UNIVERSIDAD RAFAEL LANDÍVAR FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES Y AGRÍCOLAS LICENCIATURA EN CIENCIAS AGRÍCOLAS (PD) EFECTO DE LA FERTILIZACIÓN FOLIAR SOBRE LA OBTENCIÓN DE PLÁNTULAS DE CALAHUALA (Phlebodium pseudoaureum (Cav.) Lellinger) A PARTIR DEL CULTIVO DE ESPORAS TESIS DE GRADO ERVIN OCTAVIO PENSAMIENTO VARGAS CARNET61447-98 GUATEMALA DE LA ASUNCIÓN, OCTUBRE DE 2013 CAMPUS CENTRAL UNIVERSIDAD RAFAEL LANDÍVAR FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES Y AGRÍCOLAS LICENCIATURA EN CIENCIAS AGRÍCOLAS (PD) EFECTO DE LA FERTILIZACIÓN FOLIAR SOBRE LA OBTENCIÓN DE PLÁNTULAS DE CALAHUALA (Phlebodium pseudoaureum (Cav.) Lellinger) A PARTIR DEL CULTIVO DE ESPORAS TESIS DE GRADO TRABAJO PRESENTADO AL CONSEJO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES Y AGRÍCOLAS POR ERVIN OCTAVIO PENSAMIENTO VARGAS PREVIO A CONFERÍRSELE EL TÍTULO DE INGENIERO AGRÓNOMO EN EL GRADO ACADÉMICO DE LICENCIADO GUATEMALA DE LA ASUNCIÓN, OCTUBRE DE 2013 CAMPUS CENTRAL AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD RAFAEL LANDÍVAR RECTOR: P. ROLANDO ENRIQUE ALVARADO LÓPEZ, S. J. VICERRECTORA ACADÉMICA: DRA. MARTA LUCRECIA MÉNDEZ GONZÁLEZ DE PENEDO VICERRECTOR DE INVESTIGACIÓN Y PROYECCIÓN: DR. CARLOS RAFAEL CABARRÚS PELLECER, S. J. VICERRECTOR DE INTEGRACIÓN UNIVERSITARIA: DR. EDUARDO VALDÉS BARRÍA, S. J. VICERRECTOR ADMINISTRATIVO: LIC. ARIEL RIVERA IRÍAS SECRETARIA GENERAL: LIC. FABIOLA DE LA LUZ PADILLA BELTRANENA DE LORENZANA AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES Y AGRÍCOLAS DECANO: DR. ADOLFO OTTONIEL MONTERROSO RIVAS VICEDECANO: ING. MIGUEL EDUARDO GARCÍA TURNIL SECRETARIA: ING. REGINA CASTAÑEDA FUENTES DIRECTORA DE CARRERA: LIC. ANNA CRISTINA BAILEY HERNÁNDEZ NOMBRE DEL ASESOR DE TRABAJO DE GRADUACIÓN LIC. JOSÉ VICENTE MARTÍNEZ ARÉVALO TERNA QUE PRACTICÓ LA EVALUACIÓN MGTR. ADÁN OBISPO RODAS CIFUENTES MGTR. ERBERTO RAÚL ALFARO ORTIZ ING. MANUEL RODRIGO SALAZAR RECINOS AGRADECIMIENTOS A: DIOS: Nuestro Padre Celestial por darme la vida, por permitirme alcanzar una meta más, por darme sabiduría, fortaleza y ser siempre la luz que ilumina mi camino. Mi familia: Por estar allí, por su apoyo moral y espiritual, por su confianza en mí y por ayudarme a ver en cada reto, una oportunidad. Universidad Rafael Landívar: Facultad de Ciencias Ambientales y Agrícolas: Por brindarme sus puertas hacia el aprendizaje y convertirse en mi segunda casa. Ing. José Vicente Martínez Arévalo: Por el asesoramiento brindado para la realización del presente trabajo de graduación. Ing. Javier Francisco Vázquez Vázquez: Por brindarme su apoyo, amistad y acertada orientación para el desarrollo del presente trabajo de graduación. Ings. Adán Rodas, Raúl Alfaro, Rodrigo Salazar: Por formar parte del proceso de graduación, brindarme su apoyo y sobre todo su amistad. Todas aquellas personas, aunque no se nombren, que de alguna manera han contribuido con su cariño, trabajo y consejos para culminar esta meta. DEDICATORIA A: DIOS: Nuestro Padre Celestial por darme la vida, por permitirme alcanzar una meta más, por darme sabiduría, fortaleza y ser siempre la luz que ilumina mi camino. MIS PADRES: Edgar Octavio Pensamiento Balcárcel, Tania Magaly Vargas de Pensamiento. Por ser mi principal ejemplo de vida, porque gracias a sus sabios consejos y apoyo incondicional hoy cumplen uno de sus principales anhelos, después de tantas jornadas llenas de lucha, amor y esperanza. Los amo. MI ESPOSA: María del Carmen Barraza González. Porque Dios te puso en mi camino para compartir el resto de mi vida y ser la madre ejemplar de mis hijos. Gracias por tu apoyo incondicional para alcanzar este éxito. Te amo. MIS HIJOS: María Renee y Diego Emilio, porque han llenado mi vida de felicidad, espero que este esfuerzo sea un ejemplo para ustedes y por ser la fuente de energía que me mantiene luchando. Los quiero y los amo. MIS HERMANAS: Tania Sugheily, Jennipher Aymé, Shadya Dennisse y Josselyn Selenne. Gracias por su apoyo incondicional y por ayudarme en todo momento, compartiendo esta alegría al cumplir esta meta que deseábamos realizar. Las quiero. MIS TIOS: Gracias por brindarme su apoyo y cariño incondicional en todos los momentos de mi vida. Los quiero. MIS ABUELOS: En especial a Mateo Pensamiento “papa teo” (Q.E.P.D.) y Enma Margarita Balcárcel de Pensamiento “mama ema” (Q.E.P.D.) Que descansan en la presencia del señor, y nunca serán olvidados. Los llevo siempre en mi corazón. ÍNDICE GENERAL Página RESUMEN i SUMMARY ii I. INTRODUCCIÓN 1 II. MARCO TEÓRICO 3 2.1. GENERALIDADES DE LOS HELECHOS 3 2.2. LAS PLANTAS MEDICINALES 3 2.2.1 Plantas medicinales bajo cultivo 4 2.2.2 Generalidades de los principios activos de las plantas medicinales 5 2.3. EL CICLO VITAL DE UN HELECHO 6 2.4. HÁBITO, FORMA DE VIDA DE LOS HELECHOS 8 2.4.1 Terrestre 9 2.4.2 Epífitas 9 2.4.3 Acuático 10 2.5. CULTIVO DE HELECHOS 10 2.5.1 Propagación vegetativa 10 2.5.2 Rizoma aéreo 10 2.5.3 División 11 2.6. MICROPROPAGACIÓN DE LOS HELECHOS 11 2.6.1 Cultivo de esporas in vitro 11 2.6.2 Cultivo de brotes 13 2.7. CARACTERÍSTICAS DE LA CALAHUALA 14 2.7.1 Clasificación taxonómica 14 2.7.2 Descripción botánica de la calahuala 14 2.7.3 Distribución geográfica de la calahuala 15 2.7.4 Usos medicinales atribuidos a la calahuala 15 Página 2.7.5 Propiedades y aplicaciones 16 2.7.6 Usos y prácticas medicinales tradicionales y locales 16 2.7.7 Formas de uso 17 2.7.8 Química de la calahuala 17 2.7.9 Manejo 17 2.7.10 Producción 18 2.8 CONDICIONES CLIMÁTICAS PARA LA PROPAGACIÓN DE CALAHUALA 18 2.8.1 Luz 18 2.8.2 Fotoperíodo 18 2.8.3 Temperatura 19 2.8.4 Riego 19 2.8.5 Sustratos 19 2.8.6 Fertilización 20 2.8.7 Densidad de siembra 20 2.8.8 Plagas y enfermedades 20 2.9. PROPAGACIÓN DE LA CALAHUALA 22 2.9.1 Reproducción natural de la calahuala 22 2.9.2 Micropropagación de la calahuala 22 2.10. FERTILIZACIÓN FOLIAR III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 22 25 3.1. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN IV. OBJETIVOS 25 27 4.1. GENERAL 27 4.2. ESPECÍFICOS 27 V. HIPÓTESIS 28 Página VI. METODOLOGÍA 29 6.1. LOCALIZACIÓN DEL TRABAJO 29 6.2. MATERIAL EXPERIMENTAL 29 6.3. FACTORES ESTUDIADOS 30 6.3.1 Factores 30 6.3.2 Niveles 30 6.4. DESCRIPCIÓN DE LOS TRATAMIENTOS 32 6.5. DISEÑO EXPERIMENTAL 33 6.6. MODELO ESTADÍSTICO 33 6.7. UNIDAD EXPERIMENTAL 33 6.8. CROQUIS DE CAMPO 34 6.9. MANEJO DEL EXPERIMENTO 35 6.9.1 Recolección de esporas 35 6.9.2 Preparación del medio de siembra 36 6.9.3 Siembra de esporas 37 6.9.4 Germinación de esporas 38 6.9.5 Transplante de esporas germinadas 39 6.9.6 Separación de plantas 40 6.9.7 Transplante final de plantas 41 6.10. VARIABLES RESPUESTAS 41 6.10.1 Porcentaje de germinación de prótalos (%) 41 6.10.2 Población de esporofitos por unidad de área (4 cm²) 42 6.10.3 Biomasa (g) 42 6.10.4 Altura de esporofitos (cm) 42 6.11. ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN 42 6.11.1 Análisis estadístico 42 VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7.1. VARIABLE PORCENTAJE DE GERMINACIÓN DE PRÓTALOS (%) 43 43 43 Página 7.2. VARIABLE POBLACIÓN DE ESPOROFITOS POR UNIDAD DE ÁREA (4 cm²) 46 46 7.3. VARIABLE BIOMASA (g) 50 7.4. VARIABLE ALTURA DE ESPOROFITOS (cm) 55 VIII. CONCLUSIONES 61 IX. RECOMENDACIONES 62 X. BIBLIOGRAFÍA 63 XI. ANEXOS 65 ÍNDICE DE CUADROS Cuadro No. Página Cuadro 1. Principales plagas y enfermedades para los helechos. 21 Cuadro 2. Contenido de macronutrientes en porcentaje, de los fertilizantes foliares evaluados. 31 Cuadro 3. Contenido de micronutrientes en porcentaje, de los fertilizantes foliares evaluados. 31 Cuadro 4. Tratamientos evaluados. 32 Cuadro 5. Tiempo de cada fase de la investigación. 