Melatonina en el tracto gastrointestinal de la trucha arco iris
Anuncio
FACULTAD DE BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA FUNCIONAL Y CIENCIAS DE LA SALUD ÁREA DE FISIOLOGÍA Melatonina en el tracto gastrointestinal de la trucha arco iris: regulación y papel fisiológico TESIS DOCTORAL José Luis Muñoz Pérez Universidad de Vigo 2011 Dr..JESÚS M. MÍGUEZ MIRAMONTES, Profesor Titular de Fisiología en el' Departamento de Biología Funcional y Ciencias de la Salud de la Universidad de Vigo, y el Dr. MARCOS A. LÓPEZ PATIÑO Investigador del Programa Isidro Parga Pondal, en el Departamento de Biología Funcional y Ciencias de la Salud de la Universidad de Vigo, CERTIFICAN: Que la presente Memoria titulada "Melatonina en el tracto gastrointestinal de la trucha arco iris: regulación y papel fisiológico" presentada por D. José Luis Muñoz Pérez para optar al grado de Doctor, ha sido realizada bajo nuestra dirección y que hallándose concluida autorizamos su presentación para que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente. y para que así conste y surta los efectos oportunos, firmamos el presente en Vigo, a 30 de Junio de 2011. Dr. Jesús M. Míguez Miramontes Dr. Marcos A. López Patiño Financiación La presente Tesis Doctoral ha sido realizada en el Departamento de Biología Funcional y Ciencias de la Salud de la Facultad de Biología de la Universidad de Vigo, bajo la dirección de los Doctores Jesús Manuel Míguez Miramontes y Marcos Antonio López Patiño. La investigación desarrollada en esta Tesis, es parte del proyecto financiado por el Ministerio de Educación y Ciencia (AGL2007-65744-C03-01) a cargo del Dr. J.M. Míguez. La realización de la presente Tesis Doctoral ha sido posible gracias a la obtención de la Beca para doctorado “Gestión Propia” de la Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT), del Gobierno de Chile, a cargo de José Luis Muñoz Pérez. Agradecimientos Dar las gracias a mis directores, con los cuales siempre he contado, al Dr. Jesús Miguez y al Dr. Marcos López, por apoyo constante, no solo en lo académico sino que también en lo personal. Debo agradecer a la Dr. Rosa Álvarez, y al Dr. José L. Soengas, con los cuales compartí y recibí una gran ayuda siempre. Mis grandes amigos y compañeros de laboratorio, Adrián, Rosi, Arnau, Sergio, Manuel, Ariel, Marta C., cada uno de ustedes de forma distinta, me apoyó en el día a día del laboratorio. Muchísimas gracias ….. En la última parte de la Tesis llegaron nuevos amigos y compañeros como Marta L. y Juan a los que agradezco el apoyo en el final de la Tesis. Fue una gran experiencia realizar una estancia de investigación en el laboratorio de la Dra. María Jesús Delgado. Muchas gracias por considerarme uno más. En especial agradecer a los Drs. María Jesús, Angel Luis, y Esther; a Laura, Ana, Elena, Clara, Yurena, y Andrea. Debo agradecer a mi familia en Galicia: Ana, Francisco, Héctor, Antia, Ninoska, Mónica, Horacio, Helen, Alberto. Siempre apoyándome y haciéndome sentir en casa. Dar las gracias a mis amigos, en especial a Consuelo, Sara, Jorge, Mateus, Vagelis, Fiona, Cristian, Francisco, Sabine, Rebeca, Graciela, Vicky, Adie, Marcelo, Manolo, Linda, Iris, Rosina. Tuve la suerte de conocerlos y compartir con ustedes. Estos últimos dos años conocí a tres amigos, Talia, Corrado y Aída. Muchas gracias por vuestro apoyo y por ser parte de la “piña”. Agradecer la ayuda de parte del laboratorio de Biología Celular, en especial a Juan, así como al laboratorio del Dr. Mallo en especial a Eva y Marina por su ayuda en la realización del western blot. Agradecer también la ayuda del laboratorio del Dr. Durán, específicamente a Rosa. A mis amigos de los grupos de investigación en Fisiología Animal de la Pontificia Universidad Católica de Chile y de la Universidad Católica de la Ssma. Concepción, los cuales siempre me apoyaron, en especial al Dr. Francisco Bozinovic y al Dr. Patricio Camus. Agradecer a las personas de la Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica de Chile, con los cuales siempre conté de forma muy diligente, en especial agradecer a Carol Armando y Lucia Montero. Finalmente, dedicar esta tesis a mi familia por estar siempre apoyándome y estar en las buenas y en las malas junto a mí, para ellos está dedicada esta Tesis. Gracias a toda la gente que de una u otra manera me han ayudado a realizar esta Tesis Doctoral. Abreviaturas 5HIAA Ácido 5-hidroxindolacético 5HT 5-hidroxitriptamina (serotonina) 5HT-ir Inmunoreactividad frente a 5HT 5HTOL 5-hidroxitriptofol 5HTP 5-hidroxitriptófano 5MIAA Ácido-5-metoxindolacético 5MT 5-metoxitriptamina 5MTOL 5-metoxitriptofol AAAD aminoácido aromático descarboxilasa AANAT Arilalquilamina N-acetiltransferasa ACh Acetilcolina ADN Ácido desoxirribonucléico ADNc ADN complementario AMP Adenosín monofosfato AMPc AMP cíclico ARN Ácido ribonucléico ARNm ARN mensajero ATP Adenosín trifosfato CCK Colecistoquinina CMM Complejos motores mioeléctricos CT Tiempo circadiano EC Célula enterocromafin ELISA Ensayo Inmunoenzimático DD Oscuridad constante DMSO Dimetil sulfóxido GABA Ácido -aminobutírico GDP Guanosín difosfato GH Hormona de crecimiento GMP Guanosín monofosfato GnRH Hormona liberadora de gonadotropina GTP Guanosín trifosfato Hr Receptor de histamina HCL Acido clorihídrico HIOMT Hidroxindol-O-metiltransferasa HPLC Cromatografía líquida de alta resolución HPLC-DF Cromatografía líquida de alta resolución con detección fluorimétrica IA Intestino anterior ICC Célula intersticial de Cajal Abreviaturas IM Intestino medio IP Intestino posterior i.p. Intraperitoneal L-Ala L-Alanina LD Ciclo Luz-oscuridad L-Trp L-Triptófano MAO Monoamino oxidasa MT Receptor de melatonina (1,2,3) MCH Hormona concentradora de melanina MSH Hormona estimuladora de melanocitos NA Noradrenalina NAS N-acetilserotonina NO Óxido nítrico NSQ Núcleo supraquiasmático qRT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real PACAP Polipèptido activador de adenilato ciclasa hipofisiaria PBS Tampón fosfato salino PCR Reacción en cadena de la polimerasa PKA Proteína quinasa A PHI Péptido histidina isoleucina RIA Radioinmunoensayo SBP Serotonin-binding protein SERT Proteína transportadora de serotonina TGI Tracto gastrointestinal TP Tampón fosfato TPH Triptófano hidroxilasa VIP Péptido intestinal vasoactivo ZT Tiempo zeitgeber Índice Introducción 1. El tracto gastrointestinal (TGI) 1.1. Anatomía funcional: aspectos generales 1.2. El tracto gastrointestinal en peces 1.3. Motilidad del TGI de los peces 1.4. Regulación nerviosa y hormonal de la motilidad gastrointestinal. 1 3 7 9 2. La melatonina y los ritmos biológicos 2.1. Fuentes y Biosíntesis de la melatonina 2.2 Cuantificación de los niveles de melatonina 2.3 Ritmicidad de la síntesis de melatonina: el papel de la luz ambiental. 2.4 La melatonina como componente del sistema circadiano. 2.5. Ambiente no lumínico y síntesis de melatonina 2.6. Funciones de la melatonina 3. La melatonina en el tracto gastrointestinal 3.1. Relaciones serotonina-melatonina 3.2. La serotonina: Aspectos básicos de su metabolismo y regulación 3.3. La serotonina intestinal: localización, regulación e implicaciones fisiológicas 3.4. La melatonina en el TGI: presencia, origen y distribución 3.5. Regulación de la síntesis de melatonina gastrointestinal 3.6. Papel fisiológico de la melatonina en el TGI 3.7. La melatonina en el sistema hepatobiliar 13 14 15 18 23 25 29 30 33 37 40 41 43 4. La trucha arco iris como modelo de pez teleósteo 44 Objetivos 49 Trabajos Experimentales Trabajo Experimental 1: Determinación de melatonina en plasma, bilis y tejidos del tracto intestinal de la trucha arco iris, mediante un método de HPLC con detección fluorimétrica……………………………………………… 55 Trabajo Experimental 2: Caracterización de la síntesis de melatonina en el tracto gastrointestinal de la trucha arco iris: niveles, expresión génica, relación con serotonina e inmunolocalización……………………… 67 Trabajo Experimental 3: Producción rítmica de melatonina en el tracto gastrointestinal de la trucha arco iris: influencia del fotoperíodo y de la alimentación……..... 91 Trabajo Experimental 4: Efecto de la ingesta y del paso de alimento por el tracto digestivo sobre la síntesis local de melatonina en la trucha arco iris…………… 109 Índice Trabajo experimental 5: Efecto modulatorio del L-triptófano sobre la síntesis de melatonina en el tracto gastrointestinal de la trucha arco iris…………………………. 123 Trabajo experimental 6: Profundización en la relación entre serotonina y melatonina en el TGI de la trucha arco iris: estudio in vitro del efecto de L- triptófano y de fármacos que modulan los niveles de 5HT sobre la síntesis de melatonina……………………………………………………………… 143 Trabajo Experimental 7: Regulación por melatonina de la contractibilidad intestinal en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss). Posible interacción con los sistemas colinérgico y serotoninérgico……………………….………………….. 158 Discusión Caracterización de los niveles y de la síntesis de melatonina en el tracto gastrointestinal (TGI) de la trucha arco iris………………………………… Regulación de la producción diaria de melatonina intestinal por el fotoperiodo y el alimento…………………………………………………… Efecto de la administración de L-triptófano sobre la síntesis de melatonina a nivel gastrointestinal. Relación entre síntesis de serotonina y de melatonina.………………………………………………………………... Estudio de la función de la melatonina en la contractibilidad intestinal......... 175 185 193 199 Conclusiones 209 Bibliografía 213 Introducción Introducción 1. EL TRACTO GASTROINTESTINAL (TGI) Los sistemas digestivos cumplen un papel esencial en la provisión de nutrientes mediante la digestión y absorción de alimentos. Además, eliminan los productos tóxicos y no digeribles. El sistema digestivo más primitivo es la membrana plasmática de los organismos unicelulares, la cual engloba las partículas microscópicas de alimento mediante endocitosis, y en el interior celular son digeridas mediante enzimas digestivas. En cambio, los organismos multicelulares han desarrollado verdaderos sistemas digestivos basados en la digestión extracelular. En los vertebrados, muchas de las características de los sistemas digestivos son comunes a la mayor parte de los grupos (Figura 1). 1.1. Anatomía funcional: aspectos generales Morfológicamente, el TGI de los vertebrados consta de cuatro segmentos bien diferenciados: a) Tracto cefálico: Es la región craneal del tubo digestivo y la vía de entrada del alimento. Está constituido por órganos y estructuras especializados en la captura y deglución del alimento, como las piezas y cavidad bucales, la faringe, así como estructuras asociadas (pico, lengua y glándulas salivales). En los peces y anfibios esta zona también incluye la cavidad branquial (Horn 1998; Clements y Raubenheimer, 2005). b) Tracto anterior: Constituido básicamente por el esófago, el cual conduce mediante movimientos peristálticos el bolo o masa de alimento masticado y mezclado con la saliva desde la cavidad bucal o faringe hasta las áreas digestivas, normalmente el estómago. c) Tracto medio: Formado por el estómago (salvo algunos peces y larvas de anfibios, (Harder 1975; Kapoor et al., 1975) el intestino anterior y el intestino medio, así como las glándulas anexas (hígado y páncreas). En esta región se produce la digestión química y la absorción de proteínas, grasas y carbohidratos. d) Tracto posterior: Lo constituye el intestino grueso, que almacena los restos no digeridos de alimento y recicla iones inorgánicos y el exceso de agua mediante su absorción, para reincorporarlos a la circulación. En algunos grupos de vertebrados (reptiles, aves y la mayoría de mamíferos herbívoros) es el principal lugar de digestión bacteriana (Stevens y Hume, 1995). La conformación histológica típica del TGI distingue cuatro capas bien diferenciadas: mucosa, submucosa, capa muscular y serosa. En la mucosa se localizan las células epiteliales (absortivas, mucosecretoras y endocrinas), la lámina propia, constituida por tejido conectivo y vascular sobre el que descansan las células de la mucosa, el estrato granuloso (tejido glandular) y, a veces, una fina capa muscular, la muscularis mucosae, que puede contener fibras musculares estriadas, lisas o ambas. La submucosa consta de 1 Introducción tejido conjuntivo laxo con colágeno y láminas de elastina y puede contener glándulas submucosas. La capa muscular está constituida por dos capas, una circular más interna y otra longitudinal que recubre a la primera. Ambas contienen de forma típica células musculares lisas. Finalmente, la serosa está constituida fundamentalmente por tejido conjuntivo laxo y denso. Figura 1. Morfología del tracto gastrointestinal en los diferentes grupos de vertebrados: variación de formas, longitud y complejidad (Modificado de Moyes y Schulte, 2006). Los procesos secretores son muy abundantes a lo largo del TGI, lo que facilita el procesado del alimento y ayuda a su conversión en formas fácilmente absorbibles. No obstante, estas secreciones ocurren de forma diferencial a lo largo del TGI. Por ejemplo, en el estómago se secretan enzimas (fundamentalmente pepsinógeno) que inician la digestión de las proteínas, así como HCl que proporciona la acidez adecuada para que estas enzimas ejerzan su acción catalítica (Randall et al., 2002). Al final del estómago se encuentra el esfínter pilórico, que se relaja permitiendo el paso del contenido ácido del estómago al segmento inicial del intestino delgado (Moyes y Schulte, 2006), donde el fluido procedente del estómago recibe las secreciones del hígado y el páncreas, glándulas originadas a partir del intestino medio embrionario (Barrington, 1957). Mientras que el sistema hepatobiliar (hígado y vesícula biliar) secreta la bilis (con función emulsionante esencial para la 2 Introducción digestión de los lípidos), en el páncreas se secretan enzimas digestivas que degradan carbohidratos, grasas y proteínas. Todas estas secreciones se encuentran bajo control de numerosos factores neuroendocrinos que, en la mayoría de los casos, se activan como consecuencia de la presencia de alimento en el tracto digestivo. Existe una densa inervación del tracto digestivo por neuronas que se integran en su pared. Así, el plexo submucoso es una extensa red neuronal situada en la capa submucosa, mientras que el plexo mientérico se localiza entre las capas circular y longitudinal del músculo liso. Junto con el resto de neuronas e interneuronas del TGI, ambos plexos intraparietales conforman el sistema nervioso entérico que contribuye a la integración de las actividades motoras y secretoras del tracto (Olsson y Holmgren, 2001). Asimismo, las abundantes células endocrinas que se distribuyen a lo largo del TGI contribuyen mediante sus secreciones hormonales a la regulación intrínseca de las funciones digestivas. No obstante, muchas hormonas que son liberadas por células externas a este sistema y por neuronas cuyos cuerpos celulares se hallan fuera del aparato digestivo (forman parte de los sistemas simpático y parasimpático), contribuyen de forma decisiva a dicha regulación. 1.2. El tracto gastrointestinal en peces Tal y como ocurre en el resto de vertebrados, el TGI de los peces consiste en un tubo muscular revestido por una membrana mucosa, cuya estructura y función varía a lo largo del mismo. Existen además grandes diferencias entre los tractos digestivos de peces herbívoros y carnívoros, así como de agua dulce y marinos. Por otro lado, en los peces el TGI (Figura 2) y sus órganos asociados (hígado con vesícula biliar y páncreas) no solo desempeñan funciones relacionadas con la digestión de alimento, sino que también participan en la osmorregulación, inmunidad, regulación endocrina y eliminación de contaminantes ambientales y metabólicos (Stevens y Hume, 1995). Veamos brevemente las características más llamativas de cada una de las regiones del tubo digestivo de los peces: Figura 2. Esquema del tracto gastrointestinal de la trucha arco iris. Cada área representa las diferentes regiones: E, esófago; S, estómago; CP, ciegos pilóricos; IA, intestino anterior; H, hígado; IM, intestino medio; IP, intestino posterior. 3 Introducción Esófago El esófago de los peces es generalmente corto, ancho y recto. Destaca la presencia de fibras estriadas en ambas capas de musculatura, circular y longitudinal, frente a lo que ocurre en la mayor parte del tubo digestivo, con fibras lisas (Rust, 2002). El revestimiento de fibras estriadas confiere al esófago una gran elasticidad. También destaca la presencia de células secretoras de moco que lubrican el alimento facilitando su paso al estómago (Evans y Claiborne, 2006). La parte distal del esófago puede además presentar glándulas secretoras de pepsinógeno y ácido clorhídrico (Kapoor y Khawna, 1993). Estómago El estómago de los peces posee una gran variedad de formas, si bien predomina el tipo sigmoideo o en forma de ―U‖. Se divide en una zona anterior o cardial y una zona posterior o pilórica (Halver y Hardy, 2002), ambas delimitadas por esfínteres (cardias y píloro; Halver, 1986). La conformación histológica presenta las cuatro capas (mucosa, submucosa, muscular y serosa) típicas de los mamíferos (Figura 3.1). La característica más llamativa del estómago de los peces es la presencia de un único tipo de células oxínticas, productoras de pepsinógeno y HCl (Mattison y Holstein, 1980; Einarsson y Davies 1996). Además, la muscularis mucosae, localizada entre la mucosa y la submucosa, presenta fibras lisas y estriadas (zona anterior del estómago, Hibiya, 1982), siendo estas últimas de contracción voluntaria, lo que confiere al animal la capacidad de retener, regurgitar o rechazar el alimento (Halver y Hardy, 2002). Al igual que en el resto de vertebrados, en el estómago de los peces se inicia la descomposición del alimento mediante la rotura mecánica producida por la contracción muscular y las secreciones de enzimas y jugos gástricos (Evans y Claiborne, 2006). Dentro del estómago existen dos tipos de células características: las columnares y las oxínticas. Las primeras se encuentran en la superficie del estómago y su función es la secreción de moco (Wilson y Castro, 2011), mientras que las células oxínticas secretan pepsinógeno y ácido clorhídrico, a diferencia de los mamíferos en los que estas secreciones se producen en tipos celulares diferentes (Barrington, 1957; Hirschowitz, 1957; Smit, 1968). Al final del estómago, el esfínter pilórico controla el vaciado del contenido gástrico al intestino para su posterior procesado. Su apertura y cierre determinan los tiempos de vaciado gástrico (Halver y Hardy, 2002) y de contacto del alimento con los jugos gástricos, así como la acidez del quimo gástrico mediante las secreciones pancreáticas y de la vesícula biliar, ricas en sodio, bicarbonato y enzimas digestivas neutras. Así, el pH es 2-5 en el estómago, siendo 7-8 al comienzo de los ciegos pilóricos (Halver y Hardy, 2002). Ciegos pilóricos Son divertículos o apéndices tubulares cuyo número varía dependiendo de la especie, aunque su presencia no depende de la dieta o la longitud del intestino (Ahearn et 4 Introducción al., 1992). Se sitúan entre el final de la porción pilórica del estómago y la parte proximal del intestino anterior de los peces, pudiendo llegar a constituir la mayor parte de la superficie post-gástrica total (Buddington y Diamond, 1987). A nivel histológico, los ciegos pilóricos son una extensión del intestino medio y la característica más llamativa con respecto al patrón típico de vertebrados es la ausencia de la pared muscular (Hibiya, 1982), que sí aparece en el intestino (Figura 3.2). En los ciegos pilóricos se realizan la digestión enzimática, la absorción de nutrientes (mediante los enterocitos y sus microvellosidades), el almacenamiento y la fermentación, gracias a la secreción de moco, enzimas digestivas y hormonas. Intestino anterior y medio En aquellas especies de peces dotadas de estómago, el intestino anterior se localiza inmediatamente después del píloro y está estrechamente relacionado con los ciegos pilóricos. A nivel histológico se diferencia una parte anterior, cuyo epitelio de revestimiento es de tipo columnar y otra posterior, con predominio de células productoras de moco (Smith, 1989). Existen diferencias dependiendo del patrón alimenticio de los peces, siendo más cortos y con musculatura más robusta en los carnívoros. La mucosa intestinal en los peces (Figura 3.3) sigue un patrón típico de mamíferos, pero no está tan desarrollada. Destacado la baja cantidad de enterocitos que poseen en su zona apical los ribetes en cepillo implicados en la absorción y digestión (Yamamoto, 1966; Ezeasor y Stokoe, 1981), así como de células caliciformes asociadas a estas. Dentro del intestino medio se hallan células entero-endocrinas presentes en el epitelio de todos los peces y que, junto con el páncreas, forman el sistema endocrino gastropancreático (Holmgren y Olsson, 2009). También destaca la presencia de células rodlet en la mayoría de los peces, cuya función se desconoce (Manera y Dezfuli, 2004; Reite, 2005). Intestino posterior Es la parte final del tubo digestivo (Figura 3.4). Presenta un patrón histológico típico, con un aumento del número de células productoras de moco (caliciformes) en detrimento de las implicadas en la digestión y absorción. Además, disminuye drásticamente el número de pliegues y la capa de células epiteliales, de tipo columnar en el intestino medio, cambia a pseudoestratificada. El intestino posterior cumple funciones osmorreguladoras en los peces, ya que es aquí donde se realiza el intercambio iónico. Existe una importante absorción de NaCl y agua desde el lumen (Field, 1993) y del 10-15% de Mg2+ y SO42- (Parmelee y Renfro, 1983), secretándose K+ y HCO3- (Mush et al., 1990) que serán expulsados. Páncreas 5 Introducción En los peces, el páncreas puede localizarse como una estructura definida, o encontrarse de forma difusa entre el mesenterio adiposo y el hígado, o cerca del conducto biliar (Smith, 1989). Existen dos tipos de tejido pancreático, endocrino y exocrino. En el primer caso, existen células α, β, δ y otras de similar forma y función que en los mamíferos (Halver y Hardy, 2002). Forman agregados glandulares llamados cuerpos de Brockmann (Hibiya, 1982) que secretan hormonas implicadas en la regulación del metabolismo y la digestión. En cambio, el páncreas exocrino secreta mayoritariamente enzimas digestivas y bicarbonato hacia los ciegos pilóricos y el intestino (Einarsson y Davies, 1997). Figura 3. Cortes transversales de las distintas zonas del TGI de la trucha arco iris (tinción de hematoxilina) (A) Estómago, (B) Ciegos pilóricos, (C) Intestino medio, (D) Intestino posterior. Abreviaturas: (S) serosa, (MuE) músculo estriado, (EC) estrato compacto, (SM) submucosa, (M) mucosa, (L) lumen., (Mu) musculatura lisa. Barra: 500 µm (A, B y D), 100 µm (B). Fotografías realizadas en colaboración con la Dra. R. Álvarez (Laboratorio de Biología Celular, Universidad de Vigo) 6 Introducción Vesícula biliar La poseen la mayoría de las especies estudiadas (Lagler et al., 1977) y muestra el patrón histológico típico del TGI de los peces (Hibiya, 1982). Se localiza cerca del hígado y la zona anterior del intestino medio, vertiendo su contenido a través del conducto biliar al lumen intestinal. Numerosos mecanismos nerviosos y endocrinos regulan la contracción de la vesícula biliar y la expulsión de la bilis tras el vaciado gástrico (Lagler et al., 1977; Smith 1989; Takeda y Takii 1992; Aldman y Homgren 1995). El llenado y el color de la vesícula biliar determinan el tiempo transcurrido desde su última contracción, ya que un color verde oscuro indica un largo periodo de ayuno (Gwak et al., 1999). La bilis se sintetiza en el hígado y contiene una mezcla de compuestos de desecho, inmunoglobulinas y xenobióticos que se concentran en la vesícula (Smith, 1989). Entre los constituyentes más importantes se encuentran las sales biliares y la biliverdina/bilirrubina (Baldisserotto et al., 1990). Las primeras sirven para emulsionar los lípidos en pequeñas gotas y facilitar su posterior absorción, aunque los pigmentos también pueden colaborar en esta función (Teshima et al., 1999). Hígado El hígado de los peces está formado por dos o más lóbulos y se localiza en la porción anterior de la cavidad peritoneal, en contacto con el septo transversal. Presenta una morfología muy similar a la de otros vertebrados, si bien no está separado en lóbulos discretos o en acinos glandulares (Yasutake y Wales, 1983). Está constituido mayoritariamente por hepatocitos, los cuales almacenan glucógeno y lípidos, dependiendo de la dieta, el estado de salud, y del estado energético del pez, así como de la presencia y concentración de productos tóxicos (Gingerich y Weber, 1979; Hilton y Dixon, 1982; Tucker et al., 1997; Craig et al., 1999). Para llevar a cabo su importante función metabólica, el hígado recibe los nutrientes procedentes del TGI a través de la vena porta hepática. El aporte de oxígeno, en cambio, se consigue a través de la arteria hepática. 1.3. Motilidad del TGI de los peces La función más importante del TGI es la de optimizar la digestión y la absorción. Para ello el alimento debe ser expuesto a las enzimas y secreciones digestivas en las mejores condiciones y el tiempo necesario, lo que se consigue gracias a los procesos integrados de motilidad digestiva. Estos incluyen movimientos de avance peristáltico del contenido digestivo en sentido anterógrado y procesos de segmentación que favorecen el mezclado del contenido luminal con las distintas secreciones que tienen lugar en cada 7 Introducción tramo. La apertura y cierre controlados de los esfínteres localizados a lo largo del TGI permiten la compartimentalización de las contracciones. La motilidad implica la aparición de forma coordinada de las actividades mioeléctrica y contráctil que se generan y controlan de forma local a través del sistema nervioso entérico, aunque pueden ser modificadas por señales del sistema nervioso central o de otras regiones intestinales. Gracias a que todas las células musculares de la pared digestiva se encuentran interconectadas entre si y embebidas en una matriz extracelular de elastina y colágeno, la contracción y relajación se produce al unísono, comportándose como un sincitio. La presencia de sensores en las distintas zonas del TGI permite ejecutar patrones de motilidad específicos (tragar, vaciado gástrico, peristalsis intestinal, etc.). En general podemos hablar de patrones de motilidad diferentes según la región del TGI y el estado digestivo, pudiéndose diferenciar los estados digestivo e interdigestivo. En el intestino de los vertebrados, en general, la motilidad durante el periodo digestivo viene marcada por la actividad miogénica intrínseca de las células musculares lisas que origina un tono espontáneo de contracciones. La actividad intrínseca se basa en la existencia de un ―ritmo eléctrico básico‖ de ondas lentas de despolarización, cuyo origen parece estar ligado a la actividad mioelétrica de las células intersticiales de Cajal, (ICCs), que funcionan como osciladores rítmicos de la pared intestinal (Sanders et al., 2006). En teleósteos, el ritmo de ondas lentas se ha descrito en diversas especies, tales como el salmón chinock y el pez cebra, pero no en otras como la trucha arco iris (Manera et al., 2008). Si bien la presencia de las ICCs no se ha demostrado en el intestino de teleósteos (Holmberg et al., 2007), en el pez cebra se han identificado dos ortólogos de la proteína cKit, la cual parece necesaria para el funcionamiento de las ICCs (Rich et al., 2007). De forma asociada a las ondas lentas también se originan potenciales de acción debido a la activación/inactivación de canales iónicos, lo que se asocia con contracciones fásicas de la musculatura. La amplitud y frecuencia de dichas contracciones está modulada por influencias reflejas locales, como el estiramiento del tejido muscular, o la estimulación química de la mucosa, lo que causa que durante el estado de digestión activa exista una actividad contráctil intensa que facilita el mezclado y la propulsión del alimento. Además, el tono contráctil espontáneo puede ser modificado por el tono neurogénico procedente de la inervación intestinal, así como por el propio tono miogénico característico del músculo liso intestinal (Rumssen y Thuneberg, 1996; Sanders et al., 2006). El grado de motilidad también puede ser modificado por reflejos cefálicos como la olfacción, la presencia de alimento o la actividad anticipatoria del pez (Olsson y Holmgren, 2001). El patrón de motilidad en periodos interdigestivos se caracteriza por la aparición de los denominados complejos motores mioeléctricos (CMM). Estos son series de contracciones que se originan juntas y migran en sentido anteroposterior, facilitando el vaciado del tubo digestivo. Frente a las diferencias observadas en mamíferos entre animales carnívoros, en los que las CMMs solo se aprecian en periodos interdigestivos y 8 Introducción los herbívoros, en los que también se aprecian en el recién alimentado (Wingate, 1981), los pocos estudios existentes en los peces señalan cierta similitud con el patrón de propagación descrito en mamíferos (Karila y Holmgren, 1995). Figura 4. Representación de un ritmo eléctrico básico (REB) intestinal en peces. A) Oscilaciones en el potencial de las células musculares que ocasionalmente originan potenciales de acción dependientes de Ca2+ (Adaptado de Bortoff, 1976). B) Estimulación por acetilcolina (ACh) de la contracción del intestino en la trucha arco iris (Modificado de Aronsson y Holmgren, 2000). 1.4. Regulación nerviosa y hormonal de la motilidad gastrointestinal Inervación En condiciones de reposo la pared digestiva presenta una tensión contráctil o tono muscular basal que mantiene un diámetro en la luz intestinal. Esta contracción basal también se regula a través de vías intrínsecas, que incluyen las redes nerviosas del plexo mientérico (Figura 5) y, en menor medida, del plexo submucoso. Ambos plexos forman el sistema nervioso entérico, cuyos somas neuronales están localizados dentro de la pared intestinal. El plexo mientérico de los peces alberga la mayor parte de los somas neuronales (Kunze y Furness, 1999) que suelen estar distribuidos de una manera bastante homogénea (Burnstock, 1958; Olsson y Karila, 1995), a diferencia de los mamíferos en los que se agrupan en microganglios. Las neuronas mientéricas inervan las capas musculares, actuando como moto- e interneuronas, además de inervar las ICCs (Kunze y Furness, 1999; Sanders et al., 2006). De forma característica en los peces el plexo submucoso está pobremente desarrollado a diferencia de lo descrito en mamíferos (Burnstock, 1959) e incluye fundamentalmente motoneuronas (Olsson y Holmgren, 2001). El funcionamiento del sistema nervioso entérico es independiente del resto del sistema nervioso y constituye en si mismo un verdadero ―cerebro intestinal‖ que integra información sensorial y ejecuta patrones motores complejos. Además, la pared digestiva 9 Introducción recibe inervación extrínseca que tiene un papel importante en la coordinación de la actividad intestinal y la integración de sensaciones como el apetito, la saciedad y estímulos dolorosos (Wood et al., 1999). Se ha visto en peces que el estómago y el intestino anterior reciben inervación vagal, mientras que los nervios espinales (esplácnicos y pélvicos) inervan el resto del intestino (Burnstock, 1958; Nilsson, 1983). En cambio, en algunas especies sin estómago el nervio vago inerva la mayoría del intestino (Olsson, 2009). En la mayor parte de los vertebrados las aferencias vagales son parasimpáticas e incluyen, sobre todo, fibras sensoriales que transmiten la información desde el estómago y glándulas anejas hacia el sistema nervioso central. El neurotransmisor implicado en la inervación parasimpática del TGI es la acetilcolina (ACh) cuyos efectos son excitadores, aumentando la motilidad y estimulando las secreciones intestinales (Randall et al., 2002). Por su parte los nervios esplácnicos son eminentemente simpáticos y ejercen influencias inhibitorias utilizando como neurotransmisor la noradrenalina (NA). El nervio pélvico integra aferencias tanto simpáticas como parasimpáticas (Olsson, 2011). Figura 5. Esquema de una sección transversal de la pared intestinal. Como se puede observar en la figura, el plexo mientérico se encuentra entre ambas capas musculares longitudinal circular. Neurotransmisores y hormonas La motilidad intestinal está regulada por múltiples factores como neurotransmisores, neuropéptidos y hormonas, cuya acción excitadora o inhibidora está mediada por receptores localizados en los terminales nerviosos y en las células enteroendocrinas del epitelio intestinal (Hansen, 2003). 10 Introducción De todos los neurotransmisores implicados en la regulación de la función del TGI, la ACh es el más estudiado. Además de su acción reguladora de la motilidad gastrointestinal, también está implicada en el transporte de agua y electrolitos a través de la mucosa intestinal (Hubel, 1985). En cuanto a la motilidad, la liberación de ACh desde las aferencias vagales estimula la contracción de la pared intestinal, bien a través de receptores muscarínicos (subtipos M2 y M3) localizados en las células musculares lisas (Abrams et al., 2006), o de receptores nicotínicos presentes en las interneuronas de la pared intestinal (Uchiyama y Chess-Williams, 2004). En los peces, la respuesta contráctil inducida por ACh se ha descrito en diversas especies como la trucha (Burnstock, 1958), la carpa (Kitazawa et al., 1990) y el carpín (Velarde et al., 2010b). La presencia de ambos tipos de receptores colinérgicos es ambigua, aunque se confirmó en el carpín donde parecen mediar respuestas excitadoras diferentes que implican otros componentes neurogénicos y miogénicos (Ito y Kuriyama, 1971). En la trucha, Burka et al., (1989) sugieren la implicación de receptores muscarínicos en la contracción colinérgica, con predominancia del subtipo M2 con respecto al M1. Otro neurotransmisor muy importante en el control de la motilidad digestiva es la serotonina (5HT). A nivel intestinal, en mamíferos esta amina se sintetiza principalmente en las células enterocromafines del epitelio intestinal y, en menor medida, en interneuronas entéricas (Gershon y Tack, 2007). No obstante, en diversas especies de peces se ha visto que las fibras serotoninérgicas son más abundantes que las células endocrinas (Olsson et al., 2008; Caamaño-Tubio et al., 2007) e incluso estas últimas podrían estar ausentes en algunas especies, sobre todo de ciclóstomos (Anderson y Campbell, 1988; Olsson et al., 2008). Diversos estímulos desencadenados por la ingesta de alimento o por su presencia en el lumen digestivo (distensión, estimulación vagal, presencia de ácidos y aminoácidos, etc.) desencadenan la liberación de 5HT desde las células enterocromafines (ECs), la cual actúa de forma paracrina regulando diversos procesos secretores y de motilidad. También se conoce la existencia de proyecciones neuronales serotoninérgicas hacia la mucosa intestinal (Beattie y Smith, 2008). En general en los peces, la 5HT parece estimular la contracción intestinal (Kiliaan et al., 1989; Kitazawa et al., 1990), si bien también se han descrito efectos inhibitorios (Kiliaan et al., 1989). Dada la estrecha relación metabólica de la 5HT con la melatonina, así como su interés específico para la presente Tesis, las características de la 5HT en el TGI se tratarán en profundidad en los siguientes apartados. Al margen de los neurotransmisores ya mencionados, existe una amplia variedad de compuestos implicados en la regulación de la motilidad intestinal en los peces, de forma similar a lo que se ha descrito en mamíferos. Entre ellos, la histamina destaca como un neurotransmisor estimulador de la contracción muscular en el TGI, actuando directamente sobre las células musculares lisas (Manera et al., 2008). En peces se señala que los receptores que actúan en la contracción son los Hr1 y Hr3 (Peitsaro et al., 2000; Choich et al., 2004). Dentro de los compuestos que actúan de manera excitadora también se hallan la 11 Introducción sustancia P, la neurokinina A y la colecistoquinina (CCK). Las dos primeras se han encontrado en el intestino de distintos grupos de peces y su acción podría ser directa sobre el músculo liso o indirecta, vía motoneuronas colinérgicas o serotoninérgicas (Jensen, 1997; Karila et al., 1998). La CCK, en cambio, parece actuar especialmente sobre la capa de musculatura circular. Además de ser una señal de saciedad, parece regular la respuesta gastrointestinal al alimento, enlenteciendo el vaciado gástrico y regulando la secreción de enzimas pancreáticas y el movimiento peristáltico (Nelson y Sheridad, 2006). Por otro lado, en los peces se han identificado diversos péptidos intestinales tales como el VIP y el PACAP que ejercen una acción inhibidora de la motilidad actuando a través de receptores, cuya presencia se ha demostrado en diversas especies de teleósteos (Olsson y Karila, 1995; Olsson et al., 2008; Matsuda et al., 2000). También se ha identificado el óxido nítrico (producido por la oxidación de la arginina) como un neurotransmisor importante que media en la relajación de la musculatura lisa en peces (Green y Campbell, 1994; Holmberg et al., 2006). En base a estudios inmunohistoquímicos se ha sugerido que la inervación nitrérgica probablemente actuaría inhibiendo la actividad de las neuronas motoras (Karila et al., 1998). Por último, cabe citar que la adenina y otros nucleótidos (ATP, ADP, AMP) son capaces de estimular o inhibir la contracción muscular del TGI, bien a través de la inhibición de la liberación de ACh o de la NA. 2. LA MELATONINA Y LOS RITMOS BIOLÓGICOS La melatonina fue descubierta en 1917 por McCord y Allen quienes observaron que cuando se aplicaban extractos de glándula pineal bovina sobre preparaciones de melanóforos dérmicos de larvas de anuros se producía la agregación de melanina. Sin embargo, la estructura de la melatonina no se conoció hasta 1958, tras ser aislada por Aaron Lerner y cols. e identificada como N-acetil-5-metoxitriptamina (Figura 6). La denominaron melatonina por su capacidad de alterar la coloración de la piel de anfibios. Estudios posteriores demostraron que la melatonina se produce principalmente en el órgano pineal (o la glándula pineal en mamíferos), siendo el compuesto 5-metoxindólico más representativo y con mayor implicación fisiológica de los producidos en esta estructura endocrina. En 1960, Weissbach y cols., demostraron que su síntesis en la glándula pineal de roedores tenía lugar a partir de la 5HT en dos pasos metabólicos: una acetilación seguida de una metilación. Más tarde se postuló que la acetilación de la 5HT en la glándula pineal es un proceso dinámico que da lugar a la aparición de claros ritmos diarios tanto en los niveles de 5HT y melatonina (Quay, 1963). 12 Introducción Figura 6. Estructura química de la melatonina y su disposición en el espacio. 2.1. Fuentes, biosíntesis y metabolización de la melatonina La melatonina, tal y como ya se ha comentado, se sintetiza principalmente en el órgano pineal, aunque también se ha descrito su producción en otros tejidos neurales como la retina de los vertebrados (Gern y Ralph, 1979). Debido a su carácter lipofílico, la melatonina pineal apenas se acumula en esta estructura, siendo liberada inmediatamente al torrente sanguíneo, donde se transporta mayormente unida a albúmina (Pardridge y Mietus, 1980). Por ello, en diferentes órdenes de vertebrados se ha demostrado que los ritmos diarios de melatonina circulante son paralelos a los del órgano pineal (Reiter, 1991). La síntesis de la melatonina se inicia con la formación de 5HT a partir del aminoácido esencial L-triptófano (L-Trp), el cual es captado de la circulación. La enzima aralquilamina N-acetiltransferasa (AANAT, EC 2.3.1.87) transforma la 5HT en N-acetilserotonina (NAS), siendo éste el paso limitante en la formación de la melatonina. La NAS es rápidamente transformada en melatonina por acción de la enzima citoplasmática hidroxindol-O-metiltransferasa (EC 2.1.1.4, HIOMT), la cual también participa en la producción de diferentes metabolitos 5‘-metilados típicos del órgano pineal, aunque de todos ellos se conoce poco su significado biológico (Figura 7). Como ya se ha mencionado, diversos estudios desarrollados en mamíferos han propuesto la existencia de fuentes tisulares extrapineales de melatonina, como es el caso de la retina. Entre ellas es particularmente notoria la implicación del tracto gastrointestinal (Carrillo-Vico et al., 2004). Otras fuentes de melatonina periférica podrían ser el timo (Naranjo et al., 2007), las células del sistema inmune (Conti et al., 2000; Carrillo-Vico et al., 2004), la piel (Kobayashi et al., 2005; Slominski et al., 2008) y las gónadas (Tijmes et al., 1996; Itoh et al., 1997), entre otros. En todos los vertebrados estudiados, los niveles circulantes de melatonina muestran un perfil rítmico diario dependiente del fotoperiodo ambiental, de forma que aumentan de noche y disminuyen durante el día (Binkley, 1988; Ekström y Meissl, 1997). La regulación lumínica de la síntesis de melatonina en los tejidos productores (principalmente en pineal y retina) proporciona un patrón rítmico de la hormona en la circulación general que resulta 13 Introducción clave para entender sus funciones fisiológicas tanto a nivel diario como estacional. Así, esta ritmicidad determina que la melatonina sea considerada como el transductor de la información fotoperiódica ambiental al organismo y permite el ajuste temporal de numerosos procesos rítmicos diarios (ciclos sueño-vigilia, alimentación, cambios de coloración, etc.) y estacionales (reproducción, hibernación, etc.) (Reiter, 1993). La melatonina es rápidamente metabolizada, siendo su vida media de 15-30 minutos (Gibbs y Vriend, 1981; Lang et al., 1983; Hernadez-Ronda et al., 2000). Su degradación se produce mayoritariamente en el hígado, donde es hidroxilada a 6hidroximelatonina (compuesto carente de actividad biológica), la cual es excretada en forma de conjugados glucurónicos y sulfatados. Además puede darse su metabolización en el cerebro, mediante la formación de derivados de la quinuramina (Hirata et al., 1974). TRP L-Trp TPOH TPH 55- HTP AAAD 55- HIAL Ald.DH 55- HIAA MAO Alc.DH 55- HTOL 5 5HT HT AANAT NAS HIOMT 55- MIAA 5.MTOL 5.MTOL 55- MT MEL 55- MTP MDA Figura 7. Esquema de la principal ruta de la síntesis de melatonina. L-Trp: L-triptófano; TPH: triptófano hidroxilasa; 5HTP: 5-hidroxitriptófano; AAAD: aminoácido aromático descarboxilasa; 5HT: serotonina; AANAT: arilalquilamina N-acetiltransferasa; NAS: N-acetilserotonina; MAO: monoamino oxidasa; 5HIAL: ácido 5-hidroxindolacético; Ald.DH: aldehido deshidrogenasa; Alc. DH: alcohol deshidrogenasa; 5HIAA: ácido 5-hidroxindolacetico; 5HTOL: 5-hidroxitriptofol; HIOMT: hidroxindol-O-metiltransferasa; 5MIAA: ácido 5metoxindolacetico; 5MTOL: 5-metoxitriptofol; MEL: melatonina; MDA: melatonina deacetilasa; 5MT: 5-metoxitriptamina; 5MTP: 5-metoxitriptófano. 14 Introducción 2.2. Cuantificación de los niveles de melatonina La melatonina es una molécula presente en diferentes líquidos corporales (sangre, saliva, líquido cefalorraquídeo) y en tejidos centrales (órgano pineal, cerebro, retina) y periféricos (ovario, tracto gastrointestinal, etc.). La cuantificación de melatonina se ha llevado a cabo por diferentes metodologías, incluyendo en un primer momento los bioensayos y, posteriormente, diferentes técnicas de RIA, cromatografía de gases/espectrometría de masas, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), HPLC/espectrometría de masas y ELISA (ver rev., Harumi y Matsushima, 2000). Algunas de estas técnicas, en particular las de RIA y HPLC, también han sido de uso frecuente para determinar la tasa de síntesis de melatonina en tejidos como la retina y el órgano pineal, en base a la actividad de los enzimas (AANAT, HIOMT) implicados en la ruta metabólica de formación de melatonina (Bradford-Thomas et al., 1990; Ceinos et al., 2008; Itoh et al., 1999). Sin duda, los procedimientos de RIA son los más frecuentes a la hora de cuantificar los niveles de la hormona, especialmente en plasma, retina y órgano pineal de diferentes especies de vertebrados (Vaughan, 1983; Vakkuri et al., 1985). La sensibilidad de esta metodología permitió determinar los niveles basales y las variaciones diarias de esta hormona en diferentes especies y condiciones experimentales (Binkley, 1993). En tejidos periféricos, las mediciones se han llevado a cabo mayoritariamente en TGI de mamíferos (Bubenik et al., 1996; 2000a; Messner et al., 2001), siendo escasas las aplicaciones en no-mamíferos (Bubenik y Pang, 1997). Sin embargo, la necesidad de usar anticuerpos específicos (poco disponibles para especies de no-mamíferos) en las técnicas de RIA, así como el hecho de la utilización de isótopos radioactivos, ha fomentado el desarrollo de las técnicas de HPLC que, aunque no tan sensibles, suelen ser más versátiles en cuento a su aplicabilidad y a la posibilidad de implantarlas en muchos laboratorios. 2.3. Ritmicidad de la síntesis de melatonina: papel de la luz ambiental La ritmicidad en el proceso de síntesis de melatonina es la clave de la aparición del ritmo diario de los niveles de esta hormona tanto en tejidos productores como en la circulación sanguínea. Para ello juegan un papel clave las variaciones diarias de las enzimas responsables de la síntesis de melatonina, cuyo conocimiento deriva principalmente de estudios realizados a nivel de la glándula pineal y la retina de diferentes grupos de vertebrados. En el caso de los peces, solo la aplicación de las técnicas modernas de biología molecular ha permitido obtener algunos datos iniciales en otros tejidos. Triptófano hidroxilasa (TPH) 15 Introducción La TPH es una enzima mitocondrial que transforma el aminoácido L-Triptófano (L-Trp) procedente de la circulación en 5HTP (Lovenberg et al. 1967). En la rata, la expresión del gen y la actividad enzimática de la TPH en la glándula pineal presenta variaciones circadianas, con niveles elevados durante el día que aumentan más (2-3 veces) durante la noche (Ehret et al., 1991). No está claro si la actividad de esta enzima puede ser modulada por el sustrato, L-Trp, hecho que podría ser importante dadas las fuertes variaciones diarias en sus niveles circulante (Sugden, 1979). Algunos estudios han señalado que la administración del aminoácido por vía intraperitoneal (i.p.), o la incubación de pineales con elevadas concentraciones de L-Trp, inducen cambios en la síntesis de 5HT pineal, lo cual podría tener consecuencias en los niveles de melatonina (Ouichou et al., 1992; Yaga et al., 1993). En los peces se conoce muy poco sobre la regulación y los cambios diarios de la actividad TPH, aunque se han detectado oscilaciones diarias en la abundancia de su ARNm en la pineal del lucio y del pez cebra, pero no en la pineal de la trucha (Bégay et al., 1998). Monoamino oxidasa (MAO) En los mamíferos se ha detectado actividad MAO en los pinealocitos (MAO tipo A) y en las terminaciones nerviosas noradrenérgicas (MAO tipo B) pineales. La actividad MAO presenta variaciones día/noche con los valores más elevados durante el día (King y Steinlechner, 1985; Masson-Pévet y Pévet, 1989), aunque estos cambios no parecen afectar a la producción de melatonina. Arilalquilamina N-acetiltransferasa (AANAT) La AANAT pertenece a una familia de enzimas que utilizan acetil coenzima A como donante de acetilos en la acetilación de grupos amino de compuestos aromáticos (Deguchi, 1992). Las AANATs se han encontrado en bacterias Gram positivas, hongos, cefalocordados y vertebrados, pero no en plantas o insectos (Klein, 2006). Las formas más primitivas de las AANATs carecen de determinadas regiones implicadas en la unión de ligandos y en la actividad catalítica, lo que sugiere implicaciones en funciones diferentes a la síntesis de melatonina, tales como la detoxificación de aminas (Coon y Klein, 2006). Klein y Weller (1970) en la rata y Binkley et al., (1978) en el pollo, han demostrado que la actividad AANAT es el punto crítico de la síntesis de melatonina. Los cambios en la actividad de este enzima, típicamente con máximos nocturnos, son responsables de las variaciones diarias de producción de melatonina. De manera similar, en los peces los trabajos de Falcón et al., (1987) en lucio (Esox lucius) y Zachmann et al., (1992) en matalote blanco (Catostomus commersoni), demostraron que el ritmo de síntesis de melatonina es debido al ritmo paralelo en la actividad AANAT. En roedores, se ha evidenciado un incremento nocturno de la AANAT que depende a nivel transcripcional, translacional y postranslacional de un mecanismo regulado por el incremento intracelular en los niveles de AMPc (Klein et al., 1996; Roseboom et al., 16 Introducción 1996). Estudios de clonación en mamíferos han permitido descifrar la existencia de un solo transcrito de ARNm de la AANAT (Coon et al., 1995), pero en la actualidad se conocen secuencias pertenecientes a otros grupos incluyendo aves (Bernard et al., 1997), anfibios (Isorna et al., 2006) y peces (Coon et al., 1999; Zilberman-Peled et al., 2004; Vuilleumier et al., 2007; Isorna et al., 2009). En algunas especies de teleósteos como el lucio, el pez cebra, el rodaballo o la trucha, se conocen al menos dos transcriptos distintos derivados de la expresión de dos formas alélicas que codifican para la AANAT, conocidas como AANAT1 y AANAT2 (Bégay et al., 1998; Coon et al., 1998, Vuilleumier et al., 2007; Appelbaum et al., 2006). Dado que los teleósteos son el grupo de mayor antigüedad en el árbol evolutivo de los vertebrados (aparecieron hace 250 millones de años), se cree que la duplicación de la AANAT, así como de otros genes, debió resultar de la duplicación de su genoma acaecida en el origen de esta línea dentro de vertebrados. Estudios recientes han señalado que, al menos en algunas especies de peces como perciformes y salmónidos, pueden existir varios subtipos de la AANAT1 (a y b) (Falcón et al., 2009). Las dos formas alélicas de la AANAT de los teleósteos presentan importantes diferencias, tanto en su localización como en su regulación y función. La AANAT1 se encuentra principalmente en la retina, mientras que la AANAT2 se expresa mayoritariamente en el órgano pineal (Coon et al., 1999). A nivel de cinética enzimática se ha demostrado que la AANAT2 tiene preferencia por la 5HT como sustrato y no muestra inhibición por sustratos o productos. En cambio la AANAT1 acetila, además de indolaminas, otras arilalkilaminas y es más afín por sus sustratos, cuyo incremento su concentración inhibe su actividad catalítica (Benyassi et al., 2000; Zilberman-Peled et al., 2004). Por otro lado, se ha indicado que las dos isoformas de la AANAT podrían realizar funciones diferentes. Así, la AANAT2 pineal estaría implicada en la producción de grandes cantidades de melatonina, teniendo un papel endocrino (Falcón et al., 2009), mientras que AANAT1 de la retina contribuiría a la síntesis local de melatonina pudiendo, además, realizar funciones detoxificantes (Klein, 2006), o acetilar otros compuestos como la dopamina (Zilberman-Peled et al. 2006). Velarde et al., (2010a) ha descrito ritmos diarios de AANAT2 en tejidos centrales (pineal, retina) y periféricos (hígado, intestino) del carpín, que podrían condicionarse a la existencia de osciladores periféricos localizados en estos tejidos. Por lo tanto, la expresión génica de las AANATs, al menos en algunas localizaciones del organismo, podría ser controlada por mecanismos circadianos, los cuales a su vez ajustarían su oscilación bien a los ciclos ambientales o a los de alimentación. Hidroxindol-O-metiltransferasa (HIOMT) En la literatura se describe tanto la regulación diaria como estacional de la actividad HIOMT pineal. La existencia de un ritmo día/noche es bastante controvertida, dado que diversos estudios en roedores han observado su ausencia (Quay, 1976; Sugden y Klein, 1985). Trabajos más recientes describen un ritmo diario del ARNm de la HIOMT con niveles nocturnos que doblan a los diurnos (Ribelayga et al., 1999). Este ritmo parece tener un origen circadiano, dado que persiste en oscuridad constante y parece responder a la 17 Introducción estimulación adrenérgica nocturna en la glándula pineal de roedores. La regulación de esta enzima parece ser diferente a corto y a largo plazo, siendo en este último caso donde es más sensible a la estimulación por agonistas -adrenérgicos (Ceinos et al., 2004). Estos y otros estudios han sugerido un papel determinante de la HIOMT en los cambios estacionales de la amplitud del pico nocturno de melatonina (Ribelayga et al., 2000). En peces, los pocos estudios existentes señalan que la actividad HIOMT permanece constante a lo largo de un ciclo de 24 horas (Falcón et al., 1987; Morton y Forbes, 1988), aunque en algunas especies de salmónidos se han encontrado variaciones en el contenido proteico de la enzima (Birks y Ewing, 1981). A nivel génico, estudios recientes en rodaballo (Vuilleumier et al., 2007) señalan que, a diferencia de la AANAT que presenta dos isoformas, la HIOMT solo presentaría una forma debido a la pérdida de la HIOMT2 durante el linaje ancestral de esta especie. Sin embargo, Velarde et al. (2010a) en el carpín mostraron la presencia de dos isoformas del gen de la HIOMT y la existencia de ritmos circadianos de expresión de hiomt2 en pineal y otros tejidos periféricos como el hígado y la parte distal del intestino, sugiriendo su papel en la síntesis rítmica de melatonina en dichas localizaciones. Estos autores proponen que, al menos en intestino, los ritmos de hiomt2 están gobernados por un reloj circadiano encarrilado por señales no fóticas. 2.4. La melatonina como componente del sistema circadiano El sistema circadiano y las funciones rítmicas El ambiente al que están expuestos los organismos vivos fluctúa cíclicamente debido a los cambios geofísicos diarios y estacionales existentes en nuestro planeta, lo que genera fuertes variaciones de parámetros tales como la luz o la temperatura, entre otros. Este hecho ha supuesto una gran presión sobre los seres vivos que han adoptado mecanismos que les capacitan para generar una serie de respuestas rítmicas a nivel fisiológico (temperatura corporal, secreción hormonal, funciones cardiovasculares y digestivas, ciclos reproductores, cambios de pelaje, etc.) y de comportamiento (ciclo sueño-vigilia, periodos de actividad-reposo, etc.) que les permite anticiparse a cualquier variación ambiental. La rama de la biología que estudia los procesos cíclicos del medio y los ritmos de los organismos se denomina cronobiología. Los ritmos biológicos se definen en base a una serie de parámetros cronobiológicos que permiten no solo representar, sino también cuantificar el ritmo. Entre estos parámetros destaca el periodo, que representa el tiempo que dura un ciclo completo, la frecuencia o número de ciclos por unidad de tiempo, la amplitud, que mide la oscilación del ritmo a partir del valor medio o mesor (para ritmos sinusoidales) o entre el máximo y el mínimo (para ritmos no sinusoidales), y la fase o punto de referencia temporal de un ritmo. Los ritmos biológicos también se pueden 18 Introducción clasificar en base a la duración de su periodo, destacando entre ellos los ritmos con periodicidad cercana a las 24 horas o circadianos. En la mayoría de las especies de animales, la existencia de ritmos circadianos no es un proceso pasivo a la fluctuación ambiental, sino que depende de la existencia de un sistema circadiano, el cual integra mecanismos a nivel molecular, celular y fisiológico que permiten la expresión de actividad rítmica en numerosas funciones y comportamientos del animal. Ya desde 1960 se postuló la existencia de ritmos endógenos, los cuales persistían bajo condiciones ambientales constantes, lo que llevó a proponer la existencia de un oscilador circadiano (marcapasos o ―pacemaker‖) o reloj endógeno con un periodo característico que se mantiene constante en ausencia de estímulos externos (libre curso o ―free running‖). Los estímulos cíclicos externos podrían actuar sincronizando el ritmo del reloj, lo que permite ajustar (igualar) su periodo de actividad al periodo del agente ambiental, lo que se conoce como sincronización o encarrilamiento. Algunos estímulos pueden actuar directamente sobre el sistema efector, de forma independiente al reloj circadiano, generando situaciones de enmascaramiento de los ritmos finales. La existencia de un ritmo endógeno y/o enmascaramiento puede verificarse si este persiste cuando se evita la exposición del organismo al agente ambiental. Además de dicho reloj, para poder generar un ritmo biológico se requiere de estructuras que capten la información ambiental fluctuante y la transfieran por vía nerviosa y/o química al oscilador endógeno. Así, la retina juega un papel fundamental en la transferencia de información del ciclo luz:oscuridad, principal factor encarrilador (zeitgeber) del reloj circadiano para el ajuste de la mayor parte de las funciones rítmicas de los organismos. Por otro lado, el sistema circadiano integra las vías de salida de información desde el oscilador endógeno hacia los distintos efectores que ejecutan las funciones rítmicas. Se conocen diferentes mecanismos de salida del reloj principal de vertebrados, entre los que destaca la hormona melatonina. Bases moleculares del reloj circadiano. Osciladores centrales y periféricos y su ajuste El funcionamiento del sistema circadiano se basa en la actividad de reloj/es endógeno/s. Es un proceso muy conservado filogenéticamente, presente desde organismos unicelulares a mamíferos. El mecanismo implica una serie de bucles de retroalimentación entre los procesos de transcripción y transducción de determinados genes, (―genes reloj‖), y sus productos proteicos. En mamíferos los elementos positivos o activadores del bucle lo forman proteínas como CLOCK y BMAL, las cuales heterodimerizan en el citoplasma y son translocadas al núcleo, donde aumentan la tasa de transcripción de elementos negativos codificados por genes como period (Per1, Per2, Per3) y criptocromo (Cry1, Cry2 y Cry3). Los complejos que forman los productos proteicos PER y CRY inhiben su propia transcripción al ligarse al heterodímero CLOCK:BMAL, bloqueando su función. El brazo negativo permite un ritmo diario de la expresión de Per y Cry, así como de sus productos proteicos. Estos ciclos de oscilaciones (con brazos positivos y negativos) moleculares 19 Introducción genera periodos en la expresión de los genes reloj y en la acumulación de sus productos proteicos de aproximadamente 24 horas (figura 8). La actividad circadiana de los genes reloj controla la expresión rítmica de otros genes asociados a estos, así como diversos aspectos de la propia actividad celular (Liu et al., 1997; Okamura et al., 2002). Elemento Positivo Proteína PER CRY….. Proteína Clock, BMAL Elemento Negativo mRNA Transcripción Transducción per, cry…… Figura 8. Esquema de la regulación del reloj circadiano, a través de los genes reloj. (Modificado de Cymborowski, 2010). En poiquilotermos, la información de los mecanismos del reloj circadiano es bastante escasa. Entre los teleósteos, el sistema circadiano del pez cebra ha sido el más estudiado, existiendo un alto grado de homología con lo descrito en invertebrados y vertebrados y que muestran expresión rítmica comparable a la de dichos grupos (Pando y Sassone-Corsi, 2002). Recientemente se han caracterizado genes del sistema circadiano de otras especies de teleósteos como el carpín (Velarde et al., 2009a) y la trucha arco iris (López Patiño et al., 2011), hallándose una fuerte homología con los del pez cebra. Una diferencia importante con mamíferos es la existencia de múltiples formas de los genes reloj (hasta 6 formas del gen cry, 3 formas de clock, etc.). En los vertebrados, en general, se ha demostrado la presencia de osciladores circadianos en la retina, el núcleo supraquiasmático del hipotálamo (NSQ) y la glándula pineal. En mamíferos es el NSQ el que contiene el reloj circadiano principal de cuya actividad dependen gran cantidad de ritmos del organismo (Pickard y Turek, 1983), mientras que oscilador intra-retiniano ajusta numerosas funciones intraoculares (sensibilidad visual, niveles de segundos mensajeros y neurotransmisores, etc.). En la pineal, sin embargo, no existe un sistema circadiano, dependiendo su actividad rítmica del control ejercido por vía nerviosa del reloj principal localizado en el NSQ. 20 Introducción En vertebrados no mamíferos, el modelo de organización circadiana más aceptado consta de múltiples osciladores acoplados, localizados en tejidos como la retina, la glándula pineal y algunos núcleos hipotalámicos equivalentes al NSQ de mamíferos (Menaker et al., 1997; López Patiño et al., 2011). De todos ellos, la mayoría de estudios se han realizado en la glándula pineal. En peces, el órgano pineal es una estructura fotosensible localizada en una evaginación del techo diencefálico y formado por células fotorreceptoras modificadas (pinealocitos) cuya morfología es similar a los conos retinianos. Los pinealocitos en peces contienen todos los elementos de un oscilador circadiano: un sistema fotorreceptor que capta la información lumínica ambiental, un oscilador con elementos moleculares (‗genes reloj‘), necesarios para generar la ritmicidad y múltiples vías de salida de información en forma de señales eléctricas y hormonales. Los impulsos eléctricos circulan por las proyecciones axónicas de los pinealocitos hacia diversos núcleos cerebrales, aunque no está clara su función dentro del sistema circadiano. Por su parte, la síntesis y liberación de la hormona melatonina desde los fotorreceptores pineales es una señal directamente ligada a la actividad rítmica del oscilador intrapineal (Falcón, 1999). La localización de osciladores circadianos se abordó mucho después que en el caso del SNC. El gran desarrollo de las técnicas de biología molecular ha permitido evaluar la expresión rítmica de genes reloj no solo en tejidos centrales, sino también en la mayor parte de los órganos periféricos de mamíferos, como hígado, tejido adiposo, páncreas, riñón, pulmón ovario, tracto digestivo, etc. En los peces, la presencia de osciladores moleculares se ha demostrado en corazón, bazo, vesícula biliar del pez cebra (Kaneko et al., 2006) y más recientemente en hígado e intestino del carpín (Velarde et al., 2009a). El ciclo luz oscuridad es fundamental para el ajuste del periodo de los relojes circadianos, lo que implica una acción de la luz sobre los mecanismos moleculares de los osciladores celulares, siendo el principal mecanismo de ajuste del reloj circadiano en la retina y el órgano pineal de los peces (Falcón, 1999). Algo similar ocurre con los ritmos que dependen del reloj principal de mamíferos (NSQ), el cual recibe la información lumínica a través de la vía directa retino-hipotalámica (Bartness et al., 1993; Reiter, 1993; Goldman, 2001). Estudios más recientes han demostrado que la luz, aun siendo el principal, no es el único zeitgeber del oscilador maestro de mamíferos, sino que otros factores ambientales que se presentan rítmicamente parecen jugar papeles relevantes, destacando la alimentación diaria. De hecho, en roedores se ha demostrado que la restricción el alimento a determinados momentos del ciclo diario provoca una actividad motora anticipatoria al alimento (FAA, food anticipatory activity). Los ritmos diarios de FAA son afectados por el momento en que se presenta el alimento, o tras varios días de ayuno, o si el periodo de presencia de comida excede los límites de interpretación del sistema circadiano. Todo ello apoya la existencia de un oscilador circadiano encarrilable por el alimento (FEO, feeding entrained oscillator), cuya relación con el oscilador encarrilable por la luz (LEO) no está clara. Se ha visto que la ablación del NSQ no afecta a la FAA (Landry et al., 2006; Mendoza, 2007), aunque el alimento podría sincronizar 21 Introducción ritmos mediados por el NSQ en situación de luz u oscuridad constantes. También se ha postulado que el momento de alimentación podría ser el estímulo dominante para los osciladores periféricos (Stokkan et al., 2001) en los que el NSQ podría regular su fase directamente o controlando el ritmo diario de ingesta cuando la comida está disponible ―ad libitum‖. En diversas especies de peces, tales como la lubina (Sánchez-Vázquez et al., 1995), el carpín (Velarde et al., 2009a) o la tenca (López-Olmeda et al., 2006b), también se ha demostrado la existencia de ritmos circadianos de FAA, habiéndose sugerido que reflejan cambios de comportamiento asociados a un FEO de localización desconocida. Los antecedentes en el carpín, apoyan la idea de que la sincronización del momento de alimentación sería un factor fundamental en el ajuste de los osciladores periféricos (Velarde et al., 2010a); no obstante, en el pez cebra, se ha indicado que los osciladores periféricos podrían ser sincronizables por la luz, en base al hecho de tener un cuerpo semitransparente (Kaneko et al., 2006; Whitmore et al., 1998). La melatonina como señal de salida del reloj circadiano en peces El modelo vigente de estructura del sistema circadiano postula la existencia de vías de salida de información rítmica desde los osciladores circadianos a las células/tejidos/órganos relacionados jerárquicamente para integrar el control de las distintas funciones y comportamientos circadianos del individuo. En mamíferos está aceptado que la melatonina es uno de los principales mensajeros que portan información circadiana a todas las células del organismo. El control por vía nerviosa que ejerce el NSQ sobre la actividad de la glándula pineal, explica que el ritmo de síntesis y liberación de la hormona sea circadiano, es decir, que permanece en condiciones de ambiente constante siempre que el oscilador circadiano o la conexión NSQ-pineal no se alteren. En situación de ambiente lumínico alternante (ciclo LD), la síntesis de melatonina es máxima durante el periodo nocturno, siendo su duración lo que determina la duración del pico de producción de melatonina. Este hecho resulta relevante no solo desde un punto de vista diario, sino también estacional, razón por la cual la melatonina también ejerce control sobre funciones estacionales como la reproducción, la hibernación, la termorregulación, etc. Como ya se ha mencionado, el órgano pineal de los peces recibe directamente la información fótica de forma independiente de la retina a diferencia de mamíferos, lo que implica un control directo de la luz sobre la síntesis de melatonina (Cahill, 1996; Falcón, 1999). Estudios con cultivos de órganos pineales de diversas especies de teleósteos expuestos a ciclos lumínicos, han demostrado la permanencia de un ritmo día:noche en la síntesis y secreción de melatonina pineal, con máximos nocturnos (Falcón y Collin, 1989; 1992; Kezuka et al., 1989; Zachmann et al., 1991), lo que denota el carácter fotorreceptor del órgano y la acción prioritaria de la luz regulando su ritmo de producción de melatonina. En oscuridad constante, la ritmicidad de la síntesis de melatonina en órganos pineales en cultivo se mantiene con periodos próximos a las 24h, lo que subraya su carácter endógeno 22 Introducción y su dependencia de un reloj circadiano intrapineal (Bolliet et al., 1996; Cahill, 1996; Iigo et al., 1991; Zachmann et al., 1992; Falcón et al., 1992; Bolliet et al., 1996; Molina-Borja et al., 1996). En general se acepta que dicho reloj regula de forma circadiana los cambios producidos en la actividad AANAT, probablemente a través de la regulación de su expresión génica (Falcón et al., 1987). Aunque el carácter circadiano de la síntesis de melatonina pineal se ha demostrado en gran variedad de teleósteos (lucio, carpín, pez cebra), parecen existir excepciones. Así, en algunas especies de salmónidos (incluyendo la trucha arco iris) el ritmo de secreción in vitro de melatonina desaparece en condiciones de iluminación constante (Gern y Greenhouse, 1988; Iigo et al., 2007). Cuando se incuban los órganos pineales de éstas especies, los niveles de melatonina permanecen elevados en oscuridad constante y son inhibidos tras exposición a la luz (Gern et al., 1992). Esta inhibición ocurre de manera inmediata y se relaciona con la intensidad y el espectro de la luz incidente, apoyando el carácter típicamente fotorreceptor del órgano. En base a todo ello, se ha propuesto que el órgano pineal de salmónidos carece de reloj intrapineal (Gern y Greenhouse, 1988; Bolliet et al., 1996) o al menos que, si existe, no parece ser funcional para la regulación de la síntesis de melatonina (Coon et al., 1998; 1999). En el caso de la melatonina de origen periférico, no está claro en vertebrados que su síntesis se vincule a la existencia del sistema circadiano, ni cual es el papel de otros factores no-lumínicos. Estudios recientes en el carpín han observado ritmos dependientes de la luz en la expresión del gen de la aanat2 en hígado e intestino, los cuales se mantienen en situaciones de luz y oscuridad constantes (Velarde et al., 2010a). Ello ha llevado a proponer la existencia de una regulación circadiana de la síntesis de melatonina en dichas localizaciones, así como su ajuste potencial por factores no-fóticos. 