes no marcadas y ambos tipos de moléculas serán tratados de forma idéntica por la célula, ya que sólo se diferencian en el peso de su núcleo atómico. Algunos de los radioisótopos más usados en Biología son 3H (tritio), 14C, 32P, 35S y 125I. Los cambios de la localización o de la forma química de las moléculas radiactivas se podrán seguir en función del tiempo transcurrido desde la incorporación del isótopo radioactivo al material, al tejido o al organismo. Una de las aplicaciones más importantes de la radiactividad a la Biología celular consiste en la localización por autorradiografía de compuestos radiactivos en secciones de células enteras o de tejidos. En este procedimiento las células vivas son expuestas brevemente a un pulso de un compuesto radiactivo determinado y se incuban durante un período variable de tiempo, para permitir que el compuesto se incorpore, antes de fijarlas y tratarlas para microscopía óptica o electrónica. Cada preparación es recubierta posteriormente con una fina película de una emulsión fotográfica y se coloca en la oscuridad varios días, durante los cuales parte del radioisótopo se desintegra e impresiona la emulsión. Entonces la emulsión se revela y se determina la posición de la radiactividad en cada célula mediante la posición de los granos de plata generados. Así por ej., la incubación de células con un precursor radiactivo del ADN, timidina 3H, muestra que el ADN se sintetiza en el núcleo y permanece allí. En cambio, el marcaje de las células con uridina 3H, un precursor radiactivo del ARN, revela que el ARN se sintetiza inicialmente en el núcleo pero que luego se desplaza rápidamente hacia el citoplasma. Las moléculas marcadas con radioisótopos también pueden ser detectadas por autorradiografía después de haber sido separadas de otras moléculas mediante electroforesis en gel; de esta manera se detecta habitualmente la posición tanto de las proteínas como de los ácidos nucleicos. Además, cuando se utilizan moléculas de ácidos nucleicos marcadas radiactivamente como sondas para buscar moléculas de ácidos nucleicos complementarias a ellas, se usa la autorradiografía para detectar la posición y la cantidad de estas moléculas que se hibridan con la sonda, tanto sobre un gel como sobre la sección de un tejido. Gonzalo Vázquez Palacios AISLAMIENTO Y CRECIMIENTO DE CÉLULAS EN CULTIVO A pesar de que al microscopio pueden observarse las estructuras de los organelos y de las macromoléculas de la célula, la comprensión molecular de la célula requiere un análisis bioquímico detallado. Desgraciadamente los procedimientos bioquímicos requieren gran cantidad de células y siempre empiezan rompiéndolas. Si la muestra es un trozo de tejido, se mezclarán entre sí fragmentos de todas sus células y si, como ocurre en la mayoría de los casos, el tejido tenía células de varios tipos diferentes, se originará una gran confusión. Con el objeto de preservar toda la información que sea posible sobre cada uno de los tipos celulares, los biólogos celulares han desarrollado técnicas de disociación de células a partir de los tejidos y de separación de los distintos tipos celulares. Como resultado de estas técnicas, pueden analizarse poblaciones relativamente homogéneas de células, ya sea directamente o después de que su número se haya incrementado notablemente permitiendo que las células proliferen en cultivo. Las células de un tejido pueden ser aisladas y separadas en diversos tipos celulares El primer paso del aislamiento de células a partir de un tejido de origen animal que contiene una mezcla de tipos celulares consiste en romper la matriz extracelular y las uniones intercelulares que mantienen unidas entre sí las células. Normalmente las mejores recuperaciones de células disociadas viables son las obtenidas de tejidos fetales o neonatales, típicamente tratándolos con enzimas proteolitícas (como la tripsina y la colagenasa) y con agentes que se unen (quelan) al Ca2+ del que depende la adhesión célula-célula. Entonces, los tejidos pueden ser disociados en células individuales y viables, mediante agitación suave. En células vegetales el