41 Cuadro 6. Resultados obtenidos para la variable porcentaje de germinación de prótalos, en la investigación en campo. 43 Cuadro 7. Datos transformados, para la variable porcentaje de germinación de prótalos. 44 Cuadro 8. Resultados del análisis de varianza, para la variable porcentaje de germinación de prótalos. 44 Cuadro 9. Resultados obtenidos para la variable población de esporofitos en 4 cm² en la investigación en campo. 46 Cuadro 10. Resultados del análisis de varianza, para la variable población de esporofitos por unidad de área. 47 Cuadro 11. Prueba múltiple de medias de Tukey al 5% de significancia, para tipo de fertilizante, según la variable población de esporofitos por unidad de área. 47 Página Cuadro 12. Prueba múltiple de medias de Tukey al 5% de significancia, para tipo y dosis de fertilizante, según la variable población de esporofitos por unidad de área. 49 Cuadro 13. Resultados obtenidos para la variable biomasa, en la investigación en campo. 51 Cuadro 14. Resultados del análisis de varianza, para la variable biomasa. 51 Cuadro 15. Prueba múltiple de medias de Tukey al 5% de significancia, para tipo de fertilizante, según la variable cantidad de biomasa. 52 Cuadro 16. Prueba múltiple de medias de Tukey al 5% de significancia, para dosis de fertilizantes, según la variable biomasa. 53 Cuadro 17. Resultados obtenidos para la variable altura de esporofitos (cm), en la investigación en campo. 55 Cuadro 18. Resultados del análisis de varianza, para la variable altura de esporofitos. 56 Cuadro 19. Prueba múltiple de medias de Tukey al 5% de significancia, para tipo de fertilizante, según la variable altura de esporofitos. 56 Cuadro 20. Prueba múltiple de medias de Tukey al 5% de significancia, para dosis de fertilizantes, según la variable altura de esporofitos. 57 Cuadro 21. Prueba múltiple de medias de Tukey al 5% de significancia, para las combinaciones tipo y dosis, según la variable altura de esporofitos. 59 ÍNDICE DE FIGURAS Figura No. Página Figura 1. Ciclo general de los helechos. Figura 2. Material vegetal recolectado en el umbráculo. 29 Figura 3. Unidad experimental consistente en la mitad de una bandeja tipo jumbo. 33 Distribución de los tratamientos con sus respectivas unidades experimentales. 34 Recolección de esporas obtenidas de las frondas de calahuala. 35 Figura 6. Preparación del medio de siembra. 36 Figura 7. Siembra de esporas. 37 Figura 8. Germinación de esporas. 38 Figura 9. Rosetas de esporas germinadas. 39 Figura 10. Rosetas de esporas separadas. 40 Figura 11. Porcentaje de germinación de prótalos, de los tratamientos evaluados en la investigación. 45 Tipos de fertilizantes evaluados, para la variable población por unidad de área. 48 Combinaciones de fertilizante evaluadas, para la variable población por unidad de área. 50 Figura 4. Figura 5. Figura 12. Figura 13. 8 Página Figura 14. Tipos de fertilizantes evaluados, para la variable biomasa. 53 Figura 15. Dosis de fertilizante evaluadas, para la variable biomasa. 54 Figura 16. Tipos de fertilizantes evaluados, para la variable altura de esporofitos. 57 Diferentes dosis de fertilizantes evaluados, para la variable altura de esporofitos. 58 Combinaciones de fertilizante evaluadas, para la variable altura de esporofitos. 60 Figura 17. Figura 18. EFECTO DE LA FERTILIZACIÓN FOLIAR SOBRE LA OBTENCIÓN DE PLÁNTULAS DE CALAHUALA Phlebodium pseudoaureum (Cav.) Lellinger A PARTIR DEL CULTIVO DE ESPORAS. RESUMEN El objetivo del estudio fue generar información del efecto de la fertilización foliar, que sirva para enriquecer la elaboración de un protocolo para la propagación de calahuala, Phlebodium pseudoaureum (Cav.) Lellinger, a partir del cultivo de esporas. La investigación se realizó en la granja Villa Lobos, ubicada en el kilometro 13.5 carretera al pacífico, Villa Nueva, Guatemala. Se evaluaron tres tipos de fertilizantes foliares, tres dosis y combinaciones de los mismos en la presente investigación. Se utilizó el diseño completamente al azar con un arreglo combinatorio, con nueve tratamientos y cuatro repeticiones. Las variables respuesta fueron: porcentaje de germinación de prótalos, población de esporofitos por unidad de área, biomasa y altura de esporofitos. Los resultados obtenidos mostraron que la aplicación de Bayfolán forte con una dosis de 2 ml/L presentó la mayor población de esporofitos por unidad de área. La aplicación de Aminoleaf con una dosis de 2 g/L fue la que mejores resultados presentó, con un valor de 0.51g para la variable biomasa. La combinación de fertilizante Bayfolán forte con una dosis de 3 ml/L fue la que mejores resultados presentó, con un valor de 1.89 cm para la variable altura de esporofitos. i EFFECT OF THE FOLIAR FERTILIZATION TO OBTAIN FALSE GOLDEN POLYPODY Phlebodium pseudoaureum (Cav.) Lellinger SEEDLINGS FROM THE PRODUCTION OF SPORES SUMMARY The objective of this study was to generate information on the effect of foliar fertilization that helps strengthening the drafting of a protocol for the propagation of false golden polypody, Phlebodium pseudoaureum (Cav.) Lellinger, from the production of spores. The research was carried out in Villa Lobos farm, located at kilometro 13.5 carretera al pacífico, Villa Nueva, Guatemala. Three types of leaf fertilizers were evaluated, as well as three doses of each one. A completely randomized design in a combined arrangement (3x3) with nine treatments and four replicates was used. The response variables were: percentage of prothallus germination, population of sporophytes per area unit, biomass, and sporophyte height. The results obtained showed that the application of Bayfolán Forte at a dose of 2 ml/L showed the highest sporophyte population per area unit. The application of Aminoleaf at a dose of 2 g/L showed the best results, with a value of 0.51g for the biomass variable. The combination of Bayfolán Forte fertilizer at a dose of 3 ml/L showed the best results, with a value of 1.89 cm for the sporophyte height variable. ii I. INTRODUCCIÓN La calahuala, Phlebodium pseudoaureum (Cav.) Lellinger, es un helecho epífito con rizoma rastrero y sinuoso, nativo de Centro América. En forma silvestre crece en troncos de palmas, broza o árboles de encino y roca caliza desintegrada, y en lugares de gran humedad a la sombra. Pertenece a la familia Polipodiacea, género Phlebodium, algunas sinonimias son Phlebodium aureum, P. calahuala L., P. aereolatum H&B, P. decumanum Willd., P. leucotomos; se le conoce popularmente como calahuala, polipodio (Cáceres, 1996). Se encuentra desde México hasta América del Sur, en alturas de 1,200-2,200 msnm. En Guatemala se reporta en Alta y Baja Verapaz, Chimaltenango, Escuintla, Huehuetenango, Jalapa, Quetzaltenango, Suchitepéquez y Zacapa, aunque también se le ha encontrado en Guatemala, El Quiché, San Marcos y El Progreso. La planta es conocida en dichas regiones por sus propiedades medicinales. Toda la planta puede ser utilizada como materia médica, desde las hojas hasta el rizoma, estas materias deben ser de buena calidad en aspecto físico y químico para la fabricación de productos fitofarmacéuticos. El rizoma es utilizado para el tratamiento de afecciones intestinales (diarreas, dolor de estómago, estreñimiento, gastritis), respiratorias (asma, tos, tos ferina) y cardiacas, dolor de huesos, reumatismo, diabetes, gota, hipertensión, purificación de la sangre, parásitos, enfermedades venéreas como la sífilis y algunas afecciones renales (cálculos, hidropesía). También es utilizada para el tratamiento de dermatitis atópica, psoriasis y vitíligo; se le atribuyen propiedades para la cura de la enfermedad de Alzheimer y artritis reumatoide. Se ha demostrado actividad biológica que favorece la regeneración de tejidos afectados por las enfermedades mencionadas, por medio de la capacidad de incrementar el número de linfocitos; y una potente actividad inmunoreguladora para tratamiento de pacientes inmunodeprimidos como los del VIH y cáncer (Cáceres, 1996). 