2.5. Ambiente no lumínico y síntesis de melatonina Al margen de la luz, otros factores ambientales parecen estar implicados en la regulación de la producción de melatonina. Los peces mantienen una relación muy estrecha con su medio, lo que se refleja en regulaciones específicas por factores como la temperatura y la salinidad, entre otros. Veamos brevemente algunos de estos factores. Temperatura La temperatura es clave en la regulación de la síntesis de melatonina, especialmente en vertebrados poiquilotermos, capaces de modificar diversas funciones fisiológicas para adaptarse a los cambios de temperatura ambiental. En reptiles, la temperatura también es clave para la amplitud del pico nocturno de melatonina circulante (Vivien-Roels et al., 1979). En anfibios se encontró una correlación entre la temperatura ambiental y el incremento nocturno de melatonina, llegándose a anular el ritmo diario ocular de 23 Introducción melatonina tanto a temperaturas bajas propias del invierno (Delgado et al., 1993), como en cultivos in vitro de copas ópticas (Valenciano et al., 1997). Estudios en pineales de trucha arco iris sometidas a oscuridad constante han demostrado el incremento de la frecuencia de descarga de las células fotorreceptoras con la temperatura (Tabata y Meissl, 1993). Bajo iluminación constante, un ritmo diario de temperaturas puede mantener otro de secreción de melatonina en Catostomus commersoni y Esox lucius (Zachmann et al., 1991; Falcón et al., 1994). Los efectos de la temperatura dependen de la intensidad de la luz ambiental (Max y Menaker, 1992), de la fase del ciclo diario (Zachmann et al., 1991; Falcón et al., 1994) y de la estación del año (Iigo y Aida, 1995). La temperatura influye además en las cinéticas enzimáticas: en la trucha arco iris, el incremento de temperatura hasta unos 40ºC aumenta la actividad HIOMT (Morton y Forbes, 1989). En el caso de la actividad AANAT, el efecto de la temperatura es diferente en cada forma enzimática; así la actividad de la AANAT1 tiende a aumentar con la temperatura, mientras que la AANAT2 tiene un máximo relacionado con la preferencia térmica de la especie, por lo que se ha propuesto un papel de termosensor que, controlando la cantidad de melatonina que se sintetiza, proporcionaría información al organismo del momento del día, estación anual y/o posición en la columna de agua (Falcón y Collin, 1989; Benyassi et al., 2000). Salinidad del agua La exposición de diferentes especies de teleósteos a medios de diferente osmolaridad produce alteraciones de los niveles de melatonina circulantes (Kulczykowska, 2001; 2002; Saito et al, 2004; Kleszczynska et al., 2006). López Olmeda et al., (2009) en la lubina (Dicentrarchus labrax) indican que el incremento en la salinidad del agua provoca una reducción de los niveles de melatonina en plasma y diversos tejidos periféricos (branquias, intestino), así como en la densidad de sitios de unión de melatonina en el SNC. Mas recientemente, un estudio de López Patiño et al. (2011a) en la trucha arco iris demuestra que el incremento de osmolaridad resulta en aumentos de los niveles y de la síntesis (actividad AANAT) de melatonina en el órgano pineal, especialmente durante la fase nocturna. Asimismo, se ha sugerido que dicho efecto podría estar mediado por la acción de hormonas relacionadas con la adaptación osmótica, incluyendo el cortisol (Nikaido et al., 2010) y la arginina-vasotocina (Rodriguez-Illamola et al., 2011). Alimento Algunos estudios en mamíferos sugieren que la restricción de alimento puede modificar los niveles de melatonina circulantes (Challet et al., 1997) y reducir la amplitud y duración del incremento de melatonina en la glándula pineal (Chik et al., 1987) y la actividad AANAT (Welker y Vollrath, 1984). La composición de la dieta es otro factor a tener en cuenta, dado que ratas alimentadas con dietas de bajo contenido proteico mostraron niveles plasmáticos de melatonina más bajos y menor actividad AANAT que las alimentadas con dietas normales. Por otro lado, en roedores se ha demostrado que la administración del aminoácido L-Trp provoca un aumento del contenido de 5HT pineal 24 Introducción (Young y Anderson, 1982; Reiter et al., 1990), aunque los efectos sobre los niveles melatonina son contradictorios. Así, mientras que la el aminoácido no produce cambios drásticos en la melatonina pineal (Ferreti et al., 1990) e incluso induce efectos inhibidores (Reiter et al., 1990), si causa el aumento de los niveles de la hormona en plasma (Bubenik et al., 1992; Huether et al., 1993; Yaga et al., 1993). También se ha encontrado que la administración oral de L-Trp produce mayores incrementos en los niveles de melatonina plasmática que la inyección i.p. (Huether et al. 1992). Dado que el efecto del L-Trp sobre la melatonina circulante persiste en ratas pinealectomizadas, se ha sugerido que se debe a un aumento de la síntesis intestinal de la hormona (Yaga et al., 1993). En el caso de los peces los estudios del efecto de alimento son más bien escasos. Ceinos et al. (2008) en la trucha arco iris indican que la disponibilidad de alimento altera los ritmos de síntesis de melatonina pineal. Así, una semana de ayuno se produce la reducción del pico nocturno de melatonina y de actividad AANAT en el órgano pineal, efecto que desaparece tras varios días de realimentación. Otros estudios también han relacionado la dieta con la producción de la hormona. Así, Herrero et al. (2007) en la lubina vieron que la suplementación de la dieta con L-Trp incrementa los niveles de melatonina en plasma durante el día, aunque no está claro el origen de dichos cambios. Por último, Lepage et al. (2005a) demuestran que el enriquecimiento del medio de cultivo con L-Trp causa el incremento de los niveles intestinales de melatonina, sugiriendo una relación entre contenido del aminoácido y la síntesis intestinal de la hormona. 2.6. Funciones de la melatonina En los vertebrados la melatonina ejerce acciones fisiológicas muy diversas y en diferentes localizaciones del organismo. En general, esta señal hormonal parece ser clave para el ajuste temporal de funciones circadianas y estacionales, participando en procesos bien caracterizados tales como los ciclos diarios de actividad-reposo y sueño-vigilia, la reproducción estacional o el equilibrio energético, entre otros (Pévet, 2003; Reiter, 2003; Hardeland, 2003). En gran parte esta amplia variedad de acciones parece estar mediada por receptores específicos de la hormona, distribuidos por todo el organismo en vertebrados. Receptores de melatonina La mayor parte de las acciones fisiológicas de la melatonina se llevan a cabo a través de receptores de membrana de alta afinidad, clasificados en varios subtipos: MT1, MT2 y Mel1c, este último presente en todos los mamíferos excepto placentarios y marsupiales (Reppert et al., 1995; Park et al., 2007b). Todos ellos pertenecen a la superfamilia de receptores con siete dominios transmembrana acoplados a proteínas G (Dubocovich et al., 1998) y su activación resulta, de forma general, en la inhibición de la actividad adenilato ciclasa y la síntesis de AMPc (Reppert, 1997; Dubocovich et al., 1998), o en la activación de la fosfolipasa C. Además, en mamíferos se ha descrito la presencia de 25 Introducción sitios de unión de baja afinidad para la melatonina, denominado como MT3 (Reppert et al., 1995). Estudios con radioligandos muy selectivos han permitido saber que se trata de una quinona reductasa, enzima detoxificante del organismo, por lo que se ha propuesto que estos sitios de unión no son auténticos receptores (Nosjean et al., 2000). En el caso de los peces, se han clonado secuencias completas o parciales de los receptores de melatonina en diversas especies, tales como la trucha arco iris (Gaildrat et al., 2002), pez conejo (Siganis guttatus, Park et al., 2007a,b), pez cebra (Danio rerio, Falcón et al., 2007), lucio (E. lucius, Falcón et al., 2007), lubina (D. labrax, Sauzet et al. 2008), lenguado (Solea senegalensis, Confente et al., 2010) y carpín (C. auratus, Ikegami et al. 2009a,b). En alguna de estas especies se ha identificado subtipos de receptores MT1. La mayor parte de los estudios de localización de los receptores de melatonina se han llevado a cabo en mamíferos, encontrándose una distribución amplia, tanto en el SNC como en muchos tejidos periféricos como el ovario (Clemens et al., 2001), testículo (Frungieri et al., 2005), la glándula mamaria (Ram et al., 2002), la retina (Scher et al., 2002), vasos sanguíneos (Ekmekcioglu et al., 2001a,b), el hígado y el riñón (Naji et al., 2004), la vesícula biliar (Aust et al., 2004), la piel (Slominski et al., 2003), el sistema inmune (Pozo et al., 2004) y el tracto gastrointestinal (Sallinen et al., 2005; Stebelová et al., 2010). En peces, en comparación con mamíferos, la distribución central de los receptores de melatonina es muy amplia, extendiéndose por áreas implicadas en la integración de información sensorial, visual, auditiva, así como en el sistema límbico (Iigo et al., 2003; López Patiño et al., 2008). También se ha descrito la presencia de los subtipos MT1, MT2 y Mel1c en el órgano pineal de algunos peces (Park et al., 2006, 2007a,b), así como variaciones diarias en su expresión génica. A nivel periférico, se han descrito lugares de unión de melatonina en riñón, branquias, bazo, corazón, tubo digestivo e hígado (Kulczykowska et al., 2006; López Patiño et al., 2011; Sauzet et al., 2008; Ikegami et al., 2009a). En la trucha arco iris, el lucio y el Xenopus también se han encontrado potenciales receptores de melatonina en hipófisis y retina (Gaildrat y Falcón, 1999; Gaildrat y Falcón 2000; Wiechmann, 2003). Efectos de la melatonina sobre los ritmos circadianos La melatonina actúa como una molécula señalizadora del tiempo, capaz de influir sobre la fase y/o el periodo del reloj circadiano. El efecto cronobiótico de la melatonina, estudiado principalmente en mamíferos, entraña gran complejidad, observándose resultados variables (retrasos o avances de fase) dependiendo de la hora del día en que se administre (Wikstrom, 1996; Pévet, 2003). También en algunas especies de aves y reptiles, la pinealectomía suprime el ritmo de actividad locomotora en oscuridad constante, mientras que inyecciones diarias de melatonina son capaces de restaurarlo (Murakami et al., 2001). El efecto sincronizador de la melatonina también se ha observado en otras funciones rítmicas como su propia producción o la temperatura corporal (Vanecek, 1998; Murakami et al., 2001; Pévet, 2003). 26 Introducción En peces todavía no se ha identificado un oscilador central equivalente al del NSQ. Recientemente nuestro grupo ha demostrado en la trucha arco iris la oscilación rítmica de genes reloj (clock1, bmal1, per1) en hipotálamo y retina, apoyando la localización de marcapasos a estos niveles (López Patiño et al., 2011). Estos mecanismos podrían participar en la generación de ritmos circadianos de actividad locomotora, alimentación, coloración, etc., en los cuales el ciclo luz:oscuridad sería el encarrilador principal (Spieler, 1992; Sánchez-Vázquez et al., 1995; Aranda et al., 1999). En el caso de la actividad motora, es conocida la presencia en la mayoría de los peces de patrones diarios influenciados por la luz (Richardson y McCleave, 1974). La mayoría de los peces son nocturnos o diurnos, pero su comportamiento diario puede exhibir cierto grado de plasticidad, cambiando de nocturno a diurno y viceversa (Eriksson, 1978; Sánchez-Vázquez et al., 1995). La melatonina y su precursor (serotonina), están relacionados con la respuesta a la actividad motora en diferentes especies de peces y podrían contribuir a sincronizar estas actividades rítmicas diarias (Falcón et al., 2010). En el carpín, especie diurna, la administración i.p. de melatonina induce un descenso en su actividad (López-Olmeda et al., 2006b), al igual que en lubinas alimentadas con una dieta rica en triptófano (Herrero et al., 2007). En el salmón rojo la 5HT incrementa la actividad locomotriz solo durante la noche, mientras que la melatonina la disminuye durante el día (Byrne, 1970). También en la tenca (Tinca tinca), especie nocturna, la respuesta a la administración periférica de melatonina parece depender del momento de su administración en el fotociclo diario (López Olmeda et al., 2006a). Efectos sobre la actividad reproductora En multitud de especies animales la reproducción es un fenómeno estacional cuyos patrones dependen del fotoperiodo y la temperatura ambiental. La regulación de la reproducción requiere fuertes ajustes temporales en los mecanismos de regulación neuroendocrina, siendo la melatonina un elemento importante. En peces, los estudios sobre los efectos de la pinealectomía y la administración de melatonina sobre la función reproductora son poco conclusivos, y dependen de la especie y la estación anual. En el carpín, la pinealectomía conduce a un pico preovulatorio de gonadotropinas, provocando la ovulación en la fase no habitual del ciclo luz/oscuridad (Kezuka et al., 1989). En cambio, en la carpa la pinealectomía no afecta ni a los niveles ni a la fase del ritmo de gonadotropinas plasmáticas (Popek et al., 1994). En salmón atlántico y trucha arco iris tratados con implantes de liberación constante de melatonina no se altera el momento del desove, algo que si provoca la pinealectomía, sugiriendo la importancia de los cambios rítmicos de secreción de melatonina para el ajuste temporal del desarrollo gonadal (Bromage et al., 1995; Nash et al., 1995; Randall et al., 1995). Comportamiento social y agresividad El comportamiento social de los peces es complejo, afectando a aspectos relacionados con la existencia de jerarquías sociales, comportamiento dominante27 Introducción subordinado, agresividad, cambios de pigmentación, etc. Algunos estudios muestran que la melatonina reduce las respuestas agresivas en la perca, Aequidens pulcher (Munro, 1986). Larson et al. (2004) demostraron que los peces socialmente subordinados poseen niveles nocturnos de melatonina más altos y niveles de cortisol similares a los peces no estresados. Melatonina y pigmentación dérmica Los vertebrados poiquilotermos pueden presentar una adaptación cromática al ambiente, principalmente debido a la luz, el color del fondo y al comportamiento social. La melatonina normalmente produce aclaramiento dérmico de anfibios, reptiles y teleósteos. En la trucha arco iris el órgano pineal contiene los osciladores que controlan los ritmos circadianos de cambios de color, interrumpiéndose estas variaciones al realizar una pinealectomia (Hafeez y Quay, 1970). En el pez lápiz, Nannostomus beckfordi anomalus, los melanóforos también responden diferencialmente a la melatonina, de forma que los responsables de la coloración diurna muestran agregación pigmentaria, mientras que los implicados en la coloración nocturna sufren un efecto dispersor del pigmento (Reed, 1968). Efectos sobre la ingesta y el metabolismo La melatonina puede afectar al crecimiento y la alimentación en los peces. La respuesta varía según la especie, el estado fisiológico del pez y cómo se administre la hormona. En Salmo salar en etapa de parr, los implantes de melatonina llevan a un incremento del peso corporal (Porter et al., 1998), mientras que en la trucha reduce su tasa de crecimiento (Taylor et al., 2005). En el carpín la administración de melatonina en peces mantenidos bajo fotoperiodo corto conlleva una ganancia en peso y tasa de crecimiento (De Vlaming, 1980), mientras que la administración aguda produce un descenso de la ganancia de peso (De Pedro et al., 2008). Estos efectos de la melatonina sobre el crecimiento podrían resultar de la alteración en los patrones de ingesta de los peces. De hecho, los tratamientos con melatonina por vía I.P. reducen la tasa de ingesta de alimento en el carpín (Pinillos et al., 2001; De Pedro et al., 2008), de manera similar al efecto de su administración oral en la tenca (López-Olmeda et al., 2006a) y la lubina (López-Olmeda et al., 2009). Los mecanismos por los que la melatonina afecta a la ingesta no están claros. Se ha postulado que parte de sus acciones serían periféricas dado que se observan tras el tratamiento i.p. pero no intracerebroventricular (Pinillos et al., 2001). También se ha observado que la melatonina modifica el patrón de selección de macronutrientes de la dieta de los peces (Rubio et al., 2004). Por otra parte, se han descrito efectos de la pinealectomía y de la administración de melatonina sobre el metabolismo lipídico y de carbohidratos (Soengas et al., 1998). También se ha demostrado que la hormona puede interactuar con la secreción hipofisaria de GH, provocando efectos estimuladores o inhibidores, dependiendo del estado de activación celular y dosis empleadas (Falcón et al., 2003). Acción antioxidante celular e inmunidad 28 Introducción El estrés oxidativo de los procesos metabólicos que generan radicales libres es un factor que afecta a la actividad celular, provocando inactivación de enzimas, daño del material genético y peroxidación lipídica. Diversos estudios señalan que la melatonina es un potente agente antioxidante con capacidad intrínseca para actuar directamente sobre los radicales libres, provocando su neutralización (Ianas et al., 1991; Tan et al., 1993; Ouyang, 1998). Además, diversos estudios in vivo e in vitro han demostrado que la melatonina puede estimular la actividad de otros sistemas antioxidantes, contribuyendo de forma indirecta a reducir el estrés oxidativo (De Lastra et al., 1997; Kotler et al., 1998; Cabeza et al., 2001; Antolin et al., 2002; Mayo et al., 2002). La melatonina también podría ser altamente eficaz para reducir los niveles de oxidación lipídica, tanto basales como estimulados por diversos mecanismos oxidativos (Reiter et al., 2003). Por otro lado, la existencia de sitios de unión específicos para melatonina en los linfocitos sugiere un efecto regulador directo sobre el sistema inmune (García-Pergeñeda et al., 1997). Se ha propuesto que la melatonina ejerce efectos inmunoestimuladores en roedores (Guerrero et al., 2000). En los peces se ha sugerido una acción similar en dorada, Sparus aurata (Cuesta et al., 2008). 3. LA MELATONINA EN EL TRACTO GASTROINTESTINAL 3.1. Relaciones serotonina-melatonina en el TGI. Como ya se mencionó previamente, la regulación del funcionamiento del TGI es muy compleja e implica numerosos factores nerviosos y endocrinos cuyas relaciones funcionales son todavía desconocidas. La melatonina ha adquirido cierta notoriedad en los últimos años como potencial señal moduladora de las funciones adscritas al TGI (Bubenik, 2002), en gran medida debido a la existencia de estudios demostrando la presencia de elevadas cantidades de hormona en el TGI, habiéndose postulado este tejido como su principal fuente periférica (Huether, 1993). Por otro lado, algunas investigaciones han llevado a sugerir un papel regulador de las funciones digestivas por la melatonina (Bubenik, 2002). Sin embargo, poco se sabe de los mecanismos básicos que regulan su presencia en el TGI, en particular respecto a su síntesis y su regulación intrínseca y por factores ambientales. La síntesis de melatonina tiene lugar a partir de la 5HT, una indolamina de amplia distribución en el organismo y con importantes funciones como transmisor en el SNC y en el intestino, donde podría actuar además como un regulador endocrino/paracrino (Olsson y Holmgren, 2001). A nivel periférico, la presencia de 5HT es muy extensa en diferentes tejidos como la sangre, pulmón, riñón, corazón y, sobre todo, el TGI, donde el ambiente externo, señales neurohormonales y factores metabólicos afectan a su concentración (Bertrand y Bertrand, 2010). En el tracto digestivo, algunos estudios proponen una relación funcional entre la 5HT y la melatonina, más allá de la estricta relación metabólica 29 Introducción (Bubenik. 2002; Matheus et al., 2010). Por ello, en este apartado se abordan los principales hitos alcanzados en los estudios que se han llevado a cabo en mamíferos y peces en relación a la 5HT y la melatonina en el TGI. 3.2. La serotonina: Aspectos básicos de su metabolismo y regulación La 5-hidroxitriptamina (5HT; Figura 9) posee una amplia actividad biológica en vertebrados (Baumgarten y Grozdanovic, 1997). Inicialmente su presencia fue descrita en el suero sanguíneo y el intestino, mostrándose además como un potente agente vasoconstrictor, por lo que se le atribuyó un papel como hormona periférica (Rapport et al. 1948a,b). Más tarde se constató el papel de la 5HT como neurotransmisor tanto a nivel central como periférico, estableciéndose su relación con procesos tales como el apetito, la temperatura corporal, el sueño, el comportamiento sexual y la motilidad intestinal, entre otros (Twarog y Page 1953; Amin et al. 1954). La 5HT está presente en altas concentraciones también en la glándula pineal, donde sirve como precursor de la melatonina (Quay et al., 1967; Snyder y Axelrod, 1965). Figura 9. Estructura química de la 5HT y su disposición tridimensional. Metabolismo de la serotonina El metabolismo de la 5HT es bien conocido a nivel neuronal. Se sintetiza a partir del aminoácido neutro esencial L-Triptófano (Figura 10), que es captado al interior celular por un mecanismo de transporte activo de aminoácidos neutros. El L-Trp es hidroxilado a 5-hidroxitriptófano (5HTP) por la enzima citoplasmática triptófano hidroxilasa (EC 1.14.16.4, TPH), que requiere de O2, Fe2+ y el cofactor tetrahidrobiopterina (BH4) para su funcionamiento. Este paso es considerado como limitante de la ruta biosintética de la 5HT (Friedman et al., 1972) y un punto importante en la regulación de su liberación neuronal (Auerbach et al., 1989). A continuación el 5HTP es transformado a 5HT mediante la acción enzimática aminoácido aromático descarboxilasa (EC 4.1.1.28; AADC), que requiere piridoxal fosfato como cofactor. Esta transformación es inmediata, por lo que los niveles de 5HTP son muy bajos en condiciones normales (Tison et al., 1991). De forma similar a otras monoaminas, la 5HT se acumula dentro de las neuronas en estructuras 30 Introducción granulares o vesículas sinápticas, formando complejos con proteínas tales como la ―serotonin-binding protein‖ (SBP), cationes divalentes y ATP (Kruk y Pycock, 1991). La liberación neuronal de 5HT ocurre por dos mecanismos: i) en respuesta a la despolarización presináptica mediante mecanismos exocitóticos Ca2+-dependientes, ii) por un mecanismo dependiente del transportador de recaptación de 5HT, sensible a inhibidores, no exocitótico, independiente de Ca2+ y modulado por autorreceptores que actuaría desde el citoplasma hacia el espacio extraneuronal (Levi y Raiteri, 1993). Figura 10. Ruta biosontética y de degradacion de la serotonina.(Modificada de Gesto, 2008). La 5HT sináptica es recaptada por la proteína transportadora de serotonina (SERT), presente a nivel central y periférico (Gershon, 2004), finalizando su acción neurotransmisora y siendo, por tanto, un punto de modulación de la señal serotoninérgica (Wang et al., 2006). El proceso de recaptación requiere de energía en forma de ATP y un gradiente electroquímico de Na+ y Cl+ (von Bohlen und Halbach y Dermietzel, 2002). La metabolización de la 5HT es intracelular y se produce básicamente mediante desaminación oxidativa por la enzima citoplasmática monoamina oxidasa (MAO), de la que existen dos formas, MAO-A y B, con distinta preferencia por sustratos. En teleósteos 31 Introducción se ha sugerido la existencia de una única forma de MAO (Senatori et al., 2003). El aldehído resultante de la desaminación es altamente reactivo, pudiendo oxidarse a 5HIAA por la acción de la aldehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.3) o reducirse a 5-hidroxitriptofol por la aldehído reductasa (EC 1.1.1.21). Otras rutas menores de metabolización de la 5HT neuronal son la formación de conjugados sulfatados y glucorónicos. Además, las células que producen melatonina metabolizan la 5HT mediante N-acetilación. En circunstancias normales la ruta metabólica principal de la 5HT lleva a la formación de 5HIAA, su principal metabolito inactivo. Mediante el empleo de técnicas de microdiálisis cerebral in vivo en roedores se ha observado que la despolarización y el nivel de actividad neuronal afectan a los niveles neuronales de 5HIAA, pudiendo reflejar cambios en la cantidad de neurotransmisor recaptado desde la hendidura sináptica. Si bien la formación de 5HIAA depende de la recaptación de 5HT, una cierta cantidad parece provenir de la 5HT sintetizada de novo que permanece algún tiempo en el citoplasma antes de ser almacenada en vesículas, siendo accesible a la degradación por la MAO (Auerbach et al., 1989; Thorré et al., 1996; Paz-Valiñas et al., 2002). La relación entre los niveles de 5HIAA y 5HT (5HIAA/5HT) ha sido usada en algunos estudios como un indicador de la tasa de actividad y liberación de las neuronas serotoninérgicas (Datla y Curzon, 1996; Stenfors y Ross, 2002). El uso de esta relación es más frecuente en vertebrados donde no es posible monitorizar la actividad neuronal in vivo, como es el caso de los peces (Winberg y Lapage, 1998; Ruibal et al., 2002; Gesto et al., 2009). Regulación de la síntesis y liberación de 5HT Como ya se mencionó, la TPH es limitante y el punto de regulación para la síntesis de 5HT. De hecho, al inhibir su actividad la concentración de 5HT decrece inmediatamente, lo que no ocurre cuando se inhibe en magnitud similar la AADC. La disponibilidad de cofactores enzimáticos también parece limitar la actividad de la TPH (Kuhn et al., 1980). Además, existen otros mecanismos de regulación dependientes de Ca2+/calmodulina, AMPc o Ca2+-fosfolípidos, que están asociados a la fosforilación de la enzima (Ehret et al., 1989, 1991). Se ha demostrado que la estimulación nerviosa de los somas neuronales serotoninérgicos genera un aumento de la síntesis de 5HT en las terminales (Auerbach et al., 1989) mediado por el incremento de la fosforilación de la TPH. Por otro lado, la actividad de esta enzima no está sujeta a inhibición por la 5HT intracelular (Winberg et al., 2001), pero la 5HT extracelular si puede inhibir la actividad neuronal y su propia liberación actuando sobre autorreceptores somatodendríticos y/o presinápticos (De Vry, 2000). En los peces, también hay evidencias de que la TPH tiene un papel limitante en la síntesis de 5HT, concretamente en el hígado de Thunnus albacares (Nagai et al., 1997b), así como en trucha arco iris (Aldegunde et al., 2000). En mamíferos, existen dos genes que codifican para la enzima TPH: TPH1 (Darmon et al. 1986) y TPH2. Mientras que la expresión del TPH2 es neuronal, la del TPH1 se ha descrito como no neuronal (Côté et al., 2003; Walther et al., 2003). A nivel periférico, la 32 Introducción 5HT es sintetizada por la TPH1, que se expresa fundamentalmente en las células enterocromafines (CE) del TGI (Côté et al., 2004). Existen diferencias entre la enzima cerebral y la intestinal. Así la TPH cerebral (TPH2) nunca hidroxila D-Trp, algo que sí hace la intestinal (Côté et al., 2004), aunque a una tasa que supone tan solo un tercio respecto a la tasa de hidroxilación del L-Trp (Tyce, 1990). Otro factor de gran importancia en la regulación de la tasa de síntesis de 5HT es la cantidad de L-Trp disponible en el citoplasma neuronal (Kruk y Pycock, 1991; Winberg et al., 2001), que depende de la concentración de L-Trp circulante a resultas de sus cantidades ingeridas en la dieta y de su tasa de captación por el cerebro y las terminales nerviosas. La captación del L-Trp al interior de las neuronas serotoninérgicas puede disminuir ante elevadas concentraciones en plasma de otros aminoácidos neutros de cadena larga (L-valina, L-tirosina, L-alanina, L-fenilalanina, L-leucina, L-isoleucina y L-metionina) ya que compiten con el Trp en su unión al transportador (Fernstrom y Wurtman, 1972; Pardridge, 1977). Se ha demostrado que la modificación de los niveles de L-Trp en la dieta y/o su inyección alteran los niveles cerebrales de 5HT y de su metabolito ácido, el 5HIAA (Fernstrom y Wurtman, 1972; Gibson, 1985), así como la liberación de 5HT a la hendidura sináptica (Sharp et al., 1992; Thorré et al., 1996). En condiciones fisiológicas normales la actividad del enzima TPH no alcanza la saturación (Tyce, 1990; Winberg et al., 2001). En otros vertebrados la síntesis de 5HT también parece depender de los niveles circulantes de L-Trp. En los peces, donde la mayoría del L-Trp plasmático está en forma libre (Rozas et al., 1990), parece que las características de su transporte al cerebro son similares a los mamíferos (Aldegunde et al., 1998) y que tanto la administración de Trp en la dieta y la propia alimentación, pueden alterar el metabolismo cerebral de 5HT (Jonhston et al., 1992; Aldegunde et al., 1998). Además, la administración sistémica de L-Trp aumenta la tasa de síntesis de 5HT en el cerebro de la trucha arco iris (Aldegunde et al., 1998; 2000). 3.3. La serotonina intestinal: localización, regulación e implicaciones fisiológicas En mamíferos se ha estimado que más del 90% del contenido total de 5HT del organismo es sintetizado, almacenado y liberado desde las células enterocromafines (CE) intestinales (Erspamer, 1954; Forsberg y Miller, 1983; Legay et al., 1983; Gerson y Tack, 2007). En menor medida, la 5HT se localiza en neuronas que inervan el intestino, sobre todo en el plexo mientérico neuronal (Gershon et al., 1977; Costa et al., 1982). Las CE se encuentran dispersas en el epitelio intestinal (Figura 10) y forman poblaciones de células neuroendocrinas que a su vez integran varias subpoblaciones diferenciables según la forma, la presencia de gránulos de secreción y las terminaciones luminales (Gustafsson et al., 2006). Las CE contienen numerosos gránulos electrón-densos que almacenan la 5HT (Polak et al., 1976; Mourre et al., 1981; Ahlman y Dahlström, 1982; 33 Introducción Nemoto et al., 1982), así como un mecanismo de captación de 5HT de alta afinidad (SERT) comparable al del cerebro (Mourre et al., 1981; Ternaux et al., 1981; Legay et al., 1983). Pero además, las CE pueden sintetizar 5HT, demostrarondose mediante estudios farmacológicos (Grübe, 1976; Legay et al., 1983) y moleculares (Coates et al., 2004) la presencia de actividad TPH. Al igual que a nivel neuronal, la hidroxilación del Trp parece ser el paso limitante de la síntesis de 5HT en las CE (Legay et al., 1983b). Bertrand y Bertrand (2010) señalan para el intestino que la 5HT de nueva síntesis se almacena en gránulos o vesículas, proceso mediado por un transportador vesicular de monoaminas (VMAT1) (Figura 11). La liberación de 5HT contenida en ellos ocurre sobre todo en la zona basal de la CE, pero también podría darse en la zona apical (Nilsson et al., 1987). Figura 11. Funcionamiento de la producción y recaptación de la serotonina en una célula enterocromafín (Tomado de Bertrand y Bertrand, 2010). EC cell: Célula enterocromafin; Tryp: triptófano; 5-HTP: 5-hidroxitriptófano; 5-HT: serotonina; Epithelial cell: célula epitelial; Vesicle: vesícula; 5-HT transporter (SERT, HHT): transportadores de 5HT; Vesicular transporter (VMAT1): transportador vesicular. Las altas concentraciones de 5HT presentes en las CE sugieren su papel como almacen (pool) de 5HT. Se ha sugerido que funcionalmente podrían coexistir 2 pooles, uno más grande con 5HT almacenada, procedente sobre todo de la recaptación y con baja tasa de liberación, y otro más pequeño, derivado principalmente de nueva síntesis y más accesible a su liberación extracelular (Simon y Tenaux, 1990). Los depósitos de 5HT intestinal pueden alterarse por la administración de dietas enriquecidas y carentes de Trp, o farmacológicamente mediante inhibidores de TPH, MAO y SERT, o con reserpina, fármaco que causa el vaciado de los depósitos de 5HT (Furness y Costa, 1987; Gershon, 34 Introducción 2003; Van Nieuwenhoven et al., 2004). Aunque se ha demostrado la presencia de MAO en las CE, los niveles de 5HIAA intestinal son bajos (Legay et al., 1983), probablemente porque es retirado rápidamente del intestino. La administración de inhibidores de la recaptación provoca un aumento de la concentración de 5HT intestinal y la disminución de 5HIAA en el flujo portal. Por ello se propuso que gran parte del 5HIAA procede de la recaptación de la 5HT previamente liberada (Schrwörer et al., 1987). La distribución de 5HT en el intestino varía dependiendo de las especies y del segmento intestinal, probablemente reflejando diferencias en la anatomía, la alimentación y el ambiente microbiano. Por ejemplo, en humanos la mayor presencia de 5HT se adscribe al duodeno, en la rata predomina en el colon y en aves se distribuye de manera regular en el TGI (Hansen y Witte, 2008). La concentración de 5HT también varía con las capas de la pared intestinal, siendo unas 100 veces más elevada en la mucosa que en la pared muscular. La distribución de neuronas serotoninérgicas también es variable, con mayor presencia en el plexo mientérico y muy escasas en la mucosa (Kurian et al., 1983). Las CE pueden liberar 5HT tanto al lumen intestinal como al torrente sanguíneo (Ahlman y Dahlström, 1982), aunque es más probable su liberación hacia el espacio basolateral y la circulación portal. La liberación podría ser mediada por mecanismos exocitóticos dependientes de AMPC y de la entrada de Ca2+ a través de múltiples canales de membrana (Forsberg y Miller, 1983) y estar condicionada por diversas señales neuronales y no neuronales. Así, la estimulación vagal incrementa la liberación de la 5HT enterocromafín, posiblemente mediado por receptores β-adrenérgicos (Petterson et al., 1979; Ahlman y Dahlström, 1982; Racké et al., 1988), mientras que la estimulación -adrenérgica inhibe su liberación (Racké et al., 1988). La ACh produce la liberación de 5HT, mediada por receptores muscarínicos y nicotínicos (Forsberg y Miller, 1982). Diversas señales no neuronales, como VIP e histamina, inhiben la liberación de 5HT, mientras que otros como el ácido--amino butírico (GABA) y los péptidos opioides estimulan dicho proceso (Schwörer et al., 1989). Fisiológicamente, el estímulo luminal principal para la liberación de 5HT desde las CE parece ser mecánico, debido a la distensión intraluminal que se produce en respuesta a la presión que ejerce el bolo alimenticio sobre la pared intestinal (Bertrand y Bertrand, 2010). Sin embargo la estimulación química (ej., cambio de pH, soluciones hiperosmóticas, ácidos biliares y glucosa) parece ser importante, determinando la cantidad de 5HT liberada al lumen intestinal (Smith et al., 2006). En los peces, hay evidencias de la presencia de CE en estómago e intestino de varias especies de teleósteos (Read y Burnstock, 1968; Watson, 1979; Burkhardt-Holm y Holmgren, 1989). En la trucha arco iris se encontraron CE en el estómago, pero no en el intestino (Read y Burnstock, 1968; Anderson y Campbell, 1988). Algunos estudios inmunohistoquímicos han mostrado una distribución topográfica diferencial de las CE en 35 Introducción el intestino de varias especies de teleósteos (Holmgren, 1989; Beorlegui et al., 1992), lo que probablemente esté relacionado con diferentes hábitos de alimentación. Las referencias a la 5HT intestinal son mucho más escasas en peces que en mamíferos, aunque se han propuesto una gran variedad de acciones fisiológicas para esta amina (Nilsson, 1983). Se ha demostrado la existencia de células endocrinas conteniendo 5HT en el TGI de varias especies, tales como el híbrido del pargo y dentón (Dentex dentex x Pagrus major, Radaelli et al., 2001), la perca koreana (Coreoperca herzi; Lee et al., 2004), la anguila (Anguilla anguilla, Domeneghini et al., 2000), el carpín y la tilapia (Oreochromis mossambicus) (Kiliaan, et al., 1989, 1997). En algunas de estas especies la presencia de 5HT se limita a las abundantes células endocrinas de la mucosa intestinal, sin evidencias de una asociación con neuronas. No obstante, en otras especies, tales como el carpín y la tilapia existen numerosos cuerpos neuronales y fibras nerviosas varicosas inmunoreactivos a 5HT, asociados al plexo mientérico (Anderson y Campbell, 1988). En Platycephalus bassensis, especie carente de CE, se ha señalado que toda la 5HT presente en el intestino sería de origen neuronal. Con respecto a la trucha arco iris, en la que la presencia de CE asociadas a la capa de mucosa es escasa, parece poseer una rica inervación serotoninérgica que alcanza el epitelio de la mucosa intestinal (Read y Burnstock, 1968; Anderson, 1983; Anderson y Campbell, 1988, Beorlegui et al., 1992). Por todo ello se ha propuesto que las CE podrían estar ausentes del intestino, solo en aquellas especies que presentan inervación serotoninérgica abundante de la mucosa, que correspondería a motoneuronas que regulan la musculatura circular y el epitelio mucoso (Anderson y Campbell, 1988). También se ha indicado la existencia de una distribución topográfica de las neuronas serotoninérgicas en el TGI, con disminución en sentido distal (Balashov et al., 1992). Los estudios de Anderson et al. (1991) mostraron por primera vez en intestino aislado que las neuronas entéricas del teleósteo Platycephalus bassensis podrían sintetizar 5HT a partir de L-Trp y liberarla probablemente como sustancia transmisora. La liberación de 5HT, pero no la de 5HIAA responde a la estimulación eléctrica, siendo esta inhibida por TTX y la omisión de Ca2+. Asimismo, presentaron pruebas de que la fluoxetina (inhibidor de la captación de 5HT) incrementa la liberación espontánea de 5HT y la inducida eléctricamente, mientras que la reserpina reduce los niveles tisulares de 5HT y 5HIAA, así como la liberación espontánea y evocada de la amina. Mas recientemente, Caamaño-Tubio et al. (2007) muestran que la trucha arco iris posee elevadas concentraciones de 5HT intestinal, localizadas mayoritariamente en la pared muscular, por lo que proponen que las células que contienen 5HT en la trucha se corresponderían con fibras nerviosas serotoninérgicas ubicadas en las capas musculares de la pared intestinal. Funciones de la 5HT en el TGI La 5HT puede participar en una amplia variedad de acciones fisiológicas diferentes, que afectan sobre todo a los procesos de secreción y motilidad asociados al tracto 36 Introducción digestivo. En mamíferos se ha demostrado que la 5HT podría ser un potente estimulador de la secreción de electrolitos y moco al lumen intestinal, así como de la secreción de bicarbonato desde la mucosa duodenal en respuesta al ácido gástrico (Hansen y Witte, 2008), sugiriéndosele un papel como señalizador sensorial de los procesos intraluminales y protector de la mucosa gástrica. Los efectos secretores intestinales de la 5HT parecen ser mediados por receptores epiteliales tipo 5HT2 y probablemente por receptores neuronales de los tipos 5HT1b, 5HT3 y 5HT4 (Gershon, 2003; Gerson y Tack, 2007). Con respecto al control de la motilidad intestinal, la 5HT actuaría como modulador del patrón cíclico de motilidad originado por los complejos motores migratorios (Plaza, 2001). Así, las acciones más destacadas de la 5HT implican aumento de la contractilidad del TGI, interviniendo los receptores del tipo 5HT2a presentes en las células musculares lisas y los 5HT3 y 5HT4 que estarían predominantemente en neuronas colinérgicas (Briejer et al., 1995; Woollard et al., 1994). La 5HT también puede producir relajación de la pared intestinal mediante la liberación de neurotransmisores inhibidores, o por efectos directos sobre las células musculares. Se ha sugerido que los receptores 5HT2-like, 5HT4 y/o 5HT7 podrían mediar esta acción relajadora (Briejer et al., 1995). En los peces la 5HT también es un importante modulador de la contractilidad intestinal, con efectos predominantemente estimuladores en la mayoría de las especies de peces, incluyendo ciclóstomos, elasmobranquios y teleósteos (Johnels y Östlund, 1958; Young, 1980, 1982; Nilsson y Holmgren, 1983; Jense y Holmgren, 1994; Velarde et al., 2010b). En la trucha arco iris, se ha sugerido que los receptores involucrados en la contracción muscular son los 5HT2, ya que ni los antagonistas 5HT1 ni los 5HT3, modificaron la respuesta contráctil inducida por 5HT (Burka et al., 1989). Además, en esta especie el efecto de la 5HT puede ser directo sobre la musculatura lisa. En contraste, la estimulación de neuronas colinérgicas podría mediar parcialmente el efecto intestinal de 5HT en otros teleósteos (Jensen y Holmgren, 1991). Estudios recientes en el carpín han demostrado que la contracción inducida por 5HT es bloqueada por metisergida, un antagonista general de receptores de 5HT. También la presencia de atropina (antagonista de receptores muscarínicos) bloquea la respuesta intestinal a la 5HT, sugiriendo la implicación de la transmisión colinérgica (Velarde et al., 2010b). Sin embargo, estudios previos en la trucha arco iris muestran que ni la atropina ni la TTX afectan la contractibilidad generada por 5HT (Grove y Campbell, 1979; Holmgren et al., 1985), en contra de lo visto en el bacalao (Burka et al., 1989; Grove y Holmgren, 1992a). Por tanto, existen diferencias inter-específicas en los mecanismos que integran la respuesta serotoninérgica en el intestino, pudiendo variar dependiendo de las características anatomo-funcionales (ej., presencia/ausencia de estómago) o de la dieta de cada especie. 37 Introducción 3.4. La melatonina en el TGI: presencia, origen y distribución La melatonina fue detectada por primera vez en el TGI mediante cromatografía de papel en mucosa inflamada del apéndice humano (Raikhlin y Kvetnoy, 1974; 1976). Posteriormente, empleando técnicas inmunohistológicas se confirmó su presencia en todos los segmentos del TGI de roedores, incluyendo esófago, estómago y diferentes regiones intestinales (Bubenik et al., 1977; Holloway et al., 1980). Las primeras mediciones que se llevaron a cabo mediante RIA (Vakkuri et al., 1985; Bubenik, 1980) revelaron la existencia de elevadas concentraciones de melatonina en el TGI de roedores y aves, sobrepasando ampliamente (de 10 a 100 veces) las halladas en el plasma. Estudios posteriores con la misma técnica (Bubenik y Brown, 1997; Bubenik et al., 1999) y con HPLC (Huether et al., 1992; Huether, 1994) confirmaron dichos resultados. Comparado con la glándula pineal, se estimó que la concentración de melatonina en TGI sería del orden de unas 20 veces más baja (Messner et al., 2001), aunque la cantidad total de melatonina producida en el TGI podría ser 400 veces mayor que la presente a nivel pineal (Huether, 1993). El origen de la melatonina presente en el tejido gastrointestinal permaneció en entredicho durante años, barajándose la posibilidad de una síntesis local in situ, frente a otros estudios que apoyaban la idea de que la melatonina de origen pineal secretada a la circulación periférica podría acumularse en el TGI. De hecho, en estudios donde se administró melatonina por vía peritoneal y oral se halló un aumento de los niveles de la hormona en el TGI, lo que fue interpretado como un papel de dichos tejidos como reservorio de melatonina, especialmente de aquella sintetizada en la glándula pineal (Bubenik, 1980; Huether et al., 1998; Messner et al., 1998). No obstante, varios estudios con animales pinealectomizados parecen indicar que al menos parte de la melatonina presente en el intestino podría ser de formación local e independiente de la de origen pineal. Así, en aves y ratas, la pinealectomía reduce los niveles de melatonina en plasma, pero no los de melatonina en el intestino (Bubenik, 1980; Bubenik y Brown, 1997; Van`t Hof y Gwinner, 1999). Adicionalmente, en ratas tratadas oralmente con Trp se hallaron incrementos de unas 6 veces en los niveles de melatonina en el órgano pineal y de unas 10 veces en el intestino y el hígado (Bubenik, 2006). En esta situación, la pinealectomía reduce los niveles de melatonina en el plasma sin afectar a los presentes en el tejido intestinal, lo que indirectamente apoya la existencia de una síntesis activa de la hormona en el propio TGI, que es inducida por el aminoácido precursor (Yaga et al., 1993). Otro dato que respalda fuertemente esta posibilidad es la presencia de las dos enzimas finales del proceso de formación de la hormona (AANAT y HIOMT), que ha sido demostrada inicialmente por métodos enzimológicos en la mucosa digestiva (Quay y Ma, 1976) y más recientemente mediante técnicas moleculares que han permitido evaluar la expresión de AANAT en numerosos tejidos periféricos, incluidos el estómago y el intestino de la rata (Stefulj et al., 2001). El contenido de melatonina en el TGI varía tanto entre especies como entre las diferentes regiones digestivas. Por ejemplo, en la rata las concentraciones más bajas se 38 Introducción encontraron en yeyuno e íleon, siendo más altas en el ciego y todavía mayores en colon y recto (Bubenik et al., 1977). Mientras, en el ratón los mayores niveles fueron encontrados en el estómago, seguido del íleon, yeyuno y colon (Bubenik et al., 1992). En fetos bovinos las mayores concentraciones de melatonina GI, se encontraron en el colon en comparación con el resto de los segmentos estudiados (Bubenik et al., 2000a), mientras en adultos no se hallaron diferencias antero-posteriores (Bubenik et al., 1999). Sin embargo en el cerdo, se encontraron valores más elevados en el intestino posterior (ciego y colon) que en el anterior (Bubenik et al., 1999). Las variaciones regionales de las concentraciones de melatonina en el TGI y la variabilidad interespecífica indican que, aún estando presente en todos los segmentos del TGI, sus niveles podrían tanto estar sometidos a influencias reguladoras diversas y de diferente origen. A nivel de circulación digestiva, los niveles de melatonina fueron más elevados en la vena portal que en la circulación sistémica, siendo incrementados tras administrar Trp, mientras que el ligamiento parcial de la vena hepática los redujo en el TGI de la rata (Huether et al., 1992). Los primeros estudios histológicos realizados en humanos y otros mamíferos (perro, rata, ratón) para localizar la melatonina el TGI señalaron una presencia preferente de la hormona en las CE (Raikhlin y Kvetnoy, 1974; Bubenik et al., 1977; Raikhlin et al., 1978), las cuales pueblan densamente el epitelio de la mucosa intestinal y producen el 95% de la 5HT intestinal. Dada la relación metabólica entre melatonina y 5HT se asume en mamíferos que estas células son la principal fuente de producción de melatonina intestinal (Kvetnoy et al., 2002; Konturek et al., 2007). A pesar de estos resultados, no hay trabajos actuales que colocalicen con precisión melatonina y serotonina en el TGI ni que muestren una distribución tisular específica de la síntesis de la hormona dentro de la pared digestiva. Bubenik et al., (1999) en estudios en tracto digestivo de vacas y cerdos, mostraron la presencia de melatonina en las capas mucosa y muscular, aunque con valores mayores en la primera. También demostraron la presencia de una elevada cantidad de melatonina (altamente lipofílica) en el fluido luminal, la cual podría proceder de su vertido desde el tejido al lumen e incluso, en parte, ser producida por la flora microbiana intestinal. En los peces, estudios iniciales de Gern et al. (1986) no detectaron melatonina en el intestino de la trucha arco iris, relacionando este hecho con la baja presencia de células que contienen serotonina en el TGI de los peces en comparación con los tetrápodos. Sin embargo, Bubenik y Pang (1997) aportaron las primeras evidencias de la presencia de melatonina en todos los segmentos del TGI de esturiones, carpas y trucha arco iris, indicando que algunas de estas especies poseen la capacidad de convertir 5HT en melatonina. Estos autores hallaron la mayor concentración de melatonina en el intestino proximal de las tres especies, seguido del intestino distal, el esófago y el estómago. Estudios in vitro más recientes de Lepage et al. (2005a) en intestino de trucha arco iris muestran que la melatonina es producida in situ en el tejido intestinal y que dicho proceso no sufre inhibición por producto (melatonina acumulada en el medio de cultivo). Asimismo, nuestro grupo ha demostrado, por primera vez en los peces, la presencia en el 39 Introducción TGI de la trucha arco iris del transcrito de la enzima AANAT2 (Fernández-Durán et al., 2007). En este trabajo se pudieron localizar los productos de expresión del gen en la mayor parte de las regiones del TGI (esófago, estómago, ciegos pilóricos e intestino proximal, medial y distal) y su expresión diferencial en la pared muscular y la capa mucosa. Este hecho puede resultar relevante para comprender el origen de la hormona a nivel gastrointestinal, facilitando la compresión de sus mecanismos de regulación. Además, Velarde et al. (2010a) observaron tanto la presencia de los transcritos de AANAT2 y HIOMT2 en el intestino del carpín, como la existencia de ritmos diarios de su expresión en intestino posterior e hígado, que dependieron de las condiciones de luz ambiental. Por último, Velarde (2010) describió en su tesis doctoral las características enzimáticas de la AANAT en el intestino y el hígado del carpín, viendo una fuerte presencia de AANAT1 en función de sus preferencias por el sustrato, variaciones día/noche (mayor actividad durante el día) y un patrón regional en la distribución de dicha actividad enzimática en el intestino. Conviene señalar, también, que aunque en peces se sabe que la 5HT está presente y ejerce importantes funciones reguladoras en el intestino (Caamaño-Tubio et al., 2007), no existen estudios concretos que relacionen la presencia de melatonina con células que contienen 5HT, ni que profundicen en la relación metabólica entre ambos indoles. 3.5. Regulación de la síntesis de melatonina gastrointestinal Los estudios de regulación de la síntesis de melatonina en el TGI se han centrado en la existencia de variaciones diarias en su contenido y la influencia del alimento, considerando de este último diferentes aspectos relacionados con la ingesta, el paso del alimento por el tracto digestivo y la influencia del aminóacido L-Trp, entre otros. Con respecto a las existencia de ritmos diarios en los niveles de melatonina en TGI, los resultados varían en función de la especie y de la región del TGI estudiada (Vakkuri et al., 1985; Bubenik et al., 1992; Bubenik y Brown, 1997; Bubenik et al., 1998). Por ejemplo, Bubenik (1980) no observó cambios diarios significativos en los niveles de melatonina en TGI de la rata, mientras que en el ratón se describieron variaciones día:noche en yeyuno (mayor concentración durante la noche) pero no en otras regiones intestinales (Bubenik et al., 1993). En los peces no existen referencias sobre ritmos de melatonina intestinal, si bien Velarde et al. (2010a) describen ritmos diarios de expresión de AANAT2 y de HIOMT2 en intestino posterior e hígado del carpín. Los ritmos de expresión de AANAT2 en intestino posterior no se alteraron en condiciones de luz y oscuridad constante, sugiriendo su dependencia de un oscilador circadiano periférico. No obstante, no hay pruebas claras que indiquen que ello pueda condicionar la aparición de variaciones rítmicas de melatonina intestinal, ni de cómo pueden verse afectados los niveles plasmáticos de la hormona. Otro posible factor regulador de la síntesis de melatonina en el TGI es el alimento. Bubenik et al., (1992) observaron que en ratones ayunados durante 24 y 48 horas aumentó 40 Introducción el contenido de melatonina en estómago e intestino (especialmente en colon), así como en el plasma sanguíneo, mientras que disminuían en el cerebro. Además, el ayuno provocó un aumento de los niveles de 5HT y de metabolito (5HIAA) en intestino, probablemente asociado a un incremento del contenido local de L-Trp. A nivel plasmático, el aumento de los niveles de melatonina coincide con el hallado tras la ingesta por De Boer et al. (1988) en cerdo, así como por Rice et al. (1995) en saliva de humanos. Por otra parte, en el cerdo se ha señalado que la ingesta de alimento (realimentación tras ayuno) resulta en un rápido aumento de los niveles plasmáticos de melatonina en diversos segmentos del TGI. A nivel digestivo, este efecto se asoció con el tránsito del alimento, dado que dependió del tiempo post-ingesta. Asimismo, en el íleon se encontró una relación entre el contenido luminal acumulado en el tracto y los niveles de melatonina en el tejido digestivo (Bubenik et al., 1996). La ingesta de alimento también incrementa rápidamente los niveles de melatonina en la vena porta (Huether et al., 1992; Bubenik et al., 2000b). En los peces los pocos antecedentes relativos al efecto de la alimentación señalan una tendencia a aumentar el contenido intestinal de melatonina a las 3 y 8 horas tras la ingesta en la lubina, sin cambios en su contenido biliar (Herrero et al., 2007). La composición del alimento, específicamente la presencia de L-Trp, es un factor que parece afectar a la síntesis de melatonina en el TGI. En mamíferos, la administración oral del aminoácido genera un aumento de melatonina en el TGI (Bubenik, 1980; Bubenik et al., 1998; DeBoer, 1988, Huether et al., 1992). Huether et al. (1992) demostraron que este efecto del L-Trp se reduce fuertemente tras ligadura de la vena porta, sugiriendo una dependencia del aporte nutricional del aminoácido por vía sanguínea. Por otro lado, en la trucha arco iris la dieta suplementada con L-Trp generó un aumento de los niveles plasmáticos de melatonina durante el día (Lepage et al., 2005a), lo que concuerda con el incremento en la producción de hormona en segmentos intestinales cultivados in vitro en presencia de diferentes concentraciones del aminoácido. Sin embargo, en la lubina la administración de L-Trp en la dieta no parece afectar a los niveles de melatonina intestinal, ni a los plasmáticos, aunque si aumenta los niveles plasmáticos de 5HT (Herrero et al., 2007). 3.6. Papel fisiológico de la melatonina en el TGI Receptores de melatonina Mediante técnicas de autorradiografía se detectaron sitios de unión de melatonina en el TGI de diversas especies de mamíferos y aves (Bubenik et al., 1993; Lee y Pang, 1993), mayoritariamente en la capa de mucosa y las vellosidades intestinales. No obstante, la presencia de los potenciales receptores de melatonina parece depender de la zona del TGI. Así, en rata la mayor densidad de receptores MT1 se observa en la zona del duodeno, seguido de ileón y yeyuno. En el pato ocurre algo similar siendo la densidad de receptores: 41 Introducción íleon, yeyuno> duodeno, colon> ciegos> esófago (Lee y Pang, 1993). Específicamente en humanos se han identificado sitios de unión en la mucosa de yeyuno y colon (Pontoire et al., 1993; Poon et al., 1996). Además de la capa de mucosa, también se ha descrito la presencia de sitios de unión de melatonina en las capas submucosa y muscular de la pared del TGI (Bubenik et al., 1993; Chow et al., 1996; Lee y Pang, 1993), aunque en menor número que en la mucosa. Por ello se ha propuesto que la melatonina, cuya producción en mamíferos se asocia mayormente a la capa mucosa, podría llegar a capas más profundas a través de vasos sanguíneos y actuar regulando la musculatura intestinal (Bubenik, 2001). Estudios recientes en rata muestran la distribución diferencial de dos subtipos de receptores de melatonina, MT1 y MT2, de forma que los MT1 se asociarían a la mucosa y submucosa, mientras que los MT2 se localizarían en la capa muscular (Stebelová et al., 2010). Esta distinta la ubicación de los receptores podría asociarse a diferentes funciones de la melatonina en el TGI. En peces, Kulczykowska et al., (2006) han descrito la presencia de lugares de unión de 2-[125I]Iodomelatonina en el TGI de tres especies de teleósteos (trucha arco iris, lenguado y dorada), apoyando la idea del potencial papel fisiológico de la melatonina gastrointestinal, posiblemente similar entre los vertebrados. Más recientemente, Confente et al., (2010) detectaron la expresión del receptor MT1 en el intestino del lenguado, siendo esta mayor a media noche. En el carpín, las evidencias farmacológicas utilizando antagonistas (luzindol y 4-P-PDOT) sugieren la existencia de dos subtipos de receptores melatoninérgicos, de alta y baja afinidad respectivamente (Velarde et al., 2009b). Acciones fisiológicas de la melatonina intestinal La mayor parte de los estudios sobre la función de la melatonina en el TGI se han centrado en su papel como potencial regulador de la motilidad. Ya en 1965 Quastel y Rahamimoff mostraron en estudios in vitro que la melatonina reducía las contracciones inducidas por 5HT en el duodeno de rata, lo que fue confirmado posteriormente en estómago (Fioretti et al., 1974), yeyuno e íleon (Bubenik, 1986) y algunas regiones del colon (Harlow y Weekly 1986), indicándose su dependencia del Ca2+ y su relación con mecanismos mediados por canales de K+ (Kachi et al., 1999; Storr et al., 2000). En preparaciones de musculatura lisa intestinal se ha observado que la melatonina reduce la frecuencia de contracciones espontáneas (Quastel y Rahamimoff, 1965; Bubenik, 1986; Merle et al., 2000). Otros estudios in vivo también describieron el efecto relajante de la melatonina sobre el músculo liso visceral, contrarrestando el efecto facilitador de la 5HT sobre el tiempo de tránsito del alimento en ratones (Bubenik y Dhanvantari, 1989). Algunos autores indicaron que la 5HT y la melatonina podrían ejercer una acción reguladora negativa mutua, siendo la melatonina un inhibidor natural de la 5HT en el intestino (Bubenik, 1986; Harlow y Weekly, 1986; Reyes-Vázquez et al., 1997). Sin 42 Introducción embargo, otros estudios señalan un efecto estimulador de la melatonina sobre la contractilidad intestinal (Drago et al., 2002). En peces, los estudios de Velarde et al. (2009b) en el carpín demuestran la necesaria presencia de Ca2+ en el medio extracelular para que la melatonina, de manera dosis-dependiente, relaje la contracción de la musculatura intestinal inducida por ACh. Este grupo también demostró el efecto inhibidor de la melatonina sobre la contracción de la musculatura intestinal inducida por 5HT en el carpín (Velarde et al., 2010b), asi como que los antagonistas específicos de receptores de alta afinidad de melatonina bloquearon parcialmente estos efectos. Otra vía por la cual la melatonina generaría su efecto relajante sería el sistema nitrogénico (NO), si bien no parece tan eficaz como las anteriores (Velarde et al., 2011). No existen datos concretos sobre la regulación de la motilidad intestinal por melatonina en otros teleósteos. Al margen de su papel en la motilidad, la melatonina intestinal también podría regular otras funciones digestivas, por ejemplo, estimulando la secreción de bicarbonato en el duodeno y las secreciones pancreáticas (Jaworek et al., 2004; Bubenik, 2006). Por otra parte, se ha indicado que tanto la administración de melatonina como la pinealectomía tienen influencia sobre la actividad mitótica epitelial del TGI (Bogoeva et al., 1998; Callaghan, 1991), pudiendo existir mediación vagal o simpática (Callaghan, 1995). La melatonina es un potente neutralizador de radicales libres (Stankov y Fraschini, 1993) ejerciendo por tanto una acción protectora frente al daño oxidativo. Existen diversos trabajos acerca del papel protector de la melatonina en el intestino. Por ejemplo, la melatonina aplicada intragástricamente en rata protege la mucosa contra el daño producido por sustancias como el sulfato dextrano sódico (Pentney y Bubenik, 1995). También parece ser efectiva en la prevención de úlceras gástricas inducidas por estrés o por etanol, atribuyéndosele una acción antiserotoninérgica (Otsuka et al., 2001; Melchiorri et al., 1997; Ercan et al., 2004). La melatonina también parece proteger la mucosa intestinal estimulando la secreción de bicarbonato, con la posible mediación de receptores MT2 localizados en los enterocitos (Sjoblom et al., 2001). También se ha propuesto que podría actuar mejorando la microcirculación del epitelio digestivo (Malinovskaja et al., 2001) o reduciendo la formación de productos de la peroxidación lipídica (Akbulut et al., 1997). 3.7. La melatonina en el sistema hepatobiliar El hígado es el principal lugar de metabolización de la melatonina, que es mayormente degradada a 6-hidroximelatonina (Kachi y Kurushima, 2000). Pardridge y Mietus (1980) señalan que el 92-97% de la melatonina circulante se degrada en su primer paso por el hígado, si bien estudios más recientes no confirman estos resultados si no que sugieren que una cierta cantidad de melatonina circulante puede escapar a la metabolización hepática (Huether et al., 1998; Bubenik et al., 2000a). Se han estimado en 43 Introducción el hígado concentraciones de melatonina 15 veces superiores a las del plasma (Messner et al., 2001), con niveles elevados de la hormona en los hepatocitos (Menendez-Pelaez, et al., 1993). Mediante RIA (confirmado por HPLC) se ha visto que la bilis concentrada de mamíferos posee altas concentraciones de melatonina (2 a 11 ng/ml), 2-3 veces superiores a las presentes durante el día en el plasma y 10-40 veces las observadas en la mucosa del TGI de cerdo y vaca (Bubenik et al., 1999). Por otro lado, Messner et al. (2001) han descrito niveles de hormona mucho más bajos (sobre 85 pg/ml) en la bilis no concentrada humana, similares a los detectados en plasma. No existe una clara definición de la función de la melatonina biliar si bien, debido a su alta capacidad antioxidante, podría participar en la prevención el daño oxidativo que provocan los ácidos biliares y los derivados oxidados del colesterol en la mucosa de la vesícula biliar y del TGI (Tan et al., 1999). En los peces, Herrero et al. (2007) describen la existencia de altas concentraciones de melatonina en la vesícula biliar de la lubina (desde 803 a 2287 pg/ml), la cuales no fueron afectadas por una dieta enriquecida con L-Triptófano. Sin embargo, las lubinas que recibieron alimento suplementado con melatonina presentaron niveles 40 veces superiores a los de peces alimentados con la dieta estándar (Herrero et al., 2007), indicando que la bilis podría actuar como reservorio de parte de la melatonita administrada. 4. LA TRUCHA ARCO IRIS COMO MODELO DE PEZ TELEÓSTEO Para la realización de los experimentos se ha utilizado la trucha arco iris, especie que sirve habitualmente como modelo experimental de pez teleósteo y de la que se posee abundante información sobre sus mecanismos de regulación fisiológica. La trucha arco iris (Onchorhynchus mykiss, Walbaum, 1792) es un teleósteo de la familia Salmonidae (Orden Salmoniformes) que engloba unas setenta especies de tres subfamilias, Coregoninae, Thymallinae y Salmoninae. En esta última se incluyen los géneros Brachymystax, Hucho, Parahucho, Salmo, Salvethymus y Salvelinus, además del género Oncorhynchus, si bien existe cierta controversia (Grewe et al., 1990; Phillips et al., 1992; Oakley y Phillips, 1999; Matveev et al., 2007). Incluida originariamente en el género Salmo como Salmo gairdneri, la trucha arco iris es originaria de la costa Pacífica norteamericana, habitando una franja comprendida entre el Norte de México y Alaska (Smith y Stearly, 1989). Desde 1874 se introdujo para cultivo y uso recreacional en las aguas de todos los continentes, excepto la Antártica. Así, la trucha arco iris llegó a Europa a partir de stocks importados de América a finales del siglo XIX. Presenta dos variedades conocidas como ―rainbow‖ (arco iris) y ―steelhead‖ (cabeza de acero). Esta última es la forma anádroma de la especie.Pese a que no migra de forma natural al mar puede adaptarse al medio marino, mostrando tasas de crecimiento superiores a las medidas en agua dulce. 44 Introducción Figura 12. Trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss). Debido a su resistencia relativamente elevada a altas temperaturas (óptimo de crecimiento por debajo de los 21ºC) y bajos niveles de oxígeno y a su alta tasa de crecimiento (puede pesar entre 7 y 10 Kg en el mar en tan solo 3 años frente a los 4,5 kg en agua dulce), la trucha arco iris se ha convertido en una especie de gran importancia en la industria de la acuicultura (McKay y Gjerde, 1985). Estas mismas razones, que facilitan su supervivencia en cautividad, hacen de la trucha una de las especies de peces teleósteo más empleadas en investigación científica. Se utiliza de forma habitual como modelo experimental de pez teleósteo ya que existe abundante información sobre sus mecanismos fisiológicos (Smith et al., 1991). A nivel de estudios circadianos, se conocen sus comportamientos locomotor y alimenticio, eminentemente diurnos (John, 1983; Bolliet, 2001). También es bien conocidad la fisiología del órgano pineal y de diferentes aspectos de la regulación de la producción de melatonina (Morton y Forbes, 1988; Falcón, 1999, Ceinos et al., 2005, 2008). 45 Objetivos Objetivos Objetivos En vertebrados, la síntesis de melatonina que ocurre rítmicamente en el órgano pineal y la retina es fundamental para mantener los ritmos de la hormona en plasma y su papel como potente regulador de los ritmos diarios y estacionales. Desde hace ya tres décadas han ido aumentando las evidencias sobre la existencia de una síntesis extrapineal de melatonina, muy extensa en cuanto a su localización, abarcando órganos tales como la piel, células del sistema inmune, ovario y tracto digestivo, entre otros. Específicamente en mamíferos se han realizado estudios de cierta profundidad sobre la presencia de melatonina en el TGI, su independencia de la producción pineal/retinal y la influencia que puede tener en los niveles de melatonina en el plasma (Bubenik, 2002; Konturek et al., 2007). Todos estos datos permitieron postular la existencia de una síntesis activa de melatonina en el TGI. Esta síntesis en mamíferos se asocia a las células enterocromafines del epitelio intestinal que contienen gran cantidad de serotonina, y está afectada por señales relativas al proceso de alimentación. También se han sugerido diversas implicaciones para la melatonina en la fisiología digestiva (regulación de la motilidad y secreciones, función protectora, etc.), así como en aspectos patológicos relativos al TGI (Bubenik, 2002). A pesar de ello, los mecanismos de actuación de la hormona a nivel digestivo no han sido explorados en profundidad. En vertebrados no mamíferos la información existente sobre la melatonina gastrointestinal es escasa. No obstante, hay evidencias de que la melatonina está presente en el TGI de peces (Bubenik, 1997), siendo probablemente de origen local (Lepage et al., 2005a, Fernández-Durán et al., 2007; Velarde et al., 2010a). Sin embargo se conoce muy poco de su regulación ambiental y de la interacción con factores relacionados con la actividad alimenticia y digestiva. Aunque hay estudios que demuestran un papel de la melatonina en la actividad contráctil en teleósteos, estos se limitan a una sola especie, el carpín (Velarde et al., 2009b). Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo general de la presente Tesis Doctoral es caracterizar la producción intestinal de melatonina en la trucha arco iris como modelo de pez teleósteo, así como su regulación por factores asociados al ambiente lumínico y la alimentación. Además, se estudió la implicación de la hormona en la 49 Objetivos modulación de la actividad contráctil intestinal. Este objetivo se ha desglosado en cinco líneas de actuación: 1.- Cuantificación de los niveles de melatonina en el tracto gastrointestinal de la trucha arco iris. No planteamos elaborar un método analítico sencillo de HPLC que facilite la determinación de melatonina en diferentes fluidos corporales y tejidos digestivos. 2.