procedimiento debe tener en cuenta por una parte que en las plantas la división celular está prácticamente restringida a determinadas zonas (meristemas) y por otra parte que las células vegetales están unidas entre sí por una sustancia cementante de naturaleza polisacarídica (la lámina media o péctica) que tiene que degradarse previamente con enzimas específicas (pectinasas). Para separar los diferentes tipos celulares a partir de una suspensión celular mixta se utilizan diversos métodos. Uno de ellos consiste en aprovechar las diferentes propiedades físicas de las células. Por ejemplo, las células grandes pueden separarse de las pequeñas y las células más densas de las menos densas mediante centrifugación. Otra aproximación se basa en la tendencia de algunos tipos celulares a adherirse fuertemente al cristal o al plástico, lo cual permite separarlas de células que se adhieran menos fuertemente. La técnica más sofisticada de separación celular se basa en el marcaje específico de las células con anticuerpos acoplados a un colorante fluorescente y posterior separación de las células marcadas de las no marcadas mediante un clasificador celular activado por fluorescencia. En este aparato las células pasan en "fila india" a través de un haz láser, determinándose la fluorescencia de cada célula. Cuando, mediante alguno de los métodos mencionados, se ha obtenido una población uniforme de células, esta población puede utilizarse directamente para análisis bioquímicos. Alternativamente, esta población celular constituye un material de partida adecuado para el cultivo celular, permitiendo estudiar el complejo comportamiento de las células bajo las condiciones estrictamente definidas de una placa de cultivo. Las células pueden cultivarse en una placa de cultivo La mayoría de tipos celulares tanto vegetales como animales sobreviven, se multiplican e incluso expresan propiedades diferenciales en una placa de cultivo en condiciones adecuadas. Las células pueden visualizarse al microscopio o analizarse bioquímicamente y también se pueden estudiar los efectos de la adición o eliminación de moléculas determinadas, tales como hormonas o factores de crecimiento. Además, en cultivos mixtos pueden estudiarse las interacciones entre un tipo celular y otro. A menudo se dice que los experimentos con células cultivadas han sido realizados in vitro (literalmente "en vidrio") para diferenciarlos de los experimentos realizados en organismos intactos, que se dice que han sido realizados in vivo (literalmente "en el organismo vivo"). Los experimentos originales implicaban el cultivo de pequeños fragmentos de tejido, denominados explantes o explantos. Si bien está técnica sigue siendo utilizada, especialmente en cultivos de tejidos vegetales, en la actualidad los cultivos se preparan habitualmente a partir de suspensiones de células obtenidas por disociación de tejidos, como se ha descrito más arriba. A diferencia de las bacterias y de CÉLULA I/Origen y evolución de la célula 19 muchas células vegetales, la mayor parte de las células animales no están adaptadas a crecer en suspensión, de forma que necesitan una superficie sólida sobre la que poder crecer y dividirse. Actualmente este soporte lo constituye una superficie de plástico de una placa de cultivo. Sin embargo los distintos tipos celulares tienen requerimientos diferentes, de forma que algunos de ellos no crecen o no se diferencian a menos que la placa de cultivo esté recubierta de componentes de matriz extracelular, como el colágeno. Los cultivos preparados directamente a partir de los tejidos de un organismo, con o sin fraccionamiento previo, reciben el nombre de cultivos primarios. En la mayoría de los casos, las células de los cultivos primarios pueden recuperarse de la placa de cultivo y utilizarse para formar un gran número de cultivos secundarios. De esta forma las células pueden ser subcultivadas repetidamente durante semanas o meses. A menudo estas células muestran in vitro las propiedades que las caracterizan in vivo: los fibroblastos continúan segregando colágeno, las células derivadas del músculo esquelético