1 En cuanto al clima la calahuala se desarrolla bien bajo precipitaciones entre 1000-3000 mm/año y temperaturas cálidas que oscilen entre 15-30 °C, y una humedad relativa alta entre 70-85%. El análisis de los sustratos sobre los que crece la calahuala muestra un porcentaje de materia orgánica de 53-66%, con pH ácido a moderadamente ácido (3.95.3). Este tipo de sustrato es ideal para la siembra, sin embargo, provoca daño a los bosques, por lo que para iniciar un cultivo se recomienda hacer camas con una mezcla de los siguientes materiales: tierra fértil, aserrín de madera, arena blanca: en proporciones 2:2:1 respectivamente (Dorling, 1983). La forma de propagación del P. pseudoaureum es por medio de rizomas, la progenie o descendencia es genéticamente idéntica a las plantas madres. Este método es el más práctico, consiste en hacer cortes de rizoma, luego esterilizar el corte, inducir o esperar el enraizamiento producción. en un área de crecimiento y transplantar al lugar definitivo para La reproducción por esporas en medios de cultivo es otra forma de propagación; aquí la descendencia puede variar, este método además de llevar más trabajo requiere de un tiempo considerable para obtener una planta en producción (Rosales, 2005). En el presente trabajo se evaluarán tratamientos de fertilización foliar en la obtención de plántulas de calahuala, a partir del cultivo de esporas. 2 II. MARCO TEÓRICO 2.1 GENERALIDADES DE LOS HELECHOS Hay alrededor de unas 10,000 especies modernas de helechos, de los cuales la mayoría pertenece al orden Filicales (llamado también Polypodiales). Se encuentran en una amplia variedad de ecosistemas, pero la mayoría de ellos se localiza en partes sombreadas, en sitios bien húmedos y en climas tropicales o subtropicales (Cronquis, 1987). Los helechos se pueden reproducir en forma sexual o asexual por esporas o rizomas. Sobre el envés de las hojas se forman estructuras llamadas soros, compuestas por grupos de esporas resguardados dentro de esporangios y que forman el principal mecanismo de reproducción de estas especies en forma natural (Méndez, 2000). En función de su forma de nutrición los helechos son epífitos o sea que crecen adheridos a otra planta o sustrato sin tomar alimento de su hospedero, solo humedad. También se puede ver en la forma de alimentación de los helechos que el prótalo (estructura diminuta en comparación con el esporofito maduro), constituye una planta autotrófica independiente que inclusive sostiene al embrión del esporofito durante los primeros estadios del desarrollo (Méndez, 2000). 2.2 LAS PLANTAS MEDICINALES El hombre se ha beneficiado de las plantas medicinales desde la prehistoria y, hasta hace relativamente poco tiempo, eran el único recurso del que disponían los médicos. A principios del siglo XX la medicina dio un gran salto gracias al desarrollo de la química y al descubrimiento de complicados procesos de síntesis orgánica que dieron lugar a nuevos medicamentos capaces de luchar contra enfermedades hasta entonces incurables, principalmente infecciones. Sin embargo, siguieron obteniéndose de las 3 plantas medicinales valiosas sustancias que eran irremplazables; la medicina popular y los herbolarios, por su parte, mantenían viva esta tradición terapéutica que ha evolucionado aumentando el número de plantas medicinales conocidas y también sus aplicaciones (Campezo, 1999). Se ha comprobado un renacimiento del interés por las plantas medicinales, tanto por parte de investigadores, médicos y de la industria farmacéutica, como del público en general, deseoso de ampliar sus conocimientos acerca de este campo (Campezo, 1999). Los remedios a base de plantas reúnen ventajas frente a los químicos sintéticos, ya que sus principios activos están biológicamente equilibrados y en general, no se acumulan en el organismo ni tienen efectos indeseables, exceptuando las sustancias de las plantas venenosas. Pero no hay que olvidar que las sustancias naturales no son siempre apropiadas para todas las situaciones; es al médico a quien corresponde determinar el tratamiento de la enfermedad (Campezo, 1999). 2.2.1 Plantas medicinales bajo cultivo Durante algún tiempo se pensó que la planta cultivada pierde parte de sus principios activos y virtudes terapéuticas, lo cual es totalmente falso. Si seleccionamos el ecotipo o clon, y se implanta éste en el hábitat adecuado y se realizan los tratamientos culturales precisos, el rendimiento en principios activos y su calidad, es superior a la planta silvestre (Altertec, 1993). Las principales ventajas del cultivo son: evitar las mezclas y falsificaciones del material recolectado; se puede obtener una materia prima homogénea, abundante y de buena calidad; la recolección se facilita y en muchos casos puede mecanizarse; los agricultores pueden asociarse para montar viveros, adquirir herramienta especial y montar pequeñas industrias agrarias de primera transformación, secaderos y destilerías, en las inmediaciones, con lo que se reducen los gastos del cultivo y 4 transporte. Estos cultivos y pequeñas industrias fijan mano de obra rural y especializada: pero sobre todo es la única forma de seleccionar y mejorar el material vegetal implantado y cultivado (Altertec, 1993). La actual coyuntura socioeconómica y el acelerado aumento demográfico, obliga a los países a buscar nuevas fuentes de materias primas, para cubrir la demanda de las industrias farmacéuticas, alimentaria y perfumería, así como a investigar nuevos principios activos, sabores y aromas en el reino vegetal, base para la elaboración de nuevos fármacos, que exigen las necesidades médicas actuales, o para satisfacer las necesidades creadas por una sociedad de consumo, cada vez más refinada (Altertec, 1993). Para lograr estos objetivos, de carácter multidisciplinario, son precisos estudios coordinados con los diversos campos de la Botánica, Agronomía, Ingeniería Industrial, Fotoquímica, Farmacología, Dietética, etc., que acometen especialistas de los distintos países, partiendo de sus posibilidades y experiencia en los distintos campos (Altertec, 1993). 2.2.2 Generalidades de los principios activos de las plantas medicinales Los principios activos de las plantas medicinales se tratan de sustancias que la planta ha sintetizado y almacenado en el curso de su crecimiento con ayuda del metabolismo. Sin embargo, no todos estos productos metabólicos tienen un valor medicinal directamente aprovechable. En todas las especies están presentes al mismo tiempo principios activos. Estas últimas, llamadas también de lastre, determinan la eficacia del medicamento vegetal en cuestión, al acelerar o hacer más lenta la absorción de los primeros en el organismo. Esta es la primera de las peculiaridades de los medicamentos de origen vegetal (Altertec, 1993). 