- Localización de los lugares de síntesis de melatonina en el TGI. En base al uso de diferentes técnicas (HPLC, qPCR, inmunohistoquímica) se pretende estudiar la distribución de los niveles de melatonina, de los enzimas de su síntesis y de las células melatoninérgicas, así como su relación con la serotonina en el TGI de la trucha. 3.- Regulación de la producción gastrointestinal de melatonina por el fotoperiodo y el alimento. En primer lugar se pretenden establecer los patrones diarios de síntesis de melatonina y la influencia del ambiente lumínico, tratando de esclarecer una posible regulación circadiana de este proceso. En segundo lugar, se pretende estudiar si la ingesta y la presencia de alimento en el TGI condicionan la síntesis de la hormona en lugares intestinales y órganos asociados a la función digestiva. 4.- Efecto del L-triptófano sobre la producción de melatonina a nivel gastrointestinal: relación entre la síntesis de serotonina y de melatonina. Con este objetivo se trata de constatar hasta qué punto la presencia de L-Trp en la dieta y/o tras su administración parenteral, puede afectar a la síntesis intestinal de melatonina. De forma adicional, se desarrollarán estudios in vitro sobre segmentos de intestino para profundizar en la relación entre los procesos de síntesis de serotonina y de melatonina a nivel celular. 5.- Estudio de la función de la melatonina sobre la contractilidad del músculo liso intestinal. Se pretende caracterizar la respuesta contráctil intestinal a la melatonina, comparándola con la que ejercen distintos agentes reguladores de la motilidad (Ach y 5HT). Además, se tratará de buscar el mecanismo de acción de la hormona a través de receptores de membrana, así como la posible interacción con otros neurotransmisores que regulan la actividad motora intestinal en la trucha. 50 Trabajos Experimentales Trabajo Experimental 1 Determinación de melatonina en plasma, bilis y tejidos del TGI de la trucha arco iris, mediante un método de HPLC con detección fluorimétrica Trabajo Experimental 1 Introducción y objetivos La melatonina (n-acetil-5-metoxitriptamina) es una hormona sintetizada en las células fotorreceptoras de la glándula pineal y de la retina en la mayoría de los vertebrados y está relacionada con la regulación de numerosas funciones que tienen en común una expresión rítmica (Reiter, 1993; Falcón, 2007). La melatonina es sintetizada a partir de la 5HT, la cual es sometida a N-acetilación y posterior metilación. En la mayoría de las especies estudiadas, el incremento de la actividad enzimática AANAT durante la noche parece ser la responsable de los ritmos diarios observados en los niveles de melatonina (Klein et al., 1996; Ceinos et al., 2005). Varios trabajos recientes han puesto de manifiesto la presencia de melatonina en tejidos periféricos y fluidos corporales, como las células del sistema inmune (Carrillo-Vico et al., 2004), la piel (Kobayashi et al., 2005; Slominski., 2008), las gónadas (Tijmes et al., 1996; Itoh et al., 1997) y el TGI (Huether, 1993; Bubenik et al., 2000a). En relación con el TGI, se ha hipotetizado que la melatonina sintetizada a este nivel podría contribuir a mantener los niveles circulantes de la hormona (Bubenik et al., 1999; Messner et al., 2001). En los humanos, también se ha detectado la presencia de melatonina en la bilis, el hígado y en la circulación portal, por lo que se ha sugerido que podría realizar una acción mediadora bidireccional entre las funciones intestinales y hepáticas (Bubenik, 2002). Además, la melatonina del TGI podría también estar implicada en la regulación de numerosas funciones, como la contracción de la musculatura lisa, la ingesta de alimento, el transporte de electrolitos, e incluso tener un efecto antioxidante debido a su capacidad como aceptor de radicales libres (Bubenik, 2002; Konturek et al., 2007). En peces pocos estudios han evaluado el contenido de melatonina en el TGI. Debido a que los niveles diurnos de melatonina son muy bajos, particularmente en el plasma, se han tenido que desarrollar metodologías analíticas más sensibles y precisas que permitan su detección. La mayor parte de los estudios existentes cuantifican la melatonina en muestras de pineal, retina y plasma mediante radioinmunoensayo (RIA), técnica altamente sensible y que también ha sido empleada para la cuantificación de melatonina en el TGI de mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces (Huether, 1993; Bubenik et al., 2000; Bubenik y Pang, 1997). Como alternativa al uso de radioisótopos, se emplearon de forma satisfactoria las técnicas de espectrometría de masas (GC-LC/MS) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, Harumi y Matsushima, 2000). Con respecto a los sistemas de HPLC, es habitual el uso de detectores electroquímicos de alta sensibilidad (Vieira et al., 1992; Harumi y Matsushima, 2000; Chanut et al., 1998). Sin embargo, ello acarrea el problema de que la oxidación/reducción de la melatonina requiere de la aplicación de altos potenciales eléctricos (0.5-1 voltio), con el consiguiente incremento del ruido de fondo, inestabilidad del sistema y disminución de la sensibilidad. El uso de detectores de fluorescencia (FD) que, aún no siendo tan sensibles como los electroquímicos, ha permitido aprovechar las características de fluorescencia naturales de dicha molécula para llegar a su cuantificación en muestras complejas (por ejemplo, plasma, 55 Trabajo Experimental 1 y tejidos centrales y periféricos). Habitualmente dichos procedimientos requieren de una extracción y concentración previa de la muestra, dado su bajo contenido en melatonina (Bechgaard et al., 1998;Kulczykowska y Iuvone, 1998; Iiunuma et al., 1999; Sastre-Toraño et al., 2000; Rizzo et al., 2002; Hamase et al., 2004), lo que suele encarecer y enlentecer el procedimiento analítico. El objetivo del presente Trabajo fue desarrollar un método de HPLC con detección fluorimétrica altamente sensible, sencillo y reproducible, a la vez que económico, que permita cuantificar la melatonina presente en fluidos (plasma y bilis) y tejidos periféricos (intestino) de la trucha arco iris. Materiales y métodos Reactivos La melatonina utilizada para la preparación de los estándares fue obtenida de Sigma (St. Louis, MO, USA). El cloroformo y el acetonitrilo (grado HPLC) fueron comprados a VWR Prolabo (Fontenay sous bois, Francia). Se prepararon soluciones stock de melatonina a una concentración de 50 ng/ml en etanol-agua (1:10 v/v) y se mantuvieron a -4ºC. A partir de esta solución se prepararon diariamente soluciones patrón a la concentración de 5 ng/ml, diluyendo en fase móvil. Animales de experimentación y recolección de muestras Para el presente trabajo se utilizaron truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss) sexualmente indiferenciadas con un peso medio de 99 ± 12 g (media ± E.E.M.). Los animales fueron obtenidos en una piscifactoría situada en Soutorredondo (Lousame, A Coruña) y se transportaron en tanques dotados de suministro continuo de oxígeno hasta las instalaciones en la Facultad de Biología de la Universidad de Vigo, donde se mantuvieron en cubas de fibra de vidrio de 120 litros, dotadas de sistemas de circulación continua de agua y difusión de aire en cada cuba. Los peces fueron aclimatados a condiciones artificiales de iluminación, 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad (L:D 12:12, encendido de las luces a las 8:00 h a.m.) y con una intensidad lumínica de 400 lux en la superficie del agua durante la fotofase. La temperatura del agua se mantuvo en 14 ± 1ºC durante todo el periodo experimental. Las truchas fueron alimentados una vez al día (11:00 h) con pienso seco comercial especial para trucha (Dibaq-142 Diproteg SA., Segovia, Spain). Todos los experimentos cumplieron con la directiva de manipulación de animales de la Unión Europea (86/609EU), así como con las leyes españolas para el uso de animales en investigación (RD 1201/2005). Para cuantificar las diferencias día: noche en el contenido plasmático y tisular de melatonina, se tomaron muestras de peces sacrificados en las horas centrales del día (1256 Trabajo Experimental 1 14h) y de la noche (23-01h). Antes de cualquier manipulación, las truchas fueron capturadas en el tanque y anestesiadas mediante inmersión en una solución de MS-222 (50mg/L) tamponada con bicarbonato sódico (500 mg/L). Tras la anestesia de los animales, se procedió a la toma de muestras, comenzando por la extracción de sangre (1ml) que se llevó a cabo por punción directa en la vena caudal, con aguja humedecida en heparina. La sangre recogida fue centrifugada a 13200 rpm durante 10 minutos, para luego separar los plasmas sanguíneos (500-600µl por pez) que fueron congelados a -80ºC hasta su posterior procesado. Una alicota (200 µl) de cada uno de los plasmas fue desproteinizada añadiendo 200 l de ácido perclórico 0.4 M, siendo posteriormente centrifugadas (13200 rpm., 10 min). Al sobrenadante obtenido se le añadió bicarbonato sódico, para ajustar su pH a 7.4, tras lo cual fue almacenado a -80ºC hasta su posterior procesado. Tras la toma de sangre, los animales fueron sacrificados mediante decapitación para extraer muestras de bilis y TGI. La bilis (0.2-0.5 ml) fue obtenida directamente de la vesícula biliar, mediante punción con jeringas. Por su parte las muestras de tejido gastrointestinal fueron extraídas en condiciones de esterilidad y lavadas con solución salina (NaCl 0.6%, p/v) a 4ºC. Inmediatamente después se separaron las diferentes regiones: esófago, estómago, ciegos pilóricos y los intestinos anterior, medio y posterior. Todas estas las muestras fueron inmediatamente congeladas en hielo seco y almacenadas a -80ºC hasta su posterior procesado. Extracción de melatonina en plasma, bilis y tracto gastrointestinal Para poder cuantificar el contenido plasmático de melatonina se realizó una doble extracción con cloroformo. Para ello, una alícuota de 200 l de cada muestra fue mezclada (1:1 v:v) con tampón acético acetato 0.1M (pH 4.6). A continuación se añadieron 2 ml de cloroformo, y se agitó la mezcla durante 1 minuto, siendo posteriormente centrifugada (3800 rpm/15 min) para separar las fases orgánica y acuosa. Tras eliminar la fase acuosa mediante aspiración, se añadieron 500 l de NaOH 0.1N y la mezcla se agitó durante 30 segundos. Tras una nueva centrifugación y aspiración de la fase acuosa, se procedió a evaporar completamente la fase orgánica restante mediante corriente de aire a temperatura ambiente, en ausencia de luz. El residuo resultante fue disuelto en 100 l de fase móvil y filtrado (0.5m de tamaño de poro, Dismic-3, Toyo Roshi Kaisha). El producto obtenido fue inmediatamente congelado a -80ºC hasta su posterior análisis. Para la cuantificación del contenido en melatonina se inyectó una alícuota (50 l) del filtrado en el sistema de HPLC. En el caso de muestras de bilis se utilizó un protocolo similar, con la salvedad de que para la extracción se utilizó una alícuota de 100 l de bilis mezclada con un volumen idéntico de tampón acético acetato. Además, solo se añadió 1 ml de cloroformo a la mezcla. 57 Trabajo Experimental 1 Para la cuantificación de melatonina en el TGI de la trucha, las muestras de cada región (40 a 50 mg) se homogenizaron mediante sonicación en 500 l de tampón acético acetato y se centrifugaron a 13200 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Una fracción de 500 l del sobrenadante se depositó en tubos de vidrio de 10 ml a los que se añadieron 2.5 ml de cloroformo (1:5 v:v). Tras un periodo de agitación de 30 segundos, la mezcla se centrifugó a 3800 rpm/15 min. La capa orgánica así obtenida fue sometida a un proceso de lavado, para lo que se añadieron 500 l de NaOH 0.1N. Tras una nueva centrifugación, la fase orgánica fue transferida a un tubo limpio y secada bajo una corriente de aire en ausencia de luz. El residuo contenido en el fondo del tubo se disolvió en 100 l de fase móvil. A continuación fue filtrado (0.5m) y congelado a -80ºC hasta su análisis. El contenido en melatonina se evaluó en una alícuota de 50 l inyectada en el sistema de HPLC. La eficiencia de la extracción fue determinada en muestras charcolizadas de plasma, bilis e intestino. Para ello, se añadieron 50 mg de charcol por ml de plasma o bilis, o del homogeneizado de intestino. Las muestras fueron agitadas durante 1 hora a 20ºC y posteriormente sometidas a estabilización durante 24 horas a 4ºC. Transcurrido este tiempo, las muestras fueron centrifugadas a 7000 rpm durante 45 minutos a 4ºC. Para eliminar los restos de charcol, el sobrenadante se filtró dos veces a través de filtros con tamaño de poro de 0.45m (Millex-HV, Millipore). Con el fin de realizar las curvas de calibración sobre muestras charcolizadas, se añadieron diferentes concentraciones de melatonina (5-500 pg/ml en plasma y bilis, y 5-200 pg/g en los tejidos intestinales) a las muestras charcolizas, procediéndose a continuación a su extracción mediante el método descrito previamente. La curva de calibración se realizó por triplicado para cada una de las concentraciones y tejidos analizados. Descripción del sistema HPLC y sus condiciones El análisis de los niveles de melatonina se realizó mediante un sistema de HPLC en fase inversa similar al descrito por Vieira et al., (1992), con modificaciones. El sistema consistió en una bomba Gilson 321 conectada a un amortiguador de pulsos, a un inyector Rheodyne 7725i (50 l) y a un detector de fluorescencia Jasco FP-1520, en el cual se fijaron longitudes de onda de excitación y emisión de 285 y 360 nm, respectivamente. La separación se llevó a cabo en una columna cromatografía Beckmann Ultrasphere ODS (75 x 4.6 mm y partículas de relleno de 3 m). La composición de la fase móvil fue acetato sódico 30 mM, ácido acético 100 mM, ácido etilen-diamino-tetra-acético (EDTA-Na2) 85.6 M y 20% de acetonitrilo (V/V). La fase móvil fue filtrada (0.20 m) y desgasificada mediante burbujeo de helio, y el pH se ajustó a 4.7. Todos los ensayos se realizaron a temperatura ambiente y a un flujo de 1 mL/min. Para su análisis, las muestras fueron filtradas, inyectándose 50 l de cada una en el sistema de HPLC. La adquisición e integración de los cromatogramas se realizó con ayuda del software Biocrom XP (Jasco analítica, Madrid). La cuantificación de los picos de la muestras se estimó mediante la comparación de las áreas de los picos con las de sus respectivos estándares. 58 Trabajo Experimental 1 Análisis estadístico de los resultados Los datos fueron expresados como la media ± error estándar (E.E.M.) (N=815/grupo). Se utilizó un análisis de varianza ANOVA de una vía (Sigma Stat v3.0) para verificar la presencia de diferencias significativas entre los grupos de muestras. En el caso de la existencia de diferencias significativas se utilizó el test SNK de comparaciones múltiples. En todos los caso, el grado de significación se estableció en P <0.05. Resultados Extracción de muestras y recuperación de la melatonina La cuantificación de los niveles de melatonina en muestras complejas, tales como sangre y otros fluidos corporales, requiere de una extracción previa que permita eliminar las interferencias y a la vez concentrar el contenido de los componentes de interés presentes en las mismas. Para ello se han descrito diversos protocolos de extracción, siendo los más habituales el uso de disolventes orgánicos y la extracción en fase sólida (SPE) empaquetada en columnas (Vieira et al., 1992). La SPE se ha mostrado como un proceso selectivo para la extracción de melatonina, aunque es más costoso económicamente que los solventes orgánicos. Además, cuando se usa sobre matrices biológicas complejas (ej., plasma, tejidos) requiere de una limpieza previa de la muestra para evitar el colapso de las columnas. También se ha indicado que la tasa de recuperación de la melatonina en cartuchos SPE es susceptible de variaciones según el fabricante y el batch de fabricación (Harumi y Matsushima, 2000). Como alternativa, la extracción líquido-líquido con solventes orgánicos tales como el cloroformo y el diclorometano, es un método más barato, reproducible y fácilmente adaptable a diferentes tipos de muestras biológicas (fluidos, tejidos). En nuestro caso se escogió la extracción con cloroformo, puesto que se comprobó previamente que favorece la eliminación (o la no aparición) de residuos que podrían generar interferencias con el pico de melatonina en el cromatograma. Gracias a una doble extracción con cloroformo y un paso intermedio de limpieza de la fase orgánica con 0.1 N NaOH se pudieron minimizar dichas interferencias, con lo que no se hallaron picos que coeluyeron con la señal cromatográfica de la melatonina. Para calcular la eficiencia de la extracción se utilizaron muestras charcolizadas de plasma, bilis e intestino a las que se les añadió cantidades conocidas de melatonina (5, 50, 500 pg), comparando la señal obtenida con la proporcionada por estándares normales. Las tasas de recuperación fueron del 94 6 %, 89 5 % y 91 4 % para el plasma, el intestino y la bilis, respectivamente (Tabla 1). También se obtuvieron valores similares de eficiencia en la extracción de melatonina de muestras desproteinizadas de plasma. 59 Trabajo Experimental 1 Tabla 1. Valores de recuperación de melatonina en extractos de muestras de plasma, bilis y tejidos del TGI de la trucha arco iris sobrecargadas con diversas concentraciones de la hormona. [Mel] añadida Plasma (total) Plasma desproteinizado Tejido intestinal Bilis 5 94.2 ± 8.0 92.1 ± 6.0 86.1 ± 6.1 87.5 ± 3.7 10 96.3 ± 4.6 50 92.6 ± 3.9 100 98.5 ± 6.9 200 98.8 ± 2.3 500 95.3 ± 4.8 (pg/ml fluido o pg/g tejido) 90.2 ± 7.1 91.6 ± 4.1 91.8 ± 4.5 93.0 ± 2.7 88.6 ± 3.7 93.6 ± 5.4 89.5 ± 5.3 94.6 ± 5.6 Los valores expresan el porcentaje de recuperación de las cantidades de melatonina añadidas a las muestras. Los datos representan el promedio ± E.E.M. de tres muestras ensayadas para cada concentración de melatonina. Optimización y calidad del ensayo cromatográfico Los perfiles de elución obtenidos a partir de la inyección de estándares de melatonina y de los diferentes tejidos analizados se muestran en las Figuras 1 (plasma) y 2 (intestino y bilis). Tal y como se aprecia en las gráficas, no se observaron picos que interfieran en la separación de la melatonina en ninguna de las muestras. En nuestro sistema cromatográfico, hemos optado por columnas analíticas cortas (7.5 cm) y con rellenos de pequeño tamaño (3 m partícula) dado que proporcionan un incremento en la eficiencia, un menor tiempo de análisis y, por tanto, un coste más reducido. Bajo nuestras condiciones experimentales, la retención de la melatonina en la fase estacionaria (C18) fue 9-10 minutos, si bien podría acortarse aún más, mediante el incremento en el porcentaje del solvente orgánico. Con el fin de evaluar la selectividad del sistema de HPLC-FD, se constató que la señal cromatográfica producida por ciertos derivados 5‘-metilados relacionados estructuralmente con la melatonina (5-metoxitriptamina, 5-metoxitriptofol y ácido 5metoxiindolacético) y que también son resueltos bajo estas condiciones cromatográficas (Ceinos et al., 2005), no afectaban a la separación de la hormona. En ningún caso se observó coelución de los picos de estos compuestos con el de la melatonina. Además, se constató que sus niveles en plasma y bilis de trucha arco iris eran muy reducidos, siempre por debajo del nivel de detección de nuestra técnica. 60 Trabajo Experimental 1 mV 50 A C B Fluorescence Response 40 30 20 10 0 -10 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 min min 6 8 10 12 min Figura 1. Determinación de melatonina en el plasma de la trucha tras extracción con cloroformo. Los cromatogramas representan: (A) Plasma charcolizado libre de melatonina, (B) La misma muestra pero con melatonina añadida hasta una concentración de 166.5 pg/ml plasma, (C) Muestra extraída de un plasma obtenido durante el día (contiene 88.7 pg/ml de plasma). mV 50 A C B Fluorescence Response 40 30 20 10 0 -10 0 2 4 6 min 8 10 12 0 2 4 6 min 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 min Figura 2. Cromatogramas obtenidos a partir de extractos de: (A) Estándar acuoso de melatonina (50 pg), (B) Tejido homogenizado de intestino medio de trucha (C) Muestra de bilis. Las concentraciones de melatonina fueron 117.3 pg/g en el intestino medio y de 1783 pg/ml en bilis. 61 Trabajo Experimental 1 MEL detectada en Plasma (pg/ml) 1200 1000 800 600 MEL intestinal detecteda (pg/g tejido) Tanto los tiempos de retención como los valores del área de los picos mostraron una gran reproducibilidad, lo que se determinó mediante los coeficientes de variación (CV) intraensayo (plasmas sobrecargados con varias concentraciones de melatonina y extraídos el mismo día, CV= 3.14%) e interensayo (plasmas sobrecargados con dos concentraciones de melatonina y extraídos en días diferentes CV= 4.13%). Además se encontró una excelente correlación lineal (r2 ≈ 0.99) entre la concentración de melatonina añadida en las muestras tratadas con charcol y la cantidad de melatonina recuperada tras el proceso de extracción (Tabla 1). Tal y como se mencionó anteriormente, las curvas de calibración (Figura 3) cubrieron un rango de 5-500 pg/ml para muestras de plasma, bilis, y de 5-200 pg/ml en muestras procedentes del intestino. Por otro lado, el límite de detección (LOC, basado en un coeficiente señal/ruido de 3:1) fue estimado en 12 pg/ml en muestras de estándares acuosos inyectados sin extracción, mientras que el límite de cuantificación (LLOQ) fue de 8 pg/ml calculado sobre muestras extraídas (y concentradas) de fluidos o tejidos. En términos de cantidad inyectada, el método actual con detección por fluorescencia permite cuantificar 0.8 pg/inyección de un estándar de melatonina. 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0 50 100 150 200 Melatonin Añadida (pg) 400 200 0 0 200 400 600 800 1000 Melatonina Añadida (pg) Figura 3. Correlación entre la melatonina añadida a las muestras y la detectada tras su extracción. Las ecuaciones de la regresión lineal obtenida fueron y = 0.9399X + 8.1365, r2=0.992 (plasma); y = 0.8872x + 1.2964, r2=0.989 (intestino). 62 Trabajo Experimental 1 Análisis cuantitativo de las muestras El método analítico puesto a punto permite mediciones fiables de niveles muy bajos de melatonina plasmática, tales como los que se observan típicamente durante la fase lumínica del fotociclo diario (Tabla 2). Los valores basales obtenidos concuerdan con los descritos en trucha utilizando distintos métodos cromatográficos (Kulczykowska y Iuvone, 1998), así como mediante RIA (Gern et al., 1978). Consecuentemente, los datos muestran que los niveles nocturnos de melatonina plasmática fueron significativamente mayores (del orden de unas tres veces) a los diurnos (Tabla 2). Los valores plasmáticos fueron similares en muestras libres de proteína que en muestras de plasma no tratadas, de forma que ni los valores diurnos ni los nocturnos de melatonina fueron afectados significativamente por el proceso de desproteninzación al que fueron sometidas las muestras (Tabla 2). Tabla 2. Concentración de melatonina durante el día y la noche, en plasma desproteinizado, plasma total, bilis y homogeneizados de tejidos intestinales (intestino medio y posterior). Plasma libre de proteínas (pg/ml) Dia (12- 14h) 103.1±2.0 (n = 15) Noche (23-01 h) 453.9±31.7 (n=15) * Plasma total (pg/ml) 123.1±18.8 (n = 15) 422.1±36.2 (n=15) * Bilis (pg/ml) 1259.8±123.4 (n = 8) 1550.5±91.4 (n=8) Intestino Medio (pg/g tejido) 262.1±31.6 (n = 10) 218.6±38.4 (n=10) Intestino Posterior (pg/g tejido) 161.6±32.6 (n = 10) 174.3±32.3 (n=10) Los valores se expresan como el promedio ± E.E.M. Las unidades (pg/ml, pg/g tejido) y el tamaño muestral (n) son indicados en paréntesis. * P < 0.05 vs. respectivo valor diurno. Los resultados obtenidos también indican que existe una importante cantidad de melatonina a lo largo del TGI de la trucha arco iris (160-260 pg/g tejido), aunque ni en el intestino medio ni en el posterior se aprecian diferencias significativas entre las muestras tomadas de día y de noche. Con respecto a la bilis, la concentración de melatonina se situó entre 1259 y 1550 pg/ml, es decir unas 10 veces más que los valores hallados en plasma durante el día y unas 3 veces más que los nocturnos, indicando que probablemente la concentración de la bilis dentro de la vesícula biliar también supone un incremento de la concentración de melatonina a este nivel. Al igual que en intestino, los datos día:noche no permiten ver la existencia de variaciones diarias en el contenido de melatonina en la bilis. 63 Trabajo experimental 2 Caracterización de la síntesis de melatonina en el tracto gastrointestinal de la trucha arco iris: niveles, expresión génica, relación con serotonina e inmunolocalización Trabajo Experimental 2 Introducción y objetivos La melatonina es una hormona clave en la regulación de numerosos procesos fisiológicos, sobre todo aquellos que se desarrollan de forma rítmica. Si bien su producción rítmica diaria se realiza fundamentalmente en las células fotorreceptoras del órgano pineal y de la retina en la mayoría de las especies estudiadas (Klein et al., 1983; Falcón et al., 1987), la melatonina también se puede sintetizar en determinados órganos periféricos, principalmente el TGI, habiéndose sugerido que tanto las alteraciones en el patrón alimentario como el tránsito de alimento podrían estar involucradas en la regulación de la síntesis de la hormona en este tejido (Bubenik et al., 1996; Martin et al., 1998). La melatonina fue detectada por primera vez en el TGI de mamíferos mediante cromatografía de papel a partir de muestras de mucosa inflamada del apéndice humano (Raikhlin y Kvetnoy, 1974; 1976). Estudios inmunohistológicos posteriores confirmaron su presencia en todos los segmentos del tracto digestivo de la rata (Bubenik et al., 1977; Holloway et al., 1980). Mas tarde, fue descrita la presencia de receptores MT2 para la hormona en diferentes regiones del TGI (estómago, duodeno, colon) de la rata (Stebelová et al., 2010), así como de sitios de unión de melatonina en el colon de humanos (Poon et al., 1997), sugiriendo un importante papel de la hormona en la fisiología gastrointestinal. La síntesis gastrointestinal de melatonina parece factible debido a la presencia de elevados niveles de su precursor, la serotonina (Gershon y Tack, 2007). Los análisis enzimáticos también han demostrado la presencia de dos enzimas cruciales de la ruta biosintética de la hormona en el tracto digestivo de aves y mamíferos, la AANAT (Hong y Pang, 1995) y la HIOMT (Quay y Ma, 1976). En mamíferos, al igual que en aves, la pinealectomía provoca un descenso en el contenido intestinal de melatonina, si bien aun en estas condiciones todavía son detectadas cantidades importantes de la hormona. Todos estos datos en mamíferos, aves y peces han llevado a sugerir la existencia de una síntesis local de melatonina en el TGI (Bubenik y Brown, 1997; Van`t Hof y Gwinner, 1999). De forma complementaria, en los peces se ha descrito la presencia de melatonina en diversos segmentos del tracto gastrointestinal del esturión así como en ciertos teleósteos como la trucha arco iris, lo que pone de manifiesto la capacidad del TGI de convertir la 5HT en melatonina (Bubenik y Pang, 1997). Además, estudios recientes llevados a cabo en nuestro laboratorio han demostrado, por primera vez en los peces, la expresión génica de la enzima AANAT en el tejido gastrointestinal de la trucha arco iris, con niveles diferentes en los distintos tramos y capas tisulares (Fernández-Durán et al., 2007). En el carpín, también se ha demostrado que la expresión AANAT en intestino posterior e hígado muestra un perfil rítmico diario (Velarde et al., 2010a), por lo que se ha sugerido que existe una síntesis local rítmica de melatonina en el TGI de los peces. No obstante, a pesar de la existencia de trabajos pioneros, el conocimiento de los procesos de síntesis de melatonina en el TGI de los peces, así como su regulación, es muy limitado. Por todo ello, en el presente trabajo nos planteamos caracterizar el contenido de 67 Trabajo Experimental 2 melatonina, su precursor (5HT) y su principal metabolito (5HIAA), en las diferentes zonas del TGI y órganos asociados en la trucha arco iris. Además, se pretende localizar la expresión génica de las enzimas AANAT (aanat1 y aanat2) y HIOMT, como enzimas finales de la ruta biosintetica de la hormona. Por último, se presentan evidencias inmunohistoquímicas de la localización celular de la síntesis de melatonina en el TGI de la trucha arco iris. Materiales y métodos Animales de experimentación Al igual que en el capítulo anterior nuestro modelo animal para abordar dicho estudio fue la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss). Se utilizaron ejemplares inmaduros (110 ± 15 g; media ± E.E.M.) obtenidos en la piscifactoría situada en Soutorredondo (Lousame, A Coruña). Los peces fueron transportados en tanques con suministro continuo de oxígeno, hasta nuestras instalaciones donde se mantuvieron en cubas de 120 litros con aporte de agua filtrada libre de cloro y difusión continua de aire. Los animales se mantuvieron bajo una condición de fotoperiodo artificial con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad (L:D 12:12), siendo la intensidad lumínica de 400 lux en la superficie del agua. La temperatura del agua se mantuvo controlada a 14±1 ºC durante todo el periodo experimental. La alimentación se realizó una vez al día (10:00h) con pienso seco comercial (Dibaq-142 Diproteg SA., Segovia, Spain; composición aproximada: 48% proteína cruda, 6% carbohidratos, 5% grasa cruda, y 15% ceniza). Los experimentos realizados cumplieron con la directiva de manipulación de animales de la Unión Europea (86/609EU), así como con las leyes españolas para el uso de animales en investigación (RD 1201/2005). Experimentos y análisis Experimento 1. Niveles de indolaminas y expresión génica de los enzimas de síntesis de melatonina en diferentes regiones del TGI Para la determinación de los niveles de indolaminas (melatonina, 5HT y 5HIAA) y de los transcritos de las enzimas de la ruta biosintética de la melatonina (aanat1, aanat2 y hiomt) presentes en los diferentes regiones del TGI, se utilizaron un total de 16 truchas arco iris (n=12 para la determinación de niveles de indolaminas; n=4 para expresión génica) que fueron ayunadas durante 24 horas y posteriormente sacrificadas en mitad de la fase luminosa del ciclo diario (alrededor de las 13:00 horas). La recolección de muestras, se realizó tras anestesiar a los peces mediante inmersión en MS-222 (50 mg/L tamponado con bicarbonato sódico, pH 7.4) y su posterior decapitación. Tras ello se realizó una incisión a lo largo del vientre de los peces que permitió extraer la mayor parte del tejido gastrointestinal, cuyo contenido se vació mediante infusión de solución salina (NaCl 0,6%, 68 Trabajo Experimental 2 p/v) fría, y posteriormente el tejido se mantuvo en una placa sobre hielo. También se extrajo una muestra de hígado (50 mg aprox.), así como la vesícula biliar llena de bilis para posteriormente separar la bilis mediante una jeringa. Con respecto al TGI se separaron las siguientes regiones: esófago, estómago, ciegos pilóricos y segmentos intestinales anterior, medio y posterior. En cada uno de los tejidos se separó la capa de mucosa interna de la pared muscular externa con ayuda de un bisturí. En relación con este proceso, se realizaron previamente estudios histológicos a fin de identificar el protocolo menos agresivo para la separación de las capas de mucosa y muscular (Figura 1). Concretamente se observó que un raspado suave del intestino permite extraer prácticamente todo el moco del intestino sin afectar apenas a la capa de mucosa, mientras que un raspado profundo separa y arrastra la casi totalidad de la mucosa intestinal, siendo marginal el daño sobre la pared muscular que incluyó la lamina propia, la capa de submucosa y la capa muscular externa (Figura 1C). Así pues, para el muestreo se optó por este último procedimiento. De cada tejido gastrointestinal (pared y mucosa), del hígado y de la pared de la vesícula biliar, se tomó una fracción (40-50mg) para la posterior cuantificación de su contenido de indolaminas mediante HPLC. Todas estas muestras, al igual que la bilis, fueron congeladas inmediatamente y almacenadas a -80ºC, hasta su procesado. Una segunda fracción de las muestras de cada tejido se usó para determinar la expresión de los genes de las enzimas de la ruta biosintética de la melatonina (aanat1, aanat2 y hiomt). Estas muestras fueron tomadas en condiciones de esterilidad, congeladas inmediatamente en hielo seco y almacenadas a -80ºC hasta la cuantificación de la expresión génica. Análisis de los niveles de melatonina, serotonina y 5HIAA mediante HPLC La cuantificación de melatonina en el TGI de la trucha se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo descrito en el Capítulo 1 de la presente Memoria, encontrándose ya publicado (Muñoz et al., 2009). El contenido de 5HT y su principal metabolito (5HIAA) en los diferentes segmentos del TGI se cuantificó mediante HPLC con detección electroquímica (HPLC-EC) según el método descrito por Gesto et al. (2006), con algunas modificaciones. El sistema de HPLC consistió en una bomba Jasco PU-2080 Plus, una columna cromatográfica Phenomenex Nucleosil C18 (5 µm, 150 mm longitud x 4.6 mm diámetro interno) y un detector electroquímico ESA Coulochem II, el cual incluyó una célula analítica (M5011) con potenciales de oxidación configurados a +40 mV (primer electrodo) y +340 mV (segundo electrodo). La fase móvil utilizada fue una solución acuosa de NaH2PO4 (63.9 mM) Na2EDTA (0.1 mM) y 1-octanosulfonato de sodio (1.63 mM), con un 14.9% de metanol (v/v). El pH de la fase móvil se ajustó a 2.79 con ácido ortofosfórico. 69 Trabajo Experimental 2 Finalmente la fase móvil fue filtrada (0.2 µm de poro; Millipore, Bedford, EE.UU) y desgasificada mediante vacio antes de su uso. B A C Figura 1. Efecto del raspado sobre la estructura tisular de la pared del Intestino medio A) sin raspado, B) tras raspado suave, C) tras raspado profundo con hoja del bisturí. Tinción Hematoxilina. Barra: 100 µm (A, B y C). Fotografías realizadas en colaboración con la Dra. R. Álvarez (Laboratorio de Biología Celular, Universidad de Vigo) Para la determinación de los niveles de indoles (5HT y 5HIAA) en las muestras, 40-50 mg de cada uno de los tejidos fueron sonicados en 0.5 ml de PCA (0.3 mM) y centrifugados a 13200 rpm durante 7 minutos. Una alícuota de 40 µl del sobrenadante fue disuelta en fase móvil (1:10 v/v) e inyectada en el sistema de HPLC. En la Figura 2 se puede observar un ejemplo de cromatograma de patrones indólicos y de una muestra de intestino. Aunque nuestra técnica también permite cuantificar los niveles de 5hidroxitriptófano (5HTP), precursor inmediato de la 5HT, esta medida no se llevó a cabo 70 Trabajo Experimental 2 en los tejidos analizados debido a los bajos niveles (en muchos casos por debajo del límite de detección) de este compuesto. Todos los cromatogramas fueron recogidos en un sistema informático equipado con el software de análisis cromatográfico Biocrom XP (Jasco Analítica, Madrid). La cuantificación de los picos de las muestras fue estimada en comparación con las áreas de los picos de sus respectivos estándares. A B Figura 2. (A) Cromatograma de una muestra de patrones (100 pg) de 5-hidroxitriptofano (8.41 min); acido 5-hidroxindolacético (11.24 min) y serotonina (13.06 min). (B) Muestra de intestino medio: 5HTP (2.20 pg; 8.47 min); 5HIAA (24.15 pg; 10.85 min); 5HT (187.51 pg; 12.50 min). Expresión génica de aanat1, aanat2 y hiomt mediante RT-PCR (qPCR) Para la cuantificación de la expresión de aanat1, aanat2 y hiomt se utilizaron cebadores específicos diseñados previamente en nuestro laboratorio (Fernández-Durán et al., 2007) y otros diseñados a partir de secuencias publicadas por otros autores. En primer lugar, se procedió a la extracción del ARN total, siguiendo el método TRI-ReagentTM. Dicho método es un protocolo sencillo de extracción de ARN en un único paso, usando una solución monobásica de fenol e isotiocianato de guanidina (TRIReagentTM), combinada con la precipitación de ARN mediante isopropanol en presencia de un alto contenido en sales (Chomczynsky y Sacchi, 1987). Siguiendo las instrucciones del fabricante, se sumergieron las muestras en reactivo TRIzol® (Invitrogen), se sonicaron (UP200H Ultraschallprozessor, Dr. Hielscher, GMBH) durante 3 segundos y se incubaron 71 Trabajo Experimental 2 durante 5 min a temperatura ambiente para asegurar la completa disolución de los complejos nucleotídicos. A continuación se añadieron 300 l de cloroformo a cada vial, se agitó vigorosamente y se incubaron nuevamente las muestras durante 15 min a temperatura ambiente. Pasado este tiempo, los viales se centrifugaron (5415R, Eppendorf) durante 15 min a 12000 g y 4ºC. Dicha centrifugación separa la muestra en tres fases: una orgánica rosada de fenol-cloroformo (contiene proteínas y ADN), una interfase sólida, y una tercera fase acuosa superior e incolora, que contiene el ARN. Dicha fase acuosa fue inmediatamente transferida a nuevos viales estériles y libres de ARNasa, a los que se añadió 0.5 ml de 2-propanol (Sigma). Tras una nueva agitación vigorosa, los extractos de ARN fueron incubados a temperatura ambiente (10 min) y posteriormente centrifugados a 12000 g durante 10 min (4ºC). Tras descartar el sobrenadante mediante decantación, el precipitado fue nuevamente resuspendido con ayuda de un agitador en 1 ml de etanol al 75% durante 2 segundos. Inmediatamente después, los viales fueron centrifugados a 12000 g y 4ºC durante 7.5 minutos. A continuación se eliminó el etanol por decantación, permaneciendo los viales abiertos y a temperatura ambiente durante 5 min, hasta la completa evaporación del etanol. Finalmente, dichos extractos fueron reconstituidos y diluidos en 20 l de agua grado MilliQ estéril y libre de ARNasa. La cantidad de ARN y su pureza fue determinada mediante espectrofotometría a 260 nm y 280 nm. Para ello, 5 l de ARN extraído se diluyeron en 1.5 ml de solución Tris. La composición de dicho tampón fue: 3.027 g de Trizma Base (Sigma) y 0.93 g de EDTA, diluidos en 1 L de agua grado MilliQ estéril libre de ARNasa (pH 7.6). Tras medir la absorbancia de la solución Tris-ARN a 260 y 280 nm, se calculó el ratio entre dichas absorbancias (260/280 nm). Un valor entre 1.7 y 2.0 se consideró óptimo. En segundo lugar, se procedió a la síntesis del ADN complementario a partir de los extractos de ARN purificado. Para ello se pipeteó un volumen previamente calculado de cada muestra (conteniendo 2 µg de ARN) en un nuevo vial estéril y libre de ARNasa. A continuación, se añadió 1 µl de la solución de random primer (Promega) y se completó con agua MilliQ estéril libre de ARNasa, hasta un volumen final de 11 µl. A continuación los viales conteniendo estas soluciones fueron incubados durante 5 min a 70ºC en un termociclador para PCR (PTC-200, MJ Research). Transcurrido este tiempo a cada vial se le añadió 9 µl de una solución conteniendo 0.2 l de inhibidor de la ARNasa (RNAguard™ RNase inhibitor, porcine (Amersham Biosciences), 1 l de transcriptasa inversa (M-MLV reverse transcriptasa, Promega), 1 l de dNTP Mix 10 mM (Promega), 4 l de tampón (M-MLV RT 5x Buffer, Promega) y 2.8 l de agua grado MilliQ estéril libre de ARNasa. El volumen final en cada vial fue, por tanto, de 20 l. Esta solución resultante se incubó a 37ºC durante 60 min, seguido de 5 min a 65ºC. El producto resultante se almacenó a -80ºC hasta el posterior análisis de las muestras mediante la técnica de PCR en tiempo real (qPCR). Para la cuantificación de la expresión de aanat1, aanat2 y hiomt en las muestras del TGI de la trucha arco iris, se utilizó una solución de 15 l conteniendo 2 l del 72 Trabajo Experimental 2 concentrado de ADN, 1 l de cada uno de los cebadores (forward y reverse, ver a continuación), 3.5 l de agua grado MilliQ estéril libre de ARNasa y 7.5 l de una solución con el fluoróforo (MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix, 2x, Fermentas). Los cebadores se diseñaron en base a secuencias conocidas de la trucha arco iris y fueron suministrados por Sigma. Las secuencias y las referencias (―genbank accesion number‖) para los genes cuantificados fueron las siguientes: aanat1 (AB007294): Forward, 5´-CAGCCAAGAGAGAAGACTTG-3´, Reverse, 5´GGAGAAACAGAAGGGGAGAA-3´ aanat2 (AF106006): Forward, 5´-CATTCGTCTCTGTGTCTGGT-3´, Reverse, 5´TTTCTGGGATATGCTGGGT-3´ hiomt: Forward, 5´-CTTCCAGGAAGGGGACTTTT-3´, Reverse, 5´TGTCTGCACCAGCATGTTCA-3´. Secuencia amablemente cedida por el Dr. J. Falcón. β-actina (AJ438158): Forward, 5´-GATGGGCCAGAAAGACAGCTA-3´, Reverse, 5´-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3´. La expresión de cada uno de los genes estudiados se calculó de forma relativa a la medida del gen de referencia, β-actina, empleando para ello el método de las delta-Cts. Cada una de las soluciones conteniendo ADN, cebadores y reactivos fue pipeteada en placas de 96 pocillos (HSS9601, Bio-Rad) que se incubación en el equipo de RT-PCR cuantitativa (MyiQ, Bio-Rad). El protocolo de qPCR se realizó en tres pasos: el primero constó de una incubación de 3 min a 95ºC; el segundo paso consistió en 50 repeticiones de 40 segundos de duración, exponiéndose los pocillos a 95ºC durante 10 segundos, seguido de un descenso de la temperatura a 55ºC durante 30 segundos. Con el fin de valorar la pureza de las muestras, un tercer paso adicional consistió en la repetición sucesiva de 79 ciclos de un proceso de calentamiento de las muestras a 94ºC durante 10 segundos y el subsiguiente enfriamiento durante 30 segundos hasta los 55ºC. Experimento 2. Inmunolocalización de serotonina, melatonina y AANAT en el TGI de la trucha arco iris Para el estudio histológico se utilizaron muestras de tejidos (intestino anterior, ciegos pilóricos, intestino medio e intestino posterior) procedentes de 10 truchas sacrificadas igual que en el Experimento 1, si bien en este caso no se procedió a separar la capa de mucosa de la pared muscular. Una porción de cada muestra fue fijada en Bouin, mientras que la porción restante fue fijada por inmersión en paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0.1M (TP 0.1M) durante 24 horas. Un primer grupo de muestras de cada tejido fue deshidratado en alcoholes de gradación creciente e incluido en parafina. Los bloques así obtenidos fueron seccionados transversalmente en un microtomo tipo Minot (Leica), oscilando el grosor de las secciones entre 5-10 m. Un segundo grupo de muestras fue crioprotegido mediante inmersión 73 Trabajo Experimental 2 secuencial en sacarosa al 15% y al 30% en TP 0.1M, incluido en Tissue-Tek y posteriormente seccionado en un criostato (Micron) con grosor de 20 m. En ambas modalidades de inclusión, se realizaron series de cortes, continuos y alternos, estos últimos destinados a detectar la presencia de 5HT, melatonina y AANAT en secciones de tejido contiguas. La citoarquitectura del TGI fue estudiada en secciones desparafinadas, rehidratadas y teñidas con hematoxilina-eosina. Las secciones de tejido destinadas a estudios inmunohistoquímicos fueron sometidas a un tratamiento con H2O2 (0.03%) durante 30 minutos, con el fin de eliminar la peroxidasa endógena. Tras varios lavados con PBS (tampón fosfato salino), al cual se añadió gelatina, tritón X-100 y azida sódica (PBS-G-TA), se procedió a las incubaciones con distintos anticuerpos: - Primer anticuerpo: Anti-5HT (Diasorin), anti-melatonina (AbD Serotc), de conejo diluidos 1/5000 en PBS-G-T-A o anti-AANAT de conejo (Millipore), diluido 1/100 en PBS-G-T-A. La incubación se realizó durante toda la noche a temperatura ambiente y en agitación a baja velocidad. - Segundo anticuerpo: Ig de cabra anti-conejo biotinizado (GAR, Vector) diluido 1/100 en PBS-G-T, incubado durante 1 hora a temperatura ambiente. - Tercer anticuerpo: Complejo-Avidina-Biotina (ABC Kit, Vector) diluido 1/100 en PBS-G-T, incubado durante 1 hora a temperatura ambiente. Entre todas las incubaciones se efectuaron varios lavados con PBS-G-T. Para el revelado de la reacción, se utilizó 3´3´-diaminobencidina tetraclorhidrato (DAB), cromógeno que en presencia de H2O2 al 0.03% se transforma en un precipitado marrón insoluble. La reacción fue expuesta al microscopio y posteriormente parada con TRIS 0.1M. La especificidad de los tres anticuerpos se puso de manifiesto mediante la incubación de secciones en paralelo y en ausencia del primer anticuerpo. En todos los casos, el resultado fue negativo. Tras la inmunotinción, parte de las secciones fueron contrastadas con hematoxilina, deshidratadas en una escala de alcoholes de gradación creciente y montadas con DePeX. Para detectar la colocalización de 5HT/melatonina y 5HT/ANAAT, se utilizaron técnicas de inmunofluorescencia en series de cortes alternos, cuyo protocolo fue el siguiente: - Incubación de las secciones en anti-5HT, anti-melatonina y anti-AANAT diluidos en PBS-G-T como se ha indicado previamente. - Incubación en presencia de los anticuerpos secundarios específicos marcados con rodamina y fluoresceína, Alexa 488 y Alexa 594 anti-conejo, respectivamente, (Molecular Probes) diluidos 1/600 en PBS-G-T, durante 1 hora, a temperatura ambiente. 74 Trabajo Experimental 2 - Montaje de las secciones con ProLong Gold (Molecular Probes). Todas las secciones fueron observadas, estudiadas y fotografiadas usando una cámara digital (DP71) conectada a un microscopio Olympus BX51 equipado con una combinación de filtros para rodamina y fluoresceína. La edición de las imágenes y láminas se realizó mediante el software Adobe Photoshop 8.0. Validación por western blot del anticuerpo anti-AANAT para la detección de AANAT en intestino de la trucha La presencia de la proteína AANAT se evaluó en extractos de órgano pineal (control interno) e intestino medio (tejido a estudiar) de la trucha arco iris mediante la técnica de western blot, utilizando para ello un anticuerpo comercial anti-AANAT (Millipore) obtenido en conejo y con reactividad demostrada frente a la AANAT de peces (Ganguly et al., 2005). Los tejidos fueron homogenizados mecánicamente en 1 ml de tampón RIPA (PBS 1x, NP-40, dexicolato sódico y 10% SDS), al que se añadió en fresco una mezcla de inhibidores de proteasas (aprotinina, leupeptina, PMSF 200 mM y ortovanadato sódico 100 mM). La mezcla obtenida fue centrifugada durante 15 minutos a 4ºC. A continuación se cuantificó el contenido en proteínas del sobrenadante mediante el método de Bradford (Bio-Rad laboratorios, Inc.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Seguidamente se realizó una electroforesis, pipeteando para ello una cantidad del homogenado de tejido conteniendo 15 µg de proteína. La electroforesis se realizó en geles de SDS-PAGE al 7.5%, con una corriente de 120 V durante 90 minutos. La composición del tampón de electroforesis fue 25 mM Trizma Base, 192 mM Glicina y 0.1% SDS. Transcurrida la electroforesis, las proteínas fueron transferidas a una membrana de PVDF (difluoruro de polivinildeno) previamente activada con metanol en un sistema de transferencia semi-seco y en un tampón compuesto por 25 mM Tris, 192 mM Glicina y 20% metanol. La transferencia se realizó bajo una corriente eléctrica de 15 V durante 2 horas. Al cabo de este tiempo, la membrana se incubó en una solución de bloqueo (3% leche baja en grasa y Tween 20 al 0.1% en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente y en agitación. A continuación se añadió el primer anticuerpo (anti-AANAT, Millipore) a una dilución 1/500 y la mezcla se incubó a 4ºC durante toda la noche. Como control de carga se utilizó un anticuerpo frente a β-actina (Sigma). Posteriormente se realizaron 3 lavados de 5 minutos con una solución de lavado (0.1% Tween 20 PBS). A continuación se añadió el segundo anticuerpo unido a HRP (dilución 1:5000) y la membrana se mantuvo sumergida en la solución durante 1 hora con agitación constante. Tras tres nuevos procesos de lavado, la membrana fue finalmente sumergida en ECL Plus (GE HealthcareAmersham, UK) durante 5 minutos sin agitación y posteriormente colocada en un cassette autorradiográfico para su revelado. Análisis estadísticos de los resultados. 75 Trabajo Experimental 2 Todos los datos fueron expresados como la media ± E.E.M. (n = 8-10 para los estudios de indolaminas; n =4 para los análisis de expresión génica). Para evaluar tanto la existencia como la presencia de diferencias significativas en el contenido de indolaminas entre los distintos tramos del TGI analizados se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) de una vía (Sigma Stat v3.0) tanto para las porciones de pared como de mucosa, de forma independiente. Se aplicó el test de Student Newman Keuls (SNK) de comparaciones múltiples cuando las diferencias fueron significativas. En todos los casos, el grado de significación se estableció en P < 0.05. La expresión de los distintos genes analizados se representó como la expresión relativa respecto de la porción (mucosa o pared) del tejido que mostró la expresión más baja para cada uno de ellos, concretamente el esófago. Se utilizó el análisis de varianza ANOVA de una vía para verificar la presencia de diferencias significativas entre regiones del TGI tanto en las porciones de pared como de mucosa. En el caso de existir diferencias significativas se aplicó el test de Tukey de comparaciones múltiples. En todos los casos, el grado de significación se estableció en P <0.05. Resultados Niveles de serotonina, 5HIAA y melatonina en distintas regiones del TGI de la trucha arco iris La Figura 3 muestra el contenido de melatonina en las capas de mucosa y pared muscular de las distintas regiones del TGI estudiadas. En general, los valores detectados en pared fueron superiores a los hallados en mucosa, si bien se puede establecer alguna diferencia entre regiones. Mientras que en el estómago y los ciegos pilóricos no hubo diferencias significativas entre pared y mucosa, los niveles de melatonina fueron significativamente superiores en la pared del intestino anterior, medio y posterior, con respecto a sus respectivas mucosas. La mayor diferencia se apreció en el intestino anterior, siendo el contenido de melatonina un 275% superior en la pared muscular que en la capa de mucosa. El contenido de melatonina en las diferentes zonas del TGI fue menor en el estomago que en el intestino, con una tendencia en los niveles de esta neurohormona a decrecer hacia la zona mas distal del TGI. Con la excepción del estómago, el contenido de 5HT fue siempre superior en la capa de pared muscular de todos los tejidos estudiados en comparación con la capa de mucosa (Figura 4). Además, todas las regiones intestinales mostraron niveles muy elevados de 5HT (alrededor de 4 ng/g tejido) en la pared muscular, siendo 150-160 veces superiores a las presentes en la capa de mucosa. En los ciegos pilóricos, el contenido de 5HT en la pared fue 18 veces superior al hallado en la mucosa. Esta diferencia fue menor que en el caso del intestino, debido a los valores relativamente elevados de 5HT en la 76 Trabajo Experimental 2 mucosa de los ciegos pilóricos (6 veces mayores que los medidos en intestino en dicha capa). En contraste con los tejidos intestinales, en el estómago los niveles de 5HT en la mucosa fueron 3 veces superiores a los de la pared muscular. 200 Mucosa Pared b 150 * 400 * a a 200 100 a a a 50 m ag o In tó Es Es óf t. an te C rio ie go r s pi ló ric os In t. m ed io In t. po st er io r Es tó m ag o In t. an te C rio ie r go s pi ló ric os In t. m ed io In t. po st er io r 0 ag o 0 Melatonina pg/g tejido Melatonina pg/g tejido 600 Figura 3. Contenido de melatonina en pared muscular y mucosa de las diferentes regiones del TGI de la trucha arco iris. Los datos se representan como la media ± E.E.M. de 8 a 10 animales. Letras distintas indican diferencias significativas (P < 0.05) entre los diferentes tramos del TGI. *, Diferencias significativas (P < 0.05) con respecto a la correspondiente porción de pared. b 6000 Pared b 1100 Mucosa a* b 1000 c 900 2000 800 600 a a 400 c* 300 400 5HT ng /g tejido 5HT ng /g tejido 4000 200 200 b* b* b* 100 0 an te rio r pi ló ric os In t. m ed io In t. po st er io r C ie go s ag o In t. óm Es t Es óf ag o Es tó m ag In o t. an C t er ie io go r s pi ló ric os In t. m ed In io t. po st er io r 0 Figura 4. Evaluación del contenido de 5HT en las porciones de pared y mucosa de las diferentes zonas del TGI de la trucha arco iris. Los datos se representan como la media ± E.E.M. de 8 a 10 animales. Letras distintas indican diferencias significativas (P < 0.05) entre los diferentes tramos del TGI. *, Variaciones significativas (P < 0.05) con respecto a la correspondiente porción de pared. 77 Trabajo Experimental 2 Con respecto a los niveles de 5HIAA, se halló una distribución muy similar a la observada para la 5HT (Figura 5). En consecuencia, el contenido de 5HIAA en la porción de pared del intestino medio y posterior fue de 20 y 13 veces superior al medido en las respectivas porciones de mucosa. En cambio, en los ciegos pilóricos el contenido de 5HIAA fue muy similar en mucosa y pared. Por otro lado, la porción de mucosa del estómago mostró valores de 5HIAA unas 2 veces superiores a los observados en la pared de este tejido. b Mucosa Pared 5 HIAA ng/g tissue 1500 250 b b 200 1000 b 500 150 200 b* c 100 a* a 100 a a a* 50 tó m Es Es ag o In t. an te C rio ie go r s pi ló ric os In t. m ed io In t. po st er io r 0 óf ag o Es tó m ag In o t. an C te ie rio go r s pi ló ric os In t. m ed In io t. po st er io r 0 5 HIAA ng/g tissue 2000 Figura 5. Contenido de ácido 5-hidroxindolacético (5HIAA) en pared y mucosa de las diferentes regiones del TGI de la trucha arco iris. Los datos se representan como la media ± E.E.M. de 8 a 10 animales. Letras distintas indican diferencias significativas (P < 0.05) entre los diferentes tramos del TGI. *, Variaciones significativas (P < 0.05) con respecto a la pared del mismo tejido. En el hígado y la vesícula biliar, tejidos anexos al tracto digestivo, las concentraciones de indolaminas (melatonina, 5HT y 5HIAA), expresadas por gramo de tejido fueron muy diferentes (Tabla 1). En el hígado se observaron valores bajos de melatonina comparado con lo medido en otras regiones del TGI. Por su parte, el contenido de melatonina en la vesícula biliar fue el más elevado de entre todos los tejidos evaluados, siendo incluso 3-4 veces superior al medido en las porciones de pared del resto de regiones intestinales. Es importante señalar el contraste entre los niveles bajos de melatonina en hígado y los altos niveles observados en la vesícula biliar. Los niveles de 5HT y 5HIAA, en el hígado de la trucha son muy bajos con respecto a otras zonas del TGI (11.67 y 158.7 ng/g de tejido, respectivamente), alcanzándose el grado de significación únicamente en el caso de la 5HT (P < 0.05) con respecto al resto de tejidos del TGI. Por otro lado, los niveles de 5HT en la vesícula biliar son bajos en comparación con los otros tejidos estudiados (aproximadamente 40 veces más bajos que en 78 Trabajo Experimental 2 el intestino). Además, se observó que el contenido de 5HIAA en la vesícula biliar fue relativamente alto (349 pg/g tejido), en contraste con lo observado para la 5HT. Tabla 1. Contenido de melatonina (pg/g tejido), 5HT y 5HIAA (ng/g tejido) en el hígado y la vesícula biliar de la trucha arco iris. Tejido Melatonina 5HT 5HIAA Hígado 88.5 ±21.6 11.6 ±1.13 158.7 ±25.4 Vesícula biliar 754.3 ±105.9 113.0 ±52.6 344.6 ±102.2 Los datos se representan como el promedio ± E.E.M. (n = 8-10 animales). Estudios inmunohistoquimicos y cuantificación de AANAT mediante Western Blot Inmunoreactividad a 5HT (5HT-ir) En las Figuras 6-8 se puede observar la presencia de 5HT-ir en las cuatro regiones del TGI estudiadas -estómago, ciegos pilóricos, intestino medio e intestino posterior-. Dicha positividad se localiza tanto a nivel celular como fibrilar, pudiéndose catalogar dichos elementos por su forma y ubicación como células endocrinas y neuronas o fibras serotoninérgicas (Caamaño-Tubio et al., 2007). En el estómago en general y en su mucosa en particular se observaron células fuertemente positivas a 5HT. Estas células endocrinas se ubican preferentemente en las zonas más internas de la mucosa (Figura 6B) y a nivel de la submucosa (estrato compacto más granuloso), mientras que en la capa muscular sólo se evidenciaron elementos fibrosos 5HT-positivos, correspondientes a fibras nerviosas (Figura 6A). No se detectó, sin embargo, la presencia de elementos serotoninérgicos a nivel de la lámina propia. En los ciegos pilóricos los elementos 5HT positivos se localizaron en la lámina propia, la submucosa y la capa muscular. Raramente se encontró positividad a nivel de las células endocrinas del epitelio mucosal. Atendiendo a la morfología de los elementos inmuno-teñidos, estos podrían ser células y fibras nerviosas (Figura 6C, D). 79 Trabajo Experimental 2 Figura 6. Microfotografías mostrando la presencia de serotonina en estómago (A y B) y en ciegos pilóricos (C y D). Las puntas de flecha señalan células 5HT-ir en la mucosa estomacal (A y B) y las flechas fibras posiblemente nerviosas en la submucosa (A) lamina propia (C y D) y capa muscular (C). Barra: 100 µm (A, B, C y D). En el intestino medio, tal y como se muestra en la Figura 7, la presencia de 5HT fue detectada en las tres zonas de la pared intestinal. En la mucosa, la mayor positividad se detectó en la lámina propia y en elementos de morfología fibrosa. Nuestros resultados muestran además la existencia de células endocrinas positivas en el epitelio mucosal (Figura 7 C, D y E), y células y fibras 5HT-ir en la capa muscular. Los resultados 80 Trabajo Experimental 2 obtenidos con inmunofluorescencia y detección inmunoenzimática nos permiten definir elementos nerviosos con morfología similar a la neuronal (Figura 7 F y G). Con respecto al intestino posterior, se observó una distribución similar del marcaje serotoninérgico a la del intestino medio (Figura 8). Sin embargo es de destacar que la estimación cuantitativa de las células endocrinas de la capa epitelial de la mucosa fue menor que el intestino medio. (Figura 8 A, B). Algo similar ocurrió con la presencia de células y fibras 5HT-positivas (Figura 8 C y D) en la capa muscular. Inmunorreactividad a la melatonina La evaluación de la presencia de elementos inmunopositivos a melatonina se presenta en la Figura 9. Se pueden observar imágenes panorámicas de estómago (A), ciegos pilóricos (B), intestino medio (C) intestino posterior (D), y en la figura (E) se puede observar una célula melatonina-ir del intestino posterior. En todas ellas se puede constatar la presencia de células positivas a melatonina. El hecho de presentar inmunorreactividad a la hormona no significa necesariamente que en ellas se localice la síntesis activa de melatonina, ya que esta indolamina difunde inmediatamente después de ser sintetizada a través de la mucosa. Al comparar las distintas zonas del TGI se comprobó que la mayor proporción de células positivas a melatonina se halla en el intestino medio, seguido por los ciegos pilóricos, el intestino posterior y el estómago. En todas las regiones del TGI, la presencia de células inmunorreactivas a melatonina se localizó en la capa epitelial de la mucosa. No hemos detectado elementos positivos a melatonina en las porciones de lamina propia, submucosa y capa muscular. Los estudios inmunohistoquímicos en cortes adyacentes o contiguos de intestino medio mostraron que ambas indolaminas (5HT y melatonina) podrían estar colocalizadas en las mismas células del epitelio mucoso (Figura 10). Por analogía de la inmunotinción con 5HT, se podría señalar que la célula melatonina-positiva también sería una célula endocrina (Caamaño-Tubio et al., 2007). Inmunorreactividad a la AANAT en intestino medio Mediante técnicas de inmunoblot se validó el anticuerpo anti-AANAT para la trucha arco iris. Tanto en las muestras procedentes de glándula pineal como en las de intestino medio se pudo observar una banda con un peso molecular de 23 Kda, el cual corresponde con el peso molecular de la proteína AANAT (Figura 11). El análisis inmunohistoquímico para localizar AANAT se realizó inicialmente en el intestino medio como ejemplo de tejido intestinal (Figura 12). Los resultados obtenidos muestran que las células positivas a AANAT se localizaron a nivel del epitelio de la mucosa intestinal (Figura 12A, B). De forma específica estas células se encuentran mayoritariamente en la base de las vellosidades intestinales. No se detectaron células AANAT-positivas en las porciones de la lamina propia, submucosa y capa muscular. 81 Trabajo Experimental 2 Figura 7. Intestino medio. (A y B) Panorámicas mostrando 5HT-ir a nivel de mucosa, submucosa y músculo. Destaca la abundante presencia de elementos positivos en la lámina propia y en la capa muscular (flechas). (C, D y E) Detalle de posibles células endocrinas 5HT-positivas a nivel de la mucosa (punta de flecha) y de fibras serotoninérgicas a nivel de la lamina propia (flechas). Elementos nerviosos (F: fibras y G: neurona) 5HT-ir a nivel de capa muscular. (A, C, D y F): detección inmunoenzimática; (B, E y G): inmunofluorescencia. Barra: 25 µm (C, D, F y G), 50 µm (E), 100 µm (A y B). 82 Trabajo Experimental 2 Figura 8. Micrografías de secciones transversales del intestino posterior donde se pueden observar detalles de una célula posiblemente endocrina, inmunorreactiva a 5HT (A). Nótese también la presencia de abundantes fibras 5HT-positivas en la lámina propia de la mucosa (B) y en menor número a nivel de la submucosa (C) y de la capa muscular (D) (Flechas). Barra: 25 µm (A y D); 50 µm (C y B). 83 Trabajo Experimental 2 Figura 9. Secciones a diferentes niveles del TGI: Estómago (A), ciegos pilóricos (B), intestino medio (C) e intestino posterior (D) mostrando la presencia de posibles células endocrinas melatonina-positivas en la mucosa (flechas). Nótese la mayor abundancia de estas células en el intestino medio. (E) Detalle de una célula melatonina-ir formando parte del epitelio mucosal en intestino posterior. Barra: 25 µm (B y E); 50 µm (A y D); 100 µm (C). 84 Trabajo Experimental 2 Figura 10. Inmunotinción en secciones adyacentes de intestino medio. La superposición de las imágenes refleja una posible colocalización en una posible célula endocrina positiva a 5HT (A) y melatonina (B). Barra: 25 µm (A y B) Órgano pineal Intestino medio 23 kDa Figura 11. Fotografía mostrando las bandas con un peso aproximado a 23 kDa correspondiente a la proteína AANAT en el órgano pineal y el intestino medio de la trucha arco iris, obtenida tras la realización de ensayos de western blot. 85 Trabajo Experimental 2 Figura 12. Presencia de AANAT en el intestino medio. Nótese que los elementos AANATir se localizan en la capa epitelial de la mucosa. Detección (A) inmunoenzimática, (B) inmunofluorescencia. Barra: 100 µm (A y B). Expresión de aanat1, aanat2 y hiomt en el TGI de la trucha La expresión de los genes de las enzimas finales de la ruta biosintética de la melatonina fue analizada en muestras procedentes de las diferentes regiones del TGI (Figura 13), así como en el hígado (Tabla 2) de la trucha arco iris. Todos los datos se representaron como la expresión relativa respecto de la cuantificación realizada en el tejido en el que se observó la expresión más baja para cada uno de los genes analizados (aanat1, aanat2 y hiomt), que en todos los casos correspondió al esófago. La expresión de aanat1 fue más elevada en el estómago y el intestino posterior, con valores intermedios en intestino anterior, medio y ciegos pilóricos. En las regiones intestinales, la capa de mucosa mostró valores de expresión de aanat1 más elevados que la pared (4 veces superior en intestino medio, 1.5 veces superior en intestino posterior) (Figura 13A). La expresión de aanat2 en los diferentes tejidos estudiados se muestra en la Figura 13B. Entre las porciones de pared, la mayor expresión relativa se halló en las regiones proximales del intestino (intestino anterior y ciegos pilóricos), mientras que el estómago mostró valores bajos similares a los hallados en el esófago. Tal y como ocurrió con la aanat1, la expresión de aanat2 fue mayor en la mucosa, tanto en el intestino medio (≈ 4 veces) como en el posterior (≈ 1.5 veces), en relación a la detectada en la pared de ambos tejidos. 86 Trabajo Experimental 2 Con respecto a la hiomt, la mayor expresión entre las porciones de pared correspondió a los ciegos pilóricos, seguido del estómago, midiéndose valores intermedios en las regiones intestinales (Figura 13C). Tanto en el intestino medio como en el posterior, la expresión de hiomt fue superior (aproximadamente 4 veces mayor) en la capa mucosa que en la pared muscular. Sorprendentemente, la expresión relativa de todos estos genes (aanat1, aanat2 y hiomt) fue muy superior en el tejido hepático de la trucha arco iris, en comparación con todos los tejidos del TGI analizados (Tabla 2). Tabla 2. Expresión del mRNA de aanat1, aanat2, hiomt en el hígado de la trucha arco iris. Expresión de las enzimas aanat1 aanat2 hiomt 32.08 ±6.92 * 30.7 ±5.5 * 11.46 ±1.05 * Los datos representan el promedio ± E.E.M. de 4 muestras. Los valores muestran la expresión relativa comparada a la medida en el esófago de la trucha para cada uno de los genes cuantificados. 