embrionario se fusionan formando fibras musculares gigantes que se contraen espontáneamente en la placa de cultivo, las células nerviosas emiten axones que son excitables eléctricamente y que establecen sinapsis con otras células nerviosas y las células epiteliales forman extensas láminas con muchas de las propiedades de un epitelio intacto. Puesto que estos fenómenos se producen en los cultivos, resultan accesibles al estudio a través de sistemas y técnicas que no se pueden aplicar en los tejidos intactos. Las líneas celulares eucariotas constituyen una fuente ampliamente utilizada para la obtención de células homogéneas La mayoría de las células de los vertebrados mueren tras un número finito de divisiones en cultivo: por ejemplo, las células cutáneas humanas en cultivo sobreviven durante algunos meses, dividiéndose únicamente entre 50 y 100 veces antes de morir. Se sugirió que esta vida limitada estaba relacionada con la vida limitada del animal del que derivan las células. Sin embargo, en cultivo ocasionalmente surgen algunas células que han sufrido algún cambio genético que las hace realmente inmortales. Estas células proliferan indefinidamente y pueden propagarse como una línea celular. Las líneas celulares preparadas a partir de células cancerosas difieren de las preparadas a partir de células normales en varios aspectos; por ejemplo, a menudo las líneas de células cancerosas crecen sin fijarse a ninguna superficie y proliferan en una placa de cultivo hasta una densidad mucho mayor que la de las células normales. A pesar de que todas las células de una línea celular son muy similares entre sí, a menudo no son idénticas. La uniformidad genética de una línea celular puede mejorarse con el clonaje celular, mediante el cual se aísla una única célula y se le permite proliferar hasta formar una gran colonia. Un clon es cualquier población de células derivadas de una única célula ancestral. Una de las aplicaciones más importantes del clonaje celular ha sido el aislamiento de líneas celulares mutantes con defectos en determinados genes. A menudo el estudio de las células que son defectuosas en una proteína determinada revela muchos datos sobre la función que tiene esta proteína en las células normales. BIBLIOGRAFÍA Lehninger, A.L., D.L. Nelson y M.M. Cox (1993) “Principios de Bioquímica”, Ediciones Omega, Barcelona, 2a edición (traducido de la segunda edición inglesa. 1993). Alberts, B., D. Bray, J. Lewis,M. Raff, K.Roberts y J.D. Watson (1994) “Molecular biology of the cell” 3rd.Ed., Garland Publishing, Inc. New York & London. Lodish, H., A. Berk, S.L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore & J. Darnell (2002)”Biología Celular y Molecular”, Editorial Médica Panamericana (traducido de la 4ª. Ed. inglesa, 2000). Solomon, E.P., L. R. Berg, D.W. Martin & C.A. Villee (1996) “La Biología de Villee”, Interamericana McGraw-Hill. Curtis, H. y N.S. Barnes (2000) “Biología”. 6ª edición española. Editorial Médica Panamericana. Cooper, G.M. (2002). La Célula. 2ª edición. Marbán Libros, S.L., España. (traducido de la 2ª edición inglesa, 2000). Purves, K.W., D. Sadava, G.H. Orians & H.C. Heller (2003) “Vida. La Ciencia de la Biología”, 6ª. Edición. Editorial Médica Panamericana (traducido de la 6ª edición inglesa, 2001). Gonzalo Vázquez Palacios CUESTIONARIO TEÓRICO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. ¿Cuáles son los postulados centrales de la teoría celular? ¿Cuál fue la importancia de la aparición de una membrana limitante al comienzo de la vida? ¿Por qué razón una célula pequeña es más eficiente que una célula mucho más grande? ¿Cuáles son las diferencias esenciales entre los procariotas y los eucariotas? ¿Y entre plantas y animales? Realice un esquema resumiendo las diferencias. Describa las principales estructuras que existen en una célula eucariótica e indique las funciones atribuidas a cada una de ellas. Explique la teoría sobre la formación de las primeras moléculas sobre la tierra. Que son los micoplasmas? Como es la estructura de una bacteria? Defina las características de los virus y su mecanismo de reproducción.