5 Casi siempre en una misma planta existen varios componentes medicinalmente activos, de los cuales uno de ellos, el principal, determina las aplicaciones que tendrá la especie en cuestión. Sin embargo, el grado en el que los componentes secundarios influyen sobre la acción queda puesto de manifiesto al aislar el principio activo principal. Es muy frecuente que su efecto sea entonces totalmente distinto. Solamente el concierto de todos los componentes, incluyéndose aquellos de lastre, confieren a la planta su acción específica, y esta es la segunda peculiaridad (Altertec, 1993). Los principios activos no se distribuyen de una manera uniforme por toda la planta. Se concentran preferentemente en las flores, las hojas o las raíces, y a veces en las semillas, en los frutos o en la corteza (Altertec, 1993). La tercera peculiaridad es la siguiente: el contenido en principios activos de una planta medicinal oscila, dependiendo del hábitat de la misma, de la recolección y de la preparación. Esto constituye una desventaja, pero puede evitarse en medida recolectando en la época más adecuada y preparándola con el máximo cuidado. Los ejemplares bien tratados, almacenados de modo correcto, apenas pierden principios activos en el proceso de secado. La mayoría de las plantas medicinales desarrollan plenamente su eficacia solo cuando se las emplea por periodos prolongados de tiempo (como por ejemplo una cura de 6 a 8 semanas) (Altertec, 1993). 2.3 EL CICLO VITAL DE UN HELECHO La planta del helecho representa la generación esporofito. La parte inferior de la fronda lleva a menudo áreas negruscas o de color café o anaranjado llamadas soros, los cuales son un conjunto de esporangios que sostienen las esporas haploides. Las células madres de las esporas sufren meiosis dentro del esporangio y producen las esporas (principio de la generación gametofita), las cuales pueden ser del mismo tipo (homosporas) o de dos tipos diferentes (heterosporas), hecho que depende de la especie (Martínez, Bernal y Cáceres, 2000). 6 Las diversas especies de helechos también difieren en la distribución, estructura y forma de soros y esporangios. En ciertos helechos cada soro está cubierto por una estructura llamada indusio. En algunos otros existen dos tipos de hojas; las que llevan los soros (o esporofilas) y las vegetativas que nunca producen esporas. Las esporas liberadas germinan en el medio húmedo y se desarrollan formando primero filamentos de células verdes con rizoides. Cada uno de estos filamentos forma un pequeño gametofito típico en forma de corazón, llamado prótalo, el cual es una lámina verde pluricelular. Posee rizoides, así como órganos sexuales femeninos y masculinos, colocados en la superficie inferior. El gametofito maduro tiene aproxidamente 0.5 cm de diámetro y lleva sus arquegonios, semejantes a los de las briofitas, cerca de la muesca, mientras que los anteridios están dispersos entre los rizoides (Martínez, Bernal y Cáceres, 2000). En ciertas especies los anteridios y arquegonios se encuentran en gametofitos distintos. Los espermatozoides multiciliados son liberados del anteridio, nadan hacia el prótalo y penetran el arquegonio, sucediéndose así en la fecundación. El cigoto o huevo resultante marca el principio de la generación esporofítica y es retenido dentro del arquegonio donde se desarrolla, formando primero un embrión y después un nuevo esporofito con raíces, tallos y hojas. Durante los primeros estados del desarrollo embrionario, hasta que aparecen las primeras raíces y hojas, este esporofito joven depende totalmente para su nutrición del diminuto gametofito (Martínez, Bernal y Cáceres, 2000). 7 En la figura 1 se presenta en forma resumida el ciclo sexual de los helechos en general. Figura 1. Ciclo general de los helechos. 2.4 HÁBITO, FORMA DE VIDA DE LOS HELECHOS Los pteridofitos exhiben un rango de hábitos y formas de vida, además existen en la mayoría de los tipos de hábitat exceptuando el ambiente marino. Los esporofitos en tamaño están entre unos milímetros a decenas de metros de alto y en peso de unos miligramos a muchas decenas de kilogramos. El hábito de los pteridofitos refleja el ambiente y substrato que ellos escogen para crecer, por lo tanto, conviene dividirlos en tres grandes clases: aquellos que crecen en la tierra, aquellos que crecen en árboles y aquellos que crecen en el agua (Hoshizaki, 1979). Sin embargo, debe notarse que una preferencia del habito/hábitat puede medirse por espacios entre estas clases. En particular, especies que viven bajo árboles, podrían clasificarse como epífitas, subepìfitas o terrestres, y plantas que crecen en los márgenes de cuerpos de agua podrían ser consideradas acuáticas (Hoshizaki, 1979). 8 Mientras esta división de la estructura global de una planta basada en donde crece podría parecer ideado y artificial, debe notarse que las familias mayores de pteridofitas son predominantemente terrestres, epífitas o acuáticas, demostrando una correlación significante de hábito, definida de esta manera con otros caracteres de su morfología. La estructura del tallo o rizoma tiene un impacto particular en el tipo de hábito, tallos rastreros determinan el espaciamiento entre las frondas (Hoshizaki, 1979). 2.4.1 Terrestre Los pteridofitos terrestres tienen tallos erectos o rastreros y las hojas se sostienen más derechas, verticales o extendidas y arqueadas. Los tallos erectos generalmente están sin agruparse, radiales con una o menos rosetas terminales de frondas, y puede ser robusto y leñoso (Osmunda, Todea), robusto y carnoso (Marattia, Angiopteris) o arborecente (Cyathea, Dicksonia, Leptopteris). Rizomas rastreros se han distanciado o alejado a las frondas, y el propio tallo puede echar ramas o tallos no agrupados, en la superficie de tierra o subterráneamente. Tales plantas pueden estar formando un bosquecillo (Gleicheniaceae), y las frondas de algunos con particularmente tallos largos (Lycopodium volubile), estípulas y raquis (Lygodium) puede ascender en las coronas de árboles pequeños. Varias especies se mantienen sobre piedras o en grietas de ellas, con sus raíces que entran en los espacios y atrapan los detritos y la suciedad. Su hábito es más a menudo más semejante a las epífitas que a otras especies terrestres (Hoshizaki, 1979). 2.4.2 Epífitas Los pteridofitos epífitos tienen sus rizomas adheridos por medio de sus raíces en las cortezas de los troncos o en las ramas de los árboles. Una distinción debe hacerse entre estos, las especies como Lygodium que tiene rizomas terrestres con frondas largas que suben en los árboles. Las epífitas pueden tener rizomas compactos, de cortos a largos y rastreros. Los tallos pueden empezar a crecer en el árbol o en la tierra, pero en todo caso se adhieren al árbol y no soportan las condiciones de la tierra. Las 9 frondas y tallos pueden ser derechos, arqueados o colgantes. Las frondas de algunas especies (Platycerium, Drynaria, Aglaomorpha y el nido de pájaro Asplenium) se adaptan para capturar detritos, principalmente en sus bases (Hoshizaki, 1979). 2.4.3 Subepifito Subepífitos viven debajo de troncos del árbol, generalmente entre el briofito deteriorando detritos. Ellos también pueden presentarse en la tierra y piedras musgosas (Hoshizaki 1979). 2.4.4 Acuático Varios helechos son verdaderamente acuáticos, un número mayor es subacuático o riofito (creciendo al lado y periódicamente inundados por arroyos). Los pteridofitos acuáticos pueden tener tallos compactos rastreros que pueden estar libres, flotando en el fondo de la superficie del agua (Azolla, Salvinnia), completamente sumergidos y enrraizados en el sedimento del fondo (Isoetes), arraizado y emergente (Marsilia) o una combinación de todos (Ceratopteris) (Hoshizaki 1979). 2.5 CULTIVO DE HELECHOS 2.5.1 Propagación vegetativa Esta se lleva a cabo por división de rizomas de helechos completamente desarrollados, asegurando la continuidad de las características deseables en plantas hijas, como la uniformidad y la continuidad (Hoshizaki, 1979). 2.5.2 Rizoma aéreo Este tipo de rizoma es típicamente epífito, que a menudo crece en grupos grandes. Las partes basales del hijo de los rizomas son rodeadas por un colchoncillo espeso de las 10 raíces, mientras la parte superior del rizoma hijo erecto crece expuesta al aire. A este grupo pertenecen algunas especies de Davalia (D. solida, D. pyxidata) y el Phlebodium decumanun (Jones, 1987). 