87 Trabajo Experimental 2 aanat1 (Expresión relativa) 30 A Mucosa Pared a* 25 20 b* 15 b a 10 a a a 5 a 0 16 Pared Mucosa c 14 aanat2 (Expresión relativa) B * 12 * 10 b 8 b 6 a 4 2 a a 0 12 Pared Mucosa C hiomt (Expresión relativa) * 10 b 8 * b 6 4 2 a a a a Es óf ag o Es tó m ag In o t. a nt C er ie go io r s pi ló ric os In t. m ed In io t. po st er io In r t. m e di In o t. po st er io r 0 Figura 13. Localización de la expresión génica de aanat1 (A), aanat2 (B) y hiomt (C) en el tubo digestivo de la trucha arco iris. Los datos representan la media ± E.E.M. de 4 peces. Letras distintas significan diferencias significativas (P < 0.05) entre las diferentes secciones del TGI. *, Variaciones significativas (P < 0.05) entre las porciones de pared y mucosa en la misma zona del TGI. 88 Trabajo experimental 3 Producción rítmica de melatonina en el tracto gastrointestinal de la trucha arco iris: influencia del fotoperíodo y la alimentación. Trabajo Experimental 3 Introducción y objetivos En el Trabajo 2 se ha puesto en evidencia la existencia de un sistema melatoninérgico en el TGI de la trucha arco iris, con diferencias topográficas relevantes en cuanto a los niveles de la hormona y los procesos enzimáticos que median su formación. Estos datos concuerdan con estudios llevados a cabo en humanos (Messner et al., 2001) y otros mamíferos (Bubenik et al., 1996; Bubenik y Pang, 1997), pero también con los escasos estudios realizados en especies de peces tales como el esturión, la carpa, y la trucha arco iris (Bubenik y Pang, 1997), complementando la información existente sobre la capacidad del TGI de los vertebrados para convertir 5HT en melatonina. Estudios recientes llevados a cabo en cultivos de segmentos intestinales de la trucha arco iris indican que la melatonina existente en TGI depende de una síntesis local de la hormona (Lepage et al., 2005a), la cual puede responder a cambios en la concentración del aminoácido Ltriptófano, que inicia la ruta de síntesis (Lepage et al., 2005a; Herrero et al., 2007). Por otro lado, tanto en mamíferos (Bubenik, 1980; Huether et al., 1998) como en peces (Herrero et al., 2007) se han presentado evidencias de que la administración de melatonina exógena conlleva un aumento de los niveles de la hormona en el TGI, sugiriendo que este tejido tiene cierta capacidad de almacenar melatonina y, por tanto, que una cierta cantidad de hormona presente en el tejido intestinal podría ser originada en otros tejidos del organismo, fundamentalmente el órgano pineal. Los estudios de pinealectomía realizados en mamíferos parecen decantarse porque la mayor parte de la melatonina intestinal es de síntesis local (Bubenik, 1980; Bubenik y Brown, 1997), mientras que esto no ocurre así en algunas especies de aves (Van‘t Hof y Gwinner, 1999). En peces, sin embargo se carece de este tipo de estudios. En la mayoría de los vertebrados, la melatonina es producida de forma rítmica en órganos típicamente asociados a la formación de la hormona, tales como la retina y el órgano pineal (Falcón et al., 2007), con niveles generalmente más elevados durante la noche que durante el día. Este patrón rítmico está muy conservado filogenéticamente y desempeña un papel importante en la organización circadiana de los organismos (Pévet et al., 2006) y en el ajuste temporal de numerosos procesos rítmicos diarios (ciclo sueñovigilia, alimentación, cambios de coloración, etc.) y estacionales (reproducción, hibernación, etc.) (Reiter, 1993; Falcón, 2009; 2010). En los peces, el ritmo diario de síntesis de melatonina está determinado por el incremento nocturno del contenido de la proteína AANAT y de su actividad enzimática (Iuvone et al., 2005; Klein, 2007), la cual durante el día es inhibida por la acción de la luz que actúa sobre los fotorreceptores pineales y retinales (Falcón et al., 2010), con excepciones (Besseau et al., 2006). Un papel menor en la regulación de la síntesis rítmica de melatonina parece desempeñar la enzima HIOMT, aunque esto ha sido menos estudiado. En teleósteos se conoce la existencia de al menos dos genes que codifican para la AANAT, denominados como aanat1 (expresada en retina y similar a las AANATs de otros vertebrados) y aanat2 (expresada en pineal y que no es ortóloga con otras clases de vertebrados) (Begay et al., 1998; Vuilleumier et al., 2007). En la trucha arco iris, se han puesto de manifiesto las características enzimáticas de 91 Trabajo Experimental 3 las dos isoformas de la AANAT, mostrando diferente preferencia por el sustrato y comportamiento de inhibición por producto final (Benyassi et al., 2000). A nivel periférico, no está clara la presencia de una o de ambas formas enzimáticas, aunque recientemente Velarde et al., (2010a) han descrito la existencia de ritmos diarios de expresión de aanat2 en hígado e intestino posterior del carpín, así como también de hiomt2. Asimismo este grupo ha presentado evidencias de actividad AANAT1 en hígado e intestino del carpín (Velarde, 2010), lo que sugiere que ambas formas de la AANAT podrían participar en la síntesis de melatonina a nivel periférico. El hecho de que se haya descrito la existencia de ritmos de expresión de genes reloj en el tejido hepático e intestinal del carpín (Velarde et al., 2009a), ha llevado a sugerir que la síntesis de melatonina en TGI pueda estar asociada a la actividad de osciladores circadianos que, en última instancia, serían responsables de generar ritmos locales de expresión de los enzimas aanat y hiomt. Dichos ritmos podrían estar ajustados por la acción de factores externos, tales como el ciclo luz-oscuridad y/o el alimento o, por efecto, de componentes neuroendocrinos internos. No obstante, a pesar de estos datos, poco se conoce en los peces del carácter rítmico de la producción de melatonina a nivel del TGI, ni de su regulación endógena y ambiental. Por todo ello, el presente Trabajo pretende explorar en la trucha arco iris varios objetivos que se enumeran a continuación: i) estudiar la contribución de la melatonina pineal a los niveles de melatonina existentes en el TGI, así como la relevancia de la producción intestinal en los niveles plasmáticos de la hormona; ii) evaluar la existencia de ritmos de síntesis de melatonina (niveles, expresión de genes de enzimas de síntesis) en el TGI; iii) evaluar la naturaleza endógena de la síntesis de melatonina en el TGI mediante experimentos en condiciones de oscuridad constante; iv) estudiar el efecto del alimento (ayuno prolongado) sobre el contenido de melatonina en el intestino. Materiales y métodos Animales de experimentación En todos los experimentos se utilizaron truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss) de 120 ± 10 g (media ± E.E.M.) obtenidas de una piscifactoría local (Soutorredondo, A Coruña) y transportadas en tanques con suministro continuo de oxígeno hasta las instalaciones experimentales en la Universidad de Vigo. Los peces se distribuyeron en cubas de fibra de vidrio de 120 litros, dotadas de circulación continua de agua y burbujeo de aire, bajo fotoperiodo artificial de 12 horas de luz (intensidad lumínica de 400 lux en la superficie de los tanques) y 12 horas de oscuridad (L:D 12:12). La temperatura del agua fue controlada a 14 ± 1ºC durante todo el periodo experimental y la alimentación se realizó una vez al día (10:00 hrs) con pienso seco comercial, a la dosis del 1% de alimento con 92 Trabajo Experimental 3 respecto a la masa corporal. Los animales fueron mantenidos en estas condiciones durante al menos dos semanas antes de cualquier manipulación. Los experimentos realizados cumplieron con la directiva de manipulación de animales de la Unión Europea (86/609EU) y con las leyes españolas para el uso de animales en investigación (RD 1201/2005). Diseños experimentales Experimento 1. Efecto de la pinealectomía sobre los niveles plasmáticos e intestinales de melatonina en la trucha arco iris Se utilizaron tres grupos de peces (n=12/grupo) que fueron asignados a los siguientes tratamientos: control (animales intactos), pinealectomizados y grupo sham (simulación de pinealectomía). La pinealectomía fue realizada siguiendo el método descrito por Sánchez-Vázquez et al., (2000). Para ello, cada trucha fue capturada, anestesiada y situada sobre una placa envuelta en un paño húmedo. Con la ayuda de un bisturí se retiró la piel y el hueso en la zona de la fontanela craneal, bajo el cual se localiza el órgano pineal. Con ayuda de una lupa binocular y pinzas de microdisección se retiró el órgano pineal, aspirando a continuación suavemente con una cánula conectada a una bomba a vacío, a fin de eliminar posibles restos de tejido pineal no tomados con las pinzas. Finalizada la operación, se procedió a reponer la parte ósea, rellenando los finos espacios adyacentes con un agente adhesivo de acción rápida. La misma operación se realizó en el grupo de animales sham, si bien en estos no se llegó a extraer el órgano pineal. La duración media de la operación en cada una de las truchas fue de alrededor de 2 minutos, tiempo durante el cual se aplicó un ligero chorro de agua con anestésico sobre las branquias y la piel del animal (excepto en la zona craneal). Transcurrido un periodo de 2 días, se comprobó la recuperación de los animales operados, con ausencia de alteraciones del comportamiento, así como la aparente ausencia de infección en la zona operada y se procedió a su sacrificio en mitad de la fase luminosa (ZT6) y oscura (ZT18) del fotociclo diario. Los peces de cada grupo se capturaron con red y se anestesiaron mediante inmersión en una solución de metanosulfito ácido 3-aminobenzoico (MS-222, Sigma) a una concentración de 50mg/L, tamponado con bicarbonato sódico a pH 7.4, y aireada de forma continua. Se tomaron muestras de sangre (1 ml) mediante punción directa en la vena caudal con jeringas heparinizadas. Seguidamente se diseccionó ventralmente el animal para extraer el intestino que fue vaciado de su contenido y lavado con solución de NaCl 0.6% fría, para finalmente tomar muestras (40-50 mg tejido) de la zona media y posterior que fueron congeladas a -80ºC. Experimento 2. Variaciones diarias del contenido de melatonina, 5HT y de la expresión génica de aanat1, aanat2 y hiomt 93 Trabajo Experimental 3 Las truchas, de características similares a las usadas en el Experimento 1, fueron divididas en 2 grupos (n= 72 peces por grupo) distribuidos cada uno en 9 tanques (n= 8 peces) y fueron adaptados durante al menos dos semanas a las condiciones de laboratorio (12L:12D, encendido de luces a las 8 h a.m.; 14ºC temperatura del agua). En los tanques del primer grupo los peces fueron alimentados de forma rutinaria, con una ración diaria (10:00 h a.m.) de pienso, incluso en el propio día del experimento. Las truchas de cada uno de los tanques fueron capturadas, anestesiadas y sacrificadas cada 3 horas (un tanque por punto temporal) a lo largo de un ciclo diario completo, comenzando en ZT0 (ZT = tiempo zeitgeber, 8:00 h a.m.), de forma que los puntos muestreados fueron ZT0, ZT3, ZT6, ZT9, ZT12, ZT15, ZT18, ZT21 y ZT0‘ (primer punto del día siguiente). En los muestreos nocturnos se facilitó la toma de muestras mediante el uso de una lámpara de luz roja de baja intensidad (<0.4 lux). El segundo grupo de peces (9 tanques de 8 animales cada uno) fue adaptado a las condiciones del laboratorio de forma similar al grupo 1, pero en este caso en el día del experimento se evitó el encendido de las luces, de forma que los animales permanecieron en situación de oscuridad constante durante 24 horas, no recibiendo alimento en este periodo de tiempo. En estos peces la toma de muestras se realizó en los mismos intervalos que en el caso anterior, pero empezando en CT3 (puntos muestreados: CT3, CT6, CT9, CT12, CT15, CT18, CT21, CT0, CT3‘) y siempre con ayuda de una lámpara de luz roja. En todos los peces incluidos en el experimento se tomaron muestras de sangre tras anestesia, así como de las regiones del intestino medio y posterior (40-50 mg tejido). En el caso de las muestras intestinales, se tomó una porción adicional de ambas regiones (media y posterior) en condiciones de asepsia (material y viales estériles) con el fin de cuantificar la expresión génica de los enzimas de la síntesis de melatonina. Experimento 3. Efecto del ayuno prolongado y la posterior realimentación sobre los ritmos diarios del contenido de melatonina intestinal Los peces fueron adaptados a las condiciones de estabulación mencionadas en el Experimento 1 (alimentados de forma rutinaria; una sola toma diaria a las 10:00 h a.m., 1% del peso del pez). Se establecieron tres grupos de peces que se llevaron en paralelo, distribuyéndose los animales de cada grupo en 8 tanques, cada uno conteniendo 8 peces, los cuales permanecieron en aclimatación durante al menos 10 días. Los grupos experimentales recibieron uno de estos tratamientos: i) peces alimentados normalmente (grupo control); ii) peces ayunados durante siete días; en el momento del alimento se realizaron las maniobras propias de la administración del mismo, es decir acercamiento del personal al tanque e izado de la red superior; iii) peces ayunados durante 7 días (similar al grupo anterior) y posteriormente realimentados (régimen alimenticio normal) durante otros 5 días. 94 Trabajo Experimental 3 Al término de cada periodo experimental (7 días de alimento normal en grupo control, 7 días de ayuno en grupo ayunado; 7 días de ayuno + 5 días de alimentación normal en grupo realimentado) se procedió al muestreo de los peces de cada tanque que fueron sacrificados a diferentes tiempos (n=8/punto) durante un ciclo de 24 horas: 14:00 (ZT6), 18:00 (ZT10), 21:00 (ZT13), 00:00 (ZT16), 04:00 (ZT20), 07:00 (ZT23), 10:00 (ZT3) y 14:00 (ZT6) horas del día siguiente. De cada animal se tomaron muestras de plasma y de intestinos medio y posterior, siguiendo los procedimientos descritos previamente. En las fases de oscuridad el muestreo se realizó con ayuda de una lámpara de luz roja de baja intensidad. Procedimientos analíticos Análisis de melatonina en plasma e intestino Inmediatamente tras la extracción de las muestras de sangre de los peces incluidos en cada uno de los experimentos, se procedió a su centrifugación a 12000 g durante 10 minutos. El plasma obtenido de cada muestra (500-600µl) fue dividido en alícuotas (200 µl) que fueron congeladas a - 80ºC hasta su posterior procesado. La extracción y cuantificación de melatonina en el plasma y en el TGI se realizó de acuerdo con el método descrito por Muñoz et al., (2009) y presentado en el Capítulo 1. Cuantificación de la expresión de aanat1 aanat2 y hiomt mediante qPCR En el Experimento 2 se obtuvieron muestras de intestino medio y posterior con el fin de cuantificar la expresión de los genes que codifican para las enzimas implicadas en la ruta biosintética de la melatonina. Los procedimientos de extracción de ARN y de cuantificación de la expresión génica de aanat1 aanat2 y hiomt mediante qPCR fueron idénticos a los descritos en el Capítulo 2 de la presente Memoria. Análisis estadísticos Todos los datos se expresan como el promedio ± E.E.M. En el Experimento 1 el análisis estadístico incluyó un ANOVA de dos vías con las variables ―grupo‖ y ―tiempo‖ para verificar el efecto de la pinealectomía sobre el contenido plasmático e intestinal de melatonina, seguido de un test de Student Neuwman Keuls (SNK) de comparaciones múltiples. En el Experimento 2, la existencia de variaciones diarias en el contenido de melatonina intestinal, así como en la expresión de genes, fue evaluado mediante un ANOVA de una vía seguido del test SNK para establecer comparaciones entre puntos concretos del ciclo diario. En el Experimento 3, se realizó una comparación entre las variaciones rítmicas diarias de melatonina en plasma e intestino de los distintos grupos de tratamiento mediante ANOVA de dos vías, seguido de un test SNK para comparación entre grupos en cada uno de los puntos diarios muestreados. En todos los análisis realizados, el grado de significación se estableció en P < 0.05. 95 Trabajo Experimental 3 Resultados Efecto de la pinealectomía sobre los niveles plasmáticos e intestinales de melatonina La Figura 1 muestra el contenido plasmático de melatonina en los grupos control, pinealectomizado y sham (operación simulada). Tanto en el grupo control como en el de operación simulada los niveles nocturnos de melatonina fueron significativamente superiores a los medidos en muestras procedentes de animales sacrificados durante el día. En cambio, dicha variación diaria en los niveles plasmáticos de melatonina desapareció completamente en el grupo de animales pinealectomizados. Melatonina en plasma (pg/ml) 400 b Dia Noche b 300 200 a a c 100 c 0 Control Pinealectomizado Sham Figura 1. Variaciones día: noche en los niveles de melatonina plasmática en truchas control, pinealectomizadas y sham. Las diferentes letras indican diferencias significativas entre grupos (P < 0.05). Por otra parte, no se detectaron diferencias significativas entre los valores de melatonina en el intestino medio de los animales del grupo control y sham muestreados de día y de noche (Figura 2), aunque si hubo una tendencia a mayores valores durante la noche. En el intestino posterior los valores nocturnos fueron significativamente mayores que los diurnos, hecho que también se constató en el grupo de animales sham. Además, la pinealectomía provocó la desaparición, en términos estadísticos, de la diferencia día/noche en dicha región intestinal, aunque se mantuvo una clara tendencia a mayores valores nocturnos que diurnos. 96 Trabajo Experimental 3 Melatonina (pg/ g tejido) 250 Dia Noche A 200 150 100 50 0 Control 350 Melatonina (pg/ g tejido) 300 Pinealectomizado Sham Dia Noche B * * 250 200 150 100 50 0 Control Pinealectomizado Sham Figura 2. Contenido de melatonina en intestino medio (A) y posterior (B) de truchas control, pinealectomizadas y sham sacrificadas en mitad del día (ZT6) y de la noche (ZT18). *, Variaciones significativas (P < 0.05) con respecto al día. Variaciones diarias del contenido intestinal de melatonina y 5HT y efecto de la oscuridad constante sobre los ritmos de melatonina en plasma e intestino En la Figura 3 se muestran las variaciones diarias del contenido de melatonina en intestino medio y posterior de animales mantenidos en condiciones lumínicas normales (ciclo L:D). El contenido de la hormona fue muy similar en ambos tejidos, no existiendo diferencias significativas entre ellos en ninguno de los intervalos de tiempo analizados. En ambos casos se observó un incremento de la hormona desde las primeras horas del día hasta la segunda mitad de la fase de luz, con un primer pico a ZT9, comenzando a descender hasta valores basales el inicio de la noche. Posteriormente se hallaron un segundo pico con valores máximos, en la mitad del periodo nocturno (ZT18). 97 Trabajo Experimental 3 Int. Medio Int. Posterior 500 Melatonina (pg/g tejido) * 400 * 300 200 100 0 3 6 9 12 15 18 21 0' Tiempo ZT Figura 3. Variaciones rítmicas diarias del contenido de melatonina en intestino medio y posterior de truchas arco iris mantenidas en condiciones normales de luz y oscuridad (n= 7-8/ por tiempo). *, P < 0.05, con respecto a los respectivos valores medidos en ZT0. El perfil diario del contenido de 5HT (Figura 4) también fue bastante similar en el intestino medio y posterior de la trucha. Sin embargo, dicho perfil fue bastante diferente al descrito para la melatonina, observándose los máximos valores en los peces sacrificados en mitad de la fase de luz (ZT6), previos al pico diurno hallado para la melatonina, alcanzándose el grado de significación en este intervalo en ambos tejidos (P < 0.05 respecto de ZT0 en cada tejido). Durante la noche no se hallaron variaciones significativas, aunque en intestino posterior la 5HT tendió a incrementar en las horas centrales de la noche (ZT18). Tal y como cabría esperar los niveles plasmáticos de melatonina (Figura 5) en animales aclimatados a condiciones normales de iluminación (L:D) se incrementaron significativamente durante la fase oscura del ciclo diario y permanecieron elevados durante toda la noche (Figura 5A). Con el fin de evaluar el carácter endógeno de las variaciones diarias en el contenido intestinal de melatonina, se expuso un grupo adicional de peces a condiciones de oscuridad constante (D:D) durante 24 horas. En estos animales, a nivel plasmático, se observó la ausencia de ritmo diario de los niveles de melatonina, con valores ligeramente superiores durante la fase nocturna en relación a la diurna (Figura 5B). 98 Trabajo Experimental 3 12000 Int. Medio Int. Posterior 5HT (ng/g tejido) 10000 * 8000 6000 4000 2000 0 3 6 9 12 15 18 21 0' Tiempo ZT Figura 4. Variaciones rítmicas diarias en el contenido de serotonina en intestino medio y posterior de la trucha arco iris (n= 7-8/ grupo). *, P < 0.05, con respecto a los respectivos valores medidos en ZT0. El efecto de la situación de oscuridad constante a nivel de intestino solamente pudo ser constatado en el intestino medio, debido a problemas técnicos surgidos durante el procesamiento de las muestras de intestino posterior. Tal y como se muestra en la Figura 6, el perfil de melatonina intestinal también mostró un aumento durante la fase de luz subjetiva, con un máximo a CT9. Adicionalmente se observó un segundo pico de mayor amplitud que alcanzó el grado de significación en la fase subjetiva de oscuridad a CT15, es decir 3 horas antes del pico de melatonina presente el peces mantenidos bajo situación de L:D. Variaciones diarias en la expresión de aanat1, aanat2 y hiomt en tejido intestinal de la trucha arco iris En la Figura 7 se muestran las variaciones diarias en la expresión del mRNA de aanat1, aanat2 y hiomt en intestino medio y posterior de la trucha. A excepción de la aanat2 en intestino posterior, los niveles de los transcrítos analizados exhibieron un claro ritmo diario, con un pico nocturno cuyo máximo fue localizado a ZT18. En relación a la hiomt, los valores de expresión relativa fueron similares en intestino medio y posterior, mientras que para la aanat1 y aanat2 fueron mayores en la región media. De manera sorprendente, la expresión de aanat2 en intestino medio no mostró aumento nocturno. 99 Trabajo Experimental 3 700 A Melatonina en plasma pg/ml 600 * * 500 * * 12 15 400 300 200 100 0 0 3 6 9 18 21 0' Tiempo ZT Melatonina en plasma pg/ml 1000 B 800 * * 12 15 600 400 200 0 0 3 6 9 18 21 0' Tiempo CT Figura 5. Variaciones diarias en los niveles plasmáticos de melatonina, en truchas sometidas a condiciones normales de iluminación (A) (L:D), o bajo condiciones de oscuridad constante (D:D), durante 24 horas (B). *, P < 0.05, con respecto a los respectivos valores medidos en ZT0. 100 Trabajo Experimental 3 600 Melatonina (pg/g tejido) * 500 400 300 200 100 3 6 9 12 15 18 21 0 3' Tiempo CT Figura 6. Variaciones diarias del contenido de melatonina en el intestino medio de truchas arco iris sometidas a oscuridad constante (D:D) durante 24 horas. * P < 0.05 con respecto a los respectivos valores observados en CT3. La Figura 8 muestra el patrón rítmico diario de expresión de aanat1, aanat2 y hiomt en el intestino medio de peces sometidos durante un periodo adicional de 24 horas a oscuridad constante. A efectos de comparación con la situación de L:D, la figura también muestra la localización del máximo diario hallado bajo un ciclo lumínico normal. En condiciones de D:D se observó un perfil rítmico de expresión de aanat1, aanat2 y hiomt, cuyo pico se localizó durante la noche subjetiva (CT15), es decir con 3 horas de adelanto con respecto a lo observado en animales mantenidos bajo un ciclo L:D. No se halló cambio alguno durante la fase de día subjetivo. Los valores de amplitud medidos para aanat1 y hiomt fueron similares en D:D y L:D, mientras que para la aanat2, la amplitud del ritmo fue significativamente menor en oscuridad constante en comparación con la situación lumínica normal (L:D). 101 Trabajo Experimental 3 Int. Medio Int. Posterior aanat1 (Expresión relativa) 50 A *a 40 30 20 * * 10 0 0 3 9 12 15 18 21 0' Int. Medio Int. Posterior 60 aanat2 (Expresión relativa) 6 B *a 50 *a 40 30 *a *a 20 a a 10 0 0 3 6 9 12 15 18 21 0' Int. Medio Int. Posterior 14 C hiomt (Expresión relativa) 12 ** 10 8 ** * * 6 4 2 0 0 3 6 9 12 15 18 21 0' Tiempo ZT Figura 7. Variación rítmica diaria del contenido de mRNA de aanat1 (A), aanat2 (B) y hiomt (C) en condiciones normales L:D, en intestino medio y posterior de la trucha arco iris. * P < 0.05 con respecto a los respectivos valores basales de cada región intestinal; a P < 0.05 respecto al intestino posterior. 102 Trabajo Experimental 3 aanat1 (Expresión relativa) 50 A Condición D:D Condición L:D * 40 30 * * 20 10 0 3 6 9 12 15 18 21 0 3´ aanat2 (Expresión relativa) 60 B Condición D:D Condición L:D 50 40 30 * * 20 10 0 3 6 9 12 15 18 21 0 3´ hiomt (Expresión relativa) 14 C Condición D:D Condición L:D 12 * 10 8 * * 6 4 2 0 3 6 9 12 15 18 21 0 3´ Tiempo CT Figura 8.Variaciones diarias de la expresión genica de las enzimas aanat1(A), aanat2 (B) y hiomt (C) en el intestino medio de truchas arco iris aclimatadas durante 2 semanas a condiciones de luz normales (L:D) y luego sometidas durante 24 horas a oscuridad constante (D:D). * P < 0.05 respecto de los valores basales. Con el fin de facilitar la comparación con los datos en L:D, se insertaron los valores de la franja horaria en la que se obtuvo el pico de expresión en L:D (Línea discontinua, círculos blancos). 103 Trabajo Experimental 3 Efecto del ayuno y la realimentación sobre las variaciones diarias de melatonina en plasma y tracto gastrointestinal de la trucha A nivel plasmático, se observó un claro ritmo diario en los niveles de melatonina en todos los grupos experimentales (peces control, ayunados durante 7 días, realimentados), siendo los valores nocturnos significativamente superiores a los diurnos (Figura 9). El periodo de valores elevados de melatonina fue más prolongado en los animales ayunados que en los del grupo control, dado que en los primeros ya se apreció un incremento significativo al final de la fase luminosa (18:00 horas; P < 0.05 respecto del grupo control), hecho que no aconteció en los restantes grupos. Por otro lado, la amplitud del pico nocturno también fue diferente según el tratamiento. Así, los niveles máximos nocturnos observados en el grupo ayunado fueron significativamente superiores (21:00 y 00:00 horas) a los detectados en el grupo control (P < 0.05). Por su parte, la realimentación (5 días tras el ayuno) revirtió parcialmente el efecto del ayuno sobre los niveles plasmáticos de melatonina, siendo sus valores similares a los del grupo control. Melatonina plasmatica (pg/ml) 1000 * Control Ayunados Realimentados * 800 *# 600 400 * 200 0 14:00 18:00 21:00 00:00 04:00 07:00 10:00 14:00 Tiempo (horas del dia) Figura 9. Ritmo diario de los niveles de melatonina en plasma de truchas alimentadas de forma normal (grupo control), ayunadas durante 7 días y realimentadas (5 días de alimentación tras 7 días de ayuno). En el gráfico los valores representan la media ± EEM de 5-7 muestras. * P < 0.05 vs. grupo control. #, P < 0.05 vs. grupo ayunado. Con respecto al efecto de la condición alimenticia sobre los niveles de melatonina en intestino, los resultados se muestran en la Figura 10. Tanto en el intestino medio como en el posterior, el perfil diario de los niveles de melatonina fue similar al observado en el Experimento 2, con ligeros aumentos durante la fase de luz (18:00 h) y en mitad de la fase de oscuridad (04:00 h) del fotociclo diario. A nivel del intestino medio, los peces ayunados 104 Trabajo Experimental 3 durante 7 días mostraron valores mayores que los del grupo control durante gran parte de la fase diurna, siendo significativamente más elevados a las 14:00 h y 18:00 h, así como al inicio de la noche (21:00 h). A partir de ese momento, los niveles de melatonina en intestino medio descendieron drásticamente en el grupo ayunado, alcanzando valores visiblemente menores, aunque no significativos, que el control a las 04:00 h. La realimentación de los animales revirtió parcialmente el incremento diurno del contenido de melatonina observado en los ayunados y provocó un incremento de la amplitud de los niveles nocturnos de la indolamina (04:00 horas; P < 0.05 vs ayunados). Al igual que en el intestino medio, el perfil diario del contenido de melatonina en el intestino posterior se vio alterado en los animales ayunados con respecto a los controles (figura 11), presentando valores significativamente mayores durante la primera mitad de la noche (21:00 h; 00:00 h, P < 0.05 vs control). A continuación se observó una fuerte disminución de los mismos coincidiendo el mínimo con el máximo nocturno del grupo control (04.00 h, P < 0.05), recuperándose en los sucesivos intervalos. La realimentación de los animales revirtió casi por completo el efecto del ayuno sobre el perfil rítmico del contenido de melatonina en el intestino posterior de la trucha, no existiendo diferencias con respecto al grupo control en ninguno de los tiempos estudiados. 1000 Melatonina (pg/ g tejido) 800 * Control Ayunados Realimentados *# 600 *# e 400 200 # 0 14:00 18:00 21:00 00:00 04:00 07:00 10:00 Tiempo (Horas del dia) Figura 10. Variaciones diarias en el contenido de melatonina en el intestino medio de truchas control (alimentación normal), ayunadas durante 7 días, y realimentadas (5 días tras 7 días de ayuno). Los valores representan la media ± EEM de 7-8 animales. * P < 0.05 vs control en cada uno de los tiempos; # P < 0.05 respecto del grupo de animales realimentados en cada uno de los tiempos. 105 Trabajo Experimental 3 Control Ayunados Realimentados 600 Melatonina (pg/ g tejido) 500 400 *# *# 300 200 *# 100 0 14:00 18:00 21:00 00:00 04:00 07:00 10:00 Tiempo (Horas del dia) Figura 11. Variación diaria del contenido de melatonina en el intestino posterior de grupos de truchas control (alimentadas normalmente), ayunadas (durante 7 días) y realimentadas (5 días tras 7 días de ayuno). Los valores representan la media ± EEM de 7-8 datos. * y # P < 0.05 respecto de los grupos control y realimentados, respectivamente, en cada uno de los tiempos estudiados. 106 Trabajo experimental 4 Efecto de la ingesta y el paso de alimento por el tracto digestivo sobre la síntesis local de melatonina en la trucha arco iris. Trabajo experimental 4 Introducción y objetivos En los trabajos previos hemos presentado evidencias claras de que la melatonina es sintetizada en el tracto digestivo de la trucha arco iris, incluyendo la descripción de los niveles de melatonina en diferentes regiones del TGI, pruebas histológicas de la presencia de células conteniendo melatonina, serotonina y AANAT en la pared digestiva, efecto de la pinealectomía, expresión de los genes aanat1, aanat2 y hiomt, así como la existencia de cambios diarios en los niveles de melatonina intestinal y en la expresión génica, pudiendo ser modulados por el fotoperiodo y el alimento. De estos últimos resultados (Trabajo 3) hemos extraído la idea de un posible control circadiano de la síntesis de melatonina intestinal, mostrándose los ritmos de la indolamina ajustados al ciclo lumínico al cual se expone el animal. En los peces, sin embargo, la información disponible sobre los mecanismos circadianos a nivel periférico es escasa, aunque Velarde et al., (2009a) demuestran en el intestino de carpín la existencia de expresión rítmica de genes (cryptochrome y period) que forman parte de la maquinaria molecular del reloj circadiano. Este grupo también aportó evidencias de expresión rítmica de aanat y hiomt en el intestino posterior del carpín (Velarde et al., 2010a), indicando que en el caso de la aanat2 los ritmos de expresión permanecen inalterados bajo condiciones lumínicas constantes, lo que sugiere la existencia de una regulación circadiana de la síntesis intestinal de melatonina. Algo similar podría ocurrir en la trucha arco iris, dado que nuestros datos claramente muestran que los ritmos de expresión de aanat y hiomt en intestino medio persiste en un ambiente lumínico constante (Trabajo 3). Sin embargo no se puede descartar la existencia de un posible efecto modulador del factor alimenticio, independiente del mecanismo circadiano. La luz, bien sea actuando de forma directa o a través del ajuste del sistema circadiano, es el principal factor regulador de la síntesis de melatonina en tejidos fotorreceptores tales como el órgano pineal y la retina (Falcón, 1999; Ceinos et al, 2005), provocando una inhibición de la expresión y actividad de la enzima AANAT (Falcón, 1999; Ceinos et al., 2008). No obstante, es improbable que la síntesis de melatonina a nivel del TGI responda al estímulo lumínico, tal y como lo hacen las células fotorreceptoras pineales y retinales. Por tanto, un efecto modulador de la formación intestinal de melatonina por estímulos no fóticos parece ser más consecuente con la naturaleza no fotorreceptora de este tejido. En los peces, aunque existen algunos datos del efecto del ayuno sobre la melatonina a nivel del TGI (ver Trabajo 3), se ha postulado que el acceso a la comida podría también contribuir al ajuste circadiano de la síntesis de esta hormona, al igual que ocurre con otras funciones circadianas periféricas (Sánchez-Vázquez et al., 1996; Bolliet et al., 2001; Velarde et al., 2010a). La funcionalidad digestiva está condicionada por los patrones de ingesta y por el discurrir del alimento ingerido a lo largo del tubo digestivo, por lo que el factor alimenticio ha recibido atención como potencial modulador de la síntesis de melatonina en el TGI. Así, Bubenik et al., (2002) en ratón demuestran que el ayuno durante 24 y 48 h aumenta 109 Trabajo experimental 4 los niveles de melatonina en estómago e intestino, hecho que también parece ocurrir en la trucha arco iris a nivel intestinal y pineal a los 7 días de ayuno (Ceinos et al., 2008; Trabajo 3). No obstante, el comportamiento inmediato tras la ingesta podría ser diferente. Así, en humanos y cerdos se ha descrito que los niveles de melatonina periférica, que en parte podrían provenir de la síntesis intestinal, se incrementan poco tiempo tras la ingesta (DeBoer, 1988; Rice et al., 1995). Asimismo, el paso de alimento a lo largo del TGI redunda en un aumento considerable del contenido estomacal e intestinal de melatonina en el ratón (Bubenik y Pang, 1994), algo similar a lo que ocurre con los niveles de la hormona en la circulación portal hepática del cerdo (Bubenik et al., 2000b). El mecanismo por el cual la presencia de alimento en el TGI afecta al contenido de melatonina no está claro. Sin embargo, se sabe que la estimulación mecánica de la mucosa, los nutrientes y diversos factores neurohormonales liberados al lumen del tracto digestivo, junto con la presencia de alimento, son potentes reguladores de la actividad neuroendocrina intestinal, en general y, en particular, de la serotoninérgica (Bertrand y Bertrand, 2010). Ello nos ha llevado a hipotetizar que estos factores u otros relacionados con el transito digestivo del alimento, puedan también afectar a la síntesis de melatonina en el TGI de la trucha arco iris. Por todo ello, el objetivo general del presente Trabajo se ha centrado en evaluar el efecto de la ingesta y de la presencia de alimento en el tracto digestivo sobre la producción de melatonina en el propio intestino y otros órganos relacionados con la actividad digestiva en la trucha arco iris. Materiales y métodos Animales de experimentación En el presente estudio se utilizaron ejemplares inmaduros de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) de 100 ± 4 g de peso corporal. Los peces se obtuvieron de una piscifactoría (Soutorredondo, Lousame, A Coruña) y se trasladaron en tanques con suministro continuo de oxígeno hasta las instalaciones experimentales en la Universidad de Vigo, donde fueron transferidos a cubas de fibra de vidrio de 120 litros dotadas de sistemas de circulación continua de agua declorada y filtrada (14 1ºC) y difusión de aire. Los peces se mantuvieron bajo un fotoperiodo artificial de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad (L:D 12:12) y con una intensidad lumínica de 400 lux durante el día. El alimento se suministró una vez al día (ZT3) y consistió en pienso seco comercial (Dibaq-142 Diproteg SA., Segovia; Composición aproximada: 48% proteína, 14% carbohidratos, 25% grasas, y 11.5% extracto seco; 20.2 MJ/kg de pienso). La cantidad diaria de alimento suministrado fue del 1% de la masa corporal de los animales. Los experimentos fueron acordes con la directiva de manipulación de animales de la Unión Europea (86/609EU) y con las Leyes españolas para el uso de animales en investigación (RD 1201/2005). 110 Trabajo experimental 4 Diseño experimental y toma de muestras Se usaron dos grupos de 50 truchas cada uno, distribuidas en 10 tanques (n=10/tanque). Todos los animales recibieron alimento a las 10 h de la mañana (ZT2) durante al menos 2 semanas previas del inicio del experimento. Transcurrido dicho periodo, uno de los grupos recibió alimento a la hora habitual (grupo control), mientras que el segundo grupo se mantuvo en ayunas durante 72 horas (grupo ayunado), con el fin de asegurar la ausencia de restos del alimento en todo el TGI. Transcurrido ese tiempo, los animales de ambas grupos fueron sacrificados en los siguientes momentos, tomados en referencia a la hora habitual de suministro del alimento: -120 minutos (pre-ingesta, solo en animales del grupo control), 20 minutos, 120 minutos, 240 minutos y 360 minutos (postingesta). Estos tiempos fueron elegidos, en base a observaciones previas sobre la cronología del paso del alimento por el TGI de la trucha arco iris (Tabla 1). Tabla 1. Cronología del paso del alimento a través de las diferentes zonas del TGI Tiempo post ingesta 0-2 hora Zona del TGI donde se encuentra el alimento Esófago y estómago Observaciones 2 horas Estómago, intestino anterior y ciegos pilóricos 4 horas Estómago (en menor cantidad), intestino anterior, ciegos y intestino medio Intestino anterior, Ciegos pilóricos, intestino medio 5 horas 6 horas 8 horas El alimento es tragado y comienza su acumulación en el estomago, en el cual es triturado y ablandado. Comienza el paso del alimento desde el estomago hacia el intestino anterior y ciegos pilóricos, liberación de bilis en el paso del estomago hacia el intestino anterior y ciegos. El alimento llega al intestino medio, junto con bilis liberada, y se termina el vaciado del estomago. El alimento se encuentra en su mayoría en la zona del intestino anterior, ciegos pilóricos e intestino medio. El alimento comienza a llegar a la zona del intestino posterior Intestino anterior, Ciegos pilóricos, intestino medio y intestino posterior Ciegos pilóricos, intestino medio y posterior El alimento se encuentra, en todas las zonas intestinales. 24 horas Intestino medio y posterior Restos de alimentos se encuentran en el intestino medio y su gran mayoría está en el intestino posterior 48 horas Intestino posterior Al cabo de este tiempo, aun se encuentra alimento en el intestino posterior. La zona del intestino anterior y medio, ya sin alimento, presentan una coloración amarilla verdosa. 111 Trabajo experimental 4 Para la toma de muestras las truchas fueron anestesiadas por inmersión en una solución de MS-222 (50mg/L) y pesadas previamente a la extracción de sangre, que se realizó mediante punción en la vena caudal con jeringas heparinizadas. Inmediatamente después, se sacrificaron y se extrajo el intestino en su integridad, procediéndose de forma inmediata al vaciado del contenido luminal que se recogió en viales para análisis posteriores. En el caso de los animales que recibieron alimento (grupo control), se constató la presencia del mismo en el tubo digestivo como señal evidente de que todos habían ingerido alimento. En el caso de los peces ayunados, el volumen luminal recogido fue muy pequeño y básicamente estaba formado por una secreción mucosa amarillenta (indicativo de la secreción de bilis al lumen intestinal). Posteriormente, el tejido intestinal fue seccionado para obtener diferentes regiones (intestino anterior, medio y posterior). Para la cuantificación de la expresión de aanat1, aanat2 y hiomt y el efecto de la presencia de alimento se tomaron muestras de intestino medio a diferentes tiempos (120 min) o después de la ingesta (20, 120, 240 y 360 min), tanto en animales ayunados como alimentados. También se extrajo una muestra de hígado, así como la vesícula biliar (con todo su contenido) que se introdujo en un vial con el fin de vaciar la totalidad de bilis contenida. El volumen de bilis se midió con una micropipeta, e inmediatamente después se separó una muestra para su congelación. Todas los viales de las muestras obtenidas en el procedimiento fueron congelados inmediatamente en hielo seco y posteriormente a -80ºC hasta su procesado. Procedimientos analíticos La muestras de sangre fueron centrifugadas (13200 rpm, 10 min a 4ºC) tras su obtención a fin de separar el plasma, el cual fue dividido en alícuotas que se congelaron a -80ºC. El proceso de extracción de melatonina en el plasma, así como en la bilis y en los tejidos intestinales, se realizó conforme a los protocolos previamente establecidos (Muñoz et al., 2009) y descritos en el Capítulo 1 de la presente Memoria. Con respecto a las muestras de contenido luminal, se tomó un volumen de 200 l de cada una (o un volumen menor en algunas muestras de animales ayunados) que fue mezclado con HCl 0.1N y centrifugado (13200 rpm, 5 min a 4ºC). El sobrenadante obtenido se sometió al mismo proceso de extracción de melatonina con cloroformo que el plasma y la bilis. El análisis de melatonina se llevó a cabo siguiendo los procedimientos descritos en Muñoz et al., (2009) y descritos en el Capítulo 1 de la presente Memoria, con modificaciones. En este caso, aunque las características generales del sistema de HPLC fueron similares, se utilizó una columna analítica Phenomenex Kinetex C-18 de 2.6 m de diámetro de partícula y 50 mm de longitud, a través de la cual se hizo pasar la fase móvil (igual composición a la indicada en el Trabajo 1) a un flujo de 0.7 ml/minuto y a temperatura ambiente. Aunque la menor longitud y diámetro de esta columna, en relación a la usada previamente, exige un volumen de carga menor, las características de su relleno (partículas de diámetro muy reducido, gran empaquetamiento) permiten obtener una resolución muy elevada y una mayor sensibilidad (incremento de hasta 3 veces) al acelerar 112 Trabajo experimental 4 la salida de los compuestos separados. De hecho, con el uso de esta columna se consiguió un tiempo de análisis por muestra muy reducido (cromatogramas de 6-7 minutos, ver figura 1) y una considerable reducción en los costes analíticos (flujo reducido de la fase móvil, menor tiempo de análisis). A B Figura 1. Comparación de resolución y tiempos de análisis entre las columnas utilizadas. (A) Patrón de melatonina con 100 pg inyectado en columna utilizada con anterioridad (Beckmann Ultrasphere ODS) (B) Melatonina 100 pg inyectada en columna (Phenomenex Kinetex C-18). La expresión de los genes aanat1, aanat2 y hiomt se evaluó siguiendo los procedimientos de extracción, retrotranscripción y cuantificación descritos en el Capítulo 2 de la presente Memoria. Análisis estadísticos Todos los datos se muestran como el promedio ± E.E.M. para cada tejido evaluado. Dentro de cada grupo de tratamiento (alimentado y ayunado) se compararon los distintos tiempos mediante un ANOVA de una vía seguido de un test SNK de comparaciones múltiples. En cada uno de los intervalos de tiempo, las comparaciones entre ambos grupos se realizaron mediante la prueba de la T de Student para muestras independientes. En todos los análisis realizados, el grado de significación se estableció en P < 0.05. 113 Trabajo experimental 4 Resultados Niveles de melatonina en intestino, hígado y bilis Como se muestra en la Figura 1, las truchas que recibieron alimento mostraron cambios dependientes del tiempo en el contenido intestinal de melatonina. Tomando como referencia el punto de muestreo pre-ingesta (2 horas antes de administrar alimento) se observa un aumento significativo en el contenido de melatonina en intestino anterior (120 y 360 min), medio (120, 240 y 360 min) y posterior (20 y 360 min). También es importante señalar que en el grupo de animales alimentados, el incremento del contenido de melatonina se produjo en el intestino anterior y en el intestino medio (Figura 1A y 1B) a los 120 minutos después de la toma de alimento, mientras que en el intestino posterior (Figura 1C) dicho incremento no fue significativo hasta pasados 360 minutos, lo que podría indicar la existencia de un patrón temporal de aumento de los niveles de melatonina en relación con el tránsito del alimento por las distintas regiones. Además en el intestino posterior se observó un incremento significativo del contenido de melatonina a los 20 minutos post-ingesta, el cual podría estar asociado a una respuesta reguladora que afectaría únicamente a este patrón intestinal. Sin embargo, en los peces que no recibieron alimento (ayuno durante 72 horas), no se observaron aumentos dependientes del tiempo, e incluso en intestino anterior y posterior se observó una tendencia al descenso (intestino anterior: P < 0.05 a 360 min vs 20 min; intestino posterior: P < 0.05 a 240 y 360 min vs 20 min). Al igual que en el grupo control, el intestino posterior de los animales ayunados mostró un incremento significativo del contenido de melatonina en los primeros 20 minutos, lo que indicaría la persistencia del mismo mecanismo regulador local en el intestino posterior que el observado en los peces control. La Figura 2 muestra el volumen de bilis existente en la vesícula biliar en cada grupo experimental en el momento de sacrificio de los animales. Como era de esperar, el volumen de bilis varió significativamente a lo largo del tiempo en el grupo de animales alimentados, de modo que disminuyó de forma rápida y continua tras la ingesta, alcanzándose los valores mínimos en los animales sacrificados 360 min después de ser alimentados. En el grupo de animales ayunados, el volumen de bilis fue estable y los valores similares a los hallados en los animales alimentados en el periodo pre-ingesta (-120 min) e inmediatamente tras la ingesta (20 min). Los niveles de melatonina presentes en el contenido luminal del intestino, así como la concentración de la hormona en el tejido hepático y la bilis se muestran en la Figura 3. Cuando se analizó el contenido de melatonina presente en el contenido luminal de los peces alimentados (Figura 3A), se observó un incremento significativo a los 120 minutos tras recibir el alimento (P < 0.05 respecto del grupo -120 min; P < 0.05 respecto al grupo ayunado), el cual se mantuvo elevado hasta los 240 minutos (P < 0.05 respecto del grupo 114 Trabajo experimental 4 ayunado). A partir de ese momento se observó una disminución paulatina del contenido de melatonina, hasta alcanzar valores pre-ingesta a los 360 min. En cambio, el grupo de peces ayunados no mostró variaciones en el contenido de melatonina a lo largo del tiempo. El contenido hepático de melatonina (Figura 3B) no se vio significativamente alterado a lo largo del tiempo en ninguno de los grupos analizados (alimentados y ayunados). Únicamente a los 240 minutos post-ingesta el contenido hepático de melatonina en los animales control tendió a ser superior al medido en los peces ayunados. Con respecto a la concentración de melatonina en la bilis (Figura 3C), no hubo cambios dependientes del tiempo en ninguno de los grupos estudiados. Sin embargo, la concentración de melatonina fue siempre superior en las truchas alimentadas que en las ayunadas. Así, tanto a 20 como a 240 y 360 minutos post-ingesta el contenido de biliar de la indolamina fue significativamente superior en los animales alimentados (P < 0.05 respecto al grupo de ayunadas en dichos intervalos). Es importante señalar que en el hígado y vesícula biliar, el incremento en los niveles de melatonina en los peces alimentados se produjo tanto a tiempos cortos (20 min) como largos (a partir de los 240 minutos post-ingesta), con respecto a lo observado en el grupo de animales ayunados. 115 Trabajo experimental 4 500 Ayunado Alimentados A Melatonina (pg/g tejido) * # 400 *# 300 a 200 100 0 Melatonina (pg/g tejido) 500 B * * * 400 300 # 200 100 0 400 C Melatonina (pg/g tejido) # *$ 300 * 200 100 0 -120 20 120 240 360 Tiempo(minutos) Figura 1. Contenido de melatonina en muestras de intestino (A) anterior, (B) medio y (C) posterior procedentes de dos grupos de truchas arco iris, ayunadas y alimentadas, sacrificadas a diferentes tiempos en relación al momento de la ingesta (tiempo 0). * P < 0.05 con respecto al grupo de ayunadas (n=8/grupo). # P< 0.05 respecto de los demás tiempos dentro del mismo grupo (n=8/grupo). 116 Trabajo experimental 4 350 Ayunados Alimentados Volumen de Bilis (µl) 300 250 200 $ 150 *$ 100 *# 50 0 -120 20 120 240 360 Tiempo (minutos) Figura 2. Variación temporal del volumen de la vesícula biliar en truchas alimentadas y ayunados. Los tiempos se tomaron en relación al momento de la ingesta (tiempo 0) * P < 0.05 respecto del grupo de peces ayunados (n=8/grupo). # P < 0.05 con respecto a los demás tiempos del mismo grupo. Expresión de aanat1, aanat2 y hiomt en intestino medio La expresión génica de annat1, aanat2 y hiomt en el intestino medio (Figura 4), cambió de forma drástica a lo largo del tiempo en el grupo de animales alimentados, no observándose cambios apreciables en los peces ayunados. Hay que mencionar que solo se procesaron muestras procedentes de intestino medio, debido a que esta zona es la que presentó una mayor producción de melatonina con respecto al resto de regiones del TGI. En los animales alimentados, la expresión de aanat1 (Figura 4A) sufrió variaciones dependientes del tiempo. Así, a los 20 y 120 minutos de recibir el alimento la expresión de aanat1 se incrementó de forma significativa con respecto a lo observado en el resto de intervalos temporales (P < 0.05 para cada uno de ellos). Además, en estos mismos intervalos la expresión de aanat1 en los animales alimentados fue muy superior a la medida en los peces ayunados (P < 0.05 para cada uno de ellos). Por otro lado, la expresión de aanat2 (Figura 4B) en las truchas alimentadas fue significativamente mayor a la observada en las ayunadas en todos los tiempos analizados, salvo a los 360 minutos. Además, la expresión de aanat2 se mantuvo elevada en el grupo de animales alimentados desde dos horas antes de la ingesta hasta los 240 minutos postingesta con respecto a la expresión medida a los 360 minutos en el mismo grupo (P<0.05 respectivamente), momento este último en el cual la expresión de aanat2 disminuyo drásticamente hasta valores similares a los del grupo ayunados. 117 Trabajo experimental 4 La expresión de hiomt (Figura 4C) también fue afectada únicamente en el grupo de animales alimentados. La expresión de hiomt se incrementó de forma significativa a los 20 minutos post-ingesta en los animales alimentados, comparado tanto con el resto de intervalos en el mismo grupo (P < 0.05) como con respecto al grupo de truchas ayunadas (P < 0.05). Durante el resto de intervalos temporales, la expresión de hiomt no se modificó en ambos grupos de peces. 118 Trabajo experimental 4 7000 A Ayunados Alimentados *# Melatonina (pg/ml) 6000 5000 * 4000 3000 2000 1000 0 180 -120 20 120 240 360 -120 20 120 240 360 B Melatonina (pg/g tejido) 160 140 120 100 80 60 40 20 0 4000 C Melatonina (pg/ml) * * 240 360 * 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 -120 20 120 Tiempo (minutos) Figura 3. Variaciones temporales en el contenido luminal intestinal de melatonina (A) y niveles de la hormona en hígado (B) y en bilis (C) de peces alimentados y peces ayunados durante 72 h. Los tiempos se tomaron en relación al momento de la ingesta (tiempo 0). Los datos se expresan como el promedio ± EEM (n=8/grupo). * P < 0.05 con respecto al grupo de animales ayunados. # P < 0.05 con respecto al resto de tiempos dentro del mismo grupo experimental. 119 Trabajo experimental 4 aanat1 (Expresión relativa) 12 A *# 10 Ayunados Alimentados 8 6 *# 4 2 0 -120 18 20 B 120 240 360 * aanat2 (Expresión relativa) 16 * 14 12 * 10 8 6 4 # 2 0 -120 hiomt (Expresión relativa) 4 20 120 240 360 120 240 360 *# C 3 2 1 0 -120 20 Tiempo (minutos) Figura 4. Variaciones temporales en la expresión de aanat1 (A), aanat2 (B) y hiomt (C) en el intestino medio de truchas arco iris alimentadas o ayunadas (72h). Los tiempos se tomaron en relación al momento de la ingesta (tiempo 0). Los datos se representan como la media ± EEM (n=4/grupo) * P < 0.05 con respecto a los animales ayunados. # P < 0.05 respecto al resto de intervalos temporales en el mismo grupo. 120 Trabajo experimental 5 Efecto modulador del L-triptófano sobre la síntesis de melatonina en el tracto gastrointestinal de la trucha arco iris. Trabajo experimental 5 Introducción y objetivos La ruta de síntesis de la melatonina implica en primer lugar la hidroxilación del aminoácido esencial L-Triptófano (L-Trp), por acción de la enzima triptófano hidroxilasa, rindiendo 5-hidroxitriptófano (Lovenberg et al., 1967), el cual es descarboxilado para formar serotonina. La transformación de este indol hacia melatonina conlleva su Nacetilación y la posterior ortometilación (Reiter, 1991). En todo este proceso, hay dos pasos que podrían actuar como limitantes: el primero es la actividad de la TPH que determina la tasa de síntesis de 5HT (Boadle-Biber, 1993); el segundo es la actividad enzimática AANAT, que limita la formación de melatonina al menos en el órgano pineal y la retina (Klein et al., 1997; Klein, 2007). En el órgano pineal de los peces, principal fuente de melatonina en el organismo, la regulación de la actividad AANAT es crítica en el proceso de síntesis de melatonina, en particular durante la noche cuando la mayor parte de la 5HT acumulada en las células pineales es transformada a melatonina (Falcón et al., 2009; 2010). En el cerebro, sin embargo, la mayor parte de la 5HT es degradada mediante una monoamino oxidasa para formar un producto inactivo, el ácido 5-hidroxiindolácetico (5HIAA). Tanto en mamíferos como en peces, el TGI también realiza una importante síntesis de melatonina a partir de la 5HT presente en el propio tracto, bien en las células enterocromafines (EC, en particular en mamíferos), bien en terminaciones neuronales que inervan la pared intestinal, como ocurre en la trucha arco iris, (ver Caamaño-Tubio et al., 2006; Trabajo 2). En trabajos previos hemos demostrado la presencia de elevados niveles de 5HT en el TGI de la trucha arco iris (Trabajo 2), superiores en un rango 1000:1 a la concentración de melatonina medida en estos tejidos. También los niveles de 5HIAA a nivel intestinal son muy bajos en relación al contenido de 5HT, sugiriendo que una gran cantidad de este indol podría no ser accesible a la acción de enzimas. Este hecho anima a pensar que tanto la actividad de la enzima AANAT como la de la HIOMT podrían tener un papel de menor relevancia, en comparación con la disponibilidad de 5HT, en los cambios que ocurren en los niveles de melatonina. La disponibilidad del aminoácido L-Trp determina la tasa de síntesis de 5HT a nivel central (Fernstrom, 1983), al igual que lo hace en la glándula pineal (Ehret et al., 1991; Bessancon et al., 1996). Así, se ha descrito que, tanto una dieta rica en L-Trp como la administración del aminoácido por vía i.p. resultan en un aumento de sus niveles intracelulares, promoviendo un incremento de la síntesis de 5HT en cerebro (Fernstrom y Wurtman, 1972) y pineal (Young y Anderson, 1982; Reiter et al., 1990). Sin embargo, en roedores este aumento de la 5HT apenas modifica los niveles de melatonina en la glándula pineal (Reiter et al., 1990; Paz-Valiñas, 2009), aunque si aumenta de forma considerable la concentración plasmática de la hormona tanto en animales normales (Huether et al., 1992; Yaga et al., 1993) como en pinealectomizados (Yaga et al., 1993). En base a ello se ha postulado que la administración exógena de L-Trp produce un aumento de la síntesis de 123 Trabajo experimental 5 melatonina en el intestino, la cual podría repercutir posteriormente en el incremento de los niveles de la hormona en la circulación periférica (Huether et al., 1992; Yaga et al., 1993; Bubenik et al., 1996). Los peces son animales con un elevado metabolismo proteico, siendo el L-Trp un aminoácido esencial en su dieta (Johnston y Glanville, 1991; Navarro et al., 1996). Se ha demostrado que la alimentación de truchas arco iris con dieta suplementada con L-Trp resulta en la supresión del comportamiento agresivo (Winberg et al., 2001) y una disminución de la respuesta de estrés (Lepage et al., 2002; 2003; Höglund et al., 2007), efectos que podrían derivar del incremento de la disponibilidad y liberación de 5HT cerebral inducido por el tratamiento (Johnston y Glanville, 1991; Aldegunde et al., 2000; Hseu et al., 2003), aunque también se ha propuesto un papel de la melatonina en estos efectos (Azpeleta et al., 2010). Menos información existe sobre la capacidad del L-Trp para modular los niveles de 5HT y melatonina a nivel intestinal. Estudios in vitro recientes realizados en la trucha han demostrado un efecto estimulador del L-Trp sobre la síntesis intestinal de melatonina (Lepage et al., 2005a), hecho que contrasta con los débiles cambios observados por Herrero et al., (2007) en la lubina alimentada con una dieta suplementada con L-Trp. En el presente Trabajo hemos evaluado en la trucha arco iris la hipótesis de un posible papel modulador del L-Trp en el contenido intestinal de melatonina, así como en el de su precursor, la 5HT. Dado que en mamíferos se ha postulado que los efectos de este aminoácido están condicionados por la vía de administración (Huether et al., 1992), hemos procedido a explorar los efectos derivados de la administración oral (en la comida) y parenteral (i.p.). En el primer caso también hemos obtenido algunos datos adicionales relativos a los patrones de ingesta y de estrés derivados del tratamiento con el aminoácido. Materiales y métodos Animales de experimentación y recolección de muestras Los ejemplares de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) se obtuvieron en una piscifactoría situada en Soutorredondo (Lousame, A Coruña) y fueron transportados en tanques dotados de suministro continuo de oxígeno hasta las instalaciones en la Universidad de Vigo, donde se mantuvieron en cubas de 120 litros, con circulación continua de agua y dotadas de un sistema de difusión de aire. Los peces, con una masa de 160 ± 6 g (media ± E.E.M.) fueron mantenidos en fotoperiodo artificial de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad (L:D 12:12; intensidad lumínica de 400 lux en la superficie del agua). La temperatura del agua se mantuvo en 14±1ºC. Durante el periodo de aclimatación, nunca inferior a los 15 días, los peces fueron alimentados con pienso seco comercial (Dibaq-142 Diproteg SA., Segovia, España; composición aprox.: 48% proteína cruda, 6% carbohidratos, 5% grasa cruda, y 15% ceniza), suministrado una vez al día (10:00 horas). Todos los experimentos realizados cumplen con la directiva de manipulación de animales 124 Trabajo experimental 5 de la Unión Europea (86/609EU) y con las leyes españolas para el uso de animales en investigación (RD 1201/2005). Experimento 1. Efecto de dietas enriquecidas con L-Trp sobre la ingesta, el contenido intestinal de melatonina y 5HT, así como en los niveles de melatonina y cortisol en plasma Para llevar a cabo este estudio, se utilizaron 3 grupos de truchas que fueron distribuidas en 9 cubas de 120 litros cada una (n=10/cuba). Una vez aclimatados los animales a las nuevas condiciones, se procedió a alimentar a los peces de cada grupo con dietas diferentes: i) pienso normal (control); ii) pienso suplementado con 0.5 g de LTrp/100 g de pienso; iii) pienso suplementado con 2.5 g de L-Trp/100 g. Para preparar estos tratamientos, se procedió a desmenuzar una cierta cantidad de pienso comercial para luego mezclarla con la concentración oportuna de L-Trp preparada en solución acuosa, o solo con la solución acuosa (control). Una vez mezclado, se empaquetó de manera manual en pellets similares a los de origen comercial, tras lo cual se procedió al secado del pienso a 40ºC durante 24 h. La duración del experimento fue de 7 días, durante los cuales la ingesta fue evaluada en cada uno de los grupos. Para ello, primero se cuantificó la ingesta basal de cada grupo, estimándose como la media de la cantidad de alimento ingerido por los peces de cada cuba durante los 7 días previos al inicio del experimento. En el momento de la alimentación, cada grupo de animales recibió una cierta cantidad de alimento en exceso. Transcurridos diez minutos se retiró la comida sobrante, la cual fue secada en una estufa a 40ºC durante 24 horas y posteriormente pesada. Restando el peso de la comida sobrante al del suministrado al tanque, se obtuvo la cantidad de alimento ingerido por las truchas cada día. Una vez estimada la ingesta basal y comprobada la ausencia de diferencias en la misma entre los distintos grupos experimentales, el mismo protocolo se realizó para la cuantificación de la ingesta en cada uno de ellos. La ingesta fue inicialmente calculada en gr/kg de pez y posteriormente como % acumulado de alimento ingerido diariamente con respecto al nivel basal (medido 3 dias previos al experimento). Transcurridos los 7 días del experimento, los animales de cada grupo fueron capturados y anestesiados mediante inmersión en MS-222 (50mg/L; tamponado con bicarbonato sódico) a diferentes tiempos (1 hora, 3 horas y 5 horas post-ingesta) desde el momento de ingesta. Una vez anestesiados, se procedió a la toma de sangre, mediante punción directa sobre la vena caudal, con jeringas previamente heparinizadas. La sangre fue centrifugada a 12000 g durante 10 minutos a fin de obtener el plasma que se dividió en alícuotas que se congelaron a -80ºC hasta su posterior procesado. 125 Trabajo experimental 5 Inmediatamente después de la toma de sangre los animales fueron decapitados, procediéndose a la toma de las diferentes regiones intestinales: ciegos pilóricos, intestinos anterior, medio y posterior, así como una muestra de hígado y de bilis mediante punción de la vesícula biliar. Todas las muestras fueron inmediatamente congeladas en hielo seco y almacenadas a -80ºC hasta ser analizadas. Con el fin de comprobar el efecto de las dietas enriquecidas se midieron los niveles de triptófano en plasma y en intestino medio, para esto se determino la concentración de triptófano mediante cromatografía líquida con detección por fluorescencia (HPLC-FD), con derivatización pre-columna en condiciones isocráticas (Aswad, 1984; Cervantes et al. 2009). Experimento 2. Efecto de la inyección i.p. de L-Trp y de 5HTP sobre los niveles de indolaminas y melatonina intestinales Se evaluó el efecto agudo de la administración intraperitoneal de L-Trp y de 5HTP sobre el contenido intestinal de melatonina y 5HT. Para ello se establecieron cuatro grupos de truchas (n=8/grupo) que recibieron como tratamientos: solución salina (grupo Control), L-Trp a la dosis de 20 mg/kg; L-Trp a la dosis de 80 mg/kg; 5HTP a la dosis de 25 mg/kg. Los tratamientos fueron preparados en solución salina a las concentraciones deseadas, administrándose un volumen de 0.2 ml a cada trucha. Transcurridas 2 horas desde la inyección, los animales fueron sacrificados, procediéndose a la toma de muestras de intestino anterior, medio y posterior, hígado y bilis, tal y como se relató en el experimento anterior. Procedimientos analíticos Determinación de los niveles de indolaminas y melatonina La cuantificación de los niveles de 5HT y 5HIAA en las muestras de ciegos pilóricos, intestino e hígado se realizó mediante HPLC con detección electroquímica (HPLC-EC), siguiendo el protocolo descrito por Gesto et al. (2006) con algunas modificaciones (ver Capitulo 2). En las muestras procedentes del Experimento 2 se analizaron también los niveles de 5HTP siguiendo el mismo procedimiento analítico. Para la cuantificación de la concentración de melatonina en plasma, bilis e intestino se procedió a su extracción con cloroformo y el posterior análisis mediante HPLC con detección fluorimétrica tal y como se detalla en Muñoz et al. (2009) y en el Capítulo 4 de la presente Memoria. Determinación de los niveles plasmáticos de cortisol Una alícuota de plasma (200 l) fue utilizada para cuantificar mediante ELISA el contenido plasmático de cortisol, para lo que se utilizó un kit comercial (Cayman chemical, 126 Trabajo experimental 5 USA) siguiendo las indicaciones del fabricante. Previamente en nuestro grupo de investigación se realizo la validación de dicha técnica, mediante el estudio de la linealidad en diluciones seriadas de un pool de plasma con elevada concentración de cortisol. Además fueron calculadas las variaciones interensayo, que fueron cercanas al 7.5% y la media del porcentaje de recuperación, que fue del 92.3 ± 11.5%. Análisis estadísticos Todos los datos se expresan como el promedio ± E.E.M. Para evaluar el efecto de la dieta enriquecida con L-Trp se realizó un análisis de varianza de dos vías, tomando ―dosis de L-Trp‖ y ―tiempo post-ingesta‖ como factores principales. Para la comparación entre grupos en cada intervalo de tiempo se utilizó un ANOVA de una vía seguido de un test SNK. Para el análisis estadístico de los datos derivados del efecto de la administración i.p. de L-Trp y 5HTP, se utilizó un ANOVA de una vía. En el caso de la existencia de diferencias significativas entre grupos, se realizó el test SNK de comparaciones múltiples. El grado de significación se estableció en P < 0.05. Resultados Efecto de dietas enriquecidas con L-Trp sobre la ingesta, los niveles de cortisol y melatonina en plasma La ingesta de las truchas no sufrió cambios significativos relacionados con la concentración de L-Trp en el alimento (Figura 1). Cabe destacar que el grupo control, presento un porcentaje acumulado menor que los animales alimentados con dieta enriquecida. Ambas dietas suplementadas con el aminoácido presentaron una ingesta similar sin observarse cambios significativos entre ambas. Al medir los niveles del aminoácido en plasma y intestino medio, confirmamos un aumento en su concentración en plasma: Control: 45.5 ± 5.4; L-Trp 0.5: 56.9 ± 6.3; L-Trp 2.5: 65.1 ± 5.4 (ng/µl). En el intestino medio el aumento de los niveles de L-Trp fue más marcado: Control: 5.8 ± 1.1; LTrp 0.5: 7.8 ± 0.2; L-Trp 2.5: 10.8 ± 1.1 (ng/mg de tejido). Con respecto a los niveles plasmáticos de cortisol, solo se observó un efecto significativo con el alimento que llevaba incorporada la concentración más alta de L-Trp (Figura 2). En este grupo se observó un descenso significativo de los niveles plasmáticos de cortisol en todos los tiempos muestreados, con una máxima inhibición del 55% en comparación con el grupo control 5 horas después de la ingesta. Los niveles plasmáticos de melatonina por su parte no se modificaron significativamente tras la adición al alimento de distintas concentraciones de L-Trp (Figura 3). No obstante, se apreció una ligera tendencia al incremento de la melatonina plasmática 127 Trabajo experimental 5 en el grupo tratado con la dosis más alta de L-Trp (2.5 g/100 g), en todos los tiempos, si bien no se alcanzó el grado de significación. 700 Ingesta (Porcentaje Acumulado) 600 Control L-trp 0.5 /100g L-trp 2.5/100g 500 400 300 200 100 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Dias Figura 1. Valoración de la ingesta en truchas alimentadas con pienso normal (control) o enriquecido con diferentes concentraciones de L-Trp (0.5 y 2.5 g/100 g pienso). Cada punto representa la media ± E.E.M. de valoraciones realizadas por triplicado en cada uno de los grupos experimentales. La ingesta esta expresada en porcentaje acumulado. 128 Trabajo experimental 5 Control L-trp 0.5g/100g L-trp 2.5g/100g 120 Cortisol (ng /ml plasma) 100 80 * 60 * * 40 20 0 1 3 5 Horas post ingesta Figura 2. Niveles plasmáticos de cortisol en animales alimentados con dietas sin suplementar con L-Trp (Control) o suplementadas con diferentes concentraciones del aminoácido (0.5 y 2.5 g/100 g pienso) a diferentes tiempos post ingesta (1, 3 y 5 horas). Los datos se representan como la media ± E.E.M. de 10 peces por grupo. * P < 0.05 respecto de los demás grupos experimentales en cada uno de los tiempos estudiados. Melatonina en plasma (pg /ml) 120 Control L-trp 0.5g /100g L-trp 2.5g /100 g 100 80 60 40 20 0 1 3 5 Horas post ingesta Figura 3. Niveles plasmáticos de melatonina en truchas alimentadas con dietas sin suplemento de L-Trp (Control) o suplementadas con diferentes concentraciones del aminoácido (0.5 y 2.5 g/100 g pienso) a diferentes tiempos post ingesta (1, 3 y 5 horas). Los datos se representan como la media ± E.E.M. de 10 animales por punto. 129 Trabajo experimental 5 Efecto de dietas enriquecidas con L-Trp sobre los niveles de indoles y melatonina en intestino, hígado y bilis El contenido de melatonina en las diferentes regiones del TGI y en bilis evaluadas se muestra en la Figura 4. De todas ellas, los valores más elevados de la indolamina se midieron en la bilis (Figura 4F), con valores medios cercanos a los 2.5 ng/ml, seguido del intestino anterior (Figura 4A), con valores que oscilaron entre los 400 pg/g tejido (grupo Control) y 1 ng/g tejido (grupo L-Trp 2.5 g/100 g pienso). En general, las dietas enriquecidas con L-Trp (0.5 y 2.5 g/100 g pienso) provocaron incrementos significativos en el contenido de melatonina en todos los tejidos analizados (ciegos pilóricos, intestino anterior, medio y posterior e hígado) y en la bilis. En la casi todos los casos, los mayores efectos se hallaron con la dosis más elevada de L-Trp, siendo esta la única que produjo efectos en los ciegos pilóricos en cualquiera de los tiempos muestreados. En las tres regiones intestinales (anterior, media y posterior; Figura 4A, C y D), la dosis más alta de L-Trp produjo efectos independientes del tiempo (1, 3 y 5 horas), incrementándo el contenido de melatonina con respecto al grupo control (P < 0.05 respecto a su control). Además, en el intestino medio, los animales control (sin L-Trp) presentaron niveles más elevados de melatonina a 5 horas con respecto a los medidos a 1 hora (P < 0.05 respecto a control a 1 hora). En los ciegos pilóricos (Figura 4B) la adición de L-Trp provocó un incremento dosis-dependiente del contenido de melatonina (P < 0.05 respecto a los controles), si bien dicho incremento fue independiente del tiempo post-ingesta. Con respecto al hígado (Figura 4E), cabe reseñar la ausencia de efectos significativos a 1 hora, mientras que las dos dosis de L-Trp incrementaron los niveles de melatonina a 3 y 5 horas (P < 0.05 respecto a su control). Al igual que en el intestino medio, el grupo control muestreado a 5 horas presentó valores de melatonina superiores a los hallados en los peces sacrificados a 1 hora post-ingesta (P < 0.05). En cuanto a la bilis, los cambios observados fueron de menor magnitud, aunque los tratamientos con la dosis más elevada de L-Trp aumentaron siempre la concentración de melatonina, mientras que la dosis menor solo tuvo efecto a las 5 horas post-ingesta. El enriquecimiento de las dietas con L-Trp provocó incrementos en el contenido de 5HT en la mayoría de los tejidos analizados (Figura 5), que dependieron tanto del tiempo como de la dosis de aminoácido utilizada. Las mayores concentraciones de 5HT se observaron casi siempre en el grupo que recibió L-Trp 2.5 g/100 g de pienso y, en general, fueron medidas en muestras tomadas 5 horas después de la ingesta, a excepción del hígado donde los mayores efectos se alcanzaron a las 3 horas. Además, en los ciegos pilóricos se observó un incremento significativo de los niveles de 5HT en el grupo control a lo largo del tiempo, hecho que también aconteció en el intestino medio. En general, en todos los 130 Trabajo experimental 5 tejidos se aprecia una tendencia al aumento de los niveles de 5HT con el tiempo postingesta, con independencia de los tratamientos recibidos. En términos generales, el enriquecimiento de las dietas con L-Trp provocó el descenso del contenido de 5HIAA con respecto a los animales control en la mayoría de los tejidos estudiados, salvo el hígado donde no hubo cambios significativos (Figura 6), con respecto a su control. Dicho descenso en el contenido de 5HIAA fue observado a diferentes tiempos dependiendo del tejido analizado. Así, a 1 hora post-ingesta solo se observó un descenso en el nivel de 5HIAA con la dosis mayor de L-Trp en los ciegos pilóricos, efecto que se repitió a las 5 horas. Las dos dosis de L-Trp generaron un descenso en el nivel de este metabolito en intestino anterior (3 y 5 horas), mientras que en el intestino medio ambas dosis de L-Trp produjeron dicho efecto (3 horas). En el posterior, en cambio, el descenso fue causado por la dosis mayor de L-Trp a las 3 horas. Por último, conviene destacar que los niveles de 5HIAA en el intestino anterior y medio de las truchas control muestreadas a las 3 horas post-ingesta fueron más elevados que en las muestreadas a 1 hora. Algo similar ocurrió en el hígado, independientemente del tratamiento aportado en la dieta. 