2.5.3 División La división es uno de los medios más útiles de propagación de helechos en aquellos que se prestan para ello, y siendo un proceso no muy delicado puede llevarse a cabo con un mínimo de experiencia y equipo. La división probablemente es la técnica más frecuentemente usada y el método más eficaz de propagación vegetativa de helechos. El único equipo que se necesita es un cuchillo afilado o quizás una azada para los especímenes más grandes (Hoshizaki, 1979). En el proceso de división simplemente se toma un grupo conveniente de helechos y se dividen en dos o más partes que sean capaces de existir como plantas separadas. Un helecho conveniente es un grupo que tiene más de una joven fronda creciente, las cuales estén separadas por suficiente distancia para ser divididas. La división puede llevar parte del sustrato donde se encuentra, y si hay demasiadas raíces, es conveniente quitarlas para mantener un equilibrio con el sistema radical reducido de la división. En las heridas hechas durante la división se le puede frotar un poco de cal de jardín (Jones, 1987). 2.6 MICROPROPAGACIÓN DE LOS HELECHOS Actualmente algunos helechos es posible micropropagarlos por medio de cultivo de esporas y por cultivo de brotes. 2.6.1 Cultivo de esporas in vitro Las esporas de los helechos, que son bastante pequeñas, pueden ser esterilizadas y manejadas de la misma manera como las semillas de las orquídeas, pero como algunas son resistentes a la humedad es importante adherir una solución húmeda de hipoclorito, 11 luego sacudir bien el recipiente que contiene las esporas durante la esterilización (Tanchez, 2000). Las esporas asépticas de los helechos pueden ser germinadas in vitro, si son colocadas en un medio semi-sólido, conteniendo una baja concentración de sales, y si son convenientemente sembradas dentro de tubos de ensayo largos. La composición exacta del medio de soporte para la germinación de esporas en realidad no es tan complicada, puede o debe contener una relativa baja cantidad de concentración de iones. Algunos medios, que han sido usados con buenos resultados son medio Knudson (1946) con macronutrientes más micronutrientes, Steeves et al. (1955), el medio de Moore (1903) a mitad Freeberg and Wetmore, 1957 o a toda fuerza, y Miller y Miller 1961, el cual también puede ser improvisado por la adición de micronutrientes. Las sales de White (1954) medio que probablemente puede ser satisfactorio. La adición de vitaminas o reguladores de crecimiento puede ser no necesaria. Los azúcares probablemente no son requeridos para la germinación de esporas, pero el crecimiento de los gametofitos son más rápidos cuando están presentes los azúcares. Una baja concentración de glucosa o sucrosa (e.g. 2.5-20 g/l) es usualmente empleada (Méndez, 2000). Los cultivos son mantenidos en luz de baja irradiación. La óptima temperatura de incubación es variable de acuerdo al hábitat natural de las distintas especies de los helechos. Miller (1968), encontró que la germinación de algunas especies depende de la densidad a la cual las esporas fueron inoculadas dentro del medio. Cuando se establecen los medios de cultivo es aconsejable poner los tubos en el cual el número de esporas por unidad de área han variado (Méndez, 2000). Las esporas germinadas dan a crecer protalos no vasculares. Los esporofitos son usualmente producidos después en el mismo recipiente, pero no serán obtenidos en caso que no haya suficiente agua libre que permita el movimiento de los gametos masculinos. La fertilización puede ser asistida si una pequeña cantidad de agua esterilizada es introducida dentro de los recipientes de cultivo por medio de una jeringa en un estado apropiado del desarrollo del gametofito (Hoshizaki, 1979). 12 Aunque el tejido gametofito no produzca esporofitos en su forma normal, puede todavía ser usada para la micropropagación por medio de la apogamia y aposporia. En algunas circunstancias el tejido esporofito de los helechos puede producir gametofitos sin primero producir esporas. Esta circunstancia es llamada aposporia. Similarmente esporofitos algunas veces crecen del tejido gametofito sin que haya sucedido fertilización, lo que se llama apogamia. Estos eventos pueden ser rápidamente observados y manipulados durante el cultivo in vitro (Hoshizaki, 1979). 2.6.2 Cultivos de brotes Los esporofitos de algunos helechos pueden ser propagados en cultivo de brotes usando puntas o extremos de brotes, o las puntas de las yemas laterales de los estolones o rizomas, como explantes iniciales. El grado de contaminación de la superficie de los estolones o rizomas puede ser reducido creciendo plantas madres en canastas colgantes. El cultivo de brotes es puesto en paréntesis, porque frecuentemente la multiplicación de brotes no es enteramente por proliferación de brotes axilares. Hennen y Shehan (1978) reportaron que en Platycerium, la multiplicación de brotes ocurría por formación directa de yemas adventicias en la base de explantes originales y en raíces y frondas producidas in vitro. En Nephrolepsis exaltata, Loescher y Albrecht (1978) encontraron que el grado de formación directa de brotes adventicios en los rizomas de las puntas de los explantes, dependía del grado de concentración de sales en el medio MS, fue alta cuando la concentración de macronutrientes fue reducida a la mitad, y 2% de sucrosa fue adherida, pero solamente un pequeño número de brotes adventicios fueron producidos en el medio completo o el cual contenía 3 o 4% de sucrosa (Rosales, 2005). Rangos de multiplicación en cultivo de brotes son usualmente muy rápidos, y con los helechos de Boston es posible obtener 37,500 plantas de 100 estolones, puntas de explantes arriba de un periodo de 9 meses. La micropropagación con esta significancia 13 ha venido a ser el método más exitoso de multiplicación vegetativa para muchos helechos, la cual en consecuencia ha llegado a ser disponible como plantas de follaje (Costa Rica. 1999). 2.7 CARACTERÍSTICAS DE LA CALAHUALA 2.7.1 Clasificación taxonómica Reino: Plantae División: Polypodiophyta Clase: Polypodiopsida Familia: Polypodiaceae Género: Phlebodium Especie: Phlebodium psedoaureum (Cav.) Lellinger Nombres comunes: Calaguala, calahuala, polipodio. 2.7.2 Descripción botánica de la calahuala Rizomas Los rizomas son rastreros, de uno a dos centímetros de grosor, recubiertos densamente por escamas; las escamas son de forma linear-lanceoladas, delgadas, de color naranja a ferruginosas y traslúcidas de 0.5 a 1.5 centímetros de largo, con márgenes cortamente ciliados. Los rizomas presentan meristemos (brotes) que se diferencian para formar frondes, la distancia entre meristemos sobre el rizoma es de 1.5 a 2 centímetros (Cáceres, 1996). Frondes Los frondes se encuentran dispersos a lo largo de los rizomas; se presentan frondes fértiles (que presentan en el envés soros) y estériles (sin soros). Los frondes según su estado de desarrollo pueden medir hasta 120 centímetros de largo desde la base del 14 rizoma hasta la parte final de la lámina frondal. El fronde se divide en el estipe (pecíolo) y la lámina frondal que es pinnada. El fronde es imparapinado, un fronde adulto tiene de 25 a 29 pinas. Un estipe de un fronde adulto llega a medir hasta 30 centímetros de largo, es de color café rojizo, con un diámetro en la base de 0.5 centímetros. La lámina de la fronde mide de la base al ápice 45 centímetros, las pinas basales miden 26 centímetros de longitud desde la aurícula (lóbulo basal de una pina) hasta el ápice. En su parte más ancha el fronde mide 42 centímetros (Cáceres, 1996). 2.7.3 Distribución geográfica de la calahuala Crecen silvestres en troncos de palmas, árboles de encino y roca caliza desintegrada, en lugares de gran humedad a la sombra. Se encuentran desde México y Centro hasta Sur América en alturas de 1,200-2,200 msnm. En Guatemala se ha descrito en Alta Verapaz, Baja Verapaz, Chimaltenango, Escuintla, Guatemala, Huehuetenango, Jalapa, Quetzaltenango, Suchitepéquez y Zacapa (Cáceres, 1996). 2.7.4 Usos medicinales atribuidos a la calahuala La infusión y decocción del rizoma se usa oralmente para tratar afecciones gastrointestinales (diarreas, dolor de estómago, estreñimiento, gastritis); respiratorias (asma, tos, tos ferina) y cardíacas, dolor de huesos, reumatismo, diabetes, gota, hipertensión, purificar la sangre, parásitos, enfermedades venéreas, sífilis, y afecciones renales (cálculos, hidropesía). (Cáceres, 1996) Tópicamente se usa la infusión en emplasto y cataplasma para el tratamiento de contusiones, reumatismo, úlceras, quebraduras, cáncer, cierto tipo de tumores, psoriasis y eczema. La decocción de las hojas se usa para detener las hemorragias. Se le atribuye propiedad analgésica, antihemorrágica, depurativa, diurética, desinflamante, emenagoga, espasmolítica, expectorante, febrífuga, laxante, pectoral, purgante, sudorífica y tranquilizante (Cáceres, 1996). 15 2.7.5 Propiedades y aplicaciones La materia médica son los rizomas verdosos en su estado fresco y café dorado cuando secos, son cilíndricos, tortuosos, escamas moreno ferruginosas, sin un olor especial; deben reunir las mismas características fisicoquímicas y sanitarias de las otras materias primas usadas para la elaboración de productos fitofarmaceùticos. Entre los principales compuestos con propiedades medicinales de esta especie están los glucósidos de la saponina, basados en polipodosapogenina, incluyendo osaldina, ecdisteroides poliodinas A y B, derivados de la floroglucina, sustancias diversas; aceite esencial, aceite fijo, tanino, etc. (Martínez et al., 2000). 2.7.6 Usos y prácticas medicinales tradicionales y locales Se utiliza la raíz y el tallo del helecho masculino contra enfermedades del pecho. Entre los campesinos del Ecuador se dice que es antirreumática, antisifilítica, diaforética y sudorífica. Es un plante pectoral, demulcente, purgante y antihelmíntica, la decocción fuerte expulsa la tenia. Señalan además que el rizoma de Phlebodium aureum es comestible, así como también indican que en el Herbario Nacional Colombiano existen distintos exsicados que dicen que las especies del género Phlebodium tienen los siguientes usos populares: el rizoma en infusión se toma contra la tos persistente, principalmente después de la tos ferina. Es usado como expectorante, pectoral y alterativo, se le ha usado contra la tos y padecimientos respiratorios, como tónico en casos de dispepsia y pérdida del apetito y como alterativo en enfermedades de la piel. Su sabor dulce se lo debe a la osladina. Ocasionalmente produce comezón tras su ingestión, se desconoce la razón, pero este efecto parece ser inocuo (Martínez et al., 2000). 16 2.7.7 Formas de uso La parte utilizada es el rizoma. Se utiliza el extracto liquido, en dosis de 1-4 ml. Señalan que para el tratamiento de psoriasis, eczemas, dermatosis, vitíligo y estados de disfusión inmune, se recomienda administrar tres veces al día en dosis de 1 capsula (Disfur, Armaya o similar) antes de las comidas, 1-4 g/taza de decocción, 3-5 ml de tintura 1:10 en etanol 35%. Por las mismas indicaciones puede aplicarse tópicamente, ya sea en forma de pomada o ungüento. Por su actividad antiinflamatoria e inmunomoduladora puede combinarse con achiote, apacin, manzanilla y zarzaparrilla. Como depurativo puede combinarse con amargón, palo de jiote y saúco (Martínez, et al; 2000). 2.7.8 Química de la calahuala Los estudios aun son incompletos. El rizoma de Phlebodium aureum contienen azúcar, aceite esencial, mucílago, almidón, nitrato de potasio y colorante rojo: además contiene calagualina, polipodina, aceites grasos y taninos, así como esteroides (ecdisterona y dos ecdisonas como la polipodaureina). De Phlebodium leucatomos ya se obtiene un producto farmacéutico elaborado en España con materia prima proveniente de Honduras, de la empresa Extractos Vegetales de Centroamérica, en donde para 1992 se estaban cultivando bajo saran (tela especial para producir cierto porcentaje de sombra), seis hectáreas con capacidad para producir 500 kg de extracto purificado por mes (Martínez et al., 2000). 2.7.9 Manejo Cáceres (com. Per.) Indica que en Guatemala los rizomas se obtienen por recolección en los bosques de poblaciones silvestres, siendo el material muy variable en sus características botánicas. En Honduras se cultiva comercialmente en desechos de palma en condiciones de invernadero. En Guatemala los lugares de mayor cantidad de extracción son Mataquescuintla y la montaña de Jalapa. Para 1996 se tiene información 17 que se exportaron 18 toneladas de rizomas a Europa, de las cuales no se tiene información si son o no cultivadas. Se recomienda para la calahuala mantener bajo manejo las zonas de crecimiento natural o iniciar su domesticación. Se carece de información acerca de su multiplicación por rizoma, pero se puede indicar que al momento de iniciar un trabajo de cultivo es la parte recomendada para la propagación. 2.7.10 Producción En Honduras desde 1990 la Empresa llamada HELSINT (Helechos Internacionales) tiene bajo producción 6 ha de Phlebodium leucatomos, con un total de 60 empleados permanentes y 20 temporales, dicha empresa invirtió alrededor de US$1.000.000.00 para tener una capacidad de producción del 20% de su capacidad instalada y actualmente está produciendo 500 kg de extracto purificado por mes. La parte utilizable por la empresa es la fronda, para lo cual cuenta con una planta procesadora de la misma con capacidad de 2500 kg /mes de extracto purificado, los cuales son exportados principalmente a España, Portugal y Jordania (Caballer y Girón, 1991). 2.8 CONDICIONES CLIMÁTICAS PARA LA PROPAGACIÓN DE LA CALAHUALA 2.8.1 Luz Crecen bien en luz media; no toleran luz solar directa, necesitan de bastante humedad del ambiente para reproducirse (Dorling, 1983) 2.8.2 Fotoperíodo Crecen activamente durante todo el año, aunque más lentamente en los meses de días cortos (Dorling, 1983). 18 2.8.3 Temperatura Toleran temperaturas inferiores a 10 C, siempre que se mantengan más secas que lo normal. Cuando las temperaturas superan los 20 C, debe incrementarse la humedad de las plantas, situando las macetas sobre bandejas húmedas o haciendo riegos sobre el sustrato y aplicando nebulizaciones diarias de agua sobre el follaje. Efectúese una nebulización fina, para que no se depositen gotas que podrían decolorar las hojas. Las temperaturas adecuadas para su desarrollo son alrededor de 19 C a 24 C en condiciones normales (Dorling, 1983). 2.8.4 Riego Necesitan de riego abundante a fin de que se mantenga siempre húmedo el sustrato (Dorling ,1983). 2.8.5 Sustratos En condiciones naturales los Phlebodium crecen silvestres en troncos de palmas, árboles de encino y roca caliza desintegrada. O sea que se recomienda utilizar broza de encino cernida puede contener piedra caliza desintegrada, desechos de palma que ya se está experimentando en Honduras con el fin de que el rizoma tenga espacio suficiente para extenderse, ramificarse y absorber humedad del sustrato (Cáceres, 1996). pH: Se recomiendan los pH de 4.5-5 para helechos, orquídeas, bromelias y anturios (Dorling ,1983). 19 2.8.6 Fertilización En el cultivo de la calahuala Tánchez (2000) recomienda utilizar soluciones completas de fertilizantes a las dos semanas después de haber sembrado, también recomienda llevar a la par un estudio de análisis de suelos y recomienda la aplicación de fósforo en menores cantidades que nitrógeno y potasio. No existe una recomendación determinada para el cultivo de la calahuala, debido a la falta de información y manejo de la misma. 