131 Trabajo experimental 5 1400 Melatonina (pg/g tejido) 1200 600 A * * 500 1000 * * * * * 400 300 600 200 400 200 100 0 0 *#* 600 Melatonina (pg/g tejido) B * 800 700 600 C D * 500 # *#* * 500 # * * # * * 400 400 300 300 200 200 100 100 0 0 500 4000 E *# *# *# * * * 3000 # 300 # 200 F # Melatonina (pg/ml) 400 Melatonina (pg /g tejido) Control L-trp 0,5g/100g L-trp 2.5 g/100g * * * 2000 1000 100 0 0 1 3 5 1 Horas post ingesta 3 5 Horas post ingesta Figura 4. Contenido de melatonina, en intestino anterior (A), ciegos pilóricos (B), intestino medio (C), intestino posterior (D), hígado (E) y bilis (F) de truchas alimentadas con dietas sin suplemento de L-Trp (Control), o tras añadir diferentes concentraciones del aminoácido (0.5 y 2.5 g/100 g pienso) y sacrificadas a diferentes tiempos post-ingesta (1, 3 y 5 horas). Los datos se representan como la media ± E.E.M. de 10 peces por grupo. * P < 0.05 respecto del grupo Control en el mismo intervalo de tiempo; # P < 0.05 respecto del mismo grupo a 1 hora. 132 Trabajo experimental 5 10000 Control L-trp 0.5g/100g L-trp 2.5g/100g 3000 A * 5HT (ng/g tejido) 8000 2500 * * # 2000 6000 * 1500 4000 1000 2000 500 0 0 3500 10000 C * 3000 5HT (ng/g tejido) # * B * * D * * * 8000 * 2500 # # 2000 6000 1500 4000 1000 2000 500 0 0 1 3 5 1 Horas post ingesta 3 5 Horas post ingesta 200 E * 180 5HT (ng/g tejido) 160 140 * 120 100 80 60 40 20 0 1 3 5 Horas post ingesta Figura 5. Contenido de serotonina (5HT) en muestras de intestino anterior (A), ciegos pilóricos (B), intestino medio (C), intestino posterior (D) e hígado (E) de truchas alimentadas con pienso no suplementado con L-Trp (Control), o suplementado con concentraciones diferentes del aminoácido (0.5 y 2.5 g/100 g pienso) y sacrificadas a diferentes tiempos post-ingesta (1, 3 y 5 horas). Los datos se representan como la media ± E.E.M. de 10 peces por grupo. * P < 0.05 respecto del grupo Control; # P < 0.05 respecto del mismo grupo a 1 hora. 133 Trabajo experimental 5 5000 # A 5 HIAA (ng/g tejido) 4000 B 2000 3000 1500 * * 2000 * 1000 * * * 1000 500 0 3500 0 3000 # D C 3000 5HIAA (ng/g tejido) Control L-trp 0.5g/ 100g L-trp 2.5 g/100g 2500 2500 2500 2000 * 2000 1500 1500 * 1000 1000 500 500 0 0 1 3 5 1 Horas post ingesta 180 5 E 160 # # 140 5 HIAA (ng/g tejido) 3 Horas post ingesta # 120 100 80 60 40 20 0 1 3 5 Horas post ingesta Figura 6. Contenido de ácido 5-hidroxindol acético (5HIAA) en muestras de intestino anterior (A), ciegos pilóricos (B), intestino medio (C), intestino posterior (D) e hígado (E) de truchas alimentadas con pienso no enriquecido (Control), o suplementado con dos concentraciones diferentes de L-Trp (0.5 y 2.5 g/100 g pienso) y sacrificadas a 1, 3 y 5 horas post ingesta. Los datos se representan como la media ± E.E.M. de 10 peces por grupo. * P < 0.05 respecto del grupo Control a la misma hora. # P < 0.05 respecto de los grupos del mismo tratamiento sacrificados a 1 hora post ingesta. 134 Trabajo experimental 5 Efecto de la inyección i.p. de L-Trp y de 5HTP sobre los niveles de indolaminas intestinales La inyección intraperitoneal de L-Trp a las dosis de 20 y 80 mg/kg no modificó, en general, el contenido de melatonina en las distintas secciones del intestino analizadas (Figura 7). Solo en el intestino posterior se aprecia un incremento (+40%, no significativo) en el contenido del indol tras la inyección de L-Trp (Figura 7C), que fue independiente de la concentración del aminoácido inyectada. Tampoco se hallaron cambios significativos derivados del tratamiento con L-Trp en los niveles de melatonina en hígado (Figura 7D) ni en la bilis (Figura 7E). En cambio, la administración i.p. del precursor inmediato de la serotonina, el 5HTP (25 mg/kg), promovió un fuerte incremento en los niveles de melatonina en todas las secciones intestinales (+50-100% vs control), así como en el hígado (+100% vs control) y en la bilis (+ 20% vs control). De forma análoga a lo observado para la melatonina, el contenido intestinal de 5HT no se modificó tras la administración i.p. de ambas dosis de L-Trp en ninguna de los tejidos analizados (intestinos anterior, medio y posterior e hígado) (Figura 8). En cambio, el 5HTP (25 mg/kg) provocó el incremento en el contenido intestinal de 5HT (+40-60%) con respecto al grupo control, que fue especialmente fuerte en el hígado con aumentos de más de 100 veces respecto al control. Con respecto a los niveles de 5HIAA (Figura 9), se observó un patrón de respuesta muy similar al de la 5HT, con ausencia de cambios significativos con respecto al grupo control tras la administración de L-Trp (20 y 80 mg/kg) y el tratamiento con 5HTP produjo un brusco incremento en el contenido de 5HIAA en todos los tejidos analizados, especialmente en el hígado donde el contenido de 5HIAA fue del orden de 140 veces superior al observado en el grupo control. En la Figura 10 se muestran los niveles de 5HTP en todos los grupos experimentales y tejidos analizados. En este sentido, solo la dosis de 80 mg/kg de L-Trp provocó un incremento significativo del contenido de 5HTP en el intestino medio (Figura 10B) y en el hígado (figura 10D). Además, tal y como sucedió con los otros parámetros serotoninérgicos, la administración de 5HTP provocó un espectacular incremento en el contenido de sus niveles en todos los tejidos analizados (100-520 veces), con respecto a lo observado en el grupo control. Este dato confirma claramente que el 5HTP administrado por vía i.p. fue fácilmente absorbido por las células intestinales y hepáticas, lo que justifica los fuertes incrementos provocados por su administración en los niveles de 5HT y 5HIAA. 135 Trabajo experimental 5 800 * A 800 * 600 600 400 400 200 200 0 700 0 1600 C * 600 * D 1400 1200 500 1000 400 800 300 600 200 m 25 20 LTr p m g/ kg /k g g C on t g/ kg 25 5H TP LTr p 20 80 m m m g/ kg /k g g C on t LTr p 1600 5H TP 0 80 0 LTr p 200 ro l 100 g/ kg 400 ro l Melatonina (pg/g tejido) B m Melatonina (pg/g tejido) 1000 * E Melatonina (pg/ml) 1400 1200 1000 800 600 400 200 g/ kg m g/ kg 25 5H TP 80 LTr p LTr p 20 m m g C on t /k g ro l 0 Figura 7. Efecto de la inyección i.p. de L-Trp (20 y 80 mg/kg) o 5HTP (25 mg/kg) sobre el contenido de melatonina en intestino anterior (A), intestino medio (B), intestino posterior (C), hígado (D) y bilis (E) de la trucha arco iris. Los datos se representan como media ± E.E.M. (n=10/grupo). * P < 0.05 respecto del grupo Control. 136 Trabajo experimental 5 5HT ng/g tejido 8000 * A 10000 B * 8000 6000 6000 4000 4000 2000 2000 0 10000 0 * C 6000 * D 5000 6000 4000 200 4000 100 2000 m g/ kg 25 5H TP LTr p 80 20 m m g C on /k g tro l g m 25 80 g/ k m g/ kg g m LTr p 20 5H TP /k g tro l C on LTr p g/ kg 0 0 LTr p 5HT ng/g tejido 8000 Figura 8. Efecto de la inyección i.p. de L-Trp (20 y 80 mg/kg) o 5-hidroxitriptófano (25 mg/kg) sobre el contenido de serotonina (5HT) en intestino anterior (A), intestino medio (B), intestino posterior (C) e hígado (D) de la trucha arco iris. Los datos se representan como media ± E.E.M. (n=10/grupo). * P < 0.05 respecto del grupo Control. 137 Trabajo experimental 5 5HIAA ng/g tejido 24000 * A 40000 * B 32000 16000 24000 16000 8000 1500 5000 4000 1000 3000 2000 500 1000 0 40000 0 * C 8000 5HIAA ng/g tejido 32000 * D 7000 24000 6000 16000 5000 2000 200 1500 1000 100 500 0 g/ kg 5H TP 80 25 m g m LTr p 20 LTr p m g/ kg /k g l C on tro 5H TP 80 LTr p 25 m g m 20 m g/ kg /k g l C on tro LTr p g/ kg 0 Figura 9. Variaciones en el contenido de ácido 5-hidroxindolacético (5HIAA) a las 2 horas de la inyección i.p. de L-Trp (20 y 80 mg/kg) o 5-hidroxitriptófano (25 mg/kg) en intestino anterior (A), intestino medio (B), intestino posterior (C) e hígado (D) de la trucha arco iris. Los datos representan la media ± E.E.M. (n=10/grupo). * P < 0.05 respecto del grupo Control. 138 Trabajo experimental 5 * A 10000 8000 8000 6000 6000 200 500 150 400 200 50 100 0 0 * * 16000 14000 C D 12000 8000 10000 8000 6000 6000 200 * 400 100 200 25 TP 5H p 80 m m g Tr 20 p Tr L- g/ kg /k g l C on tro 25 TP 5H Tr p 80 m m g m L- 20 p Tr g/ kg /k g l C on tro L- g/ kg 0 g/ kg 0 L- 5HTP ng/g tejido * 300 100 10000 * B m 5HTP ng/g tejido 10000 Figura 10. Variaciones en el contenido de 5-hidroxitriptófano (5HTP) a las 2 horas de la inyección i.p. de L-Trp (20 y 80 mg/kg) o 5-hidroxitriptófano (25 mg/kg) en intestino anterior (A), intestino medio (B), intestino posterior (C) e hígado (D) de la trucha arco iris. Los datos se representan como media ± E.E.M. (n=10/grupo). * P < 0.05 respecto del grupo Control 139 Trabajo experimental 6 Profundización en la relación entre serotonina y melatonina en el TGI de la trucha arco iris: estudio in vitro del efecto de L- triptófano y de fármacos que modulan los niveles de 5HT, sobre la síntesis de melatonina. Trabajo experimental 6 Introducción y objetivos En teleósteos, el triptófano es un aminoácido esencial y su ausencia en la dieta puede ser causa de la aparición de malformaciones y erosiones (Poston y Rumsey, 1983; Walton et al., 1984). Al igual que en mamíferos, el L-Trp es el único precursor de la 5HT (Russo et al., 2004) en los peces. Si bien en estos la mayor parte del L-Trp en el plasma se encuentra en forma libre, a diferencia de lo descrito en mamíferos (Walton et al., 1984b; Rozas et al., 1990), la elevación de sus niveles mediante administración exógena redunda en un aumento de la concentración neuronal de 5HT (Aldegunde et al., 1998) al mismo tiempo que induce cambios en el comportamiento y el nivel de estrés (Winberg et al., 2001; Höglund et al., 2007). En el capítulo anterior, hemos observado que el enriquecimiento de la dieta con L-Trp pero no su administración i.p. provoca un aumento del contenido de 5HT intestinal, lo que se asocia a un aumento de los niveles de melatonina. Estudios llevados a cabo in vitro con tejidos intestinales de trucha arco iris también demostraron un efecto estimulador del L-Trp sobre la producción de melatonina (Lepage et al., 2005a), sugiriendo que la síntesis de 5HT en las células intestinales productoras de melatonina podría condicionar la cantidad de hormona formada. En los vertebrados el TGI contiene las concentraciones más elevadas de 5HT periférica (Vandermaelen, 1985; Verbeuren, 1989). Mientras que la 5HT intestinal es producida y almacenada principalmente en las EC en los mamíferos (Erspamer, 1954; Gerson y Tack, 2007) y en menor medida en neuronas que inervan el intestino (Costa et al., 1982; Gershon et al., 1990), en algunas especies de peces no está clara la existencia de EC, por lo que la mayor parte de la 5HT podría asociarse a neuronas, al menos en aquellos teleósteos que presentan una inervación serotoninérgica abundante de la mucosa intestinal (Anderson y Campbell, 1988). En el caso de la trucha arco iris, nuestros estudios señalan que las mayores concentraciones de 5HT y de su principal metabolito, el 5HIAA, se hallan en la pared muscular, probablemente asociadas a una densa inervación serotoninérgica que forma parte del plexo mientérico, mientras que las bajas concentraciones de 5HT de la mucosa podrían ser debidas a la presencia debil de EC, o bien a algunas fibras serotoninérgicas que alcanzan esta capa epitelial. Estos resultados concuerdan con los presentados por Caamaño-Tubio et al., (2007) en esta misma especie. En nuestro trabajo, sin embargo, hemos obtenido pruebas histológicas y bioquímicas de que la mayor síntesis de melatonina acontece en la capa de mucosa, a pesar de su bajo contenido en 5HT. Una vez más, esto sugiere que mas que el contenido tal de 5HT, su disponibilidad en el citoplasma celular podría ser un factor un factor limitante de la formación de melatonina en el intestino. Una vez sintetizada, la 5HT entra en gránulos o vesículas que almacenan temporalmente la amina y facilitan su liberación al espacio extracelular (Nilsson et al., 1987). Tanto a nivel central como intestinal, la mayor parte de la 5HT liberada es recaptada por una proteína transportadora (SERT) (Gershon, 2004), que también está presente en peces (Wang et al., 2006), para ser metabolizada in situ mediante una MAO 143 Trabajo experimental 6 cuya actividad en el intestino de los peces es muy elevada (Senatori et al., 2003; CaamañoTubio et al., 2007). En el intestino aislado de la trucha se ha demostrado que la 5HT es sensible a fármacos que interfieren con la dinámica intracelular y sináptica de la amina, alterando sus niveles intracelulares (Anderson et al., 1991). Por ello, el uso de estos fármacos puede ser útil para vislumbrar el grado de relación entre la disponibilidad de 5HT y la formación de melatonina a nivel del intestino. El presente Trabajo pretende profundizar en las relaciones entre 5HT y melatonina a nivel intestinal en la trucha arco iris. Para ello se estudió en primer lugar el efecto del LTrp sobre los niveles de 5HT y de melatonina en segmentos intestinales cultivados in vitro, así como la influencia de un aminoácido neutro (L-Alanina) que compite con el L-Trp por el mismo transportador celular (Baumrucker et al., 1989). Por otro lado, se estudió el efecto de la pargilina y de la fenfluramina, fármacos que interfieren con el metabolismo oxidativo y con la liberación/recaptación celular de 5HT, respectivamente. Materiales y métodos Animales de experimentación Se emplearon truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss) de 180±10 g (media ± E.E.M.) obtenidas en una piscifactoría local (Soutorredondo, A Coruña). Una vez en las instalaciones de la Universidad de Vigo, los peces fueron mantenidos en cubas de fibra de vidrio de 120 litros, dotadas con sistemas de circulación continua de agua y burbujeo de aire. Se estableció un régimen de fotoperiodo artificial de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad (12L:12D), siendo la temperatura del agua de 14±1ºC. Las truchas fueron alimentadas una vez al día (10:00 am) con pienso seco comercial (Dibaq Diproteg, Segovia) con una dosis de alimento del 1% de su masa corporal/día. Los animales fueron mantenidos en estas condiciones durante al menos dos semanas antes del inicio de los experimentos. Todos los protocolos experimentales realizados cumplen con la directiva de manipulación de animales de la Unión Europea (86/609EU) y con las leyes españolas para el uso de animales en investigación (RD 1201/2005). Preparación de cultivos de intestino Previamente a la toma de muestras, las truchas fueron anestesiadas mediante inmersión en una solución continuamente aireada de MS-222 (Sigma) con una concentración 50 mg/L, tamponada con bicarbonato sódico a pH 7.4. Los animales fueron sacrificados mediante decapitación, procediéndose a extraer la región del intestino medio, que fue abierto longitudinalmente, vaciado de su contenido y lavado con solución salina. A continuación el tejido se seccionó longitudinalmente en tiras que se depositaron en medio de cultivo fresco. En base a los estudios in vitro de Lepage et al., (2005a) en intestino de trucha, se usó un medio de cultivo RPMI-1640 (Sigma; R8005) a una concentración de 144 Trabajo experimental 6 16.4 g/L, siendo tamponado con bicarbonato (2.2 g/L, pH 7.2). Al medio se le añadió una mezcla de antibióticos (10000 U/ml de penicilina y 10 mg/ml de estreptomicina, Sigma) a una concentración final de 5 ml/L. En cada ensayo, se usaron fragmentos de intestino medio procedentes de 8 truchas, los cuales fueron mezclados en un único pool y depositados en placas de cultivo de tejidos de 48 pocillos (diámetro 10 mm/pocillo, IWAKI, Japan), de forma que cada pocillo contenía 4-5 tiras de intestino. Antes de introducir el tejido en los pocillos, se pipeteó en cada uno un volumen (500 l) de medio de cultivo fuertemente oxigenado (99% O2: 1% CO2). Las placas se incubaron en una estufa de cultivos a una temperatura de 15.5± 0.5ºC y agitación suave de forma continua. El tiempo de incubación fue variable según el experimento. No obstante, se hicieron ensayos previos a fin de constatar los mejores tiempos de incubación, monitorizando el contenido de melatonina en el tejido. Usando tiempos de incubación de 3, 6, 12 y 18 horas, se constató que la acumulación de melatonina en el tejido intestinal fue lineal. Al final de los ensayos, las muestras fueron extraídas, pesadas e inmediatamente congeladas en hielo seco antes de ser almacenadas a -80ºC hasta su posterior procesado. Diseño experimental Efecto del L-Trp sobre la producción de melatonina en el tejido intestinal. Competición con L-Alanina (L-Ala) Para evaluar el efecto del L-Trp se prepararon medios de cultivo enriquecidos con cinco dosis diferentes de L-Trp, 0; 0.1; 0.5; 1.0 y 2.0 mM, de acuerdo con lo descrito en la bibliografía (Lepage et al., 2005a). De cada tratamiento se realizaron al menos seis réplicas y los cultivos se hicieron por triplicado. Por tanto, cada uno de los tratamientos fue realizado en un mínimo de 18 muestras de intestino medio de trucha. Transcurrido un periodo de incubación de 12 horas a 15.5±0.5ºC, los fragmentos de intestino fueron recolectados, congelados y almacenados a -80ºC hasta su posterior análisis. Conocido el efecto del L-Trp sobre la síntesis intestinal de melatonina, se realizó un ensayo de competición en el que se emplearon medios conteniendo L-Trp (se seleccionó la concentración de 1 mM por ser la más efectiva) conjuntamente con L-Ala. Las condiciones experimentales ensayadas fueron: i) Medio control (0 mM L-Trp + 0 mM L-Ala), ii) Medio con 0 mM L-Trp + 1 mM L-Ala, iii) Medio con 1 mM L-Trp + 0 mM L-Ala, iv) Medio con 1 mM L-Trp + 0.5mM L-Ala, v) medio con 1 mM L-Trp + 1mM L-Ala, vi) Medio con 1mM L-Trp + 2 mM L-Ala. En todos los casos el periodo de incubación, la temperatura y el número de muestras fueron los indicados anteriormente (12 horas, 15.5ºC; n=18 muestras/tratamiento). En todas las muestras se midió el contenido de melatonina, y de 5HT y 5HIAA. 145 Trabajo experimental 6 Efecto de la adición de pargilina y fenfluramina al medio de cultivo sobre la producción intestinal de melatonina La pargilina es un inhibidor de la actividad enzimática monoamino oxidasa (MAO), lo que impide la degradación de la 5HT por esta vía (Fowler et al., 1981). La fenfluramina, a su vez, ha sido definida como un inhibidor de la liberación y de la recaptura de la serotonina (Garattini, 1987; Cammaño-Tubio et al., 2007), lo que favorece su acumulación en el interior celular. Para evaluar el efecto de ambos compuestos sobre la síntesis de melatonina en el intestino medio de la trucha in vitro, se realizaron ensayos independientes con fragmentos de intestino expuestos a diferentes concentraciones de pargilina (5 y 50 mM) y de fenfluramina (4 y 25 mM). En ambos casos se dispuso un grupo control expuesto a medio de cultivo sin fármacos adicionales. La duración de los cultivos fue de 6 horas, mientras que la temperatura y tamaño muestral fueron iguales que en los casos anteriores (15.5ºC; n=18 muestras/tratamiento). Una vez concluido el ensayo, se retiró el tejido y se evaluó su contenido de melatonina, 5HT y 5HIAA, y así se calculo la relación 5HIAA/5HT. Con el fin de evaluar el efecto de ambos fármacos sobre la función serotoninergica, se evaluó el contenido de 5HT y 5HIAA en el medio de cultivo. Las mediciones se relativizaron en relación al peso del tejido. Procedimientos analíticos El análisis de los niveles tisulares de melatonina se llevó a cabo mediante HPLC con detección fluorimétrica, tal y como se describe en capítulos anteriores de la presente Memoria (ver capitulo 1 y 4). Los niveles de 5HT y 5HIAA fueron medidos mediante HPLC con detección electroquímica tal y como describen en Gesto et al. (2006) con modificaciones (ver Capítulo 2). Análisis estadístico Todos los datos se expresan como el promedio ± E.E.M. Antes de la aplicación de cualquiera de los métodos de análisis estadístico, los datos fueron analizados mediante una prueba de normalidad (Shapiro-Wilks) y de homogeneidad de varianzas (prueba C de Cochran). Se realizaron análisis de varianza de una vía (ANOVA) para comprobar la existencia de variaciones significativas en la producción intestinal de melatonina, 5HT, 5HIAA y en el cociente 5HIAA/5HT con los distintos tratamientos, siendo la concentración de ―L-Trp‖ ―L-Ala‖, ―pargilina‖ y ―fenfluramina‖, las correspondientes variables. En el caso de existir diferencias significativas, se realizo un test Tukey de 146 Trabajo experimental 6 comparaciones múltiples. En todos los análisis realizados, el grado de significación se estableció en P < 0.05. Resultados Efecto del L-Trp y la competición con aminoácidos neutros sobre la producción intestinal de melatonina en la trucha. Tal y como se observa en la Figura 1, la adición de L-Trp al medio de cultivo provocó un incremento dosis-dependiente en el contenido intestinal de melatonina tras 12 horas de cultivo. Dicho incremento alcanzó el grado de significación con concentraciones de 0.5 mM de L-Trp y superiores, en comparación con el grupo control (sin L-Trp añadido al medio). Si bien los niveles de melatonina encontrados en los ensayos in vitro son bastante más elevados que los observados en condiciones in vivo, los resultados obtenidos con la adición de L-Trp sobre cultivos de intestino de trucha son similares a los descritos por otros autores (Lepage et al., 2005a). Con respecto a los niveles de 5HT y de 5HIAA, se apreció una tendencia dosis-dependiente al alza, que no alcanzó el grado de significación con ninguna de las concentraciones utilizadas de L-Trp (Figura 2A). Conviene destacar, sin embargo, que la magnitud del cambio neto en la concentración de 5HT, en relación a la hallada para melatonina, fue alrededor de 1000 veces superior. Así, por ejemplo, para una concentración de L-Trp 1mM se produjo casi un 100% de incremento en los niveles de melatonina, lo que supone 600 pg de melatonina más por gramo de tejido en relación a los valores hallados en el grupo sin L-Trp. Cuando se midieron en esos grupos los niveles de 5HT, se vio un aumento inducido por el L-Trp 1mM del 12% con respecto al grupo incubado sin el aminoácido. Este pequeño efecto supuso un incremento neto de 400 ng de 5HT por gramo de tejido. A pesar de estos valores, conviene destacar que los niveles de melatonina en el tejido aumentaron de forma continua con la dosis de L-Trp, mientras que en el caso de la 5HT se observó un estancamiento a partir de la concentración de L-Trp 0.5mM. Debido a que tanto la 5HT como su metabolito (5HIAA) se comportaron de forma similar frente a la adición de diferentes concentraciones de L-Trp, la relación entre ambos compuestos (5HIAA/5HT) tampoco mostró variaciones significativas (Figura 2B), aunque se aprecia una ligera y continua tendencia al descenso con el aumento de la concentración de L-Trp en el medio. En la Figura 3 se muestra el efecto de un medio de cultivo que lleva incorporado LTrp y/o L-Ala sobre el contenido de melatonina en el tejido intestinal de la trucha. En concordancia con los resultados mostrados anteriormente, la adición de L-Trp (1 mM) al medio de cultivo provocó un fuerte incremento de la síntesis de melatonina, mientras que si el medio lleva incorporado L-Ala (sin L-Trp) no se produce ningún efecto. Cuando se 147 Trabajo experimental 6 combinaron ambos aminoácidos, se observó un efecto competitivo de manera que incrementos en la concentración de L-Ala reducen de forma dosis-dependiente el efecto estimulador del L-Trp sobre el contenido intestinal de melatonina. De manera análoga la adición de L-Trp (1 mM) al medio de cultivo también provocó un ligero incremento (aunque no significativo) en los niveles de 5HT, hecho que no fue evidente para el 5HIAA (Figura 4A), mientras que la incubación del tejido con LAla sola induce un descenso significativo en los niveles de ambos compuestos (P < 0.05). La incubación del intestino con dosis crecientes de L-Ala en presencia de 1 mM L-Trp origina una reducción paulatina (aunque no significativa) de los niveles de 5HT y 5HIAA, contrarrestando el ligero efecto producido por la administración de L-Trp solo. Los tratamientos con ambos aminoácidos no afectaron significativamente a la relación 5HIAA/5HT (Figura 4B). 2600 * 2400 Melatonina (pg /g tejido) 2200 2000 * 1800 1600 1400 * 1200 1000 800 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 Concentracion de L- Trp (mM) Figura 1. Contenido de melatonina en el tejido intestinal de trucha arco iris cultivado in vitro y tratado con diferentes concentraciones de L-Triptófano. * P < 0.05 vs control (0 mM de L-Trp). Los datos están expresados como la media ± E.E.M. de un total de 18 muestras de cada tratamiento. 148 Trabajo experimental 6 A 5HT 5HIAA 5HT (ng/g tejido) 5000 250 200 4000 150 3000 100 2000 50 1000 0 5HIAA (ng/g tejido) 6000 0.0 0.1 0.5 1.0 2.0 0 Concentración de L- Trp (mM) 0,07 B Relación 5HIAA / 5HT 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 0.0 0.1 0.5 1.0 2.0 Concentración de L- Trp (mM) Figura 2. Efecto del L-Trp sobre el contenido de 5HT y 5HIAA en el intestino medio de trucha cultivado in vitro (A) y sobre la relación 5HIAA/5HT (B). Los datos están expresados como la media ± E.E.M. de un total de 18 muestras de cada tratamiento. 149 Trabajo experimental 6 2500 a Melatonina (pg /g tejido ) 2000 1500 *a * 1000 * 500 0 L-Trp --- --- 1 1 1 1 (mM) L-Ala --- 1 --- 0.5 1 2 (mM) Figura 3. Efecto de la adición de L-Trp y L-Ala al medio de cultivo sobre la producción de melatonina intestinal. Los datos están expresados como la media ± E.E.M. de un total de 18 muestras de cada tratamiento. * P < 0.05 vs 1 mM L-Trp, a, P < 0.05 vs control (sin L-Trp). 150 Trabajo experimental 6 5HT 5HIAA A 5HT (ng /g tejido) 1400 100 1200 * 1000 80 * 800 60 600 40 400 20 200 0 L-Trp --- --- 1 1 1 1 (mM) 0 L-Ala --- 1 --- 0.5 1 2 (mM) 0,12 Relacion 5HIAA /5HT 120 5 HIAA (ng/g tejido) 1600 B 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 L-Trp L-Ala ----- --1 1 --- 1 0.5 1 1 1 2 (mM) (mM) Figura 4. Variaciones en los niveles de 5HT y 5HIAA (A), así como en la tasa de recambio 5HIAA/5HT, (B) en ausencia o presencia de L-Trp y L-Ala en el medio de cultivo. Los datos están expresados como la media ± E.E.M. de 18 muestras en total para cada tratamiento. * P < 0.05 vs 1 mM L-Trp y control. En la Figura 5 se muestra el efecto de la adición de pargilina al medio de incubación sobre el contenido intestinal de melatonina. Se observa que la pargilina produjo un aumento dosis-dependiente en este parámetro, que casi llega a duplicar su valor con la dosis más elevada de pargilina (50mM), con respecto a lo observado en el grupo control. La pargilina también produjo cambios significativos en el contenido de 5HT y 5HIAA, así como en la relación 5HIAA/5HT (Figura 6). Mientras que los niveles de 5HT aumentaron fuertemente (+25% con la dosis más baja y +70% con la dosis mayor de pargilina), los de su metabolito ácido fueron afectados negativamente de una forma dosisdependiente, llegando casi a anularse con la dosis más elevada de pargilina (Figura 6A). Como consecuencia, la relación 5HIAA/5HT también disminuyo de forma drástica y de forma dosis-dependiente, indicando una disminución de la actividad serotoninérgica (Figura 6B) causada por la adición de pargilina. En el medio de cultivo los niveles de 5HT 151 Trabajo experimental 6 se incrementaron significativamente (Figura 6C), en relación a los tratamientos con pargilina. Los resultados obtenidos tras la inclusión de fenfluramina al medio de cultivo se muestran en la Figura 7. La fenfluramina no produjo cambios significativos en los niveles intestinales de melatonina, aunque con la dosis mayor se notó una caída importante (25% vs control) en este parámetro. Tal y como se observa en la Figura 8, el contenido de 5HT en el tejido incubado tampoco mostro cambios significativos tras aplicar las diferentes dosis de fenfluramina al medio de cultivo (Figura 8A). En cambio, el contenido de 5HIAA se incrementó de manera dependiente de la concentración del fármaco (P <0.05, respecto del control). En consecuencia, la relación entre el metabolito y el precursor (5HIAA/5HT) se incrementó de forma progresiva con la concentración empleada de fenfluramina (Figura 8B), siendo estos aumentos significativos en relación al grupo control. A diferencia de los niveles de 5HT en el tejido, el contenido de este neurotransmisor en el medio de cultivo se incremento significativamente en relación al control (Figura 8C), este resultado nos confirma la acción del fármaco sobre la liberación de la 5HT, generando similar efecto ambas concentraciones de fenfluramina. 300 * Melatonina pg /g tejido 250 * 200 150 100 50 0 0 5 50 Pargilina (mM) Figura 5. Variaciones del contenido de melatonina en tejido intestinal de trucha arco iris cultivado in vitro tras la adición de diferentes concentraciones de pargilina al medio de cultivo. Los datos están expresados como la media ± E.E.M. de 18 muestras en total para cada tratamiento. * P < 0.05 vs Control. 152 Trabajo experimental 6 5HT 5HIAA A * 350 0,18 250 * 200 2000 150 * 100 1000 * 0 0 5 50 Relación 5HIAA / 5HT 3000 0,14 0,12 0,10 0,08 * 0,06 0,04 * 0,02 0 50 B 0,16 5 HIAA (ng /g tejido) 5HT (ng / g tejido) 300 0,00 0 5 Pargilina (mM) 100 En el medio de cultivo C 5HT 5HIAA 100 * 80 5HT ng/g tejido 50 Pargilina (mM) 80 60 60 ** 40 40 20 20 0 5HIAA ng /g tejido 4000 0 0 5 50 Pargilina (mM) Figura 6. Variaciones en el contenido de 5HT, 5HIAA (A) y la relación 5HIAA/5HT (B) en el intestino de la trucha cultivado in vitro, tras la adición de pargilina al medio de cultivo (C) variaciones en el contenido de 5HT y 5HIAA en el medio de cultivo. Los datos están expresados como la media ± E.E.M. de un total de 18 muestras para cada tratamiento. * P < 0.05 con respecto al respectivo grupo control. 153 Trabajo experimental 6 Melatonina (pg/g tejido) 800 600 400 200 0 0 4 25 Fenfluramina (mM) Figura 7. Efecto de la adición del inhibidor de la liberación de 5HT (fenfluramina) al medio de cultivo sobre la producción intestinal in vitro de melatonina en la trucha arco iris. Los datos están expresados como la media ± E.E.M. de 18 muestras para cada tratamiento. 5HT 5HIAA * * 1000 80 800 60 600 40 400 200 0 4 25 0,10 * 0,08 0,06 0,04 20 0,02 0 0,00 0 Fenfluramina (mM) 7 5HT ng/g tejido 6 B 4 25 Fenfluramina (mM) En el medio de cultivo 5HT 5HIAA C * * 140 120 5 100 4 80 3 60 2 40 1 20 0 5HIAA ng/g tejido 5HT (ng/g tejido) 100 1200 * 0,12 120 1400 0 0,14 140 Relación 5HIAA / 5HT 1600 A 5HIAA (ng/g tejido) 1800 0 0 4 25 Fenfluramina mM Figura 8. (A) Efecto de la adición de fenfluramina sobre el contenido de 5HT y su principal metabolito, 5HIAA, en preparaciones in vitro del intestino medio de la trucha. (B) Relación 5HIAA/5HT en el grupo control y en los tratados con fenfluramina (C) variaciones en el contenido de 5HT y 5HIAA en el medio de cultivo. Los datos están expresados como la media ± E.E.M. de un total de 18 muestras para cada tratamiento. * P < 0.05 respecto al control (0 fenfluramina). 154 Trabajo experimental 7 Regulación por melatonina de la contractibilidad intestinal en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss). Posible interacción con los sistemas colinérgico y serotoninérgico. Trabajo experimental 7 Introducción y objetivos La melatonina es una molécula implicada en numerosos aspectos fisiológicos y patológicos del TGI en los vertebrados, (Bubenik, 2002; Konturek et al., 2007). A modo de ejemplo, posee una destacada capacidad aceptora de radicales libres (Stankov y Fraschini, 1993) por lo que se ha postulado su papel protector de la mucosa gastrointestinal (Akbulut et al., 1997; Konturek et al., 2007), pero también parece ser un regulador de la secreción de bicarbonato (Sjobom et al., 2001) y de la proliferación celular digestiva, entre otros (Bubenik, 2001). Un aspecto que también ha recibido atención ha sido su implicación en la regulación de la motilidad intestinal. En este sentido, Bubenik (1986) mostró en íleon de rata que la melatonina provoca una disminución del tono contráctil, efecto que podría implicar una interacción con la regulación serotoninérgica. Por su parte, Merle et al., (2000) proponen que la melatonina altera los patrones de motilidad pre- y postprandiales durante la noche en la rata. Asimismo, dosis bajas de melatonina i.p. provocan el incremento del vaciado intestinal en ratas (Drago et al., 2002), mientras que dosis altas lo retrasan (Kasimay et al., 2005). A pesar de estos datos, se desconocen en gran parte los mecanismos a través de los que la hormona ejerce su acción reguladora de la motilidad intestinal. Los estudios acerca del papel de la melatonina en la fisiología digestiva de vertebrados no mamíferos son mucho más escasos. Recientemente se ha descrito que la melatonina atenúa el incremento de las contracciones inducidas por ACh en intestino del carpín, especie de teleósteo carente de estómago (Velarde et al., 2009b). Asimismo, estos autores muestran que el efecto de la melatonina es bloqueado por antagonistas de receptores de membrana de la hormona, los cuales también parecen mediar un efecto modulador de la melatonina sobre la contractilidad intestinal inducida por la 5HT (Velarde et al., 2010b). Dado que en peces, al igual que en mamíferos, existe una producción endógena de melatonina a nivel del TGI (trabajos precedentes incluidos en esta Memoria), no cabe duda de que todos estos resultados apoyan una relación funcional entre la melatonina y la actividad motora digestiva. Por otro lado, se ha de tener en cuenta que una parte de la melatonina presente en el TGI podría provenir de la secreción biliar, fruto de su síntesis hepática (Trabajo 3) y cuya liberación al lumen intestinal acontece tras la ingesta. En todo este proceso de integración fisiológica, es posible que sea el propio desplazamiento del alimento por el tubo digestivo el que active reflejos neuroendocrinos que, en primera instancia, promuevan de manera secuencial las actividades secretoras y motoras asociadas al TGI y, en segunda instancia, modulen la síntesis de melatonina en el intestino (ver Trabajos 4 y 5). Constatar la existencia de una regulación funcional de la melatonina sobre la actividad contráctil intestinal podría suponer establecer un nexo funcional cuya relevancia es todavía una incógnita. De hecho, la melatonina ha sido propuesta como una señal neuroendocrina periférica con efecto anorexigénico en teleósteos (Pinillos et al., 2001; López Olmeda et al., 2006b), por lo que no es descartable que sus efectos sobre la 157 Trabajo experimental 7 actividad motora intestinal formen parte del sistema señalizador que contribuye a regular la ingesta alimenticia. La motilidad intestinal está dirigida a facilitar el tránsito del alimento y los procesos de digestión y absorción. La extensa regulación intrínseca y extrínseca del TGI contribuye a regular su motilidad desencadenando patrones específicos pre- y post-absortivos (Olsson y Holomgren, 2001; 2010). De manera similar a lo que ocurre en mamíferos, la inervación extrínseca vagal contribuye a coordinar la actividad digestiva en los peces, considerándose la ACh liberada desde las neuronas motoras parasimpáticas como el principal responsable de la contracción del músculo liso intestinal (Aronsson y Holmgren, 2000; 2010; Olsson, 2009). Otro neurotransmisor que parece tener un papel destacado en la regulación de la motilidad intestinal es la 5HT, cuya presencia en las neuronas entéricas es muy extensa (Karila et al., 1998; Burka et al., 1989). Aunque en el carpín se ha demostrado que la 5HT regula la actividad contráctil a través de receptores localizados sobre neuronas colinérgicas, la función de este neurotransmisor en otras especies de teleósteos es aún poco conocida. En trucha arco iris y alguna otra especie de teleósteo se ha descrito la presencia de sitios de unión para 2-[125I]-melatonina en el intestino, postulándose un papel de la hormona como modulador de la motilidad digestiva. El objetivo del presente trabajo ha sido esclarecer las acciones potenciales directas de la melatonina sobre la motilidad intestinal de la trucha arco iris realizando para ello las siguientes aproximaciones experimentales: i) Caracterizar la actividad contráctil intestinal y el efecto regulador de la ACh y la 5HT; ii) Evaluar la acción de la melatonina y la especificad de su efecto (mediación por receptores de membrana de la hormona) iii) Evaluar la implicación del Ca2+ extracelular en el efecto de la melatonina y de la 5HT; iv) evaluar la posible interacción de la melatonina con mecanismos colinérgicos y/o serotoninérgicos reguladores de la actividad contráctil intestinal. Materiales y métodos Animales Se utilizaron trucha arco iris con un peso aproximado de 150 ±10 g que permanecieron durante al menos 3 semanas en el en las instalaciones habilitadas en el Centro de Cultivo Experimental de la Universidad Politécnica de Madrid (Escuela Técnica Superior de Ingenieros de Montes), dotado de piscinas con sistemas de flujo constante de agua declorada. Los peces fueron mantenidos bajo condiciones naturales de fotoperiodo y temperatura oscilando esta última entre 13ºC y 16ºC. El alimento fue suministrado a diario, a las 09:30 h y consistió en pienso seco comercial (Dibaq-142 Diproteg SA., Segovia). La cantidad diaria de alimento suministrado fue del 1% de la masa corporal de los peces. Los 158 Trabajo experimental 7 experimentos se realizaron conforme a la directiva de manipulación de animales de la Unión Europea (86/609EU) y las Leyes españolas para el uso de animales en investigación (RD 1201/2005). Baño de órganos e incubación de los tejidos Para abordar los objetivos marcados en el presente Capitulo se dispuso de un sistema de incubación en baño de órganos, técnica utilizada con frecuencia en fisiología animal y farmacología y que permite medir cambios en la fuerza contráctil de preparaciones aisladas de músculo liso tras la adición de distintos fármacos al medio en el que está sumergido el tejido (Velasco Martín, 2001). Esta técnica también permite conocer la respuesta de los distintos componentes de la musculatura (circular y longitudinal), en función de la posición del fragmento de intestino aislado en la preparación (Sarr et al., 2001). El baño de órganos, cuyo esquema se representa en la Figura 1, tiene la ventaja fundamental de permitir que el tejido se mantenga funcional durante varias horas, debido a que está constantemente inmerso en el medio de cultivo apropiado (Ringer específico para teleósteos), burbujeado constantemente con carbógeno (O2 95%, CO2 5%) y mantenido a una temperatura controlada de 15ºC. La cámara de cultivo está recubierta de un vidrio doble y alberga en su interior un espacio que se llena con el medio de cultivo. Entre las dos paredes se produce un flujo continuo de agua a 15ºC, gracias al cual se mantiene constante la temperatura del cultivo (Hollands, 1974). En el interior de la cámara de incubación se introduce el tejido conectado a un sistema sensor, el cual mediante un transductor isométrico (Pre205, Cibertec) envía la señal a un computador para ser recogida con un software de registro (ADQ2C, CromaNec). Figura 1. Representación esquemática del sistema de baño de órganos utilizado en el presente estudio. 159 Trabajo experimental 7 Antes del inicio de los cultivos de intestino las cámaras del baño fueron llenadas con 10 ml de medio de cultivo, el cual se encontraba previamente mantenido a 15ºC, (al igual que los 500 ml de medio almacenado en un matraz Erlenmeyer) y con burbujeo constante de carbógeno. A continuación se anestesiaron los peces mediante inmersión en hielo, se pesaron, e inmediatamente se sacrificaron por decapitación. Tras abrir la cavidad abdominal y extraer el intestino medio, este fue vaciado y limpiado de restos de alimento (haciendo pasar una solución Ringer) y de tejido adiposo, con ayuda de unas pinzas. Posteriormente se procedió a fragmentar el intestino medio en segmentos de 1.5 a 2 cm de longitud, que fueron colocados en la preparación en sentido longitudinal. Inmediatamente después se realizó una ligadura con hilo de sutura en uno de los extremos del segmento y se aprovecharon los cabos del hilo para fijarlo al alambre del soporte. Mediante punción el otro extremo del segmento intestinal fue fijado a un gancho móvil. Una vez conseguido, la preparación se situó en la cámara de cultivo, ajustándose la tensión del tejido para un correcto registro de la actividad contráctil. La tensión óptima estimada utilizada para la trucha arco iris fue de 10 mN, que equivale a 1 g de peso. Para aplicar dicha tensión, en cada sensor de cada cámara se cuelga una pesa de 1 g, con lo que se genera una respuesta en el sistema de adquisición de datos, con valores esperados de 500 mV para 1 g de peso. En estas condiciones se ajusta la señal a 0 mV con el botón de ―balance‖ del transductor. Esto permite que, al retirar la pesa, el registro sea de aproximadamente -500 mV. Al colgar el alambre móvil que está unido al tejido con el sensor, se genera una señal en el sistema de adquisición. El tejido debe estar sometido a una tensión de 10 mN y la señal en 0 mV, lo que se consigue aumentando o disminuyendo la tensión con el uso de los tornillos micrométricos situados sobre el sensor. Solución de incubación y preparación de los compuestos ensayados La composición del medio de cultivo Ringer empleado para la incubación del intestino de trucha arco iris fue el siguiente: NaCl 140 mM, KCl 2.5 mM, CaCl2 1.5 mM, MgSO4 0.8 mM, NaHCO3 15mM, KH2PO4 1 mM, HEPES 5 mM y glucosa 10 mM. El pH de la solución se ajustó a 7.8 con NaOH 10% (p/v). Los fármacos cuyo efecto se deseaba ensayar fueron incorporados en alícuotas de 100 l a la cámara de incubación, de manera que la concentración añadida se diluyó 100 veces. Todas las diluciones madre fueron preparadas a una concentración 10 mM en H2O y a partir de estas se realizaron diluciones seriadas con un factor de dilución 1:10. Los fármacos no solubles en agua pero si en solución alcohólica, como la melatonina o el luzindol, se disolvieron primero en una pequeña cantidad de etanol, completándose con agua hasta alcanzar la concentración 10 mM. Así, la concentración final de etanol en el baño fue siempre del 0.05%. Otros fármacos como la metisergida, se prepararon directamente a 10 mM en dimetil sulfoxido (DMSO), para posteriormente realizar diluciones en agua hasta abarcar las concentraciones deseadas. En el caso de la 160 Trabajo experimental 7 atropina se acidificó ligeramente el agua con una gota de HCl 1N, lo que facilitó su completa disolución. Registro de la contractilidad Al inicio de cada día de experimentación los primeros registros se realizaron en muestras de tejido no tratadas, con el fin de definir la contracción basal y su variación a lo largo del día. Antes de la realización de cada registro (basal o tras la adición de cualquier fármaco) se realizó un registro basal de al menos 2-5 minutos para cada tejido ensayado, obteniéndose la línea base de referencia con la cual se compararon los cambios obtenidos tras los distintos tratamientos. Un ejemplo se puede apreciar en la Figura 2 que muestra un registro de la contractibilidad basal del intestino, seguido del incremento en la contractilidad generado tras la adición de melatonina. En cambio, cuando se realizaron ensayos de agentes reguladores en presencia de agentes bloqueantes (luzindol y metisergida), estos fueron añadidos al inicio del ensayo, se incubaron las muestras durante 10 minutos y a continuación se añadió el fármaco regulador cuyo efecto se deseaba estudiar. Todos los datos presentados en el presente Trabajo están expresados en unidades de fuerza (mN). En nuestras condiciones experimentales 50 mV del registro equivalen a 1 mN, mientras que un gramo de tensión equivale a 10 mN. Figura 2. Ejemplo de un registro de contractilidad del intestino de trucha arco iris, en el se explica cómo se obtuvo el diferencial medido. A la hora de cuantificar los resultados, no fueron evaluados ni el número de contracciones de la musculatura por minuto (frecuencia), ni la amplitud de la onda contráctil, ya que los registros obtenidos en intestino de trucha presentaron una elevada variabilidad entre tejidos y dentro del mismo ensayo. En este sentido, nuestros resultados 161 Trabajo experimental 7 concordaron con estudios previos (Johansson y Holmgren, 2003) que demostraron que en la trucha arco iris no se observa de forma clara un ritmo basal de ondas contráctiles (―ondas lentas‖) e incluso el patrón de registro varía de forma considerable entre ensayos, pero también dentro de un mismo ensayo con los cambios de medio, estabilizándose la señal tras largo tiempo. Puesto que el diferencial de la línea base de las ondas fue un parámetro muy estable, los resultados se evaluaron teniendo en cuenta dicho parámetro. Diseño experimental Caracterización de la respuesta contráctil del intestino de la trucha arco iris a ACh, 5HT y melatonina En primer lugar se caracterizó la respuesta contráctil del intestino frente a los tratamientos con distintas concentraciones de ACh, 5HT y melatonina. El rango de concentraciones para cada fármaco fue: ACh, desde 10-11 a 10-5 moles/l; 5HT, desde 10-10 a 10-5 moles/l; melatonina, desde 10-11 a 10-3 moles/l. Para cada una de las concentraciones se realizaron un mínimo de 5 ensayos. Efecto de la ausencia de C2+ y de la adición de atropina en el medio de incubación sobre la contractilidad inducida por 5HT y melatonina Una vez caracterizada la respuesta contráctil del intestino frente a la adición de diferentes concentraciones de 5HT y melatonina, se realizaron ensayos con medio de cultivo sin Ca2+, con el fin de conocer la dependencia de la respuesta contráctil al ión. Para ello se preparó medio de cultivo libre de Ca2+ cuya concentración se sustituyó por NaCl (concentración final: 143mM). Se utilizaron cuatro dosis de 5HT, desde 10-8 a 10-5 moles/l y de melatonina, desde 10-7 a 10-4 moles/l. En paralelo se realizaron los mismos tratamientos en muestras cultivadas en presencia de Ca2+ en el medio. Con el fin de evaluar la implicación de mecanismos colinérgicos en la estimulación inducida por 5HT y melatonina en la fuerza contráctil basal del intestino de la trucha, se realizaron cultivos en los que se incluyó atropina (bloqueante de receptores muscarínicos) a una concentración final de 10-4 moles/l. Previamente se constató que la atropina añadida al medio de cultivo inhibía eficazmente la respuesta contráctil colinérgica. Posteriormente se evaluó el efecto de la 5HT (10-8 a 10-5 moles/l) y de la melatonina (10-7 a 10-4 moles/l) sobre la actividad contráctil de segmentos de intestino preincubados con atropina. Como control, se realizaron experimentos sin atropina en el mismo ensayo. Efecto del antagonista luzindol sobre la estimulación de la fuerza contráctil basal inducida por melatonina 162 Trabajo experimental 7 Para identificar los mecanismos de acción de la melatonina sobre la contractilidad del intestino, el efecto de la hormona se ensayó en presencia de luzindol, un antagonista específico de receptores de melatonina. Se realizaron cultivos en los que el intestino se pretrató con cuatro concentraciones distintas del antagonista (10-9 a 10-6 moles/l), añadiéndose posteriormente melatonina a la concentración de 10-6 moles/l. Posible interacción de la melatonina con mecanismos serotoninérgicos reguladores de la contractilidad intestinal Para estudiar una posible interacción entre la melatonina y la 5HT en la regulación de la contractilidad intestinal, se realizaron dos tipos de ensayos. Por una parte se expusieron cultivos de intestino a una única concentración de 5HT (10-8 moles/l), añadiéndose a continuación diferentes concentraciones (10-7 a 10-3 moles/l) de melatonina. Por otra parte, se realizaron los mismos ensayos pero cambiando el orden de administración de los indoles, siendo el intestino pre-tratado con diferentes dosis de melatonina (10-7 a 10-3 moles/l) y posteriormente expuesto a 5HT (10-8 moles/l). En otra serie de ensayos se evaluó una posible acción inespecífica de la melatonina modulando la motilidad intestinal a través de receptores de 5HT. En estos ensayos se monitorizó el efecto de la melatonina en presencia de metisergida, inhibidor específico de los receptores 5HT1 y 5HT2 de serotonina. En primer lugar se estudió el efecto de metisergida (de 10-8 a 10-5 moles/l) sobre la estimulación contráctil inducida con 5HT (10-8 moles/l). Dado que la metisergida, incluso a concentraciones relativamente bajas, produce un efecto general bloqueante de la actividad muscular intestinal, en una siguiente tanda de cultivos se realizó una curva dosis-respuesta con cinco concentraciones de metisergida (de 10-8 a 10-5 moles/l), evaluándose su efecto sobre la actividad contráctil basal del intestino. Esto permitió conocer la dosis del inhibidor que, siendo efectiva sobre la actividad serotoninérgica, no llegase a bloquear el tono contráctil basal. La dosis seleccionada (10-8 moles/l) fue empleada como pre-tratamiento en cultivos sucesivos con tres dosis de melatonina (de 10-7 a 10-5 moles/l). Finalmente, para verificar si la melatonina modula la respuesta contráctil intestinal generada por la ACh, se realizó un nuevo diseño experimental en el que se cultivaron fragmentos de intestino en presencia de una concentración baja de ACh (10-8 moles/l) y diferentes concentraciones de melatonina (de 10-9 a 10-5 moles/l). Análisis estadísticos La actividad contráctil fue medida en mN y los datos se muestran como la media ± E.E.M. de al menos 4-5 réplicas/tratamiento. Antes de realizar cualquier análisis estadístico todos los datos obtenidos fueron sometidos previamente a los tests de normalidad (Shapiro-Wilks) y de homogeneidad de varianzas (prueba C de Cochran). Para la caracterización de la actividad contráctil intestinal en la trucha arco iris, se realizaron 163 Trabajo experimental 7 curvas dosis-respuesta con distintos neurotransmisores u hormonas. Los resultados obtenidos fueron evaluados mediante análisis de varianza (ANOVA) de una vía. En el caso de existir diferencias significativas, se realizó el test de Tukey de comparaciones múltiples. En cambio, cuando se analizó el efecto de dos compuestos diferentes sobre la contracción intestinal de la trucha, el análisis de varianza de dos vías fue el método elegido con el fin de cuantificar el efecto de cada variable por separado, así como la interacción entre ambas. En el caso de que existieran diferencias significativas inducidas por alguno de los tratamientos se aplicó un test de Tukey de comparaciones múltiples. Para todos los análisis el grado de significación se estableció en P < 0.05. Resultados Efecto de ACh, 5HT y melatonina sobre la actividad miogénica espontánea en el intestino de la trucha En la Figura 3 se muestra el efecto de diferentes dosis de ACh (A), 5Ht (B) y melatonina (C) sobre la contractilidad intestinal de la trucha. Tanto la adición de ACh como la de 5HT produjeron una estimulación significativa dosis-dependiente de la contracción en los segmentos de intestino. La concentración mínima que produjo un efecto contráctil significativo fue de 10-8 moles/l para ambos fármacos. En ambos casos, la dosis mayor ensayada (10-5 moles/l) incrementó la fuerza contráctil en unas 40 veces sobre la contracción basal, sin que se observara una meseta en la respuesta a estas dosis. La melatonina mostró un claro efecto estimulador de la contracción muscular que dependió de la concentración del indol empleada. La dosis mínima efectiva fue de 10-7 moles/l, aumentando progresivamente la fuerza contráctil hasta 10-5 moles/l. Sin embargo, concentraciones más altas de la hormona (10-4 y 10-3 moles/l) produjeron un claro descenso en su potencia estimuladora de la contractilidad intestinal. Efecto de la ausencia de Ca2+ y de la adición de atropina en el medio de incubación sobre la contractilidad inducida por melatonina y 5HT Tal y como se aprecia en la Figura 4, la incubación del intestino en medio carente de Ca extracelular provocó una fuerte atenuación del efecto estimulador de la contracción muscular intestinal ejercido por la melatonina (Figura 4A) y la 5HT (Figura 4B). La magnitud de la reducción en el efecto de la melatonina en ausencia de Ca2+ se mantuvo constante con todas las concentraciones ensayadas de ambos compuestos, pudiendo observarse todavía una cierta dosis-dependencia de la contracción inducida por melatonina y por 5HT en estas condiciones. 2+ 164 Trabajo experimental 7 Por otro lado, la Figura 4 también muestra el efecto de la atropina sobre la estimulación de la fuerza contráctil intestinal inducida por melatonina (Figura 4C) y 5HT (Figura 4D). La atropina bloqueó el efecto de ambos compuestos, poniendo de manifiesto una interacción de la melatonina con los mecanismos colinérgicos implicados en la regulación del tono contráctil intestinal. Efecto de la melatonina sobre la estimulación intestinal colinérgica El efecto de la melatonina (10-9 a 10-5 moles/l) sobre el incremento de la fuerza contráctil intestinal inducido por ACh solo se ensayó en presencia de una concentración débil de ACh (10-8 moles/l) dado que el gran efecto estimulador inducido por concentraciones más elevadas impide ver cualquier cambio (de mucho menor rango) promovido por la melatonina. Tal como se muestra en la Figura 5, la melatonina indujo un efecto estimulador concentración-dependiente de la respuesta contráctil inducida por la dosis baja de ACh. La mínima concentración efectiva de melatonina fue 10 -7 mol/l, similar a la que produjo efectos sobre la motilidad espontánea (ver Figura 3C). 165 Trabajo experimental 7 A 60 * Tensión muscular (mN) 50 * 40 30 * 20 * 10 0 -10 0 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -1 Acetilcolina, Log [mol l ] B 50 * Tensión muscular (mN) 40 30 * * 20 * 10 0 0 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -1 5HT, Log [mol l ] 5 C * Tensión muscular (mN) 4 * 3 * 2 * 1 * 0 -1 0 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -1 Melatonina, Log [mol l ] Figura 3. Caracterización del efecto concentración-dependiente inducido por ACh (A), 5HT (B) y melatonina (C) en cultivos de intestino medio de trucha arco iris. Los datos se presentan como el promedio ± E.E.M. de 4 valoraciones independientes. * P < 0.05 respecto del medio sin añadir el compuesto testado. 166 Trabajo experimental 7 Tensión muscular (mN) 5 Medio con Ca2+ Medio sin Ca2+ A 4 40 30 3 20 2 * 1 -7 10 * * 0 * * -6 -5 -8 -4 2,5 * * * 0 -7 -6 -5 5HT, Log [mol l-1] Melatonina, Log [mol l-1] 3,0 Tensión muscular (mN) B Medio con Ca 2+ Medio sin Ca 2+ C Medio sin atropina Medio atropina 25 Medio sin atropina Medio atropina D 20 * 2,0 15 1,5 10 1,0 0,5 * * 5 * * * 0,0 * 0 -7 -6 -5 -4 -8 Melatonina, Log [mol l-1] * -7 -6 -5 5HT, Log [mol l-1] Figura 4. Efecto de la ausencia de Ca2+ extracelular (A y B) y de la presencia de 10-4 moles/l atropina (C y D) en la acción estimuladora de la contractilidad intestinal inducida por melatonina y 5HT en la trucha. Los datos se presentan como el promedio ± E.E.M. de 4 valoraciones independientes. * P < 0.05 respecto del respectivo control incubado con calcio y sin atropina, respectivamente. 167 Trabajo experimental 7 6 Ach 10-8 en medio * Tensión muscular (mN) 5 * 4 * 3 2 1 0 0 -9 -8 -7 -6 -5 -1 Melatonina, Log [mol l ] Figura 5. Efecto de la melatonina sobre la respuesta contráctil (tensión muscular) inducida por ACh (10-8 moles/l). El intestino se incubó en presencia de ACh y posteriormente se expuso a diferentes concentraciones de melatonina. La línea punteada señala el valor de la respuesta colinérgica. Los datos se muestran como la media ± E.E.M. de 4 experimentos independientes. * P < 0.05 respecto del intestino incubado sin melatonina. Efecto del luzindol sobre la estimulación intestinal inducida por melatonina Conocido el efecto estimulador de la contractilidad intestinal ejercido por la melatonina, el siguiente paso fue conocer si dicho efecto está mediado por receptores específicos de la hormona. Para ello se realizaron cultivos de intestino expuesto a diferentes concentraciones del antagonista general de dichos receptores, luzindol, y posteriormente tratados con una dosis de melatonina que mostró un fuerte efecto estimulador de la contracción intestinal (10-6 moles/l). Como se aprecia en la Figura 6, el pre-tratamiento con luzindol bloquea la estimulación de la contracción intestinal provocada por la melatonina. No obstante dicho efecto no pareció depender de la dosis de antagonista empleada, al menos en el intervalo de concentraciones estudiado. 168 Trabajo experimental 7 1,8 Melatonina 10-6 en medio Tensión muscular (mN) 1,6 1,4 1,2 1,0 * 0,8 0,6 * * 0,4 * 0,2 0,0 0 -9 -8 -7 -6 -1 Luzindol, Log [mol l ] Figura 6. Efecto del antagonista general de los receptores de melatonina, luzindol, sobre la estimulación de la contracción intestinal ejercida por la adición de melatonina (10-6 moles/l). Los datos se presentan como el promedio ± E.E.M. de 4 valoraciones independientes. * P < 0.05 respecto del control incubado sin luzindol. Posible interacción de la melatonina con los mecanismos serotoninérgicos reguladores de la contractilidad intestinal Con el fin de cuantificar una posible interacción entre la melatonina y la 5HT como moduladores de la fuerza contráctil intestinal, se realizaron experimentos en los que se cuantificó, en primer lugar, el efecto de diferentes concentraciones de la hormona en intestinos incubados previamente con una concentración débil (10-8 moles/l) de 5HT (Figura 7). El hecho de seleccionar esta concentración se debió, al igual que en caso de la ACh, a la desproporción de cambios que inducen ambos compuestos a dosis elevadas, siendo el efecto de la 5HT de tal magnitud que impide ver cualquier efecto de la melatonina, de rango mucho menor. Conforme a los resultados obtenidos, solo concentraciones altas de melatonina, concretamente 10-5 moles/l, inhiben el potencial incremento de la fuerza contráctil causado por la adición de 5HT al medio de incubación. Dicho efecto se observó de forma independiente al orden de la adición de ambos compuestos (melatonina y serotonina, datos no mostrados). En una segunda serie de ensayos se evaluó el efecto del pre-tratamiento del medio de incubación con metisergida, sobre la contracción inducida por melatonina. Como en ensayos previos, se evaluó el efecto de la metisergida sola sobre la contractilidad espontánea basal y sobre el aumento de la fuerza contráctil en respuesta a 5HT. La metisergida aplicada sola provocó una fuerte reducción en la tensión muscular basal, visible ya a concentraciones de 10-8 moles/l (70% inhibición) y todavía incrementada con 169 Trabajo experimental 7 concentraciones mayores (10-5 moles/l; 92% inhibición) (Figura 8A). En presencia de 5HT (10-8 moles/l), la metisergida inhibió la estimulación contráctil serotoninérgica de una manera concentración-dependiente (Figura 8B), siendo el efecto ya visible con 10-7 moles/l de metisergida (40% inhibición) y máximo a 10-5 moles/l (95% inhibición). Para evitar un posible enmascaramiento del efecto de la metisergida sobre el efecto de la melatonina (presumiblemente de menor rango), se decidió emplear la dosis efectiva más baja de metisergida (10-8 moles/l). Tal como se aprecia en la Figura 9, el pre-tratamiento con metisergida no solo impidió el incremento de la tensión contráctil intestinal que normalmente debería inducir la melatonina, si no que también disminuyo la respuesta contráctil basal. Esto pone de manifiesto la posible mediación de receptores serotoninérgicos en la acción reguladora de la melatonina, sobre la contractibilidad intestinal de la trucha. Tensión muscular (mN) 4 Control (no 5HT en medio) 5HT 10-8 en medio 3 * 2 1 0 0 -7 -6 -5 -4 Melatonina, Log [mol l-1] Figura 7. Respuesta contráctil intestinal frente a la adición de melatonina en presencia o ausencia de 5HT (10-8 moles/l) en el medio de cultivo. Los datos se presentan como la media ± E.E.M. de 4 experimentos. * P < 0.05 respecto al respectivo valor control (sin 5HT en el medio). 170 Trabajo experimental 7 A Tensión muscular (% basal con 5HT) Tensión muscular (% basal) 140 120 100 80 60 * 40 * * 20 * 0 0 -8 -7 -6 140 B 5HT 10-8 en medio 120 100 80 * 60 * 40 20 * 0 -5 0 Metisergida, Log [mol l-1] -8 -7 -6 -5 Metisergida, Log [mol l-1] Figura 8. (A) Efecto del antagonista de los receptores de 5HT (metisergida) sobre la tensión muscular basal en el intestino medio de la trucha arco iris. (B) Inhibición por metisergida de la respuesta contráctil inducida por 5HT (10-8 moles/l). Los datos (promedio ± E.E.M, 4 replicas) se presentan como el porcentaje de la tensión basal promedio (100%) (A) y tensión basal estimulada con 5HT (B). * P < 0.05 respecto del valor obtenido sin metisergida (control). 0,5 -8 Tensión muscular (mN) Metisergida 10 en medio 0,4 0,3 * * * -6 -5 0,2 0,1 0,0 0 -7 -1 Melatonina, Log [mol l ] Figura 9. Inhibición por metisergida (10-8 moles/l) del efecto de la melatonina sobre la fuerza contráctil en intestino de trucha. Los datos representan la media ± E.E.M. de 4 réplicas. * P < 0.05 respecto valores obtenidos en la incubación sin melatonina. 171 Discusión Discusión Caracterización de los niveles y de la síntesis de melatonina en el tracto gastrointestinal (TGI) de la trucha arco iris. Puesta a punto de un método de HPLC con detección fluorimétrica para detección de melatonina en diferentes fluidos corporales y tejidos digestivos. Actualmente la determinación de melatonina en muestras experimentales se lleva a cabo por diferentes técnicas analíticas, principalmente RIA, EIA y HPLC. Al margen de la mayor o menor complejidad de cada una de las técnicas, los métodos basados en RIA y EIA están sujetas a la existencia de anticuerpos específicos anti-melatonina, lo que no resulta frecuente en vertebrados no mamíferos a nivel comercial, con el consiguiente riesgo de imprecisión en la cuantificación cuando se usan anticuerpos de otras especies. Los métodos de HPLC tienen la ventaja de que, con pequeñas adaptaciones, pueden ser aplicados a diferentes tipos de muestras independientemente de su origen biológico. Aunque estas técnicas suelen ser altamente eficaces en cuanto a su sensibilidad, las bajas concentraciones de melatonina presentes en muchas muestras (especialmente durante el día) hacen necesario desarrollos adecuados a cada tejido y/o fluido corporal, a fin de optimizar el análisis. El primer objetivo de la presente tesis ha sido el desarrollar un método sencillo de cuantificación de melatonina por HPLC, pero con suficiente sensibilidad como para medir los niveles de la hormona en plasma, bilis y tejidos intestinales de la trucha arco iris. La técnica desarrollada cumplió estos objetivos, pero también puede ser usada sin modificaciones para medidas de melatonina en órgano pineal y retina de peces y, con ligeras modificaciones, en mamíferos. Recientemente ha sido incluso utilizada de manera exitosa para la cuantificación de melatonina en hemolinfa y tejidos nerviosos del cefalópodo Octopus vulgaris (Muñoz et al., 2011). En muestras biológicas complejas (plasma, bilis, tejidos,..) el análisis de melatonina requiere de una extracción previa, normalmente mediante el uso de solventes orgánicos (cloroformo, diclorometano) o columnas de extracción en fase sólida (SPE). En nuestro caso hemos seleccionado cloroformo para extraer la melatonina, aunque se requiere un doble proceso de extracción con este orgánico y un posterior lavado con NaOH, a fin de eliminar impurezas que surgen en el proceso. El posterior secado y re suspensión del extracto en volúmenes pequeños de solvente permitió elevar la concentración de la melatonina, lo cual es útil para aquellas muestras muy diluidas de las que se requiere usar volúmenes elevados para alcanzar una cantidad mínimo cuantificable de la hormona. En este sentido, el procedimiento de extracción empleado resulta de bajo coste (menor que el uso de columnas SPE), altamente reproducible y de fácil adecuación a los diferentes tipos de muestras biológicas, ya sean fluidos o tejidos. Los sistemas de detección aplicables a HPLC determinan en gran medida la selectividad en la cuantificación de un compuesto y el nivel de detección que se puede alcanzar. La detección electroquímica (DE) es un sistema altamente sensible para la 175 Discusión cuantificación de indoles y sus derivados oxidados (Harumi & Matsushima, 2000) y es usada de forma rutinaria con este fin en nuestro laboratorio. No obstante para la detección de compuestos metilados, tales como la melatonina, la DE resulta poco ventajosa, ya que se es necesario aplicar elevados potenciales de oxidación/reducción (Ceinos et al., 2005). En esta situación, las altas corrientes generadas tienden a desestabilizar la señal en los cromatogramas, cuya consecuencia es una baja reproducibilidad y sensibilidad. Este problema no ocurre cuando se emplean detectores fluorimétricos, por lo que fue este tipo de detección el usado para la puesta a punto del método de cuantificación de melatonina aprovechando la fluorescencia nativa de este compuesto y sin necesidad de derivatización de las muestras. El procedimiento descrito se basa en el uso de fases móviles con un contenido relativamente bajo de solvente orgánico (14% acetonitrilo), en comparación con otros procedimientos que utilizan una mayor proporción de este solvente o de metanol para la medición de melatonina (Vieira et al., 1992; Chanut et al., 1998; Kulczykowska y Iuvone, 1998; Rizzo et al., 2002). El hecho de usar columnas analíticas de alta eficacia (elevado número de platos teóricos) con relleno de partículas de sílice de pequeño tamaño (3 µm) facilita la separación del compuesto ligado a la fase estacionaria. Teniendo en cuenta que los métodos fluorimétricos no alteran los componentes activos de la muestra, la fase móvil usada en la separación cromatográfica no puede ser reutilizada, lo que encarece el proceso analítico. En este sentido, el uso de columnas cortas y estrechas proporciona una clara ventaja en la reducción de costes, puesto que no requieren elevados flujos de fase móvil que incluso, de tener que usarse, serían contraproducentes (incremento de la presión en el sistema). En este sentido, debemos hacer referencia a que la técnica descrita inicialmente (Muñoz et al., 2009, trabajo 1) ha sido modificada de forma reciente (ver Trabajo 4), introduciéndose un nuevo modelo de columnas (Kinetex C18, Phenomenex) de menor longitud (5 cm) y con relleno de partículas todavía más pequeñas (2,6 m). Ello permite una mejora de hasta un 300% en la sensibilidad en la detección de la melatonina, sin detrimento de la resolución (no interferencias con otros compuestos). Además de su eficacia, estas columnas requieren de flujos bajos de fase móvil (0,5-0,6 ml/min) y/o de un menor porcentaje de solvente orgánico; en ambos casos, ello se traduce en una reducción importante del coste analítico. La valoración de los niveles de melatonina plasmática es el parámetro más usado para evaluar los cambios en la función hormonal, si bien ésta es sintetizada y liberada mayoritariamente desde el órgano pineal. Por este motivo la mayoría de los métodos de HPLC se diseñaron para medir el contenido de melatonina en el órgano pineal (Reiter, 1993; Ceinos et al., 2005). Cuando se aplican estos métodos al plasma sanguíneo, una de las dificultades que surgen es que no poseen la sensibilidad necesaria para su detección, especialmente de los bajos niveles diurnos. Para mejorarla se han usado procesos complejos de enriquecimiento y derivatización de las muestras de plasma (Hamase et al. 2004; Bechgaard et al., 1998; Iinuma et al., 1999), lo que enlentece y reduce la 176 Discusión reproducibilidad del análisis. Como alternativa, se pueden usar volúmenes mayores de plasma, pero esta alternativa suele presentar limitaciones en animales de pequeño tamaño con reducido volumen circulatorio. Por ello, una de las ventajas del actual método es que permite cuantificar melatonina en volúmenes pequeños de plasma (100-150 l), incluso durante el día. En este sentido, el método es incluso más eficaz que las técnicas de EIA que empiezan a ser de uso frecuente para monitorizar melatonina en el plasma de peces. Un alto porcentaje de la melatonina plasmática se encuentra asociada a proteínas, lo que debe ser considerado a la hora de un análisis preciso de su concentración circulante. A menudo ello implica la necesidad de realizar un proceso de desproteinización de las muestras para evitar subestimar el contenido de melatonina (Rizzo et al., 2002). Bajo nuestras condiciones experimentales hemos encontrado contenidos de melatonina similares en plasma libre de proteínas y en plasma normal, lo que indica que la extracción con cloroformo tiene la capacidad de remover la melatonina asociada a proteínas. La consecuencia más inmediata es la eliminación del protocolo de desproteinización, lo que facilita la preparación de la muestra y minimiza la presencia de precipitados que puedan interferir en los análisis. La importancia del TGI como fuente de melatonina en vertebrados ha sido objeto frecuente de estudio (Huether, 1993; Bubenik et al., 1999). Por ello uno de los objetivos del procedimiento analítico ha sido su validación en muestras de tejido de diferentes regiones del TGI, así como en la bilis (como ejemplo de fluido asociado a la actividad digestiva) en la trucha arco iris. Los resultados obtenidos en dicha validación, corroborados en posteriores estudios, indican la presencia de melatonina en diversas zonas del TGI: esófago, estómago, intestino anterior, ciegos pilóricos, intestino medio e intestino posterior. La cantidad de melatonina encontrada está en el rango de la descrita en diversas especies de mamíferos (Bubenik et al., 1992; 1999), así como en las pocas especies de peces en las que se dispone de resultados (Bubenik y Pang, 1997; Herrero et al., 2007), realizándose en todas ellas la cuantificación de melatonina mediante RIA o EIA. Aunque en estos estudios iniciales se observaron ligeras variaciones día-noche en el contenido de melatonina en tejido digestivo, estas son mucho menores de las halladas en el plasma. Por su parte, los niveles de melatonina en bilis son hasta 10 veces superiores a los encontrados en plasma durante el día y triplican a los nocturnos, lo que corrobora la hipótesis planteada en mamíferos del almacenamiento de la hormona en la bilis (Tan et al., 1999). Estos valores de melatonina en bilis son similares a los detectados en otras especies de teleósteos (Herrero et al., 2007) Algunos de los aspectos relativos a la localización y regulación de la melatonina en TGI y órganos anexos, así como su posible función, serán discutidos más adelante. Distribución de los niveles de melatonina y de la expresión génica de las enzimas implicadas en su síntesis en el TGI de la trucha. Relación con los niveles de serotonina. 