2.8.7 Densidad de siembra Los rizomas se deben sembrar a poca profundidad, a unos 2.5 cm. Por debajo de la superficie. Es usual sembrarlos relativamente juntos entre sí, en tres o cuatro hileras ubicadas a lo largo de las camas o surcos. Algunos productores mencionan que prefieren distancias de 30*30 cm o aun 30*45 cm, pues se ha comprobado que a medida que la planta se desarrolla y las frondas invaden el espacio libre, se crea competencia entre las plantas y se generan problemas de aireación deficiente cuando las plantas se encuentran muy cerca. En promedio hablan de una densidad de siembra de 9 plantas por metro cuadrado, es decir entre 50,000 y 60,000 plantas por hectárea. El cultivo se desarrolla en camas cuyo ancho oscila entre los 90 a 120 cm, ya que anchos mayores dificultan las labores de recolección y limpieza (Tánchez, 2000). 2.8.8 Plagas y enfermedades Para la calahuala no se tiene ningún registro de la presencia de plagas y enfermedades, sin embargo, para los helechos en general son reportadas varias de ellas (Cuadro 1). 20 Cuadro 1. Principales plagas y enfermedades para los helechos. (Demarco, F. y Sarrugeri, H. 1999). Agente Causal Nombre común Plagas 1. Escamas y Cochinillas Pseudococcus asonidum Cochinilla harinosa abanderada Coccus sp. Escama parda blanca Pinnapsis aspidistrae Escama de los helechos 2. Insectos Frankiniella occidentalis Thrips occidentales de las flores Thrips tabaci Trhips Undulambia polysticha Broca 3. Babosas y Caracoles Deroceras sp. Babosa parda de jardín Enfermedades 1. Hongos Cylindrocladium sp. Mancha foliar de fuego Cercospora sp. Mancha foliar Colletotrichum sp. Tizón foliar-Antracnosis Pythium Pudrición radicular Rhyzoctonia Pudrición de corona y raíces 2. Nematodos Pratylenchus sp. Nematodo de lesión 21 2.9 PROPAGACIÓN DE LA CALAHUALA 2.9.1 Reproducción natural de la calahuala Martínez (com. Per.) Indica que en Guatemala la calahuala Phlebodium pseudoaureum (Cav.) Lellinger, se reproduce naturalmente por rizomas con un crecimiento de 20 a 30 cm en dos años y por esporas en un tiempo de 4 a 5 años para formar un helecho adulto. 2.9.2 Micropropagación de la calahuala Para la propagación masiva in vitro de calahuala se recomienda emplear el medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) al 50 % de su concentración original, ya que en este medio se obtienen a los 210 días después de la siembra, el mayor porcentaje de esporofitos jóvenes, con una altura de 1.341 centímetros (Rosales, 2005). 2.10 FERTILIZACIÓN FOLIAR La fertilización foliar consiste en el suministro de nutrimentos a una planta atravez del tejido foliar (hojas, tallo), especialmente atravez de las hojas, dado que allí se centra la mayor actividad fisiológica de la planta. Teóricamente sería posible alimentar una planta adulta exclusivamente por vía foliar, sin embargo, se considera que esta práctica solo puede ser un complemento nutricional a la fertilización realizada al suelo y no un reemplazo total (Bertsch, 1998). La absorción de la fertilización foliar inicia en la superficie de las hojas que está constituida por la cutícula y células epidermales. La cutícula es una capa no celular, poco permeable constituida por cutina, cera, celulosa y pectina, que recubre toda la superficie externa de la hoja, incluyendo las actividades de los estomas, cuya función es 22 proteger a la hoja de la excesiva perdida de agua por transpiración. Aparentemente esta capa representaría la principal barrera para la penetración de nutrimentos por vía foliar, sin embargo, tiene zonas de organización menos densa llamadas ectodesmas, que actúan como canales atravez de los cuales se movilizan las sustancias aplicadas foliarmente hasta alcanzar las células epidermales que se encuentran debajo de la cutícula. Para que exista absorción foliar se requiere un un cierto grado de humedad que permita la expansión de la cutícula, para que se abran las capas cerosas y se pueda dar la entrada (Bertsch, 1998). Otros factores que determinan la magnitud de la absorción foliar son: Las características genéticas de la planta, ya que hay cultivos mucho mas susceptibles a otros en su respuesta a la fertilización foliar; la edad del tejido, los tejidos jóvenes tienen más capacidad de absorción por su mayos actividad, de ahí la importancia de dirigir las aplicaciones hacia los brotes; las características propias del nutrimento, especialmente por lo que se refiere a la movilidad dentro de la planta; técnicas de aplicación, equipos, tamaño de las gotas, aditivos (Bertsch, 1998). Algunas ventajas de la fertilización foliar sobre la fertilización al suelo son: Suplir nutrimentos que estén deficientes en el suelo y que se requieren en cantidades pequeñas, especialmente micronutrientes; superar la falta de la planta para absorber nutrimentos del suelo, debida a la presencia de condiciones de estrés como pueden ser daños radicales causados por implementos, enfermedades, insectos, nematodos y sequía; complementar la nutrición de cultivos que tienen gran área foliar expuesta y producciones muy fuertes; economizar productos caros que pueden perderse o fijarse en el suelo y garantizar su aprovechamiento por la planta; se requieren dosis mucho menores, para lograr efectos semejantes; se logran respuestas a muy corto plazo; puede contribuir a la recuperación por efectos fitotóxicos de otros productos; superar síntomas evidentes de deficiencia de algún nutrimento (Bertsch, 1998). 23 Mientras que algunas de las limitaciones de los fertilizantes foliares son las siguientes: Pueden presentar problemas de penetración, particularmente en cultivos con hojas de cutícula gruesa; Puede ocurrir mucha pérdida al ser aplicados sobre superficies hidrofóbicas; pueden lavarse fácilmente por lluvia; algunos productos o nutrimentos pueden presentar muy bajas tasas de retranslocación, por lo tanto solo son útiles en el sitio en que son absorbidos; pueden causar daños en las hojas, quema o necrosis, al secarse rápidamente o al usar soluciones concentradas (Bertsch, 1998). 24 III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3.1 DEFINICIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN Actualmente la medicina tradicional, es decir la medicación a base de plantas, ha cobrado mayor auge. Los estudios de plantas realizados tanto a nivel nacional como internacional, sobre sus diversas propiedades, hacen que sean mejor conocidos sus efectos farmacológicos y sus posibles efectos adversos. Nuestro país cuenta con una amplia gama de plantas cuyo efecto terapéutico se ha utilizado desde tiempos remotos. Además, por el costo que representa para la población, se ha observado su mayor utilización, favorecido también por el descubrimiento de graves efectos secundarios en fármacos sintéticos; nuevas formas de preparar y administrar las drogas vegetales y sus extractos, y los métodos de análisis que garantizan un mejor control de calidad. La calahuala, Phlebodium psedoaureum (Cav.) Lellinger, es una especie que normalmente se le encuentra en estado silvestre, desarrollándose en áreas húmedas sobre troncos de palmas, árboles de encino y roca caliza desintegrada. Debido a la importancia económica social que reviste por sus propiedades medicinales y al auge que ha tomado en los últimos años el consumo de los rizomas de ésta, recientemente se ha iniciado el proceso de domesticación de la misma. Actualmente en Guatemala, la calahuala solo la propagan en condiciones de cultivo a nivel experimental por medio de rizomas, lo que implica varias desventajas tales como: extraer grandes cantidades de rizomas de los reservorios naturales donde corre peligro de extinción (CONAP, 2001). 