177 Discusión Los resultados presentados en el Trabajo Experimental 2 demuestran que existe una distribución diferencial de melatonina en las regiones del TGI, así como entre las capas tisulares que conforman dicho tracto. De manera general el contenido de melatonina en la pared muscular en cada zona del TGI fue superior a la encontrada en la respectiva capa de mucosa. Esta diferencia fue más evidente en el intestino anterior, región que presentó el mayor contenido de melatonina a nivel de la pared muscular. En el resto de regiones, el contenido de melatonina (tanto en mucosa como en pared) fue similar entre regiones, con tendencia a valores menores en estómago que en intestino y a decrecer desde la parte más próximal del intestino hacia la región más distal. En los peces existe un único estudio que hace referencia a la distribución de melatonina en TGI del esturión, la carpa y la trucha arco iris, sin diferenciación entre pared y mucosa. En todas estas especies la mayor concentración de melatonina se asoció con la zona del intestino proximal, seguido del intestino distal (Bubenik y Pang, 1997). Una distribución similar decreciente en sentido anteroposterior también fue descrita en ratón, siendo los niveles más elevados en el estómago y el íleon y los más bajos en el yeyuno y el colon (Bubenik et al., 1992). Por el contrario, en el cerdo se describió un gradiente inverso, midiéndose las más altas concentraciones de melatonina en el colon, seguido del ciego, yeyuno e íleon, mientras que en la vaca los mayores valores se asocian con el estómago multicameral y el íleon (Bubenik et al., 1977). Por tanto, parece existir un cierto patrón topográfico de acumulación de melatonina en el TGI, pero las características del mismo parecen variar sustancialmente con la diversidad anatomo-fisiológicas de cada especie. En mamíferos, hay datos sobre la presencia de concentraciones diferentes de melatonina en la mucosa y en la capa muscular del intestino. Estudios inmunohistológicos iniciales en la rata mostraron concentraciones mucho más elevadas en la capa de mucosa que en la submucosa y la muscular (Bubenik et al., 1977; Bubenik, 1980; Lee y Pang, 1993) y asociaron la presencia de melatonina con su síntesis a nivel de las células enterocromafines intestinales. Estudios más recientes en vacas y cerdos, mostraron niveles mucho más equilibrados de melatonina entre las capas tisulares del TGI, aunque con una cierta tendencia a mayores concentraciones en la mucosa que en la capa muscular (Bubenik et al., 1999), siendo las relaciones entre ambos tejidos muy variables con la especie y región digestiva. Asimismo, estos autores mostraron la existencia de concentraciones muy elevadas de melatonina en el fluido del lúmen intestinal, en particular en la región del colón, las cuales exceden a las halladas en la mucosa y capa muscular. En el mismo sentido, los resultados incluidos en el trabajo 4 de la presente memoria también demuestran una importante presencia de melatonina en el lumen digestivo, siendo sus niveles modulables por la ingesta de alimento y su tránsito digestivo. El origen de esta melatonina extratisular será tratado más adelante en detalle. Las características químicas de la melatonina como molécula altamente lipofílica facilitan su difusión desde el plasma a los espacios intersticiales y a los tejidos y cavidades 178 Discusión próximas. Por ello, el origen de la melatonina detectada a nivel del TGI ha sido objeto de controversia, hipotetizándose una relación entre los niveles plasmáticos e intestinales de la hormona. De hecho, en la rata la pinealectomía, la cual elimina el ritmo día-noche en los niveles plasmáticos de melatonina, produce un ligero descenso en el contenido intestinal de esta hormona, sin llegar a su total desaparición (Bubenik, 1980; Bubenik y Brown, 1997). Por otro lado, la administración de L-Trp a ratas pinealectomizadas lleva a un aumento de los niveles plasmáticos de melatonina que podría derivar de un aumento en la síntesis a nivel del intestino (Huether et al., 1992; Yaga et al., 1993), postulándose que la melatonina liberada desde el intestino podría contribuir al mantenimiento de sus niveles plasmáticos. En los peces, no hay estudios tan precisos, aunque en la lubina se ha indicado que el intestino tiene cierta capacidad para acumular melatonina exógena (Herrero et al., 2007), mientras que en incubaciones de fragmentos intestinales de la trucha arco iris, las concentraciones de melatonina en el medio de incubación varían en presencia de diferentes concentraciones del aminoácido L-Trp (Lepage et al., 2005a), sugiriendo una síntesis local en el tejido intestinal. La posibilidad de un origen local de la melatonina intestinal en la trucha arco iris fue corroborada tras evaluar el efecto de la pinealectomía sobre los niveles de la hormona en plasma e intestino medio y posterior. Los resultados obtenidos mostraron que la pinealectomía eliminó el incremento nocturno en los valores plasmáticos de melatonina, reduciendo además de forma significativa los valores diurnos, lo que concuerda con datos previos mostrados en el carpín (Kezuka et al., 1992, la lubina (Bayarri et al., 2003) y la trucha arco iris (Gern et al., 1978; Sanchez-Vazquez et al., 2000). Además, nuestros resultados muestran la ausencia de efecto de la pinealectomía sobre el contenido de melatonina en intestino, en coincidencia con lo descrito en mamíferos (Bubenik y Brown, 1997) y aves (Vakkuri et al., 1985). Estos datos justifican además que la melatonina presente a nivel del intestino de la trucha es independiente de la que se produce en el órgano pineal de esta especie. Por otro lado, parece descartarse que el intestino contribuya de manera importante al mantenimiento de los niveles basales de melatonina en plasma. De hecho, los bajos niveles de melatonina detectados en animales pinealectomizados podrían derivar del aporte ocular, sin contribución destacada del tejido intestinal. Una prueba más a favor de la existencia de una producción activa de melatonina en el TGI de los peces es la caracterización de la expresión de las enzimas implicadas en su síntesis. Así, los estudios realizados en el carpín por Velarde et al., (2010a) muestran la presencia de aanat2 en zonas periféricas como intestino anterior y posterior, la vesícula biliar, el riñón, las gónadas, el hígado y el corazón, así como la presencia de hiomt2 en varios de estos órganos. En cuanto a la trucha arco iris, estudios recientes de nuestro grupo demostraron, por primera vez en los peces, la presencia en el tejido gastrointestinal de la trucha arco iris de expresión aanat2 (Fernández-Durán et al., 2007). Como una continuación de dicho estudio, en el trabajo 2 de la presente Memoria se han presentado evidencias de la expresión de las dos isoformas génicas que codifican para la enzima 179 Discusión AANAT de la trucha, la aanat1 y la aanat2, así como de la hiomt, caracterizándose su distribución en la mucosa y pared muscular de diferentes regiones digestivas. Nuestros resultados son consistentes con los mostrados previamente en la trucha arco iris, confirmando que la porción de mucosa (solo evaluada en intestino medio y posterior) presenta una mayor expresión de los genes implicados en la síntesis de melatonina (aanat1, aanat2 y hiomt) que la pared muscular (evaluada en diferentes segmentos gastrointestinales). En cuando a la expresión génica en la pared digestiva, se observó un cierto gradiente longitudinal decreciente en la expresión de hiomt, alcanzándose los mayores niveles en el estómago y ciegos pilóricos, seguido del intestino anterior y de las porciones intestinales más distales. También para la aanat2 se detectó una cierta graduación similar en su expresión, con la excepción de los bajos niveles presentes en el estómago en relación con las regiones proximales del intestino. Sin embargo, para la aanat1 solo se hallaron valores elevados en estómago, en comparación con el resto de regiones intestinales estudiadas. A partir de estos datos podemos concluir que en todo el TGI de la trucha arco iris están presentes los mecanismos enzimáticos necesarios para la producción de melatonina, así como que existen concentraciones variables de esta hormona. Aunque no ha sido posible establecer una relación clara entre los niveles de expresión de los genes aanat1, aanat2 y hiomt, y los niveles de la hormona en los diferentes tramos del TGI estudiados, se sugiere la existencia de un cierto gradiente decreciente en sentido antero-posterior, en particular para la aanat2 y la hiomt. Por otro lado, se hace notar el contraste de la existencia de valores más elevados de melatonina en la pared muscular que en la capa de mucosa que recubre internamente el tubo digestivo, mientras que la expresión de los genes aanat1, aanat2 y hiomt es mayor en la región mucosal que en la pared muscular. Entre las razones que podrían motivar este resultado, destacamos estas posibilidades: i) que exista una mayor capacidad de la pared muscular para acumular la melatonina producida localmente o proveniente de la mucosa, ii) que existan modificaciones postranscripcionales que regulen de manera diferencial la actividad enzimática en las células de la pared muscular y en las del epitelio de la mucosa, iii) que exista una distribución diferencial en la disponibilidad del sustrato metabólico (5HT) para la formación de melatonina, lo que condicione cuantitativamente la capacidad de síntesis de la hormona. Debido a que la 5HT es clave para la síntesis de melatonina, hemos evaluado el contenido de esta amina en las diferentes zonas del TGI de la trucha. Los niveles de 5HT detectados en el presente trabajo son similares a los descritos previamente en mamíferos (Martin et al., 1995; Côte et al., 2003), asi como a las mostradas en la trucha y otras especies de teleósteos (Bogdanski et al., 1963; Caamaño-Tubio et al., 2007). Además, nuestros resultados muestran diferencias en el contenido de 5HT en las distintas zonas del TGI. Aunque los menores valores corresponden al esófago y estómago, a nivel intestinal se observa una cierta tendencia a una disminución en sentido antero-posterior, con valores más elevados en la parte proximal (ciegos pilóricos e intestino anterior) y más bajos en la 180 Discusión parte distal (intestino medio y posterior). Esta distribución de los niveles de 5HT a lo largo del intestino coincide en líneas generales con la descrita en mamíferos (Hansen y Skadhauge, 1997) y en la trucha arco iris (Caamaño-Tubio et al., 2007), así como con la distribución observada en nuestro trabajo de los niveles de melatonina y la expresión génica de algunos enzimas de su síntesis. Al igual que sucedió para la melatonina, las concentraciones de 5HT en el TGI de la trucha fueron superiores en la pared de los diferentes tejidos evaluados, con respecto a la porción de mucosa, con excepción del estómago donde los niveles medidos en pared fueron incluso superiores a los de la mucosa. Cabe reseñar, sin embargo, la enorme diferencia (unas cien veces más) del contenido de 5HT detectado a nivel de la pared de las regiones intestinales con relación a la mucosa, lo que confirma datos presentados previamente por Caamaño-Tubío et al. (2007), aunque con ciertas discrepancias relativas a la distribución en las diferentes regiones intestinales. En mamíferos se ha descrito la presencia de 5HT en los plexos nerviosos entéricos y las células enterocromafines de la mucosa, siendo esta capa la que contiene el 95% de la 5HT intestinal (Gershon, 1982; Tyce, 1990; Sanger, 2008; Bertrand y Bertrand, 2010). En cambio, en teleósteos existen datos contradictorios, ya que si bien algunos estudios describen elevadas concentraciones de 5HT en las células endocrinas de la mucosa (Domeneghini et al., 2000), en otros se demostró que esta puede ser liberada desde el tejido intestinal carente de células enterocromafines (Anderson et al., 1991). En ciclóstomos y algunos teleósteos, además, se ha descrito que estas células están ausentes (El-Salhy et al., 1985; Anderson y Cambell, 1988; Yui et al., 1988), lo que añade controversia a los resultados hallados en el presente estudio. Estos datos sin embargo, concuerdan totalmente con los presentados recientemente por Caamaño-Tubío et al. (2007), quienes asocian la elevada concentración de 5HT intestinal a su extensa presencia en fibras nerviosas de la pared muscular. Teniendo en cuenta los resultados discutidos previamente, uno de los objetivos que se planteó en nuestro trabajo fue identificar los tipos celulares implicados en la síntesis de melatonina gastrointestinal, así como su asociación con células serotoninérgicas. Para ello se emplearon técnicas inmunohistoquímica con anticuerpos anti-5HT, anti-melatonina y anti-AANAT. Con respecto a la localización de células 5HT-ir, éstas se observaron en todas las zonas del TGI estudiadas (estómago, ciegos pilóricos, intestino medio e intestino posterior), siendo su densidad mayor en la región del intestino medio. En base a su morfología, los tipos celulares asociados a la 5HT-ir fueron clasificados como células endocrinas, elementos fibrosos y células con morfología típicamente neuronal. Su distribución varió de forma sustancial en las diferentes regiones y capas de la pared digestiva. En el estómago, las células endocrinas se localizaron en las capas más internas de la mucosa y a nivel de la submucosa (estrato compacto y glandular), mientras que en la capa muscular solo se observaron elementos fibrosos 5HT positivos. En los ciegos los elementos fibrosos (células y fibras nerviosas) se localizaron en la lámina propia, la submucosa y la capa muscular, con casi nula presencia de inmunoreactividad en el epitelio 181 Discusión de la mucosa. En el intestino se detectó presencia de 5HT en todas las zonas de la pared digestiva (mucosa, submucosa y capa muscular). En la mucosa se observaron células endocrinas positivas en el epitelio, así como células y elementos de morfología fibrosa en la lámina propia. La presencia de elementos con morfología típicamente neuronal fue muy evidente en la capa muscular del intestino medio y posterior, aunque este último contiene menor densidad de células 5HT positivas tanto en la submucosa como en la capa muscular. Por tanto, estos resultados confirman la presencia de 5HT-ir tanto en células endocrinas como en fibras nerviosas de distribución diferente en la pared del tracto intestinal. Las células endocrinas se localizan inmersas en la empalizada de la capa epitelial de la mucosa y parecen corresponderse con células enterocromafines, en concordancia con lo descrito previamente para esta misma especie (Caamaño-Tubio et al., 2007). Por otro lado, se ha definido la presencia de elementos con morfología fibrosa y neuronal que se corresponden con neuronas entéricas caracterizadas por una fuerte proyección hacia la lamina propia (Watson, 1979; Anderson y Campbell, 1988; Beorlegui et al., 1992) y, en algunos casos, con axones dirigidos hacia la capa muscular circular (Anderson y Campbell, 1988). Estas características serían típicas de motoneuronas implicadas en la regulación de la actividad de la musculatura circular y del epitelio mucosal (Olsson y Holmgren 2001; Olsson, 2009). Además, se ha apreciado un cierto gradiente decreciente en sentido anteroposterior en la inmunoractividad para la 5HT en el TGI de la trucha arco iris, en concordancia con lo descrito para Oncorhynchus keta (Balashov et al., 1992). Este resultado, sin embargo, es contrario al descrito en O. mykiss por Caamaño-Tubio et al. (2007) quienes observan una mayor densidad de fibras serotoninérgicas en la zona posterior del intestino. Estas diferencias podrían deberse al tipo de disección realizada y/o condicionantes de las técnicas inmunohistoquímicas empleadas. En nuestro estudio también se evaluó la presencia de células AANAT-ir, para lo cual el anticuerpo utilizado (obtenido en conejo) fue validado previamente mediante técnicas de western blot. Nuestro estudio se centró en la presencia de AANAT-ir en intestino medio, evidenciándose una posible colocalización de AANAT-ir y 5HT-ir en células de la capa de mucosa situadas en la base de las vellosidades intestinales. Ello pone de manifiesto que las células endocrinas (posiblemente células enterocromafines) de la mucosa del TGI de la trucha arco iris tienen potencial enzimático para llevar a cabo la síntesis de melatonina. No existen antecedentes que describan la presencia de células AANAT-ir a nivel intestinal de peces. Sin embargo los datos concuerdan con los obtenidos de estudios histoquímicos utilizando anticuerpos anti-melatonina, que permitieron poner de manifiesto la presencia de células inmunoreactivas a la melatonina en la mucosa de todos los tejidos intestinales estudiados. Resultados similares para la 5HT han sido descritos en ratones (Raikhlin y Kvetnoy, 1974; Raikhlin et al., 1978). Estos datos claramente apuntan a las células enterocromafines de la mucosa intestinal como elementos implicados en la síntesis local de melatonina. No obstante, teniendo en cuenta el carácter liposoluble de la melatonina y su probable difusión en los tejidos circundantes a los que realizan su síntesis, 182 Discusión el hecho de que apenas se observase inmunoreactividad a melatonina en las diferentes capas submucosales, no permite excluir dicha posibilidad. Es más, los datos obtenidos con los marcadores moleculares (expresión de genes de síntesis de melatonina) apuntan a que dicha síntesis también tiene lugar en los plexos nerviosos submucoso y mientérico, así como en las proyecciones de los mismos hacia la lámina propia y la capa de mucosa. En definitiva, los resultados obtenidos apuntan hacia la colocalización de inmunoreactividad para 5HT, AANAT y melatonina en las células enterocromafines de la mucosa intestinal de la trucha arco iris, lo que refuerza a su vez la idea de una producción local de melatonina en dichas células. Las discrepancias halladas entre la presencia de expresión génica (mayoritaria en la capa de mucosa) y el contenido de melatonina (ligeramente mayor en la pared intestinal) lleva a pensar que otros factores podrían estar contribuyendo a la regulación de la producción, en términos cuantitativos, de la hormona. El hecho de que el contenido de 5-HT sea también mucho mayor en la pared que en la mucosa, permite especular con la posibilidad de que la disponibilidad de este sustrato limite la cantidad de melatonina sintetizada. Esta hipótesis es apoyada también por la existencia de elevados niveles del metabolito oxidativo de la 5-HT, el 5-HIAA, en la zona de la pared, en contraste con niveles muy bajos del mismo en la mucosa. Ello indica que existe una mayor tasa de utilización del neurotransmisor en las neuronas serotoninérgicas que conforman los plexos nerviosos de la pared digestiva que en las células endocrinas y/o elementos fibrosos ligados al epitelio de la mucosa. El sistema hepato-bililiar y su contribución a la melatonina intestinal El hígado y la vesícular biliar son órganos anexos al tracto digestivo que podrían contribuir de una forma importante a la presencia de melatonina en el tejido y el lumen intestinal. En mamíferos se ha mostrado que el nivel de melatonina encontrado en la vesícula biliar es 10 a 40 veces superior al encontrado en la mucosa intestinal (Huether et al., 1998; Messner et al., 2001; Tan et al., 1999). Teniendo en cuenta que el hígado es el principal órgano de metabolización de la melatonina circulante, estos datos sugieren que una parte importante de la melatonina que llega al hígado a través de la circulación enterohepática, escapa a la inactivación enzimática y pasa a formar parte de la bilis (Bubenik et al., 2000b). En nuestro estudio en trucha arco iris, hemos observado que el contenido de melatonina en la bilis fue muy elevado, en concreto unas 10 veces mayor que el respectivo contenido en plasma sanguíneo durante el día y unas 3 veces mayor que el presente durante la noche. También se hallaron valores elevados en el contenido de melatonina en el tejido que conforma la pared de la vesícula biliar, lo que parece estar en relación con la difusión de melatonina desde la bilis al tejido circundantes. Los valores hallados en bilis de trucha son similares a los observados por Herrero et al. (2007) en la lubina. Aunque no se han detectado diferencias dia-noche en el contenido de melatonina en bilis, la cantidad de melatonina liberada al lumen intestinal con la secreción biliar supone abrir la posibilidad a que una gran parte de esa melatonina entre en contacto con el epitelio 183 Discusión de la mucosa y se internalice por todo el tejido que conforma la pared del TGI. Ese aporte sería mayor en las zonas del intestino proximal y medial, regiones estas que reciben de forma directa el vertido biliar, y estaría asociada principalmente a los momentos postingesta dado el papel activador que tiene esta actividad en la secreción biliar. De hecho, en mamíferos se ha observado que la ingesta de alimento condiciona los niveles de melatonina en bilis (Messner et al., 2001), asociándose la secreción de melatonina de origen biliar con funciones protectoras del epitelio intestinal durante los procesos digestivos (Tan et al., 1999). En la presente memoria se discutirán más adelante los resultados obtenidos en el Trabajo experimental 4 en relación con el efecto de la ingesta sobre el contenido biliar e intestinal de melatonina en la trucha arco iris. Nuestros datos confirman también que puede existir una importante síntesis de melatonina en el hígado, dado que en este órgano se han monitorizado la expresión de genes (aanat1, aanat2 y hiomt) de enzimas implicados en la síntesis de la hormona, con valores de expresión relativa incluso superiores a los observados en el tejido intestinal. En cambio los niveles de melatonina detectados en hígado, expresados por unidad de peso tisular, fueron más bajos que los hallados en intestino. Es evidente, también, que a la hora de valorar la potencial contribución del hígado como tejido productor de melatonina hay que tener en cuenta el gran tamaño de este órgano, así como su propia capacidad para metabolizar parte de la melatonina sintetizada localmente. En todo caso, nuestros datos claramente apuntan a que la elevada concentración de melatonina presente en la bilis de la trucha arco iris es de origen hepático, lo que no excluye que además la melatonina producida en el hígado pueda realizar funciones locales, como por ejemplo en la regulación metabólica y/o en procesos de detoxificación. En contraste con los valores de melatonina, las concentraciones de 5HT en la vesícula biliar y en el hígado fueron los más bajos de todo el TGI. Estos resultados responden a lo previsible, dado que se ha descrito que hasta un 80% de la 5HT producida en las células enterocromafines es metabolizada por la enzima MAO en el hígado (Gilis, 1985), lo que implica el drástico descenso del contenido hepático de esta amina. Por tanto, parece que en circunstancias normales el hígado podría controlar activamente la concentración de 5HT liberada a la circulación portal desde los gránulos enterocromafines intestinales (Verbeuren, 1989), siendo los productos metabólicos excretados en parte en la bilis (Tyce y Owen, 1968). Los estudios llevados a cabo en peces sobre el metabolismo enterohepático de 5HT se han centrado principalmente en los enzimas relacionadas con el catabolismo aminérgico (Yoshino et al., 1984; Chen et al., 1994; Nagai, 1995,1999). En este sentido, en la trucha arco iris se ha descrito que la forma de la MAO presente en peces tiene una baja homología con las dos isoformas conocidas en mamíferos (Chen et al., 1994), mostrando su mayor actividad tanto en el intestino como en el hígado (Edwards et al., 1986). Ello justificaría los bajos niveles de 5HT encontrados en el hígado de la trucha arco iris, en contraste con los 184 Discusión niveles relativamente elevados de su metabolito oxidativo hallados tanto en el hígado como en la vesícula biliar. De forma complementaria, también se observa un gradiente decreciente en sentido antero-posterior en el contenido intestinal de 5HIAA, tal y como se ha observado para la 5HT y la melatonina. Además, los niveles de 5HIAA fueron siempre más elevados en las porciones de pared con respecto a las de mucosas en cada zona del TGI, en fuerte relación con los niveles elevados de 5HT y de melatonina. Todo ello apoya, una vez más, la posibilidad de que la dinámica celular de la 5HT pueda ser un factor importante en la regulación de la producción de melatonina en sistema enterohepático. Regulación de la producción diaria de melatonina intestinal por el fotoperiodo y el alimento. Variaciones diarias en el contenido intestinal de melatonina e influencia circadiana En la mayoría de los vertebrados la melatonina es producida de forma rítmica en órganos típicamente asociados a la formación de la hormona, tales como la glándula pineal y la retina de los mamíferos. En los peces estas estructuras tienen características fotorreceptoras, por lo que es la luz la que, actuando de forma directa sobre las células fotorreceptores pineales y retinales, provoca una inhibición de la síntesis de la hormona y modula sus ritmos diarios (Cahill et al., 1996; Falcón et al., 2007). El patrón rítmico circulante de melatonina tiene un papel destacado en la organización circadiana de los organismos, dado que permite el ajuste temporal de numerosos procesos rítmicos a nivel diario y estacional (Pévet et al., 2006; Goldman, 2001; Falcón et al., 2010). Es conocido que el sistema circadiano contribuye al mantenimiento del ritmo diario de melatonina, dado que incluso en ausencia de cambios ambientales el ritmo de síntesis de la hormona permanece en estructuras tales como el órgano pineal y la retina (Reiter, 1993; Falcón, 1999). En el caso de los mamíferos, es el reloj circadiano principal localizado en el NSQ del hipotálamo el que mantiene el ritmo endógeno de síntesis de melatonina en la glándula pineal (Reiter, 1993), mientras que en los peces esa endogenia del ritmo de melatonina se mantiene gracias a la existencia de osciladores intrapineales e intraretinales (Falcón, 1999). En este sentido, los órganos fotorreceptores de algunos salmónidos, en particular los de la trucha arco iris, parecen constituir una excepción dentro de los teleósteos ya que carecen de mecanismos circadianos que regulen la síntesis de melatonina (Gern y Greehouse, 1988; Falcón et al., 1992; Falcón, 1999). Trabajos recientes de nuestro grupo han mostrado la presencia de oscilaciones en genes constitutivos del reloj circadiano en el hipotálamo y la retina de la trucha arco iris (López-Patiño et al., 2011b), pero todavía se desconoce su implicación en la síntesis rítmica de melatonina. En base a ello, uno de los objetivos de la presente tesis doctoral ha sido explorar la existencia de variaciones rítmicas diarias en la síntesis de melatonina en el intestino de la trucha arco iris, así como una potencial implicación del sistema circadiano en su regulación. 185 Discusión En el trabajo experimental 3 incluido en la presente memoria, se detallan las variaciones diarias del contenido de melatonina en el intestino medio y posterior, tanto en condiciones lumínicas normales (12L:12D) como bajo situación de oscuridad constante (D:D). Además, se cuantificó la expresión génica de las enzimas aanat1, aanat2 y hiomt, en estas mismas condiciones. Los resultados obtenidos apuntan a que no existen ritmos significativos en los niveles intestinales de melatonina, si bien tanto en el intestino medio como el posterior se observan incrementos puntuales durante la segunda mitad del día y la segunda parte de la noche (máximos a ZT9 y ZT 18, tomando como ZT0 el momento de encendido de las luces). Estos datos contrastan con el ritmo diario de los niveles de melatonina observado en el plasma, con fuertes incrementos durante la fase nocturna claramente dependientes de la síntesis de la hormona a nivel pineal (Ceinos et al., 2005). Ello es prueba de la pobre correlación existente entre los perfiles rítmicos de melatonina plasmática e intestinal, lo que apoya la independencia de ambos parámetros así como en los mecanismos que permiten su regulación. Por otra parte, se observó un perfil rítmico diario en el contenido de 5HT intestinal que fue muy similar en ambos segmentos estudiados (medio y posterior). Este perfíl podría definirse como contrario al descrito para la melatonina, dados los bajos niveles nocturnos de 5HT en relación a los niveles relativamente elevados de la hormona en mitad del noche. Para nuestro conocimiento no hay estudios que reflejen variaciones diarias del contenido intestinal de 5HT, mientras que para la melatonina se ha descrito en base a procedimientos inmunohistológicos la ausencia de cambios en el contenido intestinal de la rata (Bubenik, 1980), así como en la circulación periférica (venas y arterias de la circulación portal hepática) en el cerdo (Bubenik et al., 2000b). No obstante, en este último estudio se detalla la existencia de picos de melatonina en la circulación periférica tras los periodos de ingesta, lo que pone de manifiesto una potencial regulación de la melatonina enterohepática por el alimento (Bubenik et al., 2000b). En nuestro caso, los peces incluidos en el experimento fueron alimentados con normalidad (a ZT 3), incluso en el propio día de muestreo. Por tanto, es probable que el incremento diurno de los niveles de melatonina fuese provocado (directa o indirectamente) por un efecto del alimento ingerido por los peces, e incluso no es descartable que ello pudiese ser causa del fuerte incremento diurno hallado en los niveles de 5HT intestinal. Tal y como sería de esperar, bajo condiciones de oscuridad constante (D:D) los niveles plasmáticos de melatonina se mantuvieron elevados de forma continua, aunque se apreció un ligero aumento al comienzo de la noche subjetiva (CT12, CT18) en relación con los periodos de día subjetivo. Estos datos están de acuerdo con la idea de que en la trucha arco iris el ciclo L:O es el principal determinante de la producción rítmica de melatonina pineal y de su secreción al plasma, mientras que en ausencia de cambios lumínicos no se vislumbra un determinante circadiano de dichos procesos (Gern et al., 1992; Falcón, 1999). 186 Discusión A nivel del intestino, en situación de D:D se midió el contenido de melatonina únicamente en la región media, observándose un perfil diario diferente al observado en condiciones normales (L:D). Así, no se halló el incremento diurno que sí estaba presente en los animales bajo L:D, mientras que fue evidente un pico durante la noche subjetiva, aunque con un máximo adelantado 3 horas (CT15) con respecto a lo observado en L:D (ZT18). Dado que estos animales, a diferencia de los muestreados bajo el ciclo L:D, no fueron alimentados en el día de muestreo, es posible que la ausencia de valores elevados durante el día subjetivo obedezca a la falta de efecto del alimento o de los procesos digestivos que siguen a la ingesta del mismo, incluyendo la liberación de bilis desde la vesícula biliar. Por otra parte, la permanencia de un pico nocturno bajo situación de D:D y su adelanto temporal en relación al detectado bajo L:D, nos lleva a hipotetizar la existencia de un ritmo endógeno en el contenido de melatonina intestinal, cuyos valores máximos están confinados al periodo de oscuridad del ciclo diario. En todo caso, se trataría de un ritmo débil, dado, la reducida amplitud y duración del pico nocturno. De forma complementaria, la expresión de aanat1, aanat2 y hiomt fue también evaluada bajo situaciones de L:D y D:D. En situación de ciclo lumínico normal, tanto la aanat1 como la hiomt mostraron variaciones rítmicas diarias en intestino medio y posterior con un claro pico nocturno cuyos niveles máximos fueron detectados a ZT18, en coincidencia con el máximo detectado para melatonina. En cambio, la aanat2 solo se expresó de forma rítmica en intestino medio con características similares a las mostradas por aanat1. La falta de variación rítmica de la expresión aanat2 en intestino posterior no tiene una clara explicación fisiológica, al menos con los datos disponibles. Aunque es posible que dicho resultado pueda derivar de un problema metodológico, cabe mencionar que todas las muestras fueron extraídas en paralelo y ensayadas en las mismas placas en el el análisis de qPCR, lo que en principio descarta un posible error técnico. La expresión enzimática en condiciones de D:D solo fue evaluada en intestino medio, observándose un perfil similar al encontrado en condiciones normales de luz, si bien se detectó un ligero adelantamiento de 3 horas en el pico de expresión para cada uno de los genes (aanat1, aanat2 y hiomt) analizados (D:D ZT15 vs L:D ZT18). En todo caso, el momento temporal del pico hallado en la expresión de las enzimas coincidió con el observado para los niveles de melatonina, lo que apoya la existencia de un ritmo circadiano en la síntesis de melatonina en el intestino medio de trucha arco iris. En vertebrados, incluidos los teleósteos, es conocido que las variaciones rítmicas diarias de melatonina en retina y órgano pineal están determinadas principalmente por la actividad rítmica de la enzima AANAT, de modo que una alta expresión de esta conlleva incrementos de los niveles de la hormona (Iuvone et al., 2005; Klein, 2007). En cambio la HIOMT no parece tener un papel limitante, aunque se han descrito variaciones diarias en su actividad en codorniz (Fu et al., 2001) y algunas especies de roedores (Gauer et al., 1999; Ribelayga et al., 1999). En tejidos periféricos, los datos existentes acerca del papel 187 Discusión limitante de los enzimas implicados en la síntesis de melatonina son mucho más escasos, sobre todo en los peces. En este sentido, estudios recientes de Velarde et al. (2010a) demostraron la existencia de ritmos de expresión de aanat2 en el intestino posterior y el hígado del carpín, así como de la hiomt en hígado e intestino anterior y posterior. Mientras que la expresión aanat2 en el hígado presentó un pico durante la fase de luz, en el intestino los máximos se localizaron durante la noche. En el caso de la hiomt, los valores máximos del ritmo se correspondieron con la oscuridad en todos los tejidos periféricos estudiados. Estos autores también aportaron evidencias de la persistencia del ritmo de aanat2 bajo condiciones lumínicas constantes (D:D y L:L), con alteración de la acrofase en situación de inversión del ambiente lumínico, lo que demuestra su independencia del fotoperiodo y su naturaleza circadiana. Existen también algunos datos sobre la existencia de variaciones rítmicas de la actividad AANAT1 en intestino e hígado del carpín (Velarde, 2010). Los resultados de todos estos estudios coinciden básicamente con los obtenidos en nuestros experimentos en trucha arco iris, que demuestran: i) la existencia de actividad rítmica diaria en los genes que codifican para los principales enzimas de la síntesis de melatonina en el tejido intestinal, con máximos localizados durante la noche en peces expuestos a un ciclo L:D; ii) la persistencia de dichos ritmos en condiciones de D:D, lo que implica que son independientes del fotoperiodo y que pueden estar generados por osciladores circadianos. En los peces la información disponible sobre los mecanismos circadianos a nivel periférico es escasa. En el carpín se ha demostrado la existencia de ritmos de expresión de algunos genes (cry, per) que forman parte de la maquinaria molecular del reloj circadiano (Velarde et al., 2009a) y se ha hipotetizado que la síntesis de melatonina en tejidos relacionados con la actividad digestiva (intestino, hígado) podría estar bajo el control de relojes circadianos periféricos cuya oscilación sería independiente del fotoperiodo ambiental. A la hora de definir factores no-fóticos que contribuyan al ajuste de los osciladores localizados en el tracto digestivo, no cabe duda de que la ingesta de alimento debe ser considerada como un parámetro primario. En este sentido, la existencia y caracterización de osciladores encarrilados por el alimento (hora de alimentación, composición de la ingesta) está recibiendo creciente atención no solo desde un punto de vista descriptivo, sino fundamentalmente por lo que supone de sistema adaptativo que permite al organismo anticipar cambios en los procesos digestivos y metabólicos (Mistlberger, 2006; Mendoza, 2007; Zvonic et al., 2007). En nuestro estudio, la alimentación de los peces durante la fase de luz en el día de muestreo claramente afectó a los valores diurnos de melatonina, efecto que fue independiente de cambios en la expresión génica. Con respecto al pico nocturno hallado tanto en los niveles de melatonina como en la expresión de los diversos genes, no es posible definir si el adelanto del mismo bajo situación de D:D se debió a la ausencia de alimento en el día de muestro o a la ausencia de ciclo L:D per se. En este sentido harán falta estudios más precisos que definan la acción del horario de alimentación sobre el ajuste de los ritmos de síntesis de melatonina intestinal. 188 Discusión Efecto del ayuno prolongado y de la realimentación sobre las variaciones diarias del contenido de melatonina en el intestino de la trucha. Estudios realizados en el cerdo han demostrado que la ingesta de alimento puede provocar un aumento a corto plazo (entre 1 a 5 horas) en los niveles de melatonina intestinal (Bubenik et al, 1996), efecto que fue similar al provocado por la privación de alimento durante 48 horas en el ratón (Bubenik et al., 1992). En el caso de la trucha arco iris, los datos discutidos anteriormente parecen indicar que la alimentación puede modular el contenido intestinal de melatonina, con incrementos del mismo asociados a los momentos posteriores a la ingesta. En un intento de comprender mejor el papel del alimento sobre las variaciones diarias de la melatonina intestinal, hemos desarrollado un experimento en el que se evaluó el efecto de la privación de alimento durante 7 días consecutivos sobre las variaciones diarias del contenido de melatonina en el intestino medio y posterior, así como en el plasma sanguíneo. Los datos obtenidos indican que los animales ayunados presentaron un aumento de los niveles de melatonina plasmática durante el día (18:00 h) y gran parte de la noche (21:00 h y 00:00 h), en comparación con el grupo control alimentado con normalidad a las 11.00 horas. De forma paralela, a nivel intestinal la situación de ayuno produjo un fuerte incremento de los niveles de melatonina en el periodo comprendido entre mediodía (14:00 h) y medianoche (00:00h), tanto en intestino medio como en el posterior. Dicho incremento fue atenuado cuando los peces ayunados recibieron alimentos durante varios días. Estos resultados concuerdan con lo descrito por Bubenik et al. (1996) en el ratón y claramente ponen de manifiesto que el perfil diario de variación de los niveles de melatonina intestinal puede estar condicionado, en gran medida, por la presencia de alimento en momentos puntuales del ciclo diario y/o por el estado fisiológico del animal, el cual varía sustancialmente en situación de ayuno. La existencia de efectos similares de la ingesta de alimento y del ayuno prolongado provocando aumentos en el contenido intestinal de melatonina, es un resultado cuanto menos llamativo. Por un lado, parece que el alimento per se puede inducir un aumento de la síntesis de melatonina, aspecto éste que será tratado posteriormente. Por otro lado, es evidente que el ayuno podría condicionar las variaciones rítmicas de la producción intestinal de melatonina y alterar los cambios diarios en su contenido. No obstante, y teniendo en cuenta los datos de los experimentos anteriores, creemos que lo más probable es que parte de la melatonina que se acumula a nivel intestinal en situación de ayuno proceda de la bilis. En este sentido, es conocido que en las fases de ayuno existe un proceso de concentración de la bilis en la vesícula biliar, con reabsorción y reciclado de metabolitos, incluyendo la melatonina (Sewerynek et al., 1996; Tan et al., 1999; Reiter y Tan, 2003). Asimismo, en periodos de ayuno prolongado se ha demostrado que la secreción de bilis está influenciada por procesos ultradianos y/o circadianos (Camello et al., 1991; Madrid, 2006) que permiten su liberación paulatina al lumen intestinal. Por tanto, 189 Discusión parece probable que la secreción biliar proporcionase melatonina al lumen intestinal de las truchas ayunadas, siendo ésta acumulada parcialmente en los tejidos intestinales. En un experimento similar, nuestro grupo había observado que el ayuno prolongado redunda en un descenso en la síntesis de melatonina en el órgano pineal de la trucha arco iris, con fuertes caídas en el contenido de melatonina y en la actividad AANAT pineal (Ceinos et al., 2008). Resultados similares fueron aportados por estudios llevados a cabo en la glándula pineal (Holloway et al., 1985; Welker y Volrath, 1984) y a nivel del plasma sanguíneo (Chick et al., 1985) en la rata. Si la síntesis de melatonina en la glándula pineal de la trucha desciende en situación de ayuno, ¿cuál es entonces la causa del aumento de los niveles de la hormona en el plasma sanguíneo? De los datos obtenidos en nuestros experimentos en la trucha arco iris parece posible que la fuente que proporcione niveles elevados de melatonina a la circulación sanguínea durante el ayuno sea el TGI. Esta posibilidad había sido apuntada en los experimentos realizados con truchas pinealectomizadas, en las cuales se siguió detectando una cierta concentración de melatonina en plasma, aunque con valores menores que en los peces no pinealecomizados. Dado que la pinealectomía no afectó al contenido intestinal de melatonina, es posible que una parte de ésta contribuyese a los valores basales de melatonina plasmática. En la situación actual, el incremento continuado en los niveles intestinales de melatonina durante el ayuno podría desembocar en una mayor difusión de la hormona intestinal hacia los capilares sanguíneos con elevación de sus niveles plasmáticos. Una explicación alternativa sería que los peces ayunados presenten un descenso en el aclaramiento plasmático de la melatonina debido a una reducción en la capacidad metabólica hepática, lo cual ha sido también sugerido por otros autores en situaciones similares de ayuno (Bubenik et al, 1992). Regulación de la síntesis de melatonina por la ingesta y el tránsito alimenticio en el tubo digestivo. A juzgar por los experimentos anteriores, la de alimentación de los peces induce un aumento en los niveles de melatonina en el intestino. No obstante, no está claro si este efecto se debe a un incremento en la síntesis de la hormona o bien responde a otros factores como, por ejemplo, el aporte de melatonina procedente de la secreción biliar que se activa en el periodo de ingesta. Para profundizar en estos aspectos, se procedió a evaluar los cambios en los niveles de melatonina en diferentes regiones intestinales y el hígado, así como en la bilis y en el contenido del lumen intestinal, asociados al momento de ingesta y durante el tiempo de tránsito del alimento por el tubo digestivo (periodo post-ingesta). También se estudió la existencia de alteraciones en la expresión de los enzimas implicados en la síntesis de melatonina en intestino medio. Tras la alimentación se produjo un aumento del contenido de melatonina en todos los tramos intestinales, aunque el efecto fue más consistente, tanto en amplitud de cambio como en su persistencia en el tiempo (desde 120 a 360 min post-ingesta), en las regiones anterior y media del intestino. Estos resultados concuerdan con los descritos previamente 190 Discusión para mamíferos (Rice et al., 1995; Bubenik et al., 1996). En el cerdo, Bubenik et al. (1996) propone que el aumento en los niveles de melatonina se correlaciona con el desplazamiento del alimento por el tracto digestivo. Esta respuesta sería diferencial a lo largo del tracto, variando en relación al grado de desarrollo de la capa muscular. Así, tanto el esófago como el estómago, con un mayor desarrollo de la capa muscular, responden en menor medida, mientras que los mayores efectos se desencadenan en la región del íleon y la zona distal del intestino, con menor desarrollo de la capa muscular (Bubenik et al., 1996). En teleósteos, los estudios al respecto son casi inexistentes, aunque Herrero et al. (2007) en la lubina muestra un ligero incremento en el contenido intestinal de melatonina a los 180 minutos post-ingesta. Del mismo modo que la presencia de alimento en el TGI provocó el incremento de los niveles de melatonina, también indujo la expresión de las enzimas aanat1, aanat2 y hiomt en intestino medio. Dicho efecto fue visible ya a los 20 minutos tras la ingesta y disminuyó de manera muy rápida en el caso de la hiomt (ya no apareció a los 60 min), mientras que fue más persistente para la aanat1 (visible hasta los 120 min) y aanat2 (visible hasta los 240 min). Tampoco estuvo presente en los animales que no recibieron alimento, al igual que ocurrió con los cambios en los niveles de melatonina, por lo que puede concluirse que la ingesta per se estimula la síntesis intestinal de melatonina debido, al menos en parte, a un aumento en la disponibilidad de los enzimas necesarios para transformar la 5HT en melatonina, en particular de las isoenzimas AANAT1 y AANAT2. Estos resultados permiten concluir que existe una activación de la síntesis de melatonina en el tejido intestinal en respuesta a la ingesta de alimento y al tránsito del mismo por el tubo digestivo. Los mecanismos implicados en esta respuesta son todavía desconocidos, pero el hecho de que la expresión de los enzimas de síntesis de melatonina aumente de forma muy rápida (ya visible a los 20 min tras la ingesta) lleva a sospechar que existe una estimulación del proceso de síntesis por mecanismos nerviosos y/o endocrinos, los cuales podrían ser similares a los que regulan otros aspectos de la actividad digestiva y que implican a una variedad de factores nerviosos y humorales (Hansen, 2003; Olsson, 2009; 2011). Por otro lado, es posible que el aporte de componentes metabólicos en la ingesta necesarios para la síntesis de melatonina favorezca este proceso durante el periodo post-ingesta. En este sentido, es conocido que la administración de L-Trp resulta en un aumento del contenido de melatonina en el intestino de roedores (Huether et al., 1992; Yaga et al., 1993). También en la trucha arco iris se ha descrito que la incubación de fragmentos intestinales en un medio suplementado con L-Trp induce un aumento de la liberación de melatonina al medio, indicando una mayor síntesis de la hormona en el tejido (Lepage et al., 2005a). Todo ello, junto con los datos obtenidos en el presente trabajo experimental nos han llevado a valorar el efecto de la administración de L-Trp sobre la producción intestinal de melatonina (trabajos 5 y 6), lo que será discutido posteriormente. 191 Discusión Como era de esperar, el volumen de bilis en la vesícula biliar descendió de forma paulatina durante el periodo post-ingesta. Esta respuesta nos indica el grado de vaciado de la vesícula biliar que, estimulada por la ingesta y el tránsito digestivo, proyecta su contenido a la región inicial del intestino anterior. De forma complementaria al vaciado biliar, el contenido de melatonina en el fluido presente en el lumen intestinal se incrementó significativamente con el tiempo postingesta. La composición de este fluido es muy compleja ya que contiene la suma del alimento ingerido y/o parcialmente digerido, jugos gástricos y enzimas digestivos. Además, tras la ingesta contiene la bilis expulsada desde la vesícula biliar, lo que fue evidente en función del color amarillo-verdoso que presentó el fluido luminal. Nuestros datos midiendo los niveles de melatonina presentes en el fluido luminal revelan que tras la ingesta se produce un incremento en los mismos (entre 120 y 240 min tras la ingesta) como consecuencia del aporte de melatonina de origen biliar. Este efecto tuvo lugar sin apenas cambios en la concentración de melatonina a nivel hepático ni en la bilis. Por lo tanto, parece descartable un efecto de la ingesta estimulando la producción hepática de melatonina y/o su concentración en la bilis, ya que los datos indican claramente que es el volumen creciente de bilis secretada al intestino anterior tras la ingesta lo que induce un aumento del nivel de melatonina en el contenido intestinal. En definitiva, los resultados obtenidos en el trabajo 4 y precedentes demuestran que el alimento estimula la síntesis local de melatonina en el tracto digestivo, pero además estimula la liberación al tubo digestivo de bilis que contiene una elevada concentración de melatonina. Es bien sabido que la liberación de bilis ocurre en respuesta a componentes neurales (reflejos parasimpáticos activados por señales olfativas/gustativas del alimento, estimulación de mecanorreceptores y quimiorreceptores de la pared digestiva,..) y por hormonas gastrointestinales (CCK, gastrina, etc.), algunos de los cuales también podrían participar en la estimulación del proceso de síntesis de melatonina en el tejido intestinal. El incremento post-ingesta de la cantidad de melatonina tanto en el lumen como en el tejido intestinal, también sugiere que esta hormona podría ser uno más de los mecanismos que regulan la actividad digestiva. De hecho, en roedores se ha descrito que la inyección i.p. de melatonina provoca un incremento de la secreción de amilasa al fluido intestinal y en la producción de bicarbonato (Sjoblom y Flemstrom, 2003; Jaworek et al., 2004) y se ha propuesto que puede modular el efecto regulador de la 5HT en la actividad digestiva (Bubenik et al., 1994). En el carpín, la melatonina también parece modular la motilidad intestinal (Velarde et al., 2010b), resultado que concuerda con lo hallado en la trucha arco iris (Trabajo 7). Efecto de la administración de L-triptófano sobre la síntesis de melatonina a nivel gastrointestinal. Relación entre síntesis de serotonina y de melatonina. 192 Discusión Estudios in vivo del efecto de L-Trp administrado por vía oral (alimento enriquecido) o parenteral (i.p.) Como ya se mencionó anteriormente, es posible que parte de los efectos estimuladores de la ingesta sobre la síntesis de melatonina a nivel intestinal provengan de una mayor disponibilidad del aminoácido L-Trp, precursor en dicho proceso de síntesis. En concordancia con ello, los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral ponen de manifiesto que la administración de L-Trp estimula la producción de melatonina en el TGI, tanto in vivo como in vitro. Tal y como se muestra en el Trabajo experimental 5, cuando se administraron dietas suplementadas con L-Trp (0,5 y 2,5 g /100 g pienso) durante 7 días, se observó un incremento en los niveles de melatonina en diferentes regiones del TGI: ciegos pilóricos, intestino anterior, medio y posterior, así como en el hígado y la bilis. En general los efectos fueron dependientes de la concentración de L-Trp y del tiempo post-ingesta, observándose efectos mayores y más rápidos con la concentración más alta del aminoácido. Así, mientras que a una hora tras la ingesta solo se hallaron efectos con la dosis mayor de L-Trp, a las tres y cinco horas se observaron con las dos dosis estudiadas en la mayor parte de los tejidos intestinales y en el hígado. A nivel de la bilis solo se observaron incrementos con la dosis mayor de L-Trp, los cuales fueron independientes del tiempo post-ingesta. Un dato interesante de este experimento fue que, en los grupos que recibieron dieta sin suplementar con L-Trp, la presencia de alimento provocó un aumento de los niveles de melatonina en todos tejidos estudiados, incluido el hígado. Este efecto fue evidente en los peces muestreados a las 3 y/o 5 horas en comparación con los muestreados a 1 hora. Comparativamente con estos grupos, aquellos que recibieron el L-Trp en el pienso mostraron, en general, un incremento todavía mayor en el contenido en melatonina. Todo ello claramente muestra la acción de dos factores complementarios: por un lado, el alimento per se que induce la síntesis intestinal y hepática de melatonina, corroborando lo descrito en el trabajo 4. Por otro lado, la presencia de concentraciones elevadas de L-Trp en el alimento que potencian el efecto estimulador del alimento sobre la síntesis enterohepática de melatonina. Es posible que a estos efectos también contribuyese la melatonina secretada en la bilis al tracto digestivo. De hecho, la concentración de hormona en la bilis se incrementó tras la ingesta, en particular en los peces que recibieron dieta enriquecida en L-Trp. El incremento de melatonina intestinal tras la administración de L-Trp por vía oral no tuvo reflejo en los niveles plasmáticos de la hormona, en contraste al incremento descrito en estudios realizados en la trucha arco iris (Lepage et al., 2005a), aunque siendo similar a lo observado en la lubina (Herrero e tal., 2007). Esta discrepancia de resultados entre estudios podría estar relacionada con las diferentes concentración de L-Trp utilizadas y/o los tiempos en los que se evaluaron los efectos. Incluso Lepage et al. (2005a) describe que las dietas suplementadas con L-Trp incrementan los valores plasmaticos de melatonina 193 Discusión durante el día, pero no los nocturnos. Aparentemente nuestros resultados descartan que en esta situación de estimulación de la síntesis de melatonina intestinal pueda haber una contribución significativa de dicha melatonina al plasma sanguíneo durante el periodo diurno, en contraste a lo que se hemos descrito en situación de ayuno prolongado. Es posible, por tanto, que la transferencia de melatonina desde el intestino al plasma, o bien su permanencia en este compartimento (aclaramiento plasmático), estén influenciados por el estado metabólico/nutricional del animal. De forma complementaria, el enriquecimiento de las dietas con L-Trp también provocó un incremento dosis-dependiente en la concentración de 5HT en la mayoría de los tejidos intestinales analizados, especialmente evidente con la concentración mayor del aminoácido. Además, el incremento en el contenido de 5HT dependió del tiempo postingesta, aunque no fue tan notorio como para la melatonina. En peces se conoce muy poco sobre la regulación metabólica de la 5-HT intestinal, aunque estudios recientes en la lubina demostraron un aumento progresivo de la 5-HT plasmática tras la ingesta de dietas suplementadas con L-Trp, achacándose este efecto a una mayor liberación de 5HT desde el intestino (Herrero et al., 2007). En los mamíferos, sin embargo, es conocido que tanto la ingestión oral de triptófano, como su ausencia en la dieta alteran la actividad serotoninérgica (Furness y Costa, 1977; Hansen y Witte, 2008), en concordancia con lo mostrado en nuestro estudio. Por otro lado, también presentamos evidencias de que el alimento per se (sin suplemento con L-Trp, peces control) desencadena la presencia de una mayor concentración de 5HT intestinal, lo que fue muy notorio en los ciegos pilóricos y el intestino medio (valores a 3 y 6 horas post-ingesta fueron superiores a los de 1 hora). En mamíferos se sabe que diversos nutrientes presentes en la dieta (ácidos grasos de cadena larga, péptidos, glucosa) y estímulos químicos (ácidos gástricos) y sensoriales relacionados con la acción digestiva actúan estimulando la actividad serotoninérgica intestinal (Gershon y Tack, 2007, Bertrand y Bertrand, 2010). Nuestros datos sugieren que ello también parece ocurrir en el TGI de la trucha arco iris, promoviendo una mayor disponibilidad celular de 5HT. La ingesta también influyó en los niveles del principal metabolito de la 5HT, el 5HIAA, observándose una disminución de sus niveles con las dietas ricas en L-Trp. Los niveles de este metabolito en el tejido intestinal son más bajos que los de 5HT dado que es retirado rápidamente hacia el fluido intestinal y la vasculatura portal (Legay et al., 1983). Aparentemente, de nuestros datos se desprende que esa eliminación del 5HIAA podría ser acelerada en situaciones en las que hay mayor concentración celular del neurotransmisor. No obstante, tampoco es descartable que la caída de los niveles de 5HIAA con la administración oral de L-Trp acontezca por el uso alternativo de una parte de la 5HT intestinal para la formación de mayores niveles de melatonina. Cuando el L-Trp fue administrado por vía parenteral (i.p.) no produjo, en general, cambios significativos en el contenido de melatonina y 5HT en las distintas secciones del 194 Discusión TGI de la trucha, aunque una tendencia al aumento se observó en intestino posterior. Esta ausencia de efectos claros contrasta enormemente con los incrementos hallados tras la administración oral (dieta enriquecida) de L-Trp. Efectos similares han sido descritos en mamíferos, en los que el incremento en los niveles plasmáticos de melatonina es mayor cuando el L-Trp es administrado por vía oral que por inyección parenteral (Huether et al., 1992). Además, en nuestro caso hemos constatado que la administración i.p. de 5HTP sí fue eficaz al estimular los niveles de melatonina en todas las secciones intestinales estudiadas, así como en el hígado y el contenido biliar. Estos cambios inducidos por el 5HTP fueron acompañados de incrementos significativas en el contenido de 5HT y de su metabolito, el 5HIAA. Sin embargo ni los niveles de la amina ni los de su metabolito variaron tras la administración i.p. de L-Trp. Los resultados derivados de la administración i.p. de L-Trp y de 5HTP nos llevan a hipotetizar varios mecanismos posibles para explicar los efectos obtenidos. En primer lugar, es posible que la captación celular y/o biodisponibilidad de L-Trp no sea tan eficaz cuando se administra el aminoácido en la dieta como cuando se administra por vía parenteral, lo que podría estar en relación con el transportador del aminoácido a las células que sintetizan 5HT en el TGI de la trucha. En segundo lugar, es conocido el papel limitante que realiza la enzima TPH en la formación de 5HT (Tyce, 1990). En mamíferos existen dos isoformas de la TPH, habiéndose implicado la TPH1 en la conversión de L-Trp a 5HTP en las CE intestinales, mientras que la TPH2 ha sido localizada en neuronas entéricas y en el cerebro (Yu et al., 1999; Walther et al,, 2003). La presencia de estas isoformas y el probable papel limitante en los peces no han sido corroborados hasta la fecha, existiendo únicamente datos a nivel cerebral en la trucha (Aldegunde et al., 1998). En todo caso, nuestros resultados sugieren que la actividad de síntesis de 5HT intestinal puede ser modulada por el alimento, de forma que se activaría tras la ingesta facilitando la formación de 5HT y su accesibilidad para ser N-acetilada a melatonina. Se ha demostrado que valores de L-Trp fisiológicos no saturan a la TPH (Tyce, 1990; Winberg et al., 2001), pero si lo hacen concentraciones altas de L-Trp (Friedman et al., 1972). Por tanto, es posible tras la administración parenteral de L-Trp los niveles de este aminoácido en circulación fuesen muy elevados e impidiesen la adecuada función de la TPH, lo que no llegó a ocurrir tras la administración de 5HTP. Por último, nuestros resultados sugieren que, tanto la formación de 5HT como la de melatonina en las células entero-hepáticas, podrían estar condicionados por las señales sensoriales y humorales ligadas a la ingesta de alimento y a su paso por el tracto digestivo. Estas señales nerviosas y hormonales podrían facilitar el propio transporte de L-Trp al interior de las células serotoninérgicas, la síntesis de 5HT y su disponibilidad citoplasmática para la conversión a melatonina. En diversas especies de teleósteos la administración de L-Trp ha sido catalogada por producir efectos de atenuación de la respuesta de estrés (Hoglund et al., 2007), 195 Discusión incluyendo disminución de los niveles circulantes de cortisol (Lepage et al., 2002; Herrero et al., 2007). Una respuesta característica ligada a la activación de la respuesta de estrés es la disminución de la tasa de ingesta (Carr, 2002), efecto al que podrían contribuir los elevados niveles de 5-HT (De Pedro et al., 1998; Winberg y Lepage, 1998). En nuestros experimentos hemos constatado que en las truchas alimentadas con dieta enriquecida en LTrp se produjo un descenso significativo de los niveles plasmáticos de cortisol, aunque solo en aquellos que recibieron la concentración más elevada del aminoácido. Estos resultados concuerdan con los obtenidos previamente en trucha arco iris (Lepage et al., 2005a), lubina (Herrero et al., 2007) y trucha salmonada (Höglund et al., 2007). Aunque los datos disponibles de nuestros experimentos solo abarcan a la 5HT periférica, se ha demostrado que el L-Trp induce la síntesis de 5-HT en el cerebro de la trucha (Aldegunde et al., 2000). Por tanto, estos resultados apoyan fuertemente la hipótesis de que el efecto anti-cortisol del L-Trp pueda estar asociado a una activación del sistema serotoninergico a nivel cerebral y periférico. A pesar de ello, no hemos hallado alteraciones significativas de la ingesta en los animales tratados con L-Trp. Ello puede ser motivado por el hecho de nuestros experimentos fueron realizados en ausencia de estrés, en contraste con la mayoría de estudios en los que la respuesta de la ingesta al L-Trp se valoró en peces sometidos a algún tipo de estresante (Lepage et al., 2005b; Höglund et al., 2007). Relaciones entre síntesis y disponibilidad celular de 5HT y síntesis de melatonina en el intestino de trucha arco iris. Los resultados derivados de la administración de L-Trp por vía oral e i.p., sugieren que tanto la disponibilidad celular de L-Trp como la disponibilidad de la propia 5HT formada, pueden modular la síntesis intestinal de melatonina en la trucha arco iris. A fin de constatar la relación entre esos procesos, se realizaron una serie de estudios in vitro utilizando segmentos de intestino medio en los que se valoró el efecto del L-Trp sobre los niveles de 5-HT y melatonina. Se comprobó que la adición de L-Trp al medio de cultivo provoca un incremento dosis-dependiente en el contenido tisular de melatonina tras 12 horas de cultivo, en concordancia con lo descrito previamente para el intestino en esta misma especie (Lepage et al., 2005a). En general la magnitud de los efectos hallados fue superior a la observada tras la administración de L-Trp in vivo, lo que sugiere que en este último caso pueden existir otros condicionantes de la captación del aminoácido y/o de la actividad celular intestinal. A pesar de los cambios observados en la melatonina, no se apreciaron efectos de la adición de L-Trp sobre el contenido de 5HT y de 5HIAA en el tejido intestinal, si bien se apreció una tendencia dosis-dependiente al alza. Estos resultados se diferencian de los descritos in vivo, donde a mayor concentración de L-Trp en la dieta, mayores fueron los niveles de 5HT. La ausencia de efectos in vitro sobre la 5HT podría ser explicada por la enorme diferencia entre las concentración de 5HT presente en las células intestinales 196 Discusión (1000-4000 veces mayor que la de melatonina), la mayor parte de la cual permanece internalizada en vesículas/gránulos citoplasmáticos (Bertrand y Bertrand, 2010). Se ha indicado que la 5HT de nueva síntesis es rápidamente almacenada en estos gránulos mediante un transportador vesicular tipo 1 (VMAT1) que, en mamíferos, es específico de las CE (Rindi et al., 2004). Por tanto, en nuestro caso parece improbable que los pequeños cambios inducidos en la síntesis de 5HT por el L-Trp pudiesen ser detectables, dada la gran cantidad de 5HT residente en los almacenes citoplasmáticos de las células intestinales. Por otro lado, nuestros resultados revelan la importancia que tiene el sistema de transporte de aminoácidos neutros residente en las membranas de las células intestinales para la síntesis de melatonina. En este sentido, se ha demostrado que la adición de Lalanina (1 mM) al medio de incubación del tejido intestinal bloquea de manera dependiente de concentración el aumento promovido por el L-Trp en los niveles de melatonina en el intestino. Este efecto concuerda con que ambos aminoácidos comparten el mismo transportador de la membrana celular (Baumrucker et al., 1989), de forma que la competencia entre ambos limita la cantidad de L-Trp que pasa al interior de la celular, tal y como se ha descrito que ocurre en la barrera hematoencefálica de mamíferos (Fernstron y Wurtman, 1972). Sin embargo, esta competición entre aminoácido neutros por el transportador apenas tuvo consecuencias sobre los niveles de 5HT tisulares. Ello es indicativo, una vez más, de que el aumento desencadenado de forma inmediata por el aporte de L-Trp en la síntesis de 5HT, no siempre se traduce en cambios apreciables en el contenido total de 5HT (5HT sintetizada de novo + 5HT almacenada en gránulos citoplasmáticos). Estos datos claramente demuestran que el aumento de la 5HT libre (de nueva síntesis) inducida por el L-Trp fue necesario y suficiente para incrementar los niveles de melatonina, lo que avala un papel prioritario de la disponibilidad citoplasmática de 5HT no vesicular en la síntesis de melatonina (figura 1). De forma complementaria, el tratamiento con pargilina del medio de incubación intestinal, provocó un aumento dosis-dependiente del contenido intestinal de melatonina. La aplicación de este fármaco, definido como un inhibidor de la actividad enzimática MAO (Fowler et al., 1981), también provocó un aumento de los niveles de 5HT conjuntamente con un descenso de los de 5HIAA, así como en la relación 5HIAA/5HT. Dado que la MAO es un enzima mitocondrial, solo puede actuar sobre la 5HT que está en forma libre en el citoplasma (Aldegunde et al., 1998), lo que permite concluir que la pargilina indujo una mayor presencia de 5HT no vesicular/granular en el interior celular. Ello favoreció la acción de las enzimas de síntesis de melatonina que actúan sobre la 5HT libre del citoplasma, incrementando su transformación en melatonina (figura1). Contrariamente, la administración de fenfluramina provocó una disminución en la producción de melatonina in vitro, de manera similar a lo observado para la 5HT, aunque este efecto fue mucho menor que el obtenido con la pargilina. Además, la fenfluramina resultó en un incremento de los niveles de 5HIAA, así como en la relación 5HIAA/5HT, 197 Discusión siendo esta última interpretada como un indicador de la tasa de liberación funcional del neurotransmisor (verli et al., 2001). Estos datos concuerdan totalmente con los descritos por Caamaño-Tubío et al. (2006) tras inyección i.p. de fenfluramina en la trucha arco iris. Se ha postulado que la fenfluramina actúa de forma dual en las neuronas serotoninérgicas, provocando la liberación de la 5HT y bloqueando su recaptación (Garattini, 1987). A nivel intestinal, el mecanismo de recaptación de 5HT es muy activo, al igual que lo es la inactivación celular de la amina por la MAO (Edwards et al. 1986; Senatori et al., 2003). Por ello, es probable que la fenfluramina no llegue a bloquear totalmente la recaptación de la amina, permitiendo que una parte entre en el citoplasma y sea degradada de forma inmediata a 5HIAA. Por tanto, los datos concuerdan fielmente con la idea de que fenfluramina produce una reducción de la 5HT presente en el medio intracelular, lo que se traduce en menor síntesis de melatonina debido a la baja disponibilidad de 5HT libre en el citoplasma de las células intestinales(figura 1). Un mecanismo similar de regulación de la síntesis de melatonina por los niveles celulares de 5HT ha sido propuesto en la glándula pineal de mamíferos (Míguez et al., 1997). Figura 1. Esquema de la formación de 5HT a partir de aminoácidos neutros en una célula EC y de los mecanismos de acción de los fármacos que alteran la disponibilidad de 5HT celular (fenfluramina, pargilina) y su efecto sobre la síntesis de melatonina. 198 Discusión Estudio de la función de la melatonina en la contractibilidad intestinal En los vertebrados se ha propuesto que la melatonina podría estar implicada en la regulación de diversas funciones en el TGI, incluyendo un papel potencial como protector de la mucosa digestiva y en la regulación de las secreciones y de la motilidad intestinal (Bubenik, 2002; Kvetnoy et al., 2002). Sin embargo, la mayor parte de los estudios se han llevado a cabo en mamíferos y en el humano, existiendo datos muy escasos en peces. En este sentido, trabajos recientes de Velarde et al. (2009b) en el carpín dorado han demostrado que la melatonina podría ejerce un efecto de atenuación de la actividad contráctil intestinal, en parte actuando sobre receptores específicos de la hormona. Dado el interés que tiene este aspecto funcional de la melatonina, así como el poder disponer de datos a nivel comparativo entre las distintas especies de teleósteos, una parte final de nuestro trabajo dedicó su atención a estudiar la acción de la melatonina sobre la contractilidad intestinal en la trucha arco iris, utilizando para ello la metodología del baño de órganos. Nuestros resultados han puesto de manifiesto que, a diferencia de otras especies de teleósteos tales como el carpín (Velarde et al., 2009b), el pez cebra (Holmberg et al., 2007) o el salmón Chinook (Forgan y Forster, 2007), en los que existen patrones típicos de actividad muscular basal caracterizados por una actividad miogénica espontánea con contracciones periódicas de amplitud y frecuencia relativamente constantes, en la trucha arco iris existen serias dificultades para monitorizar este patrón rítmico contráctil en situación basal dada su escasa permanencia en el tiempo. Este dato concuerda con lo demostrado previamente en esta especie (Johansson y Holmgren, 2003), lo que se ha asociado a que el músculo intestinal de la trucha arco iris carece de ritmo de ondas lentas (Manera et al., 2008) que genere la motilidad espontánea. Metodológicamente, ello supone una seria limitación la hora estudiar la acción reguladora de la motilidad intestinal de sustancias con potencial acción fisiológica. Por ello, los estudios realizados en nuestro caso se centraron en la evaluación de la fuerza contráctil del intestino (tensión muscular) en situación basal y/o en presencia de melatonina y otros fármacos. La Ach ha sido descrita como el principal neurotransmisor implicado en la regulación de la contracción de la musculatura lisa intestinal de los vertebrados. Este neurotransmisor es liberado por neuronas del sistema parasimpático y del sistema entérico y su acción esta mediada por receptores muscarínicos (Mandl y Kiss, 2007). Nuestros resultados muestran una respuesta estimuladora de la contractilidad intestinal en la trucha con concentraciones de 10nM y superiores de ACh, en concordancia con estudios pioneros realizados en esta misma especie (Burnstock, 1958) y más recientemente en el carpín (Velarde et al., 2009b). Tal y como cabía esperar, los experimentos de competición realizados en presencia de atropina, un inhibidor de receptores muscarínicos, demostraron la especificidad del efecto contráctil de la ACh y su mediación por receptores muscarínicos. En teleósteos, concretamente en tilapia, se ha descrito la existencia de 5 199 Discusión subtipos de receptores muscarínicos en distintas regiones del TGI, aunque de todos ellos parece que los M1 y M3 son los más firmes candidatos a mediar respuesta contráctil colinérgica (Seo et al., 2009). En la trucha arco iris se ha descrito inicialmente la presencia del receptor muscarínico M2 (Burka et al., 1989) y más recientemente del receptor M3 (Ulrika y Holmgren, 2000). En consecuencia, a partir de los resultados obtenidos sugerimos la implicación de receptores muscarínicos de los subtipos M2 y M3 en la respuesta contráctil generada por ACh en el intestino de la trucha arco iris. La motilidad intestinal permite el tránsito de alimento y su absorción de una manera organizada a lo largo del tracto digestivo. En su regulación participan una variedad de neurotransmisores ligados a la inervación extrínseca e intrínseca del TGI, así como moduladores paracrinos (Olsson y Holmgren, 2001). Los modelos de intestino aislado permiten evaluar con relativa facilidad los cambios en la tensión muscular derivados de diversos fármacos y sustancias moduladoras. En nuestro caso, hemos demostrado que la 5HT también ejerce un efecto estimulador dosis-dependiente de la contracción muscular intestinal, el cual fue evidente con un amplio rango de concentraciones del neurotransmisor (desde 10nM a 10M). Dicho efecto de la 5HT responde a lo esperado, ya que confirma su papel estimulador de la contracción intestinal observado en una variedad de teleósteos tales como el carpín (Kiliaan et al., 1989; Velarde et al., 2010b), la carpa (Kitazawa et al., 1990), así como en estudios pioneros realizados en la trucha arco iris (Burnstok, 1958). No obstante, en la tilapia se ha descrito un efecto relajante de la 5-HT sobre de la motilidad intestinal (Kilian et al., 1989), lo que podría indicar que existen diferencias interespecíficas en la acción de este neurotransmisor. Es posible también que los efectos de la 5HT puedan ser diferentes entre las regiones digestivas, lo que ha sido propuesto para otros modelos de vertebrados (Baxter et al., 1991; Martin et al, 1993; Tonini, 2005; Kitazawa et al., 2006). Dado que a lo largo de esta tesis doctoral hemos demostrado la presencia en el intestino de la trucha arco iris de 5HT tanto en las CE de la mucosa, como en elementos nerviosos asociados a los plexos nerviosos y mientéricos, así como en proyecciones neuronales de estos plexos hacia la mucosa, los datos aportados en el presente trabajo indican que la liberación de neurotransmisor desde estas poblaciones celulares puede ejercer un papel importante estimulador del tono contráctil basal en el intestino de la trucha arco iris. En el carpín se ha indicado que el efecto contráctil inducido por la 5HT puede implicar una interacción directa sobre el músculo liso y/o una acción indirecta modulando la contracción inducida por ACh (Velarde et al., 2009b). En nuestro caso hemos comprobado que, en presencia de atropina en el medio de incubación, el efecto de la 5HT sobre la tensión muscular es considerablemente menor que si se aplica 5HT sola. Este resultado coincide con lo descrito también en otras especies de peces, como la carpa (Kitazawa et al., 1990), el bacalao (Karila et al., 1998) y la trucha (Burnstock, 1958). Por otro lado, nuestros resultados demuestran que el efecto de 5HT es en gran medida dependiente de la presencia de Ca2+ extracelular. Al incubar los fragmentos de intestino en un medio con total ausencia de ión se observó un efecto muy atenuado de la 5HT sobre la 200 Discusión fuerza de contracción muscular, requiriéndose concentraciones mayores del neurotransmisor para provocar efectos que normalmente se obtendrían con concentraciones más bajas. Ello concuerda con lo descrito previamente para esta especie (Burka et al., 1990), mientras que en el carpín se ha encontrado que la 5HT no provoca contracción alguna en un medio libre de calcio (Velarde et al., 2010b). Por tanto, nuestros datos indican que el efecto contráctil de la 5HT puede estar mediado por una estimulación de la liberación neuronal de ACh, siendo la acción postsináptica de este neurotransmisor la que explicaría gran parte de los efectos estimuladores de la 5HT en la musculatura intestinal. De forma complementaria a un efecto indirecto (liberación de ACh) ejercido por la 5HT, los datos obtenidos invitan a sugerir que este neurotransmisor también ejerce una acción directa sobre la musculatura intestinal, lo que explicaría que incluso en presencia de atropina y/o en ausencia de calcio (ión necesario para la liberación de ACh), la 5HT sigue ejerciendo un efecto de estimulación contráctil. En vertebrados se conoce la presencia de diversos receptores de 5HT en intestino, con potencial implicación en la regulación de la contracción de la musculatura lisa. Tal es el caso de los subtipos 5HT1b, 5HT1d, 5HT2, 5HT3 y 5HT4 o los recientemente identificados como el 5HT7 (Hoyer et al., 2002; Gershon y Tack, 2007). En peces el conocimiento de receptores serotoninérgicos es más bien escaso, aunque en la trucha se ha apuntado al subtipo 5HT2 como el responsable de la contracción muscular intestinal inducida por 5HT (Burka et al., 1989), mientras que en el carpín existirían al menos dos subtipos de receptores mediando la acción de la 5HT, concretamente los subtipos 5HT4-like y 5HT7-like (Velarde et al., 2010b). En nuestro caso, se ha evaluado el efecto de metisergida, un fármaco que en mamíferos se ha descrito como antagonista de receptores 5HT1 y 5HT2 y 5HT7, sobre la respuesta contráctil basal inducida por 5HT. Los resultados mostraron un claro efecto inhibitorio de metisergida sobre la fuerza contráctil basal, lo que dificultó técnicamente su seguimiento en el tiempo. Además, la metisergida bloqueó de manera concentración-dependiente la respuesta contráctil inducida por 5HT, la cual se anuló completamente con concentraciones elevadas del antagonista. En consecuencia, estos resultados sugieren que ciertos receptores de 5HT, concretamente los subtipos 5HT2-like y/o 5HT7-like, podrían ser esenciales para el mantenimiento de la contractilidad basal en el intestino de la trucha arco iris. El bloqueo de estos subtipos de receptores provoca la pérdida casi total del tono contráctil e impide la acción de agentes estimuladores de la contracción. Conocidos algunos de los mecanismos mediadores de la contractilidad intestinal en nuestro modelo de teleósteo, hemos tratado de averiguar la influencia que podría ejercer la melatonina sobre este proceso fisiológico. Los resultados obtenidos tras la incubación del tejido intestinal con concentraciones crecientes de melatonina muestran una respuesta estimuladora de la tensión muscular, aunque los efectos significativos se alcanzaron a partir de 0.1 M de melatonina. El efecto máximo se obtuvo con la concentración de 10 M y a partir de ésta el efecto estimulador de la melatonina decayó progresivamente. Esta acción diferencial de la melatonina concuerda con la variedad de efectos descritos en la 201 Discusión bibliografía para esta hormona. Así, en preparaciones de intestino de rata se ha descrito un efecto inhibitorio de la melatonina sobre la frecuencia contráctil, sin alterar la amplitud de las contracciones (Bubenik, 1986; Harlow y Weekly, 1986), mientras que en otro estudio en que se registró actividad mioeléctica en intestino de rata in vivo, se observaron efectos estimuladores con dosis bajas de melatonina administradas a los animales e inhibidores con dosis elevadas (Drago et al., 2002). También en la rata se ha observado que la melatonina produce efectos farmacológicos sobre la motilidad intestinal, diferentes según el estado prandial y la fase diaria (día: noche) (Merle et al., 2000). Por otra parte, en el colon del cerdo la melatonina estimula la contracción intestinal, si bien solo se alcanza una respuesta estable con concentraciones elevadas de la hormona (Lucchelli et al., 1997). En cuanto al efecto de la melatonina en la contractilidad intestinal en peces, éste solo fue evaluado en el carpín, demostrándose que la melatonina no altera el ritmo miogénico espontáneo pero atenúa la respuesta contráctil inducida por ACh (Velarde et al., 2009b). Una vez determinado el efecto de la melatonina sobre la contractilidad intestinal de la trucha, se ha procedido a estudiar la especificidad del mismo en base a la acción de la hormona sobre potenciales receptores de membrana presentes en la musculatura intestinal. En los vertebrados se ha establecido la localización de lugares de unión de la melatonina en diferentes tejidos asociados al TGI, particularmente en aves y mamíferos (Lee y Pang, 1993; Pontoire et al., 1993; Poon et al., 1997; Sallinen et al., 2005). En el colon del cerdo se ha sugerido que la acción contráctil de la melatonina se produciría sobre receptores intracelulares de baja afinidad, denominados como MT3 (Lucchelli et al., 1997). Más recientemente se ha descrito la presencia de receptores de alta afinidad del tipo MT2 en la capa muscular de la rata, los cuales podrían estar relacionados con la modulación de la motilidad intestinal (Stebelová et al., 2010). Por su parte, en peces los estudios son mucho menos precisos, describiéndose la presencia de lugares de unión de melatonina en intestino de lubina, platija y trucha arco iris (Kulczykowska et al., 2006). Recientemente también se ha señalado la presencia de receptores del subtipo MT1 en el intestino y diversas regiones periféricas del lenguado, Solea senegalensis (Confente et al., 2010). En nuestro caso, se evaluó el efecto de la melatonina en presencia de luzindol, un conocido antagonista competitivo de los receptores de melatonina. Los resultados mostraron que el luzindol bloqueó hasta un 60% el efecto estimulador inducido por melatonina a la concentración de 10-6M sobre la actividad contráctil basal del intestino. Aunque el luzindol se ha definido como un antagonista de receptores de melatonina MT1/MT2, en humanos parece mostrar mayor selectividad por el subtipo MT2 (Dubocovich y Markowska, 2005). De acuerdo con ello, estos resultados sugieren que los posibles candidatos para mediar la acción reguladora de la contractibilidad intestinal por la melatonina en la trucha podría ser el receptor MT2. No obstante, el escaso conocimiento de la farmacología de receptores serotoninérgicos en los peces en general y en particular, en la trucha, no permite concluir con rotundidad tal posibilidad. Incluso en el carpín estudios similares al actual, pero utilizando una farmacología más completa, han sugerido que 202 Discusión podrían existir más de un tipo de receptores melatoninérgicos implicados en la respuesta contráctil (Velarde et al., 2009b). Es evidente, por tanto, que se requieren estudios más extensos a fín de pormenorizar el mecanismo receptor sobre el que la melatonina ejerce su efecto en la musculatura intestinal en la trucha arco iris, así como su papel en los efectos diferenciales relativos a la concentración de la hormona. Nuestros resultados muestran claramente que la estimulación de la contracción muscular inducida por melatonina es un proceso dependiente del calcio extracelular, de forma similar a lo descrito para el efecto de ACh y de 5HT. Es sabido que la contracción de la musculatura lisa intestinal depende del aumento de calcio intracelular, proporcionado por la entrada del ión través de canales específicos de la membrana, y/o liberado desde depósitos intracelulares (Aronsson y Holmgren, 2000). En el conejo se ha demostrado que la melatonina inhibe la contracción de la musculatura aórtica inducida por 5HT, provocando una inhibición en la entrada de calcio (Satake et al., 1986), mientras que en la rata inhibió la contracción aórtica inducida por KCl, pero solo con concentraciones de melatonina de rango suprafisiológico (10 mM a 1 mM) (Monroe and Watts, 1998). Estos efectos de la melatonina parecen ser indicativos de acciones no específicas, dado que no responden a luzindole y requieren concentraciones muy elevadas de la hormona. En nuestro caso, la melatonina en el rango de 0,1µM-10M potenció la contractilidad muscular estimulada por ACh (10 nM), indicando que, en parte, el efecto de la melatonina podría ser independiente de la estimulación colinérgica. Dado que el rango de concentraciones en el que la melatonina produjo efectos en presencia de ACh fue similar al que alteró la contracción intestinal en situación basal, es lógico sugerir que esta acción potenciadora de la melatonina podría ser mediada por receptores postsinápticos localizados sobre las propias fibras musculares. Esta posibilidad estaría de acuerdo con lo descrito por Lucchelli et al. (1997) en el conejo de Indias, quienes sugieren que la acción estimuladora de la melatonina sobre la contractilidad del colon proximal se lleva a través receptores postsinápticos de melatonina del subtipo MT2. No obstante, existe la posibilidad de que la melatonina actúe indirectamente sobre las terminales colinérgicas activando mecanismos exocitóticos dependientes de calcio, lo que también redundaría en una potenciación de la acción estimuladora inducida por la ACh. Incluso en el conejo de Indias se ha mostrado que la melatonina modula el potencial postsinátpico inducido por la activación de receptores nicotínicos a nivel del plexo submucoso (Barajas-López et al., 1996). Por tanto, en nuestro caso no podemos descartar una acción similar de la hormona sobre los receptores muscarínicos que median el efecto de ACh a nivel intestinal. En este sentido, el hecho de que la atropina bloquease eficazmente (y de manera similar a la ausencia de calcio) el efecto de la melatonina sobre la contracción intestinal, nos lleva a decantarnos por una posible acción de la melatonina ejercida, en gran parte, a través de mecanismos colinérgicos pre- y/o post-sinápticos (Figura 2). 203 Discusión Al margen de los posibles efectos directos y/o mediados por la actividad colinérgica, nuestros resultados indican una interacción de la melatonina con la regulación serotoninérgica de la contractilidad intestinal, de forma similar a lo propuesto en el intestino de rata (Bubenik, 1986) y del carpín (Velarde et al., 2010b). Así, en la trucha la melatonina (10 M) inhibió significativamente la contracción muscular inducida por concentraciones bajas (10 nM) de 5HT. Asimismo, la presencia del antagonista serotoninérgico metisergida en el medio de incubación intestinal inhibió la respuesta contráctil inducida por la melatonina. Este bloqueo de la metisergida sobre el efecto de la melatonina fue incluso más evidente (desde un punto de vista del rango farmacológico) que el que ejerció sobre la contractilidad inducida por 5HT. Todo ello nos lleva a proponer una acción de la melatonina sobre mecanismos serotoninérgicos que regulan la contractilidad intestinal en la trucha arco iris. En el mismo sentido, Velarde et al. (2010b) proponen un efecto modulador de la melatonina sobre la contracción intestinal evocada por 5HT. A diferencia de nuestro estudio, en el carpín el efecto de la melatonina tuvo lugar en el rango pM y fue totalmente bloqueado por luzindole, sugiriéndose una mediación por receptores específicos localizados en terminales colinérgicas y/o en las células musculares lisas. En nuestro caso, el efecto modulador de la melatonina sobre la estimulación serotoninérgica solo fue visible con concentraciones elevadas de la hormona (10M), lo que os lleva a catalogar dicha respuesta como de orden suprafisiológico. Esta acción inhibidora con elevadas concentraciones de melatonina podría explicar el menor efecto que sobre la contractilidad intestinal basal provocan las concentraciones elevadas de melatonina (rango mM), en relación con aquellas más próximas al rango fisiológico (MnM). Dada la similitud estructural de la melatonina con la 5HT (así como con algunos agonistas 5HTérgicos), es posible una acción directa de la melatonina a elevadas concentraciones sobre los receptores serotoninérgicos. Sin embargo, dicha posibilidad ha sido descartada en estudios llevados a cabo en el colón del conejo de Indias (Lucchelli et al. 1997). Por tanto, en el presente trabajo proponemos que la acción moduladora de la melatonina sobre la actividad contráctil inducida por 5HT en intestino de trucha podría ser mediada por un efecto inhibitorio de la melatonina actuando de forma directa sobre las terminales serotoninérgicas que forman parte de los plexos nerviosos entéricos (Figura 2). 204 Discusión Figura 2. Esquema de la posible acción de la melatonina intestinal sobre neuronas colinérgicas y/o a través de mecanismos serotoninérgicos para modular su efecto sobre la musculatura lisa. Los resultados de este último trabajo nos llevan a proponer a la melatonina como un posible modulador fisiológico de la actividad motora intestinal en la trucha arco iris. Las consecuencias fisiológicas de dicha modulación no son del todo evidentes, pero podrían estar encaminadas a la facilitación de la actividad digestiva y absortiva, adaptando la velocidad de desplazamiento del alimento por el tracto digestivo. En este sentido, nuestros datos concuerdan con aquellos obtenidos en el ratón que muestran que las inyecciones intraperiotoneales de melatonina reducen el tiempo de tránsito del alimento (Bubenik y Dhanvantari, 1989), aunque en ratas se han señalado respuestas variables dependiendo de la dosis de melatonina. Por otro lado, diversos trabajos muestran que la melatonina actúa como un agente anoréctico en algunas especies de teleósteos, tales como el carpín (Pinillos et al., 2001) y la lubina (López-Olmeda et al., 2006a), con posibles efectos reguladores del peso corporal (De Pedro et al., 2008). Los experimentos realizados en nuestro laboratorio en la trucha nos han permitido definir un efecto inhibitorio de débil magnitud de la melatonina sobre la ingesta de alimento (datos no publicados), menor que el observado para otras especies. También el efecto modulador (estimulador) de la melatonina sobre la contractilidad intestinal descrito en nuestro trabajo es diferente al descrito para la melatonina en el carpín (inhibidor), lo que claramente indica la existencia de diferencias entre especies en la acción fisiológica de la hormona y/o de los mecanismos que integran su respuesta. En todo caso, el hecho de que la melatonina altere la actividad contráctil y el tiempo de tránsito de alimento en el tracto digestivo apoya la posibilidad de que participe en la generación de las señales periféricas (hambre, saciedad) que orientan al organismo en la ingesta de alimento. 205 Conclusiones Conclusiones Conclusiones 1.- Se ha desarrollado un método analítico de HPLC con detección fluorimétrica para cuantificar melatonina en muestras de diferentes fluidos corporales y tejidos digestivos. La sencillez del método basado en un tratamiento extractivo de la muestra con cloroformo y un mayor rendimiento de las condiciones cromatográficas, reduce el coste analítico sin detrimento de la sensibilidad y de la versatilidad de las técnicas de HPLC. 2.- El tracto gastrointestinal de los peces, de forma similar a mamíferos, contiene importantes cantidades de melatonina y expresa toda la maquinaria enzimática que justifica la síntesis local de la hormona. Además, los datos señalan que existe una gran independencia entre los niveles de melatonina presentes en el TGI y aquellos presentes en la circulación sanguínea. La bilis, un fluido asociado a la actividad digestiva, también contiene una cantidad muy elevada de melatonina, presumiblemente de origen hepático. 3.- La síntesis de melatonina, al igual que la de 5HT, parece ser ubicua a lo largo del TGI, aunque muestra diferencias territoriales. Además, el contenido de ambos indoles no está uniformemente distribuido en la pared digestiva, concentrándose sobre todo en la capa muscular en relación al epitelio de la mucosa. Sin embargo, la expresión génica de las enzimas que sintetizan melatonina es mayor en la zona en la mucosa que en la pared, indicando que la facilidad de la hormona para difundir en los tejidos puede enmascarar una localización más específica de la síntesis de melatonina en la mucosa. 4.- Mediante estudios inmunohistoquímicos se ha localizado la inmunoreactividad a 5HT, AANAT y melatonina en el TGI de la trucha. Tanto las células que contienen 5HT, como aquellas que expresan AANAT y melatonina, se localizan preferentemente en la zona de la base del epitelio mucosal, sugiriendo que podrían ser similares a las enterocromafines. 5.- No se han encontrado cambios rítmicos diarios en el contenido de melatonina en intestino de trucha, pero si en la expresión génica de las enzimas aanat1, aanat2 y hiomt que aumenta durante el periodo de oscuridad. Estos ritmos de expresión parecen ser endógenos ya que se mantienen en condiciones de ambiente lumínico constante. No obstante, la ingesta del alimento también tiene efectos moduladores de la síntesis de melatonina y debe ser un factor a considerar a la hora del ajuste rítmico. 6.- La actividad de ingesta induce un aumento en la producción intestinal de melatonina que parece ser en gran parte desencadenado por reflejos neuroendocrinos ligados al paso de alimento a lo largo del tubo digestivo, lo que condiciona la expresión de los genes implicados en la síntesis de la hormona. Otro factor que contribuye al incremento de los niveles de melatonina en el tracto digestivo es la secreción de bilis al lumen intestinal, activada por reflejos relacionados con la ingesta y el transito del contenido digestivo. 7.- En condiciones prolongadas de ayuno, los niveles intestinales de melatonina se incrementan durante la fase diaria en la que normalmente tiene lugar la ingesta. Aunque es 209 Conclusiones posible que en estas condiciones aumente la tasa de síntesis de melatonina en el tejido intestinal, el aumento de los niveles de la hormona también podría provenir de la bilis liberada de forma paulatina al lumen digestivo, incluso en situación de ayuno. Teniendo en cuenta las propiedades antioxidantes y protectoras celulares de la melatonina, su presencia en el tubo digestivo de animales ayunados podría contribuir al buen mantenimiento del epitelio intestinal. 8.- Mientras que la administración del aminoácido L-Trp por vía oral (suplemento alimenticio) induce un aumento de la síntesis de melatonina en el intestino, la administración parenteral no tiene efectos. Este dato, conjuntamente con el efecto estimulador del 5HTP, indica que no es suficiente la mayor presencia del aminoácido en las células productoras de melatonina (y de serotonina) para activar su síntesis, sino que existe una compleja relación entre disponibilidad celular de 5HT y síntesis de la hormona. Los reflejos neuroendocrinos desencadenados por el tránsito del alimento a lo largo del tubo digestivo podrían regular esta relación, incrementando la disponibilidad de 5HT accesible para la acción de los enzimas implicados en la síntesis de melatonina. 9.- La melatonina afecta significativamente la contractilidad intestinal de la trucha arco iris, generando un incremento en la fuerza de contracción basal. Este efecto, diferente al observado en el carpín, muestra características de dependencia de la concentración y de la entrada de calcio extracelular, y es bloqueado por atropina. En parte, el efecto de la melatonina es mediado por receptores específicos de membrana presentes en el tejido intestinal. 10.- Los efectos de la melatonina sobre la contractilidad son mucho menores que los que ejercen dos de los principales neurotransmisores que regulan la motilidad digestiva, la acetilcolina y la serotonina. Es probable que la melatonina intestinal, de forma específica o inespecífica, también ejerza un efecto modulador de la motilidad a través de estos neurotransmisores y/o de los mecanismos celulares que median la acción de estos neurotransmisores. 11. A modo de conclusión general, los resultados nos muestran al TGI de la trucha arco iris como un tejido productor de melatonina, con una regulación potencial por mecanismos circadianos pero sobre todo asociada a la ingesta y al tránsito de alimento en el tubo digestivo. La melatonina intestinal también podría contribuir a modular el tránsito intestinal, facilitando con ello la coordinación temporal y funcional de la actividad digestiva y absortiva. 210 Bibliografía Bibliografía Abrams, P., Andersson, K.E., Buccafusco, J.J., Chapple, C., De Groat, W.C., Fryer, A.D., Kay, G., Laties, A., Nathanson, N.M., P.J., Pasricha (2006) Muscarinic receptors: their distribution and function in body systems, and the implications for treating overactive bladder. Br. J. Pharmacol. 148:565–578. Ahearn, G.A., Gerencser, G.A., Thamotharan, M., Behnke, R.D. y T.H., Lemme (1992) Invertebrate gut diverticula are nutrient absorptive organs. Am. J. Physiol. 263: 472-481. Ahlman, H., y A., Dahlstrom (1982) Storage and release of 5-hydroxytryptamine in enterochromaffin cells of the small intestine. En: 5-Hydroxytryptamine in Peripheral Reactions. Editado por F. De Clerk y P. M. Vanhoutte. Raven Press (New York, USA), pp.: 1-21. Akbulut, H., Akbulut, K.G., B., Gonul (1997) Malodialdehyde and glu-athione in rat gastric mucosa and effects of exogenous melatonin. Dig. Dis. Sci. 42: 1381-1388 Aldegunde, M., J. Garcia, J. L. Soengas, G., Rozas (1998) Uptake of tryptophan into brain of rainbow trout. J. Exp. Zool., 282: 285-289. Aldegunde, M., Soengas, J.L., G., Rozas (2000) Acute effects of L-tryptophan on tryptophan hydroxylation rate in brain regions (hypothalamus and medulla) of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). J. Exp. Zool. 286: 131–135. Aldman, G., y S., Holmgren (1995) Intraduodenal fat and amino acids activate gallbladder motility in the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Gen. Comp. Endocrinol.100(1):27–32. Amin, A. H., Crawford, T. B. B., J. H., Gaddum (1954) The distribution of substance P and 5hydroxytryptamine in the central nervous system of the dog. J. Physiol., 126: 596-618. Anderson, C. (1983) Evidence for 5-HT-containing intrinsic neurons in the teleost intestine. Cell Tissue Res., 230: 377-386. Anderson, C., y G., Campbell (1988) Immunohistochemical study of 5-HT-containing neurons in the teleost intestine: relation to the presence of enterochromaffin cells. Cell Tissue Res. 254:553-559. Anderson, C. R., Campbell, G., O‘Shea, F., M., Payne (1991) The release of neuronal 5-HT from the intestine of a teleost fish, Platycephalus bassensis. J. Auton. Nerv. Syst. 33: 239-246. Andersen, D., Reid, S., Moon, T., S., Perry (1991) Metabolic effects associated with chronically elevated cortisol in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Can. J. Fish Aquat. Sci., 48: 1811-1817. Antolin, I., Mayo, J.C., Sainz, R.M., del Brio Mde, I., Herrera, F., Martin, V., y C., Rodriguez (2002) Protective effect of melatonin in a experimental model of Parkinson's disease, Brain Res. : 943: 163–173. Appelbaum, L., Vallone, D., Anzulovich, A., Ziv, L., Tom, M., Foulkes, N.S., Y., Gothilf (2006) Zebrafish arylalkylamine-N-acetyltranferase genes–targets for regulation of the circadian clock. J. Mol. Endocrinol. 36:337-347. 213 Bibliografía Aranda, A., Madrid, J.A., Zamora, S., y F.J., Sánchez-Vázquez (1999) Synchronizing effect of photoperiod on the dual phasin of demand-feeding rhythms in sea bass. Biol. Rhythm Res. 30: 392-406. Aronsson, U., y S., Holmgren (2000) Muscarinic M·-like receptors, cyclic AMP and L-tuype calcium channels are involved in the contractile response to cholinergic agents in gut smooth muscle of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Fish Phyisiol. Biochem. 23: 353-361. Aswad, D.W. (1984) Determination of D- and L-aspartate in amino acid mixtures by high performance liquid chromatography after derivatization with a chiral adduct of ophthaldialdehyde. Anal. Biochem. 137: 405- 407. Auerbach, S.B., Minzenberg, M.J., L.O., Wilkinson (1989) Extracellular serotonin and 5hydroxyindoleacetic acid in hypothalamus of the unanesthetized rat measured by in vivo dialysis coupled to high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Brain Res. 499:281–290. Aust, S., Thalhammer, T., Humpeler, S., Jäger, W., Klimpfinger, M., Tucek, G., Obrist, P., Marktl, W., Penner, E., C. Ekmekcioglu (2004) The melatonin receptor subtype MT1 is expressed in human gallbladder epithelia. J. Pineal Res. 36: 43–48. Azpeleta, C., Martínez-Álvarez, R.M., Delgado, M.J., Isorna, E., De Pedro, N. (2010). Melatonin reduces locomotor activity and circulating control in goldfish. Horm. Behav. 57:323-329. Balashov, I.V., Nozdrachev A.D., V.G., Skopichev (1992) The localization and functional status of serotonin-producing structures in the gastrointestinal tract of chum salmon fry. Fiziol. Zh. SSSR Im. I. M. Sechenova. 78: 95-104. Baldisserotto, B., Mimura, O.M., y L.C., Salomão (1990) Gallbladder bile and plasma ionic content of some freshwater teleosts. Bol. Fisiol. Anim. (São Paulo). 14: 7–11. Barrington, E.J.W. (1957) The alimentary canal and digestion. In ―The physiology of fishes”, Vol. 1, Metabolism, ed. M.E. Brown, pp. 106-161. New York: Academic Press. Barajas-Lopez, C., Peres, A. L., y R., Espinosa-Luna (1996) Cellular mechanisms underlying adenosine actions on cholinergic transmission in enteric neurons Am. J. Physiol. Cell Physiol. 271:(1) C264-C275 Bartness T.J., Powers J.B., Hastings M.H., Bittman E.L. y B.D., Goldman (1993) The time infusion paradigm for melatonin delivery: what has it taught us about the melatonin signal, its reception, and the photoperiodic control of seasonal responses. J. Pineal Res. 15: 161-190. Baumgarten, H. G. y Z., Grozdanovic (1997) Serotonergic neurons and 5-HT receptors in the CNS. En: Handbook of Experimental Pharmacology. Vol. 129. Editado por H. G. Baumgarten y M. Gothert. Springer-Verlag (Berlin, Alemania), pp.: 41-88. Baumrucker, C. R., Guerino, F., y G. B., Huntington (1989) In ―Absorption and Utilization of Amino Acids‖ (M. Friedman, ed.), p. 189. CRC Press, Boca Raton, FL. 214 Bibliografía Baxter, G.S., Craig, D.A., D.E., Clarke (1991) 5-hydroxytryptamine4 receptors mediate relaxation of the rat oesophageal túnica muscularis mucosae. Naunyn- Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 343: 439-446. Bayarri, M.J., Rol De Lama, M.A., Madrid, J.A., F.J., Sánchez-Vázquez (2003) Both pineal and lateral eyes are hended to sustain daily circulating melatonin rhythms in the sea bass. Brain Res. 969:175-182. Beattie, D.T., y J.A.M., Smith (2008) Serotonin pharmacology in the gastrointestinal tract: a review. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 377:181-203. Bechgaard, E., Lindhardt, K., L., Martinsen (1998) High-performance liquid chromatographic analysis of melatonin in human plasma and rabbit serum with on-line column enrichment. J. Chromatogr. B. 712: 177-181. Bégay, V., Falcón, J., Cahill, G.M., Klein, D.C., S.L., Coon (1998) Transcripts encoding two melatonin synthesis enzymes in the teleost pineal organ: circadian regulation in pike and zebrafish, but not in trout. Endocrinology 139:905-912. Beorlegui, C, Martinez, A., P. Sesma (1992) Endocrine cells and nerves in the pyloric ceca and the intestine of Oncorhynchus mykiss (Teleostei): an immunocytochemical study. Gen. Comp. Endocrinol. 86: 483-495. Benyassi, A., Schwartz, C., Coon, S.L., Klein, D.C., J., Falcón (2000) Melatonin synthesis: arylalkylamine N-acetyltransferases in trout retina and pineal organ are different. Neuroreport. 11:255-258. Bernard, M., Klein, D.C., M., Zatz (1997) Chick pineal clock regulates serotonin Nacetyltransferase mRNA rhythm in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:304-309. Bertrand P., R.L., Bertrand (2010) Serotonin release and uptake in the gastrointestinal tract. Auton Neurosci.: Bas. Clin. 153: 47–57. Besancon, R., Simonneaux, V., Jouvet, A., Belin, M.F. y M., Fevre-Montange (1996) Nycthemeral expression of tryptophan hydroxylase mRNAs in the rat pineal gland. Brain Res. Mol. Brain Res. 40:136-138. Besseau, L., Benyassi, A., Møller, M., Coon, S.L., Weller, J.L., Boeuf, G., Klein, D.C., Falcón, J. (2006). Melatonin pathway:breaking the ―high-at-night‖ rule in trout retina. Exp. Eye Res. 82:620-627. Binkley, S.A., Riebman, J.B. y K.B., Reilly (1978) The pineal gland : a biolgical clock in vitro. Science 202, 1198-1200. Binkley, S. (1988) The pineal: endocrine and neuroendocrine function. In: Hadley, M.E. (Ed.), Endocrinology Series. Prentice Hall, Englewood CliVs, pp. 175–184. Binkley, S. (1993) Structures and molecules involved in generation and regulation of biological rhythms in vertebrates and invertebrates. Experientia. 49: 648-53. 215 Bibliografía Birks E.K., y R.D., Ewing (1981) Photoperiod effects on hydroxyindole-O-methyltransferase activity in the pineal gland of chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha). Gen. Comp. Endocrinol. 43: 277-283. Boadle-Biber, M. C. (1993) Regulation of serotonin synthesis. Prog. Biophys. Mol. Biol. 60: 1-15. Bogdanski, D.F., Bonomi, L., y B.B., Brodie (1963) Occurrence of serotonin and catecholamines in brain and peripheral organs of various vertebrate classes, Life Sci. 2: 1–84. Bogoeva M., Mileva M.S., K.S., Tsanova (1993) Effect of exogenous melatonin on the twentyfour-hour mitotic activity of some normal mouse tissues. C. R. Acad. Bulgare Sci. 46:107– 110. Bolliet, V., Ali, M.A., Lapointe, F.J., J., Falcón (1996) Rhythmic melatonin secretion in different teleost species: an in vitro study. J. Comp. Physiol. B 165: 677-683. Bolliet, V., Azzaydi, M., y T., Boujard (2001) Effects of feeding time on feed intake. In: D. Houlihan, T. Boujard and M. Jobling, Editors, Food Intake in Fish, Blackwell Science, Oxford, pp. 233–249. Bortoff, A. (1976) Myogenic control of intestinal motility. Physiol. Rev. 56: 416-434. Bromage, N.R., Randall, C.F., Porter, M. J. R. y B. Davies (1995) How do photoperiod, the pineal gland, melatonin, and circannual rhythms interact to co-ordinate seasonal reproduction in salmonid fish? En: Proc. Fifth Int. Symp. Reprod. Biol. Fish. Austin, TX. 95, pp.164-166. Bradford, T.K., ZJ, P.M., Iuvone (1990) Arylalkylamine (serotonin) Nacetyltransferase assay using high-performance liquid chromatography with fluorescence or electrochemical detection of N- acetyltryptamine. Anal Biochem 184:228-234. Briejer, M.R., Akkermans, L.M.A., Lefebvre, R.A., y J.A.J., Schuurkes (1995) Novel 5-HT2-like receptor mediates neurogenic relaxation of the guinea-pig proximal colon. Eur. J. Pharmacol. 279 , p. 123. Bubenik, G.A. (1980) Localization of melatonin in the digestive tract of the rat. Effect of maturation, diurnal variation, melatonin treatment and pinealectomy. Hormone Res. 12:313– 323. Bubenik, G.A. (1986) The effect of serotonin, N-acetylserotonin and melatonin on spontaneous contractions of isolated rat intestine. J. Pineal Res. 3:41-54. Bubenik G.A. (2001) Localization, physiological significance and possible clinical implication of gastrointestinal melatonin. Biol. Signals Recept. 10:350–366. Bubenik, G.A. (2002) Gastrointestinal melatonin localization, function, and clinical relevance. Digest. Diseases and Sci. 47: 2336-2348. Bubenik, G.A. (2006) Gastrointestinal melatonin- 30years of research. J. Exp. Zool. 305A: 114114. 216 Bibliografía Bubenik, G.A. (2008) Thirty four years since the discovery of gastrointestinal melatonin. J. Physiol. Pharmacol. 59:33-51. Bubenik, G.A., y S., Dhanvantari (1989) The influence of serotonin and melatonin on some parameters of gastrointestinal activity. J. Pineal Res. 7: 333-344. Bubenik, G. A. y G. M., Brown (1997) Pinealectomy reduces melatonin levels in the serum but not in the gastrointestinal tract of rats. Biol. Signals 6: 40-44. Bubenik, G.A., y S.F. Pang (1994) The role of serotonin and melatonin in gastrointestinal physiology: ontogeny, regulation of food intake and mutual serotonin-melatonin feedback. J. Pineal Res. 16: 91-99 Bubenik, G.A., y S.F., Pang (1997) Melatonin levels in the gastrointestinal tissues of fish, amphibians, and a reptile. Gen. Comp. Endocrinol. 106:415-419. Bubenik, G. A., Brown, G. M. y L. J., Grota (1977) Inmunohistological localization of melatonin in the digestive system of the rat. Experientia 33: 662-663. Bubenik, G.A., Ball, R.O., S.F., Pang (1992) The effect of food deprivation on brian and gastrointestinal tissue of tryptophan, serotonin, 5-hydroxyindolacetic acid, and melatonin. J. Pineal Res. 7-16. Bubenik, G.A., Niles L.O., Pang, S.F. y P.J., Pentney (1993) Diurnal variations and binding characteristics of melatonin in the mouse brain and gastrointestinal tissues. Comp. Biochem. Physiol. 104A:377–380. Bubenik, G. A., Pang, S. F., Hacker, R. R. y P. S., Smith (1996) melatonin concentrations in serum and tissues of porcine gastrointestinal tract and their relationship to the intake and passage of food. J. Pineal Res. 21: 251-256. Bubenik, G.A., Ayles, H.L., Friendship, R.M., Brown, G.M., R.O., Ball (1998) Relationship between melatonin levels in plasma and gastrointestinaltissues and the incidence and severity of gastric ulcers in pigs. J. Pineal Res. 24: 62–66. Bubenik, G.A., Hacker, R.R., Brown, G.M., L., Baros (1999). Melatonin concentrations in the luminal fluid, mucosa and muscularis of the bovine and porcine gastrointestinal tract. J. Pineal Res. 26:56-63. Bubenik, G.A., Brown, G.M., Hacker, R.R., L., Bartos (2000a) Melatonin concentration in the gastrointestinal tissues of bovine fetuses. Acta Vet. Brno. 69:177–182. Bubenik, G.A., Pang, S.F., Cockshut, J.R., Smith, P.S., Grovum, L.W., Friendship, R.M., R.R., Hacker (2000b) Circadian variation of portal, arterial and venous blood levels of melatonin in pigs and its relationship to food intake and sleep. J. Pineal Res. 28:9–15. Buddington, R.K., y J.M., Diamond (1987) Pyloric ceca of fish: a new absorptive organ. Am. J. Physiol. 252: G65-G76. 217 Bibliografía Burnstock, G. (1958) The effect of drugs on spontaneous motility and on response to stimulation of the extrinsic nerves of the gut of a teleostean fish. Brit. J. Pharmacol. 13:216-226. Burka, J. F., Blair, R. M., Hogan, J. E. (1989) Characterization of the muscarinic and serotoninergic receptors of the intestine of the rainbow trout (Salmo gairdneri). Can. J. Physiol. Pharmacol., 67: 477-482. Burka J.F., Blair, R.M.J., Chong C. y J.E., Hogan (1990) Effects of calcium channel blockers on pharmacologically induced contractions of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish Physiol. Biochem. 8: 251–527. Burkhardt-Holm, P. y Holmgren, S. (1989) A comparative study of neuropeptides in the intestine of two stomachless teleost (Poecilia reticulata, Leuciscus idus melanotus) under conditions of feeding and starvation. Cell Tissue Res., 255: 245-254. Byrne, J.E., (1970) Locomotor activity responses in juvenile sockeye salmon, Oncorhynchus nerka, to melatonin and serotonin. Can J. Zool. 48: 1425-1427. Caamaño-Tubío, R.I., Pérez, J., Ferreiro, S., M., Aldegunde (2007) Peripheral serotonin dynamics in the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Comp. Biochem. Physiol. Part C 145:245-255. Cabeza, J., Motilva, V., Martin, M. J. y C. A., De La Lastra (2001) Mechanism involved in gastric protection of melatonin against oxidant stress by ischemia-reperfusion in rats. Life Sci. 68: 1405-1415. Cahill G.M., (1996) Circadian regulation of melatonin production in cultures zabrafish pineal and retina. Brain Res. 708: 177-181. Callaghan, B.D. (1991) The effect of pinealectomy and autonomic denervation on crypt cell proliferation in the rat small intestine. J. Pineal Res. 10:180–185. Callaghan, B.D. (1995) The long-term effect of pinealectomy on the crypts of the rat gastrointestinal tract. J. Pineal Res. 18:191– 196. Camello, P.J., Pozo, M.J., Salido, G.M., et al. (1991) Ultradian rhythms in canine gallblader bile composition. J. Interdiscipli. Cycle Res. 22 (3): 281-291. Carr, J.A. (2002) Stress, Neuropeptides, and Feeding Behavior: A Comparative Perspective. Integr. Comp. Biol. 42 (3): 582-590. Carrillo-Vico, A., Calvo, J.R., Abreu, P., Lardone, P.J., García-Maurino, S., Reiter, R.J., J.M., Guerrero (2004) Evidence of melatonin synthesis by human lymphocites and its physiological significance: possible role as intracrine, autocrine, and/or paracrine substance. FASEB J. 18:537-539. Carrillo-Vico, A., Reiter, R.J., Lardone, P.J., Herrera, J.L., Fernández-Montesino, R., Guerrero, J.M., D., Pozo (2006) The modulatory role of melatonin on immune responsiveness. Curr. Opin. Investig. Drugs 7:423-431. 218 Bibliografía Ceinos, R.M., Chansard, M., Revel, F., Calgari, C., Míguez, J.M. y V., Simonneaux (2004) Analysis of andrenergic regulations of mela-tonin synthesis in Siberian hamster pineal emphasizes the role of HIOMT. Neurosignals 13: 308-317. Ceinos, R.M., Rabade, S., Soengas, J.L. y J.M., Miguez (2005) Indoleamines and 5methoxyindoles in trout pineal organ in vivo: daily changes and influence of photoperiod. Gen. Comp. Endocrinol. 144: 67-77. Ceinos, R.M., Polakof, S., Rodriguez, A., Soengas, J.L. y J. M., Míguez (2008) Food deprivation and refeeding effects on pineal índoles metabolism and melatonin synthesis in the rainbow trout Oncorrhynchus mykiss. Gen. Comp. Endocrinol. 156: 410-417. Cervantes, C.R.C., Barbosa, R.D., Faro, L.R., Adan, L.V., Gago-Martínez, A., M.A. Pallares (2009) Differential changes of neuroactive amino acids in simples obtained from discrete rat brain regions alter systemic administration of saxitoxin. Neurochem Int.54: 308-313. Challet, E., Pévet P., Vivien-Roels, B., y A., Malan (1997) Phase-advanced daily rhythms of melatonin, body temperature, and locomotor activity in food-restricted rats fed during daytime. J. Biol. Rhythms 12: 65–79. Chanut, E., Nguyen-Legros, J., Versaux-Botteri, C., Trouvin, J.H., J.M., Launay (1998) Determination of melatonin in rat pineal, plasma and retina by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. B 709: 11-18. Chen, K.H., Wu, F., Grimsby, J., J.C., Shih (1994) Cloning of a novel monoamine oxidase cDNA from trout liver. Mol. Pharmacol. 46: 1226-1233. Chik, C., Ho A.K., G.M., Brown (1987) Effect of food restriction on 24-h serum and pineal melatonin content in male rats. Acta Endocrinol. 115:507–513. Choich, J.A., El-Nabawi A., y E.K., Silbergeld (2004) Evidence of histamine receptors in fish brain using an in vivo [14C]2-deoxyglucose autoradiographic method and an in vitro receptorbinding autoradiographic method. Environ. Res.94: 86–93. Chomczynsky, P., y N., Sacchi (1987) Single-step method of RNA isolation by guanidinium thiocyanate–phenol–chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156–169. Chow, P.H., Lee, P.P.N., Poon, A.M.S., Shiu, S.Y.W., S.F., Pang (1996) The gastrointestinal system: A site of melatonin paracrine action. 21:123–132. Clemens, J.W., Jarzynka, M.J., y P.A., Witt-Enderby (2001) Down-regulation of mt1 melatonin receptors in rat ovary following estrogen exposure. Life Sci. 69: 27–35. Clements, K. D., y D., Raubenheimer (2005) Feeding and nutrition. In D. H. Evans, editor. The physiology of fishes. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 616 p. Coates, M.D., Mahoney, C.R., Linden, D.R., Sampson, J.E., Chen, J., Blaszyk, H., Crowell, M.D., Sharkey, K.A., Gershon, M.D., Mawe, G.M., G.M., Moses (2004) Molecular defects in 219 Bibliografía mucosal serotonin content and decreased serotonin reuptake transporter in ulcerative colitis and irritable bowel syndrome. Gastroenterology 126: 1657–1664 Confente, F., Rendón, M.C., Besseau, L., Falcón J., y J.A., Muñoz-Cueto (2010) Melatonin receptors in a pleuronectiform species, Solea senegalensis: Cloning, tissue expression, day– night and seasonal variations. Gen. Comp. Endocrinol. 167: 202-214. Conti, A., Conconi, S., Hertens, E., Skwarlo-SontA, K., Markowska, M., J.M., Maestroni, (2000) Evidence for melatonin synthesis in mouse and human bone marrow cells. J. Pineal Res. 28:193-202. Coon, S.L., D.C., Klein (2006) Evolution of arylalkylamine N-acetyltransferase: emergence and divergence. Mol. Cell Endocrinol. 252:2-10. Coon, S.L., Roseboom, P.H., Boler, R., Weller, J.L., Namboodiri, M.A., Koonin, E.V., D.C., Klein (1995) Pineal serotonin N-acetyltransferase: expression, cloning and molecular analysis. Science 270:1681-1683. Coon, S.L., Bégay, V., Falcón, J., D.C., Klein (1998) Expression of melatonin synthesis genes is controlled by a circadian clock in the pike pineal organ but not in trout. Biol. Cell. 90:399-405. Coon, S.L., Bégay, V., Deurloo, D., Falcón, J., D.C., Klein (1999) Two arylalkylamine Nacetyltranseferase genes mediate melatonin synthesis in fish. J. Biol. Chem. 274:9076-9082. Costa, M., Furness, J. B., Cuello, A. C., Verhofstad, A. A. J., Steinbusch, H. W. J., R. P., Elde (1982) Neurons with 5-hydroxytryptamine-like immunoreactivity in the enteric nervous system: their visualization and reactions to drug treatment. Neuroscience 7: 351-364. Côte, F., Thevenot, E., Fligny, C., Fromes, Y., Darmon, M., Ripoche, M. A., Bayard, E., Hanoun, N., Saurini, F., Lechat, P., Dandolo, L., Hamon, M., Mallet, J., G. Vodjdani (2003) Disruption of the nonneuronal tph1 gene demonstrates the importance of peripheral serotonin in cardiac function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 13525-13530. Cote, F., Fligny, C., Fromes, Y., Mallet, J., G., Vodjdani (2004) Recent advances in understanding serotonin regulation of cardiovascular function. Trends Mol. Med., 10: 232-238. Craig, S. R., Neill, W. H. y D. M., III, Gatlin (1995) Effects of dietary lipid and environmental salinity on growth, body composition, and cold tolerance of juvenile red drum (Sciaenops ocellatus). Fish Physiol. Biochem. 14:49-61. Cuesta, A., Rodríguez, A., Calderón, M.V., Meseguer, J., y M.A., Esteban (2007) Effect of the Pineal Hormone Melatonin on Teleost Fish Phagocyte Innate Immune Responses After in vitro Treatment. J. Exp. Zool. 307A:509–515. Cymborowski, I. (2010) Introduction to Circadian Rhythms. En: Biological clock in fish. Editores: Kulczykowska, E., Popek, W., Kapoor, B.G. Enfield (NH) : Science Publishers, 264p. 220 Bibliografía Damiola, F., Le Minh, N., Preitner, N., Kornmann, B., Fleury-Olela, F., U., Schibler (2000) Restricted feeding uncouples circadian oscillators in peripheral tissues from the central pacemaker in the suprachiasmatic nucleus. Genes Dev. 14:2950-2961. Darmon, M.C., Grima, B., Cash, C.D., Maitre, M., J., Mallet (1986) Isolation of a rat pineal gland cDNA clone homologous to tyrosine and phenylalanine hydroxylases. FEBS Lett. 206: 43-46. Datla, K.P., y G., Curzon (1996) Effect of p-chlorophenylalanine at moderate dosage on 5-HT and 5-HIAA concentrations in brain regions of control and p-chloroamphetamine treated rats. Neuropharmacology 35: 315–320. De Lastra, C.A., Cabeza, J., Motilva, V., M.J., Martin (1997) Melatonin protects against gastric ischemia reperfusion injury in rats. J. Pineal Res. 23: 47–52. De Pedro, N., Pinillos, M.L., Valenciano, A.I., Alonso-Bedate, M. y M.J., Delgado (1998) Inhibitory effect of serotonin on feeding behaviour in goldfish: involvement of CRF. Peptides 19:505–511. De Pedro, N., Martínez-Álvarez, R., M.J., Delgado (2008) Melatonin reduces body weight in goldfish (Carassius auratus): effects on metabolic resources and some feeding regulators. J. Pineal Res. 45:32-39. De Vlaming, V.L. (1980) Effects of pinealectomy and melatonin treatment on growth in the goldfish, Carassius auratus. Gen. Comp. Endocrinol. 40: 245-250. De Vry, J. y R., Schreiber. (2000) Effects of selected serotonin 5-HT(1) and 5-HT(2) receptor agonists on feeding behavior: possible mechanisms of action. Neurosci. Biobehav. Rev. 24: 341-353. DeBoer, H. (1988) The influence of photoperiod and melatonin on hormone levels and operand light demand in the pig. PhD thesis. University of Guelph, Ontario, Canada. Deguchi, T. (1992) Physiology and molecular biology of arylamine Nacetyltransferases. Biomedical Res. 13:231-242. Delgado, M.J., Alonso-Gomez, A.L., Gancedo, B., De Pedro, N., Valenciano, A.I., M. AlonsoBedate (1993) Serotonin N-acetyltransferase (NAT) activity and melatonin levels in the frog retina are not correlated during the seasonal cycle. Gen. Comp. Endocrinol. 92:143–150. Drago, F., Macauda, S., S., Salehi (2002) Small doses of melatonin increase intestinal motility in rats. Dig. Dis. Sci. 47:1969-1974. Domeneghini, C., Radaelli, G., Arrighi, S., Mascarello, F. y A., Veggetti (2000) Neurotransmitters and putative neuromodulators in the gut of Anguilla anguilla (L.). Localizations in the enteric nervous and endocrine systems. Eur. J. Histochem. 44: 295-306. Dubocovich, M.L., M., Markowska (2005). Functional MT1 and MT2 receptors in mammals. Endocrine 27:101-110 221 Bibliografía Dubocovich, M.L., Yun, K., Al-Ghoul, W.M., Benloucif, S., M.I., Masana (1998) Selective M2 melatonin receptor antagonists block melantonin- mediated phase advances of circadian rhythms. FASEB J 12:1211–1220. Ezeasor D.N., y W.M., Stokoe (1981) Light and electron microscopic studies on the absorptive cells of the intestine, caeca and rectum of the adult rainbow trout, Salmo gairdneri, Rich., J. Fish Biol. 18: 527–554. Edwards, D., Hall, R. T., J. A., Brown (1986) The characteristics and distribution of monoamine oxidase (MAO) activity in different tissues of the rainbow trout Salmo gairdneri. Comp. Biochem. Physiol. C, 84: 73-77. Ehret, M., Cash, C.D., Hamon, M., y M., Maitre (1989) Formal demonstration of the phosphorylation of rat brain tryptophan hydroxylase by calcium/calmodulin-dependent protein kinase, J. Neurochem. 52: 1886–1891 Ehret, M., Pévet, P. y M., Maitre (1991) Tryptophan hydroxylase synthesis is induced by 3',5'cyclic adenosine monophosphate during circadian rhythm in the rat pineal gland. J. Neurochem. 57: 1516-21. Einarsson S., y P.S., Davies (1996) On the localisation and ultrastructure of pepsinogen, trypsinogen, and chymotrypsinogen secreting cells in the Atlantic salmon, Salmo salar L. Comp. Biochem. Physiol. 114B: 295–301 Einarsson, S., P.S., Davies (1997) A multiductal system conveys digestive enzymes from the pancreas into the intestine in the Atlantic salmon. J Fish Biol 50: 1120–1123. Ekmekcioglu, C., Haslmayer, P., Philipp, C., Mehrabi, M.R., Glogar, H.D., Grimm, M., Leibetseder, V.J., Thalhammer, T., W., Marktl (2001) Expression of the MT1 melatonin receptor subtype in human coronary arteries. J. Recept. Signal Transduct Res. 21:85-91. Ekmekcioglu, C. (2006) Melatonin receptors in humans: biological role and clinical relevance. Biomed. Pharmacother 60:97-108. Ekström, P., H., Meissl (1997) The pineal organ of teleost fishes. Rev. Fish Biol. Fish. 7:199-284. El-Salhy, M., Winder, E., M., Lundqvist (1985) Comparative studies of serotonin-like immunoreactive cells in the digestive tract of vertebrates. Biomed. Res. 6: 371–375. Ercan, F., Cetinel, S., Contuk, G., Cikler, E. y G., Sener (2004) Role of melatonin in reducing wáter avoidance stress-induced degeneration of the gastrointestinal mucosa. J. Pineal Res. 37: 113-121. Eriksson, L.O. (1978) Nocturnalism versus diurnalism – dualism within fish individuals. En: J.E. Thorpe, Editor, Rhythmic Activity of Fishes, Academic Press, New York, pp. 69–89. Erspamer, V. (1954) Il sistema cellulare enterocromaffine ae l‘enteramina (5-idrossitriptamina). Rend. Sci. Farmitalia, 1: 1-193. 222 Bibliografía Essman, W. B. (1978) Serotonin Distribution in Tissues and Fluids. En: Serotonin in Health and Disease. Volume I: Availability, Locatization and Disposition. Editado por W. B. Essman, M.D., Ph.D. Spectrum Publications, Inc. (New York, USA), pp.: 15-179. Evans, D.H., y J.B., Claiborne (2006) The physiology of fishes, 3rd Edicion, Taylo & Francis group, Boca Raton, Florida. 601p. Falcón, J. (1999) Cellular circadian clocks in the pineal. Prog. Neurobiol. 58:121-162. Falcón, J. y J. P., Collin (1989) Photoreceptors in the pineal of lower vertebrates: functional aspects. Experientia 45: 909-913. Falcón, J., Guerlotté, J., Voisin, P. y J.P., Collin (1987) Rhythmic melatonin biosynthesis in a photoreceptive pineal organ: a study in the pike. Neuroendocrinology 45: 479-486. Falcón, J., Thibault, C., Bégay V., Zackmann A., y J.P. Collin, (1992) Regulation of the rhythmic melatonin secretion by the fish pineal photoreceptor cells. In: M.A. Ali, Editor, Rhythms in fishes, NATO ASI Series A: Life Sciences vol. 236, Plenum Press, New York, pp. 167–198. Falcón, J., Bolliet, V., Ravault, J.P., Chesneau, D., Ali, M.A. y J.P., Collin (1994) Rhythmic secretion of melatonin by the superfused pike pineal organ: thermo- and photoperiod interaction. Neuroendocrinology 60: 535-543. Falcón, J., Boilliet, V., J.P., Collin (1996) Partial characterization of serotonin Nacetiltransferases from northern pike (Esox lucius, L.) pineal organ and retina. Pflugers Arch. 432:386-393. Falcón, J., Besseau, L., Fazzari, D., Attia, J., Gaildrat, P., Beauchaud, M., G., Boeuf (2003) Melatonin modulates secretion of growth hormone and prolactin by trout pituitary glands and cells in culture. Endocrinology. 104: 4648-4658. Falcón, J., Besseau, L., Sauzet, S., G., Boeuf (2007) Melatonin effects on the hypothalmo-pituitary axis in fish. Trends Endocrinol. Metab. 18:81-88. Falcón, J., Besseau, L., Fuentès, M., Sauzet, S., Magnanou, E., G., Boeuf (2009) Structural and functional evolution of the pineal melatonin system in vertebrates. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1163:101-111. Falcón, J., Migaud, H., Muñoz-Cueto, J.A., M., Carrillo (2010) Current knowledge on the melatonin system in teleost fish. Gen. Comp. Endocrinol. 165:469-482. Feliciano, A., Vivas, Y., De Pedro, N., Delgado, M.J., Velarde, E., E., Isorna (2011) Feeding time synchronizes clock gene rhythmic expression in brain and liver of goldfish (Carassius auratus) J. Biol. Rhythms. 26: 24-33 Fernández-Durán, B., Ruibal, C., Polakof, S., Ceinos, R.M., Soengas, J.L., J.M., Míguez (2007) Evidence for arylalkylamine N-acetyltransferase (AANAT2) expression in rainbow trout peripheral tissues with emphasis in the gastrointestinal tract. Gen. Comp. Endocrinol. 152:289-294. 223 Bibliografía Fernstrom, J. D. y R. J., Wurtman (1972) Brain serotonin content: regulation by plasma neutral amino acids. Science, 178: 414-416. Fernstrom, J.D. (1983) Role of precursor availability in the control of monoamine biosynthesis in brain. Physiol Rev. 63:484–546. Ferretti, C., Blengio, M., Ghi, P., y E., Genazzani (1990) Differential effects of indolepyruvic acid and 5-hydroxytryptophan on indole metabolism in the pineal gland of the rat during the lightdark cycle. Eur. J. Pharmacol. 187:345-356. Field, M. (1993) Intestinal electrolyte secretion: history of a paradigm. Arch. Surg. 128: 273-278 Fioretti, M.C., Menconi, E., C., Ricardi (1974) Mechanism of the in vitro 5-hydroxytryptamine (5HT) antagonism exerted by pineal indole derivatives. Riv. Farmacol. Ter. 5: 43-49. Forgan, L.G., M.E., Forster (2007) Effects of potential mediators of an intestinal brake mechanism on gut motility in Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha). Comp. Biochem. Physiol. Part C 146:343-347. Forsberg, E. J., y R.J., Miller (1982) Cholinergic agonists induce vectorial release of serotonin from duodenal enterochromaffin cells. Science, 217: 355-356. Forsberg, E. J., y R.J., Miller (1983) Regulation of serotonin release from rabbit intestinal enterochromaffin cells. J. Pharmacol. Exp. Ther., 227: 755-766. Fowler, C. J., Oreland, L., B. A., Callingham (1981) The acetylenic monoamine oxidase inhibitors clorgyline, deprenyl, pargyline and J-508: their properties and applications. J. Pharm. Pharmacol. 33: 341–347. Friedman, P. A., Kappelman, A. H., S., Kaufman (1972) Partial purification and characterization of tryptophan hydroxylase from rabbit hindbrain. J. Biol. Chem., 247: 4165-4173. Frungieri, M., Mayerhofer, A., Zitta, Z., Pignataro, O.P., Calandra, R.S., y S. I., Gonzalez-Calvar (2005) Direct effect of melatonin on syrian hamster testes: melatonin subtype 1a receptors, inhibition of androgen production, and interaction with the local corticotropin-releasing hormone system. Endocrinology 146(3):1541–1552. Fu, Z., Kato, H., Kotera, N., Noguchi, T., Sugahara, K., T., Kubo (2001) Regulation of hydroxyindole-O-methyltranferase gene expression in Japanese quail (Coturnix coturnix japonica) Biosci. Biotechnol. Biochem. 65:2504-2511. Furness, J. B., y M., Costa (1987) Studies of neuronal circuitry of the enteric nervous system. En: The Enteric Nervous System. Churchill Livingstone, Edinburgh pp. 164-169. Gaildrat, P. y J., Falcón (1999) Expression of melatonin recptor and 2-[125I]-iodomelatonin binding sites in the pituitary of a teleost fish. Adv. Exp. Med. Biol. 460: 61-72. 224 Bibliografía Gaildrat, P., y J. Falcón (2000). Melatonin receptors in the pituitary of a teleost fish: mRNA expression 2-[125I]-iodomelatonin binding and cyclic AMP response. Neuro-endocrinology. 72: 57-66. Gaildrat, P., Becq, F., J. Falcón (2002) First cloning and functional characterization of a melatonin receptor in fish brain: a novel one? J. Pineal Res. 32:74-84. Ganguly, S., Weller, J.L., Ho, A., Chemineau, P., Malpaux,B., Klein, D.C. (2005) Melatonin synthesis: 14-3-3-dependent activation and inhibition of arylalkylamine N-acetyltransferase mediated by phosphoserine-205. Proc Natl Acad Sci USA 102:1222–1227. Garcia-Pergañeda, A., Pozo, D., Guerrero, J.M. y J.R., Calvo (1997) Signal transduction for melatonin in human lymphocytes: involvement of a pertussis toxin-sensitive G protein. J. Immunol. 159: 3774-3781. Garattini, S. (1987) Mechanisms of anoretic activity of dextrofenfluramine. In: Body Weight Control. Editado por A. E. Bender y L. J. Brookes. Churchill Livingstone (Edinburgh, Scotland), pp.: 261-270. Gauer, F., Poirel, V.J., Garidou, M.L., Simonneaux, V., P., Pévet (1999) Molecular cloning of the arylalkylamine-N-acetyltransferase and daily variations of its mRNA expression in the Syrian hamster pineal gland. Mol. Brain Res. 71:87-95. Gern, W.A. y C.L., Ralph (1979) Melatonin synthesis by retina. Science 204: 183-184 Gern, W.A., Duvall, D., y J.M., Nervina (1986) Melatonin: A discussion of its evolution and actions in vertebrates. Am. Zool. 26: 985–996. Gern, W. A., y S. S., Greenhouse (1988) Examination of in vitro melatonin secretion from superfused trout (salmo gaisdneri) pineal organs maintained under diel illumination or continous darkness. Gen. comp. Endocrinol. 71: 163-174. Gern, W.A., Owens, D.W., C.L., Ralph (1978) Plasma melatonin in the trout: Day-night change demonstrated by radioimmunoassay. Gen. Comp. Endocrinol. 34: 453-458. Gern W.A., Greenhouse, S.S., Nervina, J.M., y J.P., Gasser (1992) The rainbow trout pineal organ: an endocrine photometer. En: Rhythms in fishes. Ali, M.A. (ed.). Plenum Press, New York. pp. 199-1218 Gershon, M. D. (1982) Serotonergic neurotransmission in the gut. Scand. J. Gastroenterol. 17: 2641. Gershon, M.D. (2003) Plasticity in serotonin control mechanisms in the gut. Curr Opin Pharmacol. 3(6):600–607. Gershon, M.D., (2004) Review article: serotonin receptors and transporters—roles in normal and abnormal gastrointestinal motility. Aliment. Pharmacol. Ther. 20: 3–14. 225 Bibliografía Gershon, M.D., y J., Tack (2007) The serotonin signalling system: from basic understanding to drug development for functional GI disorders. Gastroenterology 132:397-414 Gershon, M. D., Dreyfus, C. F., Pickel, V. M., Joh, T. H., D. J., Reis (1977) Serotoninergic neurons in the peripheral nervous system: identification in gut by inmunohistochemical localization of tryptophan hydroxylase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 3086-3089. Gershon, M. D., Sherman, D. L., y J. E., Pintar (1990) Type-specific localization of monoamine oxidase in the enteric nervous system: relatonship to 5-hydroxytryptamine, neuropeptides, and sympathetic nerves. J. Comp. Neurol. 301: 191-213. Gesto, M., Tintos A., Soengas J.L., J.M., Míguez (2006) Effects of acute and prolonged naphthalene exposure on brain monoaminergic neurotransmitters in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Comp. Biochem. Physiol. C 144:173–183. Gesto, M. (2008) Efectos a nivel neuroendocrino de la exposicion a hidrocarburos aromaticos policíclicos en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss). Tesis doctoral. Universidad de Vigo, Vigo, España 155p. Gesto, M., Tintos, A., Álvarez, R., Soengas, J.L., J.M., Míguez (2009) Alterations in the brain monoaminergic neurotransmitters of rainbow trout related to naphthalene exposure at the beginning of vitellogenesis. Fish Physiol Biochem 35: 453-465. Gibbs, F.P. y J., Vriend (1981) The half-life of melatonin elimination from rat plasma. Endocrinology 109:1796-1798. Gibson, G.E. (1985). Hypoxia. In: Cerebral Energy Metabolism and Metabolic Encephalopathy(ed. D. W. McCandless),. New York, London: Plenum Press. pp. 43-78. Gillis, C. N. (1985) Peripheral metabolism of serotonin. En: Serotonin and the Cardiovascular System. Editado por P. M. Vanhoutte. Raven Press (New York, USA), pp.: 27-36. Gingerich, W. H., y L. J., Weber (1979) ―Assessment of Clinical Procedures to Evaluate Liver Intoxication in Fish,‖ Ecol. Res. Ser. EPA, Duluth, MN. Goldman, B.D. (2001) Mammalian photoperiodic system: formal properties and neuroendocrine mechanism of photoperiodic time measurement. J. Biol. Rhythms. 16: 283-301. Green, K., y G., Campbell (1994) Nitric oxide formation is involved in vagal inhibition of the stomach of the trout (Salmo gairdneri). J. Auton. Nerv. Syst. 50: 221–229. Grewe, P.H., Billington, N.E. y P.D.N., Herbert (1990) Phylogenetic relationships among members Salvelinus inferred from mitochondrial DNA divergence. Can. J. Fish Aquat. Sci. 47: 984-991. Grove, D.J., y C., Campell (1979) The role of extrinsic and intrinsic nerves in the coordination of gut motility in the stomachless flatfish Rhombosolea tapirina and Ammotretis rostrata Guenther. Comp. Biochem. Physiol. 63C: 143–159. 226 Bibliografía Grove, D.J., y S., Holmgren (1992) Mechanisms controlling stomach volume of the Atlantic cod (Gadus morhua) following gastric distension. J. Exp. Biol. 163: 49–63. Grübe, D. (1976) The endocrine cells of the gastrointestinal epithelium and the metabolism of biogenic amines in the gastrointestinal tract. Prog. Histochem. Cytochem., 8: 1-128. Guerrero, J.M., Pozo, D., García-Maurino, S., Osuna, C., Molinero, P., y J.R., Calvo (2000) Involvement of nuclear receptors in the enhanced IL-2 production by melatonin in Jurkat cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 917: 397-403. Gustafsson, B.I., Bakke, I., Tommeras, K. y H.L., Waldum (2006). A new method for visualization of gut mucosal cells, describing the enterochromaffin cell in the rat gastrointestinal tract. Scand J Gastroenterol 41: 390–395. Gwak, W.S., Seikai, T. y M., Tanaka (1999) Evaluation of starvation status of laboratory-reared Japanese flounder Paralichthys olivaceus larvae and juveniles based on morphological and histological characteristics. Fisheries Sci. 65: 339–346. Hafeez, M.A., y W.B., Quay (1970) Pineal acetylserotonin methyltransferase activity in the teleost fishes, Herperoleucus symmetricus and salmo gairdneri, with evidence for lack of effect of constant light and darkness. Comp. Gen. Pharmacol. 1: 257-262. Halver, J. (1989) Fish nutrition, pp. 798. Academic Press, San Diego, California. Halver, J. y R., Hardy (2002) Fish nutrition, pp. 824. Third edition, Academic Press, San Diego, California. Hamase, L., Hirano, J., Kosai, Y., Tomita, T., K., Zaitsu (2004) A sensitive internal standard method for the determination of melatonin in mammals using precolumn oxidation reversedphase high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. B 811: 237-241. Hansen, M.B. (2003) Neurohumoral control of gastrointestinal motility. Physiol. Res. 52: 1-30. Hansen, M.B., y E., Skadhauge (1997) Signal transduction pathways for serotonin as an intestinal secretagogue. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 118: 283–290. Hansen, H.B., y A.B., Witte (2008) The role of serotonin in intestinal luminal sensing and secretion. Acta Physiol. 193:311-323. Hara, R., Wan, K., Wakamatsu, H., Aida, R., Moriya, T., Akiyama, M. y S., Shibata (2001). Restricted feeding entrains liver clock without participation of the suprachiasmatic nucleus. Genes Cells. 6: 269-278. Harumi, T., y S., Matsushima (2000) Separation and assay methods for melatonin and its precursors. J. Chromatogr. B 747: 95-110. Hardeland, R., B., Poeggeler (2003) Non-vertebrate melatonin. J. Pineal. Res. 34:233- 241. 227 Bibliografía Harder, W. (1975) Anatomy of fishes, part I, Stuttgart: E. Schweizerbart‘sche Verlagsbuchhandlung. 612pp. Harlow, H.J., B.L., Weekly (1986) Effect of melatonin on the force of spontaneous contractions of in vitro rat small and large intestine. J. Pineal Res. 3:277-284. Hernández, J. (2011) Efecto protector de la melatonina frente a las alteraciones del sistema circadiano intestinal del pez cebra (danio rerio) durante el envejecimiento. Proyecto fin de Master, Universidad de Vigo, España. 22p. Herrero, M.J., Martínez, F.J., Míguez, J.M., J.A., Madrid (2007) Response of plasma and gastrointestinal melatonin, plasma cortisol and activity rhythms of European sea bass (Dicentrarchus labrax) to dietary supplementation with tryptophan and melatonin. J. Comp. Physiol. B 177: 319-326. Hirata, F., Hayaishi, O., Tokuyama, O., Senoh, S. (1974). In vitro and in vivo formation of two new metabolites of melatonin. J. Biol. Chem. 249:1311-1313. Hirschowitz, B.I. (1957) Pepsinogen, its origins, secretion and excretion. Physiol. Rev. 37: 475511. Hibiya, T. (1982) ―An Atlas of Fish Histology: Normal and Pathological Features.‖ Kodansha, Tokyo. 213 pp. Hilton, J.W. y D.G., Dixon (1982) Effect of increased liver glycogen and liver weight on liver function in rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson: recovery from anaesthesia and plasma 35 S-sulphobromophthalein clearance. J. Fish Dis. 5: 185–195. Hoegg, S., Brinkmann, H., Taylor, J.S., A., Meyer (2004) Phylogenetic timing of the fishspecific genome duplication correlates with the diversification of teleost fish. J. Mol. Evol. 59:190203. Höglund, E., Sørensen, C., Bakke, M. J., Nilsson G. E., y Ø., Øverli (2007) Attenuation of stressinduced anorexia in brown trout (Salmo trutta) by pre-treatment with dietary L-tryptophan. Br. J. Nutr. 97:786–789. Hollands, T.R. (1974). Constant temperature tissue bath for the in vitro measurement of muscle tension. Lab. Pract. 23:253-254. Holloway, W. R., Grota, L. J. y G. M., Brown (1985) Immunohistochemical Assessment of Melatonin Binding in the Pineal Gland. J. Pineal Res. 2,3: 235–251. Holloway, W. R., Grota, L. J. y G. M., Brown (1980) Determination of immunoreactive melatonin in the colon of teh rat by immunocytochemistry. J. Histochem. 28: 255-262. Holmgren, S., Grove, D. J. y S., Nilsson (1985). Substance P acts by releasing 5hydroxytryptamine from enteric neurons in the stomach of the rainbow trout, Salmo gairdneri. Neuroscience 14: 683–693. 228 Bibliografía Holmberg, A., Olsson, C., S., Holmgren (2006) The effects of endogenous and exogenous nitric oxide on gut motility in zebrafish, Danio rerio, embryos and larvae. J. Exp. Biol. 207: 923935. Holmberg, A., Olsson, C., G.W., Hennig (2007) TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae. J. Exp. Biol. 210:1084-1091. Holmgren, S., C., Olsson (2009) The neuronal and endocrine regulation of gut function. En: Fish neuroendocrinology. (Eds. N.J. Bernier, G. Van Der Kraak, A.P. Farrell, C.J. Brauner). Academic Press, Oxford. pp 467-512. Hong, G.X. y S.F., Pang (1995) N-acetyltransferase activity in the quail (Coturnix coturnix jap) duodenum. Comp. Biochem. Physiol. 112B: 251-262. Horn, M.H. (1998) Feeding and digestion. En: The physiology of fishes. (Ed.: D.H. Evans). CRC Press, New York. pp 43-63. Hoyer, D., Hannon, J.P., Martin, G.R., (2002) Molecular, pharmacological and functional diversity of 5-HT receptors. Pharmacol. Biochem. Behav. 71:533– 554. Hseu, J.R., Lu F.I., Su, H.M., Wang, L.S., Tsai, C.L., P.P., Hwang (2003) Effect of exogenous tryptophan on cannibalism, survival and growth in juvenile grouper, Epinephelus coioides. Aquaculture 218: 251–263. Hubel, K.A. (1985) Intestinal nerves and ion transport: stimuli, reflexes, and responses. Am. J. Physiol. 248:G261-G271. Huether, G. (1993) The contribution of extrapineal sites of melatonin synthesis to circulating melatonin levels in higher vertebrates. Experientia 49:665–670. Huether, G., (1994) Melatonin synthesis in the gastrointestinal tract and the impact of nutritional factors on circulating melatonin. Ann. N. Y. Acad. Sci. The Aging Clock 719: 146–158. Huether, G., Poegeller, B., Reimer, R., A., George (1992) Effect of tryptophan administration on circulating melatonin levels in chicks and rats: evidence for stimulation of melatonin synthesis and release in the gastrointestinal tract. Life Sci. 51:945-53. Huether, G., Messner, M., Rodenback, A., R., Hardeland (1998) Effects of continuous infusion on steady state plasma melatonin levels under near physiological conditions. J. Pineal Res. 24:146–15. Ianas, O., Olnescu, R., y I., Badescu (1991) Melatonin involvement in oxidative stress, Rom. J. Endocrinol. 29 (1991), pp. 147–153. Iigo, M., Kezuka, H., Aida, K. y I., Hanuy (1991) Circadian rhythms of melatonin secretion from superfused goldfish (Carassius auratus) pineal glands in vitro. Gen. Comp. Endocrinol. 83: 152-158. 229 Bibliografía Iigo, M., y K., Aaida (1995) Effects of season, temperaure, and photoperiod on plasma melatonin rhythms in the golfish, Carassius auratus. J. Pineal Res. 18, 62-68. Iigo, M., Furukawa, K., Tabata, M., K., Aida (2003) Circadian variations of melatonin binding sites in the goldfish brain. Neurosci. Lett. 347:49-52. Iigo, M., Abe T., Kambayashi, S., Oikawa, K., Masuda, T., Mizusawa, K., Kitamura, S., Azuma, T. Takagi, Y., Aida, K., y T., Yanagisawa (2007) Lack of circadian regulation of in vitro melatonin release from the pineal organ of salmonid teleosts. Gen. Comp. Endocrinol. 154: 91-97. Iinuma, F., Hamase, K., Matsubayashi, S., Takahashi, M., Watanabe, M., K., Zaitsu (1999) Sensitive determination of melatonin by precolumn derivatization and reversed-phase highperformance liquid chromatography. J. Chromatogra. A 835:67-72. Ikegami, T., Azuma, K., Nakamura, M., Suzuki, N., Hattori, A., H., Ando (2009a) Diurnal expressions of four subtypes of melatonin receptor genes in the optic tectum and retina of goldfish. Comp. Biochem. Physiol. A 152:219-224. Ikegami, T., Motohashi, E., Doi, H., Hattori, A., H., Ando (2009b) Synchronized diurnal and circadian expression of four subtypes of melatonin receptor genes in the diencephalon of a puffer fish with lunar-related spawning cycles. Neurosci. Lett. 469:58-63. Isorna, E., Besseau, L., Boeuf, G., Desdevises, Y., Vuilleumier, R., Alonso-Gómez, A.L., Delgado, M.J., J., Falcón (2006) Retinal, pineal and diencephalic expression of frog arylalkylamine N-acetyltransferase-1. Mol. Cell. Endocrinol. 252:11-18. Isorna, E., El M' rabet, A., Confente, F., Falcón, J., J.A., Muñoz-Cueto (2009) Cloning and expression of arylalkylamine N-acetyltranferase-2 during early development and metamorphosis in the sole Solea senegalensis. Gen. Comp. Endocrinol. 161:97-102. Ito, Y., H., Kuriyama (1971) Nervous control of the motility of the alimentary canal of the silver carp. J. Exp. Biol. 55:469-487. Itoh, M.T., Ishizuka, B., Kudo, Y., Fusama, S., Amemiya, A., Y., Sumi (1997) Detection of melatonin and serotonin N-acetyltransferase and hydroxindole-O-metyltransferase activities in rat ovary. Mol.Cell.Endocrinol. 136:7-13. Itoh, M.T., Shinozawa, T., y Y., Sumi (1999) Circadian rhythms of melatonin-synthetizing enzyme activities and melatonin levels in planarians. Brain Res. 830: 165–173 Iuvone, P.M., Tosini, G., Pozdeyev, N., Haque, R., Klein, D.C., S.S., Chaurasia (2005) Circadian clocks, clock networks, arylalkylamine N-acetyltransferase, and melatonin in the retina. Prog. Retinal Eye Res. 24:433-456. Jaworek, J., Nawrot, K., Konturek, S.J., Leja-Szpak, A., Thor, P. y W.W., Pawlik (2004) Melatonin an its precursor, L-tryptophan: influence on pancreatic amylase secretion in vivo and in vitro. J. Pineal Res. 36: 155-164. 230 Bibliografía Jensen, J. (1997) Co-release of substance P and neurokinin A from the Atlantic cod stomach. Peptides 18:717-722. Jensen, J., y S., Holmgren (1991) Tachykinins and intestinal motility in different fish groups. Gen. Comp. Endocrinol. 83:388-396. Jensen, J., y S., Holmgren (1994) The gastrointestinal canal. In: Nilsson S, Holmgren S, editors. J Chur, Switzerland:Harwood Academic Publisher; 199: 119–67. John, T.M.; Beamish, F.W.H. y J.C., George (1983) Diurnal impact of locomotory activity and melatonin and N-acetylserotonin treatment on blood metabolite levels in the rainbow trout. Arch. Int. Physiol. Biochim. 91: 115-120. Johnels, A. G., y E., Östlund (1958) Anatomical and physiological studies on the enteron of Lampetra fluviatilis (L.). Acta Zool. (Stockh.) 39: 9–12. Johansson, A., S., Holmgren (2003) Ca2+-recruitment in tachykinin inducedcontractions of gut smooth muscle from African clawed frog, Xenopus laevis, and rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Gen. Comp. Endocrinol. 113:185-191. Johnston, W. L., y N.T., Glanville (1992) Effect of feeding and fasting on plasma tryptophan and tryptophan to large neutral amino acid ratio, and on brain serotonin turnover in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Fish Physiol. Biochem. 10: 11-22. Kachi, T., M., Kurushima (2000) Pineal-digestive organ relations: Physiological and pathophysiological significance of melatonin in the digestive system. Hirosaki Med. J. 51:93– 108. Kachi, T., Suzuki, T., Yanagisawa, M., Kimura, N., T., Irie (1999) Pinealgut relations. Hirosaki Med J 51: 209–S213. Kaneko, M., Hernandez-Borsetti, N., G.M., Cahill (2006) Diversity of zebrafish peripheral oscillators revealed by luciferase reporting. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:14614-14619. Kapoor, B.G., Smit, H., I.A., Verighina (1975) The alimentary canal and digestion in teleost. Adv. Mar. Biol. 13:109-230. Kapoor, B. G. y B., Khawna (1993) The potencial spectrum of the gut in teleost fishes. J. Fish Biol. 1: 221-226. Karila, P., S., Holmgren (1995) Enteric reflexes and nitric oxide in the fish intestine. J. Exp. Biol. 198:2405-2411. Karila, P., Shahbazi, F., Jensen, J., S., Holmgren (1998) Projections and actions of tachykinergic, cholinergic, and serotonergic neurons in the intestine of the Atlantic cod. Cell. Tissue Res. 291:403-413. Kasimay, Ö., Çakir, B., Devseren, E., B.Ç., Yegen (2005) Exogenous melatonin delays gastric emptying rate in rats: role of CCK2 and 5-HT3 receptors. J. Physiol. Pharmacol. 56:543-553. 231 Bibliografía Kezuka, H., Kobayashi, M., Aida, K., y I., Hanyu (1989) Effects of photoperiod and pinealectomy on the gonadotropin surge and ovulation in goldfish Carassius auratus. Nippon Suisan Gakkaishi 55: 2099-2103 Kezuka, H., Iigo, M., Furukawa, K., Aida, K., I., Hanyu (1992) Effects of photoperiod, pinealectomy and ophthalmectomy on circulating melatonin rhythms in the goldfish, Carassius auratus. Zool. Sci. 9:1047-1053. Kiliaan, A.J., Joosten, H.W., Bakker, R., Dekker, K., J.A., Groot (1989) Serotonergic neurons in the intestine of two teleosts, Carassius auratus and Oreochromis mossambicus, and the effect of serotonin on transepithelial ion-seletivity and muscle tension. Neuroscience 31:817-824. Kiliaan, A.J., Scholten, G. J. A., Groot (1997) Exocytotic release of vasoative intestinal polypeptide and serotonin from mucosal nerve fibres and endocrine cells of the intestine of the goldfish (Carassius auratus) and the tilapia (Oreochromis mossambicus): an ultrastructural study. Histochem. J. 29: 45-51 King, T.S. y S., Steinlechner (1985) Pineal indolalkylamine synthesis and metabolism: kinetic considerations. Pineal Res. Rev. 3: 69-113. Kitazawa, T., Hoshi, T., A., Chugun (1990) Effects of some autonomic drugs and neuropeptides on the mechanical activity of longitudinal and circular muscle strips isolated from the carp intestinal bulb (Cyprinus carpio). Comp. Biochem. Physiol. C 97:13-24. Kitazawa, T., Ukai, H., Komori, S., T., Taneike (2006) Pharmacological characterization of 5hydroxytryptamine-induced contraction in the chicken gastrointestinal tract. Auton. Autacoid. Pharmacol. 26: 157-168. Klein, D.C. (1985). Photoneural regulation of the mammalian pineal gland. In: Everet, D., Clark, E. (Eds.), Photoperiodism, Melatonin and The Pineal. Ciba Foundation Symposium 117. Pittman Press, London, pp. 38–56. Klein, D.C. (2006) Evolution of the vertebrate pineal gland: the AANAT hypothesis. Chronobiol. Int. 23:5-20. Klein, D.C. (2007) Arylalkylamine N-acetyltransferase: the ―timezyme‖. J. Biol. Chem. 282:42334237. Klein, D.C. y J.L., Weller (1970) Indole metabolism in the pineal gland: a circadian rhythm in Nacetyltransferase. Science. 169:1093-5. Klein, D. C., Sugden, D. & Weller, J. L. (1983). Postsynaptic a-adrenergic receptors potentiate the ,-adrenergic stimulation of pineal serotonin N-acetyltransferase. Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 80: 599-603. Klein, D.C., Roseboom, P.H., S.L., Coon (1996) New light is shining on the melatonin rhythm enzyme the first postcloning view. Trends Endocrinol. Metab. 7: 106-112. 232 Bibliografía Klein, D.C., Coon, S.L., Roseboom, P.H., Weller, J.L., Bernard, M., Gastel, J.A., Zatz, M., Iuvone, P.M., Rodriguez, I.R., Bégay, V., Falcón, J., Cahill, G.M., Cassone, V.M. y R., Baler (1997) The melatonin rhythm-generating enzyme: molecular regulation of serotonin Nacetyltransferase in the pineal gland. Recent Prog. Horm. Res. 52: 307-357. Kleszczynska, A., Vargas-Chacoff, L., Gozdowska, M., Kalamarz, H., Martinez-Rodriguez, G., Mancera, J. M. y E., Kulczykowska (2006) Arginine vasotocin, isotocin and melatonin responses following acclimatation of gilthead sea bream (Sparus aurata) to different environmental salinities. Comp. Biochem. Physiol. 145: 268-273. Kotler, M., Rodriquez, C., Sainz, R.M., Antolín, I., y A., Menéndez-Peláez (1998) Melatonin increases gene expression for antioxidant enzymes in rat brain cortex. J. Pineal Res. 24:83-89. Kobayashi, H., Kromminga, A., Dunlop, T.W., Tychsen, B., Conrad, F., Suzuki, N., Memezawa, A., Bettermann, A., Aiba, S., Calberg, C., R., Paus (2005) A role of melatonin in neuroectodermal-mesodermal interactions: the hair follicle synthesizes melatonin and expresses functional melatonin receptors. FASEB J. 19:1710-1712. Konturek, S.J., Konturek, P.C., Brzozowski, T., G.A. Bubenik (2007) Role of melatonin in upper gastrointestinal tract. J. Physiol. Pharmacol. 58: 23-52. Kruk, Z. L. y C. J., Pycock (1991) 5-hydroxytryptamine. En: Neurotransmitters and Drugs. 3a edicion. Editado por Z. L. Kruk y C. J. Pycock. Chapman & Hall (London, UK), pp.: 116-132. Kuhn, D. M., Wolf, W.A., W., Lovenberg (1980) Review of the role of the central serotonergic neuronal system in blood pressure regulation. Hypertension, 2: 243-255. Kurian, S.S., Ferri, G.L., De Mey, J. y J.M., Polak (1983) Immunocytochemistry of serotonincontaining nerves in the human gut. Histochemistry 78: 523–529. Kulczykowska, E. (2001) Responses of circulating arginine vasotocin, isotocin, and melatonin to osmotic and disturbance stress in rainbow trout (O. mykiss). Fish. Physiol. Biochem. 24: 201206. Kulczykowska, E. (2002) A review of the multifunctional hormone melatonin and a new hypothesis involving osmoregulation. Rev. Fish Biol. Fisheries 11: 321-330. Kulczykowska, E., y P.M., Iouvone (1998) Highly Sensitive and Specific Assay of Plasma Melatonin Using High-Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection Preceded by Solid-Phase Extraction. J. Chromatrogr. Sci. 36: 175-178. Kulczykowska, E., Kalamarz, H., Warme, J.M., R.J., Balment (2006) Day-night specific binding of 2-[125I]Iodomelatonin and melatonin content in gill, small intestine and kidney of three fish species. J. Comp. Physiol. B 176: 277-285. Kunze, W.A.A., J.B., Furness (1999) The enteric nervous system and regulation of intestinal motility. Annu. Rev. Physiol. 61:117-142. 233 Bibliografía Kvetnoy, I.M., Ingel, I.E., Kvetnaia, T.V., Malinovskaya, N.K., Rapaport, S.I., Raikhlin, N.T., Trofimov, A.V., y V.V., Yuzhakov (2002) Gastrointestinal melatonin: cellular identification and biological role, Neuro Endocrinol. Lett. 23: 121–132. Lagler, K.F., Bardach, J.E., Miller R.R., y D.R.M., Passino (1977) En: (2nd Edn. ed.),Ichthyology, John Wiley and Sons, New York, pp. 251–267. Lang, U., Aubert, M. L., Conne, B. S., Bradtke, J. C. y Sizonenko, P. C., (1983) Influence of exogenous melatonin on melatonin secretion and on the neuroendocrine reproductive axis of intact male rats during sexual maturation. Endocrinology, 112: 1578-1584. Larson, E.T., Winberg, S., Mayer, I., Lepage, O., Summers, C.H., y Ø., Øverli (2004) Social stress affects circulating melatonin levels in rainbow trout, Gen. Comp. Endocrinol. 136: 322– 327. Lee, P.P.N., S.F., Pang (1993) Melatonin and its receptors in the gastrointestinal tract. Biol. Signals 12:181-193. Lee, P. P. N., Hong, G.X. y Pang, S.F. (1991). Melatonin in the gastrointestinal tract. En: Faschini, F. y Reiter, R. J. (eds) Role of the melatonin and Pineal Peptides in Neuroimmunomodulation. Plenum Press, New York. pp. 127-136 Lee, J.H., Ku, S.K., Park, K.D., H.S., Lee (2004) Immunohistochemical study of the gastrointestinal endocrine cells in the Korean aucha Perch. J. Fish Biol., 65, 170–181. Legay, C., Faudon, M., Hery, F., J. P., Ternaux (1983) 5-HT metabolism in the intestinal wall of the rat. I. The mucosa. Neurochem. Int., 5: 721-727. Lepage, O., Tottmar, O. y S., Winberg, (2002). Elevated dietary Ltryptophan counteracts the stress-induced elevation of plasma cortisol in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). J. Exp. Biol. 205: 3679-3687. Lepage, O., Vilchez, I. M., Pottinger, T. G., y S., Winberg (2003) Timecourse of the effect of dietary L-tryptophan on plasma cortisol levels in rainbow trout Oncorhynchus mykiss. J. Exp. Biol. 206: 3589-3599. Lepage, O., Larson, E.T., Mayer, I., y S., Winberg (2005a) Tryptophan affects both gastrointestinal melatonin production and interrenal activity in stressed and nonstressed rainbow trout. J. Pineal Res. 38: 264-271. Lepage, O., Larson, E.T., Mayer, I. y S., Winberg (2005b) Serotonin but not melatonin, plays a role in shaping dominant-subordinate relationships and aggression in rainbow trout.. Hormones and Behavior 48: 233-242. Lerner, A.B., Case, J.D., Takahashi, Y. (1958). Isolation of melatonin, a pineal factor that lightens melanocytes. J. Am. Chem. Soc. 80:2057-2058. Levi, G., y M., Raiteri (1993) Carrier-mediated release of neurotransmitters.Trends Neurosci. 16: 415-419. 234 Bibliografía Liu, C., Weaver, D.R., Strogatz, S.H., S.M., Reppert (1997) Cellular construction of a circadian clock: period determination in the suprachiasmatic nuclei. Cell, 91: 855-860. López-Patiño, M.A., Guijarro, A.I., Isorna, E., Delgado, M.J., A.L., Alonso-Gómez (2007) Regulación por la temperatura de la ritmicidad de los receptores de melatonina en la tenca (Tinca tinca, L.). En: Avanços em Endocrinologia Comparativa Vol III. (Eds.: A.V.M. Canário y D.M. Power) CCMAR, Universidade do Algarve. pp. 149-153. López-Patiño, M.A., Alonso-Gómez, A.L., Guijarro, A.I., Isorna, E., M.J., Delgado (2008) Melatonin receptors in brain areas and ocular tissues of the teleost Tinca tinca. Characterization and effect of temperature. Gen. Comp. Endocrinol. 155: 847-856. López-Patiño, M.A., Rodríguez-Illamola, A., Gesto, M., Soengas, J.L., J.M., Míguez (2011a) Changes in plasma melatonin levels and pineal organ melatonin synthesis following acclimation of rainbow trout (oncorhynchus mykiss) to different water salinities J. Exp. Biolo. 214: 928-936. Lopez-Patiño M.A., Rodriguez-Illamola, A., Conde-Sieira, M., Soengas, J.L., J.M., Miguez (2011b) Daily rhythmic expression patterns of clock1a, Bmal1, and Per1 genes in retina and hypothalamus of the rainbow trout, Oncorhynchus Mykiss. Chronobiol. Intern. DOI: 10.3109/07420528.2011.566398 López-Olmeda, J.F., Madrid, J.A., F.J., Sánchez-Vázquez (2006). Melatonin effects on food intake and activity rhythms in two fish species with different activity patterns: Diurnal (goldfish) and nocturnal (tench). Comp. Biochem. Physiol. A 144:180-187. López-Olmeda, J.F., Bayarri, M.J., Rol De Lama, M.A., Madrid, J.A., Sánchez-Vázquez, F.J. (2006b). Effects of melatonin administration on oxidative stress and daily locomotor activity patterns in goldfish. J. Physiol. Biochem. 62:17-25.. López-Olmeda, J.F., Oliveira, C., Kalamarz, H., Kulczykowska, E., Delgado, M.J., F.J., SánchezVázquez (2009) Effects of water salinity on melatonin levels in plasma and peripheral tissues and on melatonin binding sites in European sea bass (Dicentrarchus labrax). Comp. Biochem. Physiol. A 152: 486-490. Lovenberg, W., Jequier, E., A., Sjoerdsma (1967) Tryptophan hydroxylation in pineal gland, brainstem and carcinoid tumor. Science, 155: 217-219. Lucchelli, A., Santagostino-Barbone, M.G., M., Tonini (1997) Investigation into the contractile response of melatonin in the guineapig isolated proximal colon: the role of 5-HT4 and melatonin receptors. Br. J. Pharmacol. 121:1775–1781. Madrid, J.A. (2006) Cronobiología básica y clínica (Eds.: J.A. Madrid y M.A. Rol de Lama). Editec@Red, Madrid, España. 864p. Malinovskaja, N., Komarov, F., Rapoport, S., Voznesenskaya, Sharov, A., L., Wetterberg (2001) Melatonin production in patients with duodenal ulcer. Neuroendocrinol. Lett. 22:109 117. 235 Bibliografía Mailliet, F., Ferry, G., Vella, F., Berger, S., Coge, F., Chomarat, P., Mallet, C., Guenin, S.P., Guillaumet, G., Viaud-Massuard, M.C., Yous, S., Delagrange, P., Boutin, J.A. (2005). Characterization of the melatoninergic MT3 binding site on the NRH: quinone oxidoreductase 2 enzyme. Biochem. Pharmacol. 71:74-88. Mandl, P., J.P., Kiss (2007) Role of presynaptic nicotinic acetylcholine receptors in the regulation of gastrointestinal motility. Brain Res. Bull. 72:194–200. Manera, M., y B.S., Dezfuli (2004) Rodlet cells in teleosts: a new insight into their nature and functions, J. Fish Biol. 65: 597–619. Manera, M., Giammarino, A., Perugini, M., M., Amorena (2008) In vitro evaluation of gut contractile response to histamine in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792). Res. Vet. Sci. 84: 126-131. Matheus, N., Mendoza C., Iceta, R., Mesonero, J.E., A.I., Alcalde (2010) Melatonin inhibits serotonin transporter activity in intestinal epithelial cells. J. Pineal Res. 48: 332-339. Matsuda, K., Kashimoto, K., Higuchi, T., Yoshida, T., Uchiyama, T., Uchiyama, M., Shioda, S., Arimura, A., T., Okamura (2000) Presence of pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide (PACAP) and its relaxant activity in the rectum of a teleost, the stargazer, Uranoscopus japonicus. Peptides 21:821-827. Matveev, V., Nishihara, H. y N., Okada (2007) Novel SINE families from salmons validate Parahucho (Salmonidae) as a distinct genus and give evidence that SINEs can incorporate LINE-related 3'-tails of other SINEs, Mol. Biol. Evol. 24: 1656–1666. Martin, F. J., y M., Aldegunde (1995) Peripheral serotonin and experimental Diabetes mellitus (type I). A review. Biogenic Amines, 11: 453-467. Martín, M.T., Fernández, A.G., Fernández, E., Goñalons, E. (1993) Receptors implicated in the actions of serotonin on chicken ileum longitudinal smooth muscle. Life Sci. 52: 1361-1369. Martin, M.T., Azpiroz, F., J.R., Malagelada (1998) Melatonin in the gastrointestinal tract. Thérapie 53: 453-458. Masson-Pévet, M., y P., Pévet (1989) Cytochemicallocalization of type-A and –B monoamine oxidase in the rati pineal gland. Cell Tissue Res. 255: 299-303. Mattison, A. y B., Holstein (1980) The ultrastructure of the gastric and its relation to induced secretory activity of cod. Gadus morhua. Acta Physiol. Scand. 109: 51-60. Max, M., y M., Menaker (1992) Regulation of melatonin production by light, darkness and temperature in the trout pineal. J. Comp. Physiol., 170: 479-489. Mayo, J.C., Sainz, R.M., Antolin, I., Herrera, F., Martin, V., C., Rodriquez (2002) Melatonin regulation of antioxidant enzyme gene expression. Cell Mol Life Sci. 59: 1706–13. 236 Bibliografía McCord, C.P., Allen, F.P. (1917) Evidences associating pineal gland function with alterations in pigmentation. J. Exp. Zool. 23:207-224. McKay, L. y B., Gjerde (1985) The effect of salinity on growth of rainbow trout. Aquaculture. 49: 325-331. Melchiorri, D.E., Sewerynek, E., Reiter, R.J., Ortiz, G.G., Poegeller, B., G., Nistico (1997) Suppressive effect of melatonin administration on ethanol-induced gastroduodenal injury in rats in vivo. Br. J. Pharmacol. 121:264–270. Menaker, M., Moreira, L.F., G., Tosini (1997). Evolution of cicadian organization in vertebrates. Brazilian J. Med. Biological Res. 30:305-313. Mendoza, J. (2007). Circadian clocks: setting time by food. J. Neuroendocrinol. 19:127-137. Menendez-Pelaez, A., Poeggeler, B., Reiter, R.J., Barlow-Walden, L., Pablos, M.I., D-X., Tan (1993) Nuclear localization of melationin in the different mammalian tissues: Immunocytochemical and radioimmunoassay evidence. J. Cell Biol. 53:373–382. Merle A., Delagrange P.H., Renard P., Lesieur D., Cuber J.C., Roche M., S., Pellissier (2000) Effect of melatonin on motility pattern of small intestine in rats and its inhibition by melatonin receptor antagonist S 221152. J. Pineal Res. 29:116–124. Messner, M., Hardeland, R., Rodenbeck A., y G., Huether (1998) Tissue retention and subcellular distribution of continuously infused melatonin in rats under near physiological conditions, J. Pineal Res. 25: 251–259. Messner, M., Huether, G., Lorf, T., Ramadori, G., C., Schwörer (2001) Presence of melatonin in the human hepatobiliary-gastrointestinal tract. Life Sci. 69:543-551. Míguez, J.M., Simonneaux, V., y P., Pévet (1997) The role of the intracellular and extracellular serotonin in the regulacion of melatonin production in rat pinealocytes. J. Pineal Res. 23: 6371 Mistlberger, R.E. (2006) Circadian rhythms: perturbing a food-entrained clock Current Biol. 16(22): 968-969. Molina-Borja M., Falcón, J. Urquiola, E. y J.P. Ravault (1996) Production of melatonin by the gilthead sea bream pineal: in vivo and in vitro study, Fish Physiol. Biochem. 15: 413–419. Monroe, K.K., Watts, S.W. (1998) The vascular reactivity of melatonin. Gen. Pharmacol. 30:31– 35. Morton D.J. y H.J., Forbes (1989) Probable mechanism of catalysis of pineal gland hydroxyindole-O-methyltransferase (HIOMT) from rainbow trout (Salmo gairdneri). J. Neural Transm. 75: 65-71. 237 Bibliografía Morton, D.J., y H.J., Forbes (1988). Pineal gland N-acetyltransferase and hydroxyindole-Omethyltransferase activity in the rainbow trout (Salmo gairdneri): seasonal variation linked to photoperiod. Neurosci. Lett. 94: 333-337. Mourre, C., Calas, A., J., Gonella (1981) Radioautographic study of uptake and storage of indoleamines in the rabbit enterochromaffin cells. Neurosci. Lett. 23: 251-256. Moyes, C. D. y P. M., Schulte (2007) Principios de fisiología animal. Pearson Educaci´on, S:A., Madrid, España., pp.767 Munro, A.D. (1986) Effects of Melatonin, Serotonin, and Naloxone on Aggression in Isolated Cichlid Fish (Aequidens pulcher) J. Pineal Res. 3: 257–262. Muñoz, J.L.P., Ceinos, R.M., Soengas, J.L., Míguez, J.M. (2009) A simple and sensitive method for determination of melatonin in plasma, bile and intestinal tissues by high performance liquid chromatography with fluorescence detection. J. Chromatography B 877:2173-2177. Muñoz, J.L.P., López Patiño, M.A., Hermosilla, C., Conde-Sieira, M., Soengas, J.L., Rocha, F., J.M., Míguez (2011) Melatonin in nervous system and hemolymph of the octopus (Octopus vulgaris): tissue distribution and daily changes. J. Comp.Physio.A, (DOI 10.1007/s00359-0110641-x) Murakami, N., Kawano, T., Nakahara, K. Nasu, T. y K., Shiota (2001) Effect of melatonin on circadian rhythm, locomotor activity and bosy temperatura in the intact house sparrpw, Japanese quail and owl. Brain Res. 889: 220-224. Mush, M. W., O´Grady, S. M. y M., Field (1990) Ion transport of marine teleost intestine. En: Guthrie, C: y Fink, G.R. (eds.) methods in Enzymology, Vol. 194. Academic Press, San Diego. pp. 746-753. Nagai, T. (1995) Purification and properties of aromatic L-amino acid decarboxylase from liver of skipjack tuna (Katsuwonus pelamis, Teleostei: Scombridae). Comp. Biochem. Physiol. B 112: 265-270. Nagai, T. (1999) Studies on the serotonin metabolic enzymes in the liver of skipjack Katsuwonus pelamis. J. Natl. Fish Univ. Japan 48: 81-195. Nagai, T., Hamada, M., Kai, N., Tanoue, Y., F., Nagayama (1997) Characterization of yellowfin tuna (Thunnus albacares, Scombroidei) tryptophan hydroxylase. Comp. Biochem. Physiol. B, 116: 161-165. Naji, L., Carrillo-Vico, A., Guerrero, J.M., y J.R. Calvo (2004). Expression of membrane and nuclear melatonin receptors in mouse peripheral organs. Life Sci. 74: 2227–2236. Naranjo, M.C., Guerrero, J.M., Rubio, A., Lardone, P.J., Carrillo-Vico, A., Carrascosasalmoral, M.P., Jiménez-Jorge, S., Arellano, M.V., Leal-Noval, S.R., Leal, M., Lissen, E., P., Molinero (2007) Melatonin biosynthesis in the thymus of humans and rats. Cell.Mol.Life Sci. 64:781790. 238 Bibliografía Nash, J., Kime, D.E., Holtz, W. y H., Steinberg (1995) Has melatonin a role in reproductive seasonality in the female rainbow trout, Oncorhynchus mykiss?. En: Proc. Gifth Int. Symp. Goetz F.W. and Thomas P. (eds.) Reprod. Biol. Fish. Austin, TX: Fish symposium 95, p. 93. Navarro, I., Gutierrez, J., J., Planas (1992). Changes in plasma glucagon, insulin and tissue metabolites associated with prolonged fasting in brown trout (Salmo trutta fario) during two different seasons of the year. Comp.Biochem. Physiol. A, 102: 401-407. Nelson, L.E., y M.A., Sheridan (2006) Gastroenteropancreatic hormones and metabolism in fish. Gen. Comp. Endocrinol. 148:116-124. Nemoto, N., Kawaoi, A., T., Shikata (1982) Immunohistochemical demonstration of serotonin (5HT)-containing cells in the human and rat intestines. Biomed. Res. 3: 181-187. Nikaido, Y., Aluru, N., McGuire, A., Park, Y. Mathilakath, M. Vijayan, M., y A., Takemura (2010) Effect of cortisol on melatonin production by the pineal organ of tilapia, Oreochromis mossambicus.Comp.Biochem.Physiol.A. 155: 84-90. Nilsson, G. E. y O., Tottmar (1987) Effects of biogenic aldehydes and aldehyde dehydrogenase inhibitors on rat brain tryptophan hydroxylase activity. Brain Res. 409: 374-379. Nilsson, G. E. (1990) Turnover of serotonin in brain of an anoxia-tolerant vertebrate, the crucian carp. Am. J. Physiol., 258: R1308-R1312. Nilsson, S. (1983) The Autonomic Nerve Function in Vertebrates. En: Zoophysiology. Vol. XIII. Editado por D. S. Famer. Springer-Verlag (Berlin, Alemania), pp.: 100-111. Nilsson, S., y S., Holmgren (1994) Comparative Physiology and Evolution of Autonomic Nervous System. Harwood Academic Publishers, Chur, Switzerland. 376pp. Nosjean, O., Ferro, M., Coge, F., Beauverger, P., Henlin, J.M., Lefoulon, F., Fauchere, J.L., Delagrange, P., Canet, E., J.A., Boutin (2000) Identification of the melatonin binding site MT3 as the quinone reductase 2. J. Biol. Chem. 275:31311-31317. Øverli, O., Pall, M., Borg, B., Jobling, M., S., Winberg (2001) Effects of Schistocephalus solidus infection on brain monoaminergic activity in female three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Proc. Roy. Soc. Lond, Ser. B. 268: 1411-1415. Olsson, C. (2009) Autonomic innervation of the fish gut. Acta Histochem. 111:185- 195. Olsson, C. (2011) The Enteric nervous system. En: The multifunctional gut of fish. Editors: Grosell M., Farrell A. P., Brauner C.J., Academic Press, London, 444pp. Olsson, C., P., Karila (1995) Coexistence of NADPH-diaphorase and vasoactive intestinal polypeptide in the enteric nervous system of the Atlantic cod (Gadus morhua) and the spiny dogfish (Squalus acanthias). Cell. Tissue Res. 280:297- 305. Olsson, C., y S., Holmgren (2001) The control of gut motility. Comp. Biochem. Physiol. A 128:481-503. 239 Bibliografía Olsson, C., Holmberg, A., S., Holmgren (2008) Development of enteric and vagal innervation of the zebrafish (Danio rerio) gut. J. Comp. Neurol. 508:756-770. Otsuka, M., Kato, K., Murai, I., Asai, S., Iwasaki, A., Y., Arakawa (2001) Roles of nocturnal melatonin and the pineal gland in modulation of water-immersion restraint stress-induced gastric mucosal lesions in rats. J. Pineal Res. 30:82–86. Ouichou, A., y P., Pévet (1992) Implication of tryptophan in the stimulatory effect of delta-sleep inducing peptide on indole seretion from perifused rat pineal glands Bio. Signals 1: 78-87. Ouyang, M. y H. J., Vogel (1998) Melatonin and serotonin interactions with calmodulin: NMR, spectroscopic and biochemical studies. Biochem. Biophys. Acta 1383: 37-47. Okamura, H., Yamaguchi, S., K., Yaguita (2002) Molecular machinery of the cricadian clock in mammals. Cell Tissue Res. 309: 47-56. Oakley, T.H. y R.B., Phillips (1999) Phylogeny of salmonine fishes based on growth hormone introns: Atlantic (Salmo) and Pacific (Oncorhynchus) salmon are not sister taxa. Mol. Phyl. Evol. 11: 381–393. Pan, X., y M., Hussain (2009) Clock is important for food and circadian regulation of macronutrient absorption in mice. J. Lipid Res. 50(9): 1800–1813. Pando, M.P., y P., Sassone-Corsi (2002) Unraveling the mechanisms of the vertebrate circadian clock: zebrafish may light the way. Bioessays. 24(5):419-426. Pardridge, W. M. (1977) Kinetics of competitive inhibition of neutral amino acid transport across the blood brain barrier. J. Neurochem., 28: 103-108. Pardridge, W. M. y L. J., Mietus (1980) Transport of albumin bound of seawater in flounder: role of active sodium transport. Am. J. Physiol. 245: 1761-1763 Park, Y.J., Park, J.G., Kim, S.J., Lee, Y.D., Saydur Rahman, M., A., Takemura (2006) Melatonin receptor of a reef fish with lunar-related rhythmicity: cloning and daily variations. J. Pineal Res. 41:166-174. Park, Y-J., Park, J.G., Hiyakawa, N., Lee, Y.D., Kim, S.J., A., Takemura (2007a) Diurnal and circadian regulation of a melatonin receptor, MT1, in the golden rabbitfish, Siganus guttatus. Gen. Comp. Endocrinol., 150: 253-262. Park. Y-J., Park, J-G., Jeong, H-B., Takeuchi, Y., Kim, S-J., Lee, Y-D. y A., Takemura (2007b) Expression of the melatonin receptor Mel1c in neural tissues of the reef fish Siganus guttatus. Comp. Biochem. and Physiol. 147: 103-111. Paz-Valiñas, L. (2009) Estudio de las relaciones metabólicas y funcionales entre serotonina y melatonina en la glándula pineal de mamíferos. aplicación de técnicas de microdiálisis in vivo. Tesis, Doctoral Universidad Santiago de Compostela. 252 pp. 240 Bibliografía Parmelee, J.T. y J.L., Renfro (1983) Esophageal desalination of seawater in flounder: role of active sodium transport. Am. J. Physiol. 245: R888-R893. Peitsaro, N., Anichtchik, O. V., y P., Panula (2000) Identification of a histamine H(3)-like receptor in the zebrafish (Danio rerio) brain. J. Neurochem. 75: 718–724. Pentney, P. T. y G. A., Bubenik (1995) Melatonin reduce the severity of dextran-induced colitis in mice. J. Pineal Res. 19: 31-39. Petterson, G., Ahlman, H., Bhargava, H. N., Dahlstrom, A., Kewenter, J., Larsson, I., J. K., Siepler (1979) The effect of propranolol on the serotonin concentration in the portal plasma after vagal nerve stimulation in the cat. Acta Physiol. Scand., 107: 327-331. Pévet, P. (1998) Melatonin and biological rhythms. Therapie 53:411-420. Pévet, P. (2003) Melatonin: from seasonal to circadian signal. J. Neuroendocrinol. 15:422-426. Pévet, P., Agez, L., Bothorel, B., Saboureau, M., Gauer, F., Laurent, V., y M. Masson-Pévet (2006) Melatonin in the multi-oscillatory mammalian circadian world, Chronobiol. Int. 23: 39–51. Phillips, R.B., Pleyte, K.A.E. y M.B., Brown (1992) Salmonid restriction maps. Can. J. Fish Aquat. Sci. 9: 2345-2353. Pickard, G.E., y F.W., Turek (1983) The suprachiasmatic nuclei: two circadian clocks?. Brain Res. 268: 201-210. Pinillos, M.L., De Pedro, N., Alonso-Gómez, A.L., Alonso-Bedate, M., M.J., Delgado (2001) Food intake inhibition by melatonin in goldfish (Carassius auratus). Physiol. Behav. 72:629634. Plaza, M.A. (2001) 5-Hydroxytryptamine and the gastrointestinal migrating motor complex. Curr. Opin. Investig. Drugs 2: 539–544 Polak, J. M., Heitz, P., A. G. E., Pearse (1976) Differential localization of substance P and motilina. Scand. J. Gastroenterol., Suppl. 39: 39-42. Pontoire, C., Bernard, M., Silvain, C., Collin, J.P., P., Voisin (1993) Characterization of melatonin binding sites in chicken and human intestines. Eur. J. Pharmacol. 247:11-18. Poon, A.M.S., Mak, A.S.Y., H.T., Luk (1996) Melatonin and 2[125I]iodomelatonin binding sites in the human colon. Endocrine Res. 22:77–94. Poon, A.M.S., Chow, P.H., Mak, A.S.Y., S.F., Pang (1997) Autoradiographic localization of 2[125I]iodomelatonin binding sites in the gastrointestinal tract of mammals including humans and birds. J. Pineal Res. 23:5-14. 241 Bibliografía Popek, W., Breton, B., Piotrwski, W., Bieniarz, K., y P., Epler (1994) The role of the pineal gland in the control of a circadian pituitary gonadotropin release rhythmicity in mature female carp. Neuroendocrinology. 16: 183-193. Porter, M.J.R., Randall, C.F., Bromage, N.R. y J.E., Thorpe (1998) The role of melatonin and the pineal gland on development and smoltification of Atlantic salmon (Salmo salar) parr. Aquaculture. 168: 139-155. Poston,H.G., y G.L., Rumsey (1983) Factors affecting dietary requirement and deficiency signs of L-tryptophan in rainbow trout. J.Nutr. 113:2568–2577 Pozo, M.J., Camello, P.J., y G.M., Mawe (2004) Chemical mediators of gallbladder dysmotility. Curr Med Chem 11:1801–1812. Quastel, M.R., R., Rahamimoff (1965) Effect of melatonin on spontaneous contractions and response to 5-hidroxytryptamine of rat isolated duodenum. Br. J. Pharmacol. 24:455-461. Quay, W.B. (1967) Lack of day-night rhythm and effects of darkness in rat pineal content of Nacetyltransferase. Physiologist 10: 286. Quay, W.B., Y.H., Ma (1976) Demonstration of gastrointestinal Omethyltransferase.. IRCS. Med Sci. : Libr. Compend. 4:563-569. hydroxyindole- Racke, K., Schworer, H., H., Kilbinger (1988) Adrenergic stimulation of the release of 5hydroxytryptamine from the vascularly perfused ileum of the guinea-pig. Br. J. Pharmacol., 95: 923-931. Radaelli, G., Domeneghini, C., Arrighi, S., Castaldo, L., Lucini, C. y F., Mascarello (2001) Neurotransmitters, neuromodulators, and neurotrophin receptors in the gut of pantex, a hybrid sparid fish (Pagrus major x Dentex dentex). Localization in the enteric nervous and endocrine systems. Histol. Histopathol. 16: 845-853. Raikhlin, N. T. y I. M., Kvetnoy (1974) Lightening effect of the extract of human appendix mucosa on frog skin melanophores. Bull. Exp. Biol. Med. 8: 114-116. Raikhlin, N. T. y I. M., Kvetnoy (1976) melatonin and entorochromaffines cells. Acta Histochem. 55: 19-25. Raikhlin, N.T., Kvetnoy, I.M., Tolkachev, V.N. (1975) Melatonin may be synthesized in enterochromaffin cells. Nature 255:344-345. Raikhlin, N.T., Kvetnoy, I.M., Kadagidze, Z.G., y Sokolov, V. (1978) Immunomorphological studies on synthesis of melatonin in enterochromaffin cells, Acta Histochem. Cytochem. 11: 75–77. Ram, P.T., Dai, J., Yuan, L., Dong, C., Kiefer, T.L., Lai, L. y S.M., Hill (2002) Involvement of the mt1 melatonin receptor in human breast cancer. Cancer Letters 179: 141–150. 242 Bibliografía Randall, C.F., Porter, M.J.R., Bromage, N.R. y B., Davies (1995) Preliminary observations on the effects of melatonin implants and pinealectomy on the timing of reproduction in rainbow trout. En: Goetz, F. W. and Thomas, P. eds.. Proc. Fifth Int. Symp. Reprod. Biol. Fish. Austin, TX. pp. 196. Randall, D., Burggren, W., K., French (2002) Eckert: Animal Physiology (mechanisms and adaptations). 5ª Ed. W. H. Freeman, New York. Cap. 15 pp 683-724. Rapport, M. M., Green, A. A., I. H., Page (1948a) Partial purification of the vasoconstrictor in beef serum. J. Biol. Chem., 174: 735-741. Rapport, M. M., Green, A. A., I. H., Page (1948b) Serum vasoconstrictor (serotonin). IV. Isolation and characterization. J. Biol. Chem., 176: 1243-1251. Read, J. B. y G., Burnstock (1968) Fluorescent histochemical studies on the mucosa of the vertebrate gastrointestinal tract. Histochemie, 16: 324-332. Reed, B.L. (1968) The control of circadian pigment changes in the pencil fish: a proposed role of melatonin. Life Sci. 7: 961-973. Reite, O.B. (2005) The rodlet cells of teleostean fish: their potential role in host defence in relation to the role of mast cells/eosinophilic granule cells, Fish Shellfish Immunol. 19: 253–267. Reiter, R.J. (1991) Pineal melatonin: cell biology of its synthesis and of its physiological interactions. Endocr. Rev. 12: 151-180. Reiter, R.J. (1993) The melatonin rhythm: both a clock and a calendar. Experientia 49: 654-664. Reiter, R.J. (2003) Melatonin: clinical relevance. Best Practice & Research Clinical & Endocrinology & Metabolism, 17(2): 273–285. Reiter, R.J., Tan, D.X. (2003) Melatonin: A novel protective agent against oxidative injury of the ischemic/reperfused heart. Cardiovasc Res. 58: 10–9. Reiter, R.J., King, T.S., Steinlechner, S., Steger, R.W. y B.A., Richardson (1990) Tryptophan administration inhibits nocturnal N-acetyltrans-ferase activity and melatonin content in the rat pineal gland. Neuroendocrinology. 52: 291-296. Reiter, R.J., Tan, D-X., Mayo, J.C., Sainz, R.M., Leon J., Z., Czarnocki (2003) Melatonin as an antioxidant: biochemical mechanisms and pathophysiological implications in humans. Acta Biochim. Pol. 50:1129-1146. Reppert, S.M. (1997) Melatonin receptors: molecular biology of a new family of G proteincoupled receptors. J. Biol. Rhythms 12: 528-531. Reppert, S.M., Weaver, D.R., Cassone, V.M., Godson, C., L.F. JR., Kolakowski (1995) Melatonin receptors are for the birds: molecular analysis of two receptor subtypes differentially expressed in chick brain. Neuron 15:1003-1015. 243 Bibliografía Reyes-Vázquez, C., Naranjo-Rodríguez, E.B., García-Segoviano, J.A., Trujillo-Santana, J.T., B. Prieto-Gómez (1997) Apamin blocks the direct relaxant effect of melatonin on rat ileal smooth muscle. J. Pineal Res. 22:1-8. Ribelayga, C., Gauer, F., Pévet, P., y V., Simonneaux (1999) Photoneural regulation of rat pineal hydroxyindole-O-methyltransferase (HIOMT) messenger ribonucleic acid expression: an analysis of its complex relationship with HIOMT activity. Endocrinology 140: 1375-1384. Ribelayga, C., Pévet, P., y V., Simonneaux (2000) HIOMT drives the photoperiodic changes in the amplitude of the melatonin peak of the Siberian hamster. Am .J Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 278: 1339-1345. Rice J., Mayor, J., Tucker H.A., R.J., Bielski (1995) Effect of light therapy on salivary melatonin in seasonal affective disorder. Psychiatry Res. 56:221–226. Rich, A. (2009) A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the zebrafish. Neurogastroenterol. Motil. 21:225-228. Rich, A., Leddon, S.A., Hess, S.L., Gibbons, S.J., Miller, S., Xu, X., G., Farrugai (2007) Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative ICC. Devel. Dyn. 236:903-911. Richardson, N.E., y J.D., McCleave (1974) Locomotor activity rhythms of juvenile Atlantic salmon (Salmo salar) in various light conditions, Biol. Bull. mar. Biol. Lab., Woods Hole 147: 422–432. Rindi, G, Leiter, A.B., Kopin, A.S., Bordi, C., E., Solcia (2004) The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Ann. N Y. Acad. Sci. 1014:1–12. Rizzo, V., Porta, C., Moroni, M., Scoglio, E., R., Moratu (2002) Determination of free and total (free plus protein-bound) melatonin in plasma and cerebrospinal fluid by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. J. Chromatogr. B 774: 17-24. Rodríguez-Illamola, A., López Patiño, M.A., Soengas, J.L., Ceinos, R.M., J.M., Míguez (2011) Diurnal rhythms in hypothalamic/pituitary AVT synthesis and secretion in rainbow trout: Evidence for a circadian regulation. Gen. Comp. Endocrinol.170: 541-549 Roseboom, P.H., Coon, S.L., Baler, R., McCune, S.K., Weller, J.L. y D.C., Klein (1996) Melatonin synthesis: analysis of the more than 150-fold nocturnal increase in serotonin Nacetyltransferase mRNA in the rat pineal gland. Endocrinology 137: 3033-3044. Rozas, G., Rey, P., Andres, M. D., Rebolledo, E., M., Aldegunde (1990) Distribution of 5hydroxytryptamine and related compounds in various brain regions of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish Physiol. Biochem., 8: 501-506. Russo, S., Kema, I.P., Haavik, J., J., Korf (2004) Tryptophan dependency of brain serotonin is evolutionary conserved and of functional significance. En: The tryptophan link to psychopathology. Tesis dirigida por J. Korf, E. G. E. de Vries, J. A. den Boer. Hospital Universitario de Groninger (Paises Bajos), pp.: 111-132. 244 Bibliografía Rust, M. B. (2002) Nutritional physiology, in fish Nutrition, 3rd Edicion, Halver, J. E. y Hardy, R.W., (eds.), Academic Press, Amsterdam, pp.367-452. Rubio, V.C., Sánchez-Vázquez, J., J.A., Madrid (2004) Oral administration of melatonin reduces food intake and modifies macronutrient selection in European sea bass (Dicentrarchus labrax L.). J. Pineal Res. 37:42-47. Ruibal, C., Soengas, J. L., M., Aldegunde (2002) Brain serotonin and the control of food intake in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): effects of changes in plasma glucose levels. J. Comp. Physiol. A 188: 479-484. Saito, D., Shi, Q., Ando, H. y A., Urano (2004) Attenuation of diurnal rhythms in plasma levels of melatonin and cortisol, and hypothalamic contents of vasotocin and isotocin mRNAs in prespawning chum salmon. Gen Comp Endocrinol. 15,137(1): 62-68. Sallinen, P., Saarela, S., Ilves, M., Vakkuri, O., J., Leppaluoto (2005) The expression of MT1 and MT2 melatonin receptor mRNA in several rat tissues. Life Sci. 76: 1123-1134. Sánchez-Vázquez ,F.J., Madrid, J.A. y S., Zamora (1995) Circadian rhythms of feeding activity in sea bass, Dicentrarchus labrax L.: dual phasing capacity of diel demand-feeding pattern. J. Biol. Rhythms 10: 256-66. Sánchez-Vázquez, F.J., Madrid, J.A., Zamora, S., Iigo, M., M., Tabata (1996) Demand feeding and locomotor circadian rhythms in the goldfish, Carassius auratus: dual and independent phasing. Physiol. Behav. 60:665-674. Sánchez-Vázquez, F. J., Iigo, M., Madrid, J. A. y M., Tabata (2000) Pinealectomy does not affect the entrainment to light nor the generation of the circadian demand-feeding rhythms of rainbow trout. Physiol. Behav. 69: 455-461. Sanders, K.M., Koh, S.D., S.M., Ward (2006) Interstitial cells of Cajal as pacemakers in the gastrointestinal tract. Annu. Rev. Physiol. 68:307-343. Sanger, G.J. (2008) 5-Hydroxytryptamine and the gastrointestinal tract: Where next? Trends Pharmacol Res 29: 465–471. Sarr, M.G., Cullen, J.J., Otterson, M.F. (2001) Gastrointestinal motility. En: Surgical research. (Ed.: W.W. Souba, D.W. Wilmore). Academic Press, London. Cap. 40 pp 507-569. Sastre-Toraño, J., Rijn-Bikker, Van, Merkus, P., H.J., Guchelaar (2000) Quantitative determination of melatonin in human plasma and cerebrospinal fluid with high-performance liquid chromatography and fluorescence detection. Biomed. Chromatogr. :14 306-310. Satake, N., Shibata, S., Takagi, T. (1986) The inhibitory action of melatonin on the contractile response to 5-hydroxytryptamine in various isolated vascular smooth muscles. Gen. Pharmacol. 17:553–558. 245 Bibliografía Sauzet, S., Besseau, L., Herrera Pérez, P., Covès, D., Chatain, B., Peyric, E., Boeuf, G., MuñozCueto, J.A., J., Falcón (2008) Cloning and retinal expression of melatonin receptors in the European sea bass, Dicentrarchus labrax. Gen. Comp. Endocrinol. 157:186-195. Scher, J., Wankiewicz, E., Brown, G.M., H., Fujieda (2002) MT1 Melatonin receptor in the human retina: expression and localization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43:889-897. Schworer, H., Racke, K., H., Kilbinger (1987) Spontaneous release of endogenous 5hydroxytryptamine and 5-hydroxyindoleacetic acid from the isolated vascularly perfused ileum of the guinea-pig. Neuroscience, 21: 297-303. Schworer, H., Racke, K., H., Kilbinger (1989) GABA receptors are involved in the modulation of the release of 5-hydroxytryptamine from the vascularly perfused small intestine of the guineapig. Eur. J. Pharmacol., 165:29-37. Seo, J.S., Kim, M.S., Park, E.M., Ahn, S.J., Kim, N.Y., Jung, S.H., Kim, J.W., Lee, H.H., J.K., Chung (2009) Cloning and characterization of muscarinic receptor genes from the nile tilapia (Oreochromis niloticus). Mol. Cells 27:383-390. Senatori, O., Pierucci, F., Parvez, S. H., Scopelliti, R., A., Nicotra (2003) Monoamine oxidase in teleosts. Biogenic Amines 17: 199-213. Sewerynek, E., Reiter, R.J., Melchiorri, D., Ortiz, G.G. y A., Lewinski (1996) Oxidative damage in the liver induced by ischemia-reperfusion: protection by melatonin. HepatoGastroenterology 43: 898–905 Sharp, T., Bramwell, S.R., D.G., Grahame-Smith (1992) Effect of acute administration of Ltryptophan on the release of 5-HT in rat hip-pocampus in relation to serotoninergic neuronal activity: an in vivo microdialysis study. Life Sci. 50:1215–1223. Simon, C. y J.P., Ternaux (1990) Regulation of serotonin release from the enterochromaffin cells of rat cecum mucosa. J. Pharmacol. Exp. Ther. 253: 825-832. Sjoblom, M., Flemstrom, G. (2001) Central nervous stimuli increase duodenal bicarbonate secretion by release of mucosal melatonin. J. Clin. Invest. 108: 625-633. Sjoblom, M., Flemstrom, G. (2003) Melatonin in the duodenal lumen is a potent stimulant of mucosal bicarbonate secretion. J. Pineal Res. 34:288-293. Slominski, A., Tobin, D.J., Zmijewski, M.A., Wortsman, J., R., Paus (2008) Melatonin in the skin: synthesis, metabolism and functions. Trends Endocrinol. Metab. 19:17- 24. Smit, H. (1968) Gastric secretion in the lower vertebrates and birds. In: C.F. Code, Editor, Handbook of Physiology, sect 6: Alimentary canal, volume V: Bile, digestion, ruminal physiology. Am. Physiol. Soc. 2791–2805. Smith, L.S. (1980) Digestion in teleost fishes. En: Fish feed technologies Ed. FAO/UNDP www.fao.org Cap. 1 pp 2-20. 246 Bibliografía Smith, L. S. (1989) En ―Fish Nutrition,‖ 2nd ed. (J. H. Halver, ed.), p. 332. Academic Press, San Diego, CA. Smith, G.R. y R. F., Stearley (1989) The classification and scientific names of rainbow and cutthroat trouts. Fisheries 14: 4-10. Smith, N.F., Eddy, F.B., Struthers, A.D. y C., Talbot (1991) Renin, atrial natriuretic peptide and blood plasma ions in parr and smolts of Atlantic salmon, Salmo salar L., and rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), in fresh water and after short-term exposure to sea water. J. Exp. Biol. 157: 63-74. Smith, B.M., Thomsen, W.J., y A.J., Grottick (2006) The potential use of selective 5-HT2C agonists in treating obesity. Expert Opin Investig Drugs 15:257–266. Snyder, S. H. y J., Axelrod (1965) Circadian rhythm in pineal serotonin: Effect of monoamine oxidase inhibition and reserpine. Sciencie 149: 542-544. Soengas, J. L., Strong, E. F. y M. D., Andrés (1998) Glucose, lactate, and β-hydroxybutyrate utilization by rainbow trout brain: changes during food deprivation. Physiol. Zool. 71: 285293. Spieler, R.E. (1992) Feeding-entrained circadian rhythms in fishes. En: Rhythms in Fishes. M.A. Ali, (ed.). Plenum New York. pp. 137-147. Stankov, B. y F., Fraschini (1993) High-affinity melatonin binding-sites in the vertebrate brain. Neuro Endocrinology Lett. 15: 149-164. Stebelová, K., Zeman, M., Cornélissen, G., Bubenik, G., Jozsa, R., Hardeland, R., Poeggeler, B., Huether, G., Olah, A., Nagy, G., Csernus, V., Kazsaki, J., Pan, W., Otsuka, K., Bakken, E.E., y F., Halberg (2005) Chronomics reveal and quantify circadian rhythmic melatonin in duodenum of rats. Biomed. Pharmacother. 59: 209–212. Stebelová, K., Anttila, K., Mänttäri, S., Saarela, S., M., Zeman (2010) Immunohistochemical definition of MT2 receptors and melatonin in the gastrointestinal tissues of rat. Acta Histochem. 112:26-33. Stenfors C. y S.B., Ross (2002) Evidence for involvement of protein kinases in the regulation of serotonin synthesis and turnover in the mouse brain in vivo, J. Neural Transm. 109: 1353– 1363. Stefulj, J., Hörtner, M., Ghosh, M., Schauenstein, K., Rinner, I., Wölfler, A., Semmler, J., P.M., Liebmann (2001) Gene expression of the key enzymes of melatonin synthesis in extrapineal tissues of the rat. J. Pineal Res. 30: 243-247. Stevens, C. E. y I. D., Hume (1995) Comparative physiology of the vertebrate digestive system. 2nd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, united Kingdom. 400p. Stokkan, K.A., Yamazaki, S., Tei, H., Sakaki, Y., M., Menaker (2001) Entrainment of the circadian clock in the liver by feeding. Science 291:490-493. 247 Bibliografía Storch, K.F., Weitz, C.J. (2009) Daily rhythms of food-anticipatory behavioural activity do not require the known circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:6808-6813. Storr, M., Schusdziarra, V., , H.D., Allescher (2000) Inhibition of small conductance K+-channels attenuated melatonin-induced relaxation of serotonin-contracted rat gastric fundus. Can. J. Physiol. Pharmacol. 78:799-806. Sugden, D. (1979) Circadian change in rat pineal tryptophan content: lack of correlation with serum tryptophan. J. Neurochem. 40: 1647-1653. Sugden, D. y D.C., Klein (1983) Adrenergic stimulation of rat pineal hydroxyindole-Omethyltransferase. Brain Res. 265: 348-351. Tabata, M. y H., Meissl (1993) Effect of temperature on ganglion cell activity in the photoreceptive pineal organ of rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Comp. Biochem. Physiol. 105: 449-452. Takeda, M., y K., Takii (1992) In ―Fish Chemoreception‖ (T. J. Hara, ed.). Chapman & Hall, London. p. 271 Tan, D.X., Chen, L.D., Poeggeler, B., Manchester, L.C. y R.J., Reiter (1993) Melatonin: a potent endogenous hydroxyl radical scavenger. Endocrine J. 1: 57–60. Tan, D.X., Manchester, L.C., Reiter, R.J., Qi, W., Hanes, M., N.J., Farley (1999) High physiological levels of melatonin in the bile of mammals. Life Sci. 65:2523-2529. Taylor, J.F., Migaud, H., Porter, M.J.R., N.R., Bromage (2005) Photoperiod influences growth rate and plasma insulin-like growth factor-I levels in juvenile rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Gen. Comp. Endocrinol. 142:169–185 Ternaux, J. P., Gonella, J., Legay, C., Faudon, M., Barrit, M. C., F., Mery (1981) 5-HT metabolism in the intestinal wall of the rabit. J. Physiol. (Paris), 77: 319-326. Teshima, S. I., Ishikawa, M., Koshio, S., Yunoki, M., Kanazawa, A., y S., Hayashida (1999) Metabolism of ursodeoxycholic acid in the Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) and the yellowtail (Seriola quinqueradiata) Aquaculture 179: 365. Thorré, K., Sarre, S., Twahirwa, E., Meeusen, R., Ebinger, G., Haemers, A. y Y., Michotte (1996) Effect of L-tryptophan, L-5-hydroxytryptophan and L-tryptophan prodrugs on the extracellular levels of 5-HT and 5-HIAA in the hippocampus of the rat using microdialysis. Eur. J. Pharm. Sci. 4: 247-256 Tijmes, M., Pedraza, R., L., Valladares (1996) Melatonin in the rat testis: evidence for local synthesis. Steroids 61:65-68. Tison, F., Normand, E., Jaber, M., Aubert, I., B., Bloch (1991) Aromatic L-aminoacid decarboxylase (DOPA decarboxylase) gene expression in dopaminergic and serotonergic cells of the rat brain stem. Neurosci. Lett. 127: 203-206. 248 Bibliografía Tonini, M. (2005) 5-hydroxytryptamine effects in the gut: the 3, 4, and 7 receptors. Neurogastroenterol. Motil. 17:637-642. Tucker, J. W., Jr., Lellis, W. A., Vermeer, G. K., Roberts, D. E., Jr., y P. N., Woodward (1997) The effects of experimental starter diets with different levels of soybean or menhaden oil on red drum (Sciaenops ocellatus) Aquaculture 149: 323. Twarog, B. M. y I. H. Page (1953) Serotonin content of some mammalian tissues and urine and a method for its determination. Am. J. Physiol., 175: 157-161. Tyce, G. M. (1985) Biochemistry of serotonin. En: Serotonin and the cardiovascular sytem. Editado por P. M. Vanhoutte. Raven Press (New York, USA), pp.: 1-14. Tyce, G. M. (1990) Origin and metabolism of serotonin. J. Cardio. Pharmacol. 16 (Suppl. 3): S1S7. Tyce, G.M., Flock, E.V., y C.A. Jr., Owen (1968) Uptake and metabolism of 5-hydroxytryptamine by the isolated perfused rat liver. Am J Physiol 215:611–619. Uchiyama, T., R., Chess-Williams (2004) Muscarinic receptor subtypes of the bladder and gastrointestinal tract. J. Smooth Muscle Res. 40:237-247. Underhay, J.R. y J.F., Burka (1997) Effects of pH on contractility of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) intestinal muscle in vitro. Fish Physiol. Biochem. 16: 233-246. Vakkuri, O., Rintamaki, H., J., Leppaluoto (1985) Plasma and tissue concentrations of melatonin after midnight light exposure and pinealectomy in the pigeon. J. Endocrinol. 105:263-268. Vakkuri, O., Rintamaki, H., J., Leppaluoto (1985) Presence of immunoreactive melatonin in different tissues of the pigeon. Gen. Comp. Endocrinol 58:69–75. Valenciano, A.I., Alonso-Gómez, A.L., Alonso-Bedate, M. y M.J., Delgado (1997) Effect of constant and fluctuating temperature on daily melatonin production by eyecups from Rana perezi. J. Comp. Physiol. B 167: 221-228. Vandermaelen, C. P. (1985) Serotonin. En: Neurotransmitter Actions in the Vertebrate Nervous System. Editado por M. A. Rogawski y J. L. Barker. Plenum Publishing Corporation (New York, USA), pp.: 201-239. Van`t Hof , T. J. y E., Gwinner (1999) Influence of pinealectomy and pineal stalk deflection on circadian gastrointestinal trac melatonin rhythms in Zebra fish (Taenioppygia guttata). J. Biol. Rhythms 14: 185-189. Van Nieuwenhoven, M.A., Valks, S.D., Sobczak, S., Riedel, W.J. y R.J., Brummer (2004) Acute tryptophan depletion slows gastric emptying in females. Br. J. Nutr. 91: 351–355. Vanecek, J. (1998) Cellular mechanism of the melatonin action. Physiol. Rev. 78: 687-721. 249 Bibliografía Vaughan, G.M. y R.J., Reiter (1986) Pineal dependence of the Syrian hamster‘s nocturnal serum melatonin surge. J. Pineal Res. 3: 9-14. Velarde, E. (2010) Tesis doctoral: Relojes periféricos en el tracto digestivo del carpin (Carassius auratus): síntesis circadiana de melatonina y su función en la motilidad intestinal. Universidad Complutense de Madrid, Madrid, 253pp. Velarde, E. , Haque, R. , Iuvone, P.M. , Azpeleta, C. , Alonso-Gomez, A.L. , M.J., Delgado (2009a) Circadian clock genes of goldfish, carassius auratus: CDNA cloning and rhythmic expression of period and cryptochrome transcripts in retina, liver, and gut. J. Biol. Rhythms . 24: 104-113 Velarde, E., Alonso-Gómez, A.L., Azpeleta, C., Isorna, E., M.J., Delgado (2009b) Melatonin attenuates the acetylcholine-induced contraction in isolated intestine of a teleost fish. J. Comp.Physio. B. 179: 951-959 Velarde, E. , Cerdá-Reverter, J.M. , Alonso-Gómez, A.L. , Sánchez, E. , Isorna, E. , M.J., Delgado (2010a) Melatonin-synthesizing enzymes in pineal, retina, liver, and gut of the goldfish (Carassius): MRNA expression pattern and regulation of daily rhythms by lighting conditions Chronobiology International. 27:1178-1201 Velarde, E., Delgado, M.J., A.L., Alonso-Gómez (2010b) Serotonin-induced contraction in isolated intestine from a teleost fish (Carassius auratus): Characterization and interactions with melatonin. Neurogastroenterology Motility. 22: 364-373 Velarde, E., Alonso-Gómez, A.L., Azpeleta, C., Isorna, E., De Pedro, N., Delgado, M.J. (2011) Melatonin effects on gut motility are independent of the relaxation mediated by the nitrergic system in the goldfish. Comp. Biochem. Physiol.A doi: 10.1016/j.cbpa.2011.01.024. Velasco Martín, A. (2001) Técnicas instrumentales in vitro. En: Compendio de farmacología general. Díaz de Santos, Madrid. Cap. 13 pp 287-297. Verbeuren, T. J. (1989) Synthesis, storage, release, and metabolism of 5-hydroxytryptamine in peripheral tissues. En: The Peripheral Actions of 5-Hydroxytryptamine. Editado por J. R. Fozard. Oxford Medical Publications, Oxford University Press (Oxford, UK), pp.: 1-25. Vieira, R., Míguez, J.M., Lema, M., M. Aldegunde (1992) Pineal and plasma melatonin as determined by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection Anal. Biochem. 205: 300-305. Vivien-Röels, B., Arendt, J. y J., Bradtke (1979) Circadian and circannual fluctuations of pineal indoleamines (serotonin and melatonin) in Testudo hermanni Gmelin (Reptilia, Chelonia). I. Under natural conditions of photoperiod and temperature. Gen. Comp. Endocrinol. 37: 197210. Von Bohlen und Halbach, O., y R., Dermietzel (2002) Neurotransmitters and Neuromodulators. Handbook of Receptors and Biological Effects, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 402p. 250 Bibliografía Vuilleumier, R., Boeuf, G., Fuentes, M., Gehring, W.J., J., Falcón (2007) Cloning and early expression pattern of two melatonin biosynthesis enzymes in the turbot (Scophthalmus maximus). Eur. J. Neurosci. 25:3047-3057. Walther, D. J., J. U., Peter, S., Bashammakh, H., Hortnagl, M., Voits, H., Fink, M., Bader (2003) Synthesis of serotonin by a second tryptophan hydroxylase isoform. Science. 299: 76. Walton, M. J., Coloso, R. M., Cowey, C. B., J.W., Adron (1984a) The effects of dietary tryptophan levels on growth and metabolism of rainbow trout (Salmo gairdneri). Br. J. Nutr. 51: 279-287. Walton, M. J., Cowey, C.B., J.W., Adron (1984b) Effect of biotin deficiency in rainbow trout (Salmo gairdneri) fed diets of different lipid and carbohydrate content. Aquaculture. 37: 2138. Watson, A. H. D. (1979) Fluorescence histochemistry of the teleost gut: evidence for the presence of serotoninergic neurones. Cell Tissue Res. 197: 155-164. Wang, Y., S.C., Mangel (1996) A circadian clock regulates rod and cone input to fish retinal cone horizontal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 4655-4660. Wang, Y., Takai, R., Yoshioka, H., K., Shirabe (2006) Characterization and expression of serotonin transporter genes in zebrafish. Tohoku J. Exp. Med. 208:267-274 Weissbach, H., Redfield, B. G. y Axelrod, J. (1960) Biosynthesis of melatonin: enzymatic conversion. En: McNeil, W.J. y Himsworth, D. C. (eds) Salmonid ecosystems of the North Pacific,. Corvallis: Oregon State University Press. pp. 313-320. Welker, H.A. y L., Vollrath (1984) The effects of a number of short-term exogenous stimuli on pineal serotonin N-acetyltransferase activity in rats, J. Neural Transm. 59: 69–80. Wiechmann, A.F., Vrieze, M.J. y Dighe, R., Y., Hu (2003) Direct modulation of rod photoreceptor responsiveness through a Mel(1c) melatonin receptor in transgenic Xenopus laevis retina. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 44: 4522-4531. Wikstrom, M.V. (1996) Melatonin, the pineal gland and circadian rhythms; an introduction. En: Melatonin on-line. Development of trans-pineal microdialysis and its application in pharmacological and chronobiological studies. pp. 3-52. Wilson, J.M., L.F.C., Castro (2011). Morphological diversity of the gastrointestinal tract in fishes. (2-55) En: The multifunctional gut of fish. Editors: Grosell M., Farrell A. P., Brauner C.J., Academic Press, London, 444pp. Winberg, S. y O., Lepage (1998) Elevation of brain 5-HT activity, POMC mRNA expression, and plasma cortisol in socially subordinate rainbow trout. Am. J. Physiol. 274: R645-R654. Winberg, S., Overli, O., O., Lepage (2001) Suppression of aggression in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) by dietary L-tryptophan. J. Exp. Biol. 204: 3867-3876. 251 Bibliografía Wingate, D.L. (1981) Backwards and forwards with the migrating complex. Dig. Dis. Sci. 26:641666. Whitmore, D., Foulkes, N.S., Strahle, U., P., Sassone-Corsi (1998) Zebrafish Clock rhythmic expression reveals independent peripheral circadian oscillators. Nat Neurosci. 1:701-707. Woollard, D. J., Bornstein, J. C., y J. B., Furness (1994) Characterization of 5-HT receptors mediating contraction and relaxation of the longitudinal muscle of guinea-pig distal colon in vitro. Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 349: 455–462. Wood, J.D., Alpers, D.H., P.L., Andrews (1999) Fundamentals of neurogastroenterology. Gut 45:6-16. Yaga, H., Reiter, R. J. y B. A., Richardson (1993) Tryptophan loading increase day time serum melatonin in intac and pinealectomized rats. Life Sci. 52: 1231-1238. Yamamoto, T. (1966) An electron microscope study of the columnar epithelial cell in the intestine of freshwater teleosts: goldfish (Carassius auratus) and rainbow trout (Salmo irideus), Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 72: 66–87. Yasutake, W. T. y J. H., Wales (1983) Microscopic anatomy of salmonids: an atlas.U.S. Fish and Wildlife Service Resource Publication 150, 190p. USFWS, Washington, DC. Young, J. Z. (1980) Nervous control of gut movements in Lophius. J. Mar. Biol. Assoc. UK. 60: 19–30. Young, S.N. y G.M., Anderson (1982) Factors influencing melatonin, 5-hydroxytryptophol, 5hydroxytryptamine and tryptophan in rat pineal gland. Neuroendocrinology 35: 464-468. Yoshino, M., Obata, T., Sho, S., H., Kinemuchi (1984) Enzymic and molecular characteristics of a new form of monoamine oxidase, distinct from form-A and form-B. Jpn. J. Pharmacol. 35: 105-115. Yu, P.L., Fujimura, M., Okumiya, K., Kinoshita, M., Hasegawa, H., y M., Fujimiya (1999) Immunohistochemical localization of tryptophan hydroxylase in the human and rat gastrointestinal tracts. J. Comp. Neurol. 411: 654–665. Yui, R., Nagata, Y., T., Fujita (1988) Immunocytochemical studies on the islet and the gut of the arctic lamprey, Lampetra japonica. Arch. Histol. Cytol. 51: 109-119. Zachmann, A., Knijff, S.C.M., Bolliet, V. y M.A., Ali (1991) Effects of temperature cycles and photoperiod in rhythmic melatonin secretion from the pineal organ of a teleost (Catostomus commersoni) in vitro. Neuroendocrinol. Lett. 13: 325-330. Zachmann, A., Knijff, S.C.M., Ali, M.A. y M., Anctil (1992) Effects of photoperiod and different intensities of light exposure on melatonin levels in the blood, pineal organ and retina of the brook trout (Salvelinus frontinalis Mitchill). Can. J. Zool. 70: 25-29. 252 Bibliografía Zilberman-Peled, B., Benhar, I., Coon, S.L., Ron, B., Y., Gothilf (2004) Duality of serotonin-Nacetyltransferase in the gilthead seabream (Sparus aurata): molecular cloning and characterization of recombinant enzymes. Gen. Comp. Endocrinol. 138:139-147. Zilberman-Peled, B., Ron, B., Gross, A., Finberg, J.P.M., Y., Gothilf (2006) A possible new role for fish retinal serotonin-N-acetyltransferase-1 (AANAT1): dopamine metabolism. Brain Res. 1073:220-228. Zvonic, S., Ptitsyn, A.A., Kilroy, G., Wu, X., Conrad, S.A., Scott, L.K., Guilak, F., Pelled, G., Gazit, D. y Gimble, J.M. (2007) Circadian oscillation of gene expression in murine calvarial bone. J. Bone. Miner. Res. 22:357–365. 253