25 En el presente estudio se evaluaron tratamientos de fertilización foliar en una forma de propagación alternativa de la calahuala, que permita obtener gran cantidad de esporofitos jóvenes en un menor tiempo, a fin de suplir la demanda de la misma y aumentar la disponibilidad de material de propagación, ya que en la tradicional se tiene que utilizar cerca del 35% de la producción de rizoma como fuente de semilla. 26 IV. OBJETIVOS 4.1 GENERAL Generar información del efecto de la fertilización foliar, para la elaboración de un protocolo para la propagación de calahuala, Phlebodium pseudoaureum (Cav.) Lellinger, a partir del cultivo de esporas. 4.2 ESPECÍFICOS Determinar el efecto de tres tipos y tres dosis de fertilizantes foliares, sobre la formación de prótalos en cultivo de esporas de calahuala. Cuantificar la población de esporofitos en cultivo de esporas de calahuala, en diferentes tratamientos de fertilizantes foliares. Determinar la biomasa de esporofitos en diferentes tratamientos de fertilizantes foliares, en el cultivo de esporas de calahuala. Cuantificar la altura de esporofitos formados en distintos tratamientos de fertilizantes foliares, en el cultivo de esporas de calahuala. 27 V. HIPÓTESIS En al menos uno de los tratamientos de fertilización foliar a evaluar, se obtendrá una mayor formación de prótalos. Por lo menos uno de los tratamientos a evaluar, permitirá la obtención de una mayor población de esporofitos. En al menos uno de los tratamientos a evaluar, la biomasa de esporofitos será mayor. Por lo menos uno de los tratamientos a evaluar, provocara una altura mayor de esporofitos de calahuala. 28 VI. METODOLOGÍA 6.1 LOCALIZACIÓN DEL TRABAJO El presente trabajo de investigación se realizó en la Granja Villa Lobos, ubicada en el km 13.5 carretera al Pacífico. La misma está equipada con condiciones controladas de luz, temperatura, humedad y con los requerimientos adecuados que permitieron la ejecución de la presente investigación. 6.2 MATERIAL EXPERIMENTAL El material vegetal se obtuvo de las plantas de calahuala existentes en el umbráculo de la Universidad de San Carlos de Guatemala, ubicado en los campos del Centro Experimental Docente de Agronomía. Los fertilizantes foliares utilizados como material experimental fueron; Bayfolán forte, Aminoleaf y Raizal *400, en sus respectivas dosis. Figura 2. Material vegetal recolectado en el umbráculo. 29 6.3 FACTORES ESTUDIADOS 6.3.1 Factores 1. Tipos de fertilizantes foliares 2. Dosis de fertilizantes foliares 6.3.2 Niveles * Tipos de Fertilizantes Foliares A. Bayfolán forte B. Raizal *400 C. Aminoleaf * Dosis de fertilizantes foliares 1. Baja 2. Media 3. Alta Se determinó la utilización de estos fertilizantes foliares para dicha investigación, con base en la composición de sus elementos nutricionales y a la recomendación de una consulta personal con el Ing. Agr. Vicente Martínez, catedrático de la FAUSAC, el Lic. Armando Cáceres, catedrático de la FAUSAC y Gerente del laboratorio de plantas medicinales FARMAYA S.A; con experiencia en el manejo de plantas medicinales, y el Ing. Agr. Juan Alberto Chamo, productor de calahuala de la Empresa Biocultivos de Guatemala. Del cultivo de la calahuala se carece de información en cuanto a su manejo y fertilización, por lo que no existen recomendaciones especificas para el cultivo, ya que principalmente se produce en sustratos orgánicos. 30 Cuadro 2. Contenido de macro-nutrientes en porcentaje, de los fertilizantes foliares evaluados. Nombre N P₂O₅ K₂O Ca Mg S Bayfolán forte 11 8 6 0.025 0.025 0 Aminoleaf 20 20 20 0 0.05 0 Raizal *400 9 45 11 0 0.6 0.8 comercial Cuadro 3. Contenido de micro-nutrientes en porcentaje, de los fertilizantes foliares evaluados. Nombre Cu Fe Mn Zn B Mo Bayfolán forte 0.04 0.05 0.04 0.08 0.04 0.005 Aminoleaf 0.02 0.3 0.05 0.3 0.02 0.005 Raizal *400 0 0 0 0 0 0 comercial Las diferencias principales entre los fertilizantes foliares utilizados en la investigación son, que el Aminoleaf es un fertilizante foliar, que contiene alto porcentaje de macronutrientes y micro-nutrientes con respecto a los otros fertilizantes foliares. Tal es el caso del Raizal *400, el cual es un fertilizante que únicamente contiene macro-nutrientes en porcentaje alto, careciendo de micro-nutrientes. En cuanto al fertilizante Bayfolán forte, se diferencia de los otros por contener macro-nutrientes y micro-nutrientes en un porcentaje aceptable, comparado con los otros fertilizantes estudiados. Otra diferencia que se observa es la falta de Ca en los fertilizantes Aminoleaf y Raizal *400. Se recalca que el fertilizante Bayfolán forte su presentación es en solución líquida, mientras que el Aminoleaf y el Raizal *400 son cristales solubles. 31 * Dosis Comerciales de Fertilizantes Foliares 1. Bayfolán forte: 2 a 3 l/ha. 2. Aminoleaf: 5 a 7 kg/ha. 3. Raizal *400: 6 a 8 kg/ha. * Dosis utilizadas de fertilizantes foliares en porcentaje, de su recomendación comercial. 1. Baja: 25% 2. Media: 50% 3. Alta: 100% Las aplicaciones de dichos fertilizantes foliares con sus respectivas dosis, se realizaron con una frecuencia de 15 días, hasta la finalización de la investigación. La aplicación se hizo utilizando un pachón asperjador de 1 L de capacidad; por cada tipo de fertilizante foliar. 6.4 DESCRIPCIÓN DE LOS TRATAMIENTOS Los tratamientos evaluados fueron nueve, producto de la combinación entre los factores: tipo y dosis de fertilizantes foliares. A continuación se describen los tratamientos: Cuadro 4. Tratamientos evaluados. FERT. FOLIAR A B C DOSIS 1 AD1 BD1 CD1 DOSIS 2 AD2 BD2 CD2 Factor A tipo Factor B dosis A: Bayfolán Forte 1. Baja B: Raizal *400 2. Media C: Aminoleaf 3. Alta DOSIS 3 AD3 BD3 CD3 32 6.5 DISEÑO EXPERIMENTAL El diseño experimental utilizado fue completamente al azar, con un arreglo bifactorial. 6.6 MODELO ESTADÍSTICO Yij= µ+Ai+Bj+(AB)ij+Eij *Yij = Elemento perteneciente al j-èsimo nivel del factor B y al i-èsimo tratamiento del nivel A. *µ = Media general *Ai = Efecto debido a el i-èsimo nivel del factor A. *Bj = Efecto debido al j-èsimo nivel del factor B. *(AB)ij = Efecto de la interacción del j-èsimo nivel del factor B y el i-èsimo nivel del factor A. *Eij = Al error experimental perteneciente al j-èsimo nivel del factor B y al i-èsimo tratamiento del nivel A. 6.7 UNIDAD EXPERIMENTAL La unidad experimental para la propagación de calahuala por medio de esporas consistió en la mitad de una bandeja tipo jumbo, de 5 cm de alto por 57 cm de largo por 37 cm de ancho. Figura 3. Unidad experimental consistente en la mitad de una bandeja tipo jumbo. 33 6.8 CROQUIS DE CAMPO T2₂ T4₄ T6₁ T9₃ T8₃ T1₄ T3₂ T5₂ T8₁ T2₄ T7₄ T4₁ T7₁ T2₁ T9₄ T3₁ T1₃ T8₂ T6₃ T4₃ T5₄ T1₁ T3₄ T7₃ T1₂ T8₄ T5₁ T4₂ T6₂ T9₁ T3₃ T9₂ T6₄ T7₂ T2₃ T5₃ Figura 4. Distribución experimentales. de los tratamientos con sus respectivas unidades 34 6.9 MANEJO DEL EXPERIMENTO 6.9.1 Recolección de esporas Las esporas se recolectaron cuando los soros en las frondas de la especie de calahuala en estudio, presentaron un cambio de coloración de verde a amarillo oro. Las frondas se cortaron y se depositaron sobre papel blanco, de tal manera que en un período de 24 – 48 horas se desprendieron y cayeron sobre el papel. Posteriormente las esporas obtenidas se depositaron en un tubo de ensayo y se guardaron en un lugar seco, fresco y en ausencia de luz. A B C Figura 5. Recolección de esporas obtenidas de las frondas de calahuala. A) fronda de calahuala. B) frondas cortadas y depositas en la hoja de papel blanco. c) Recolección de las esporas. 35 6.9.2 Preparación del medio de siembra El medio ideal debe tener ciertas propiedades físicas y químicas, para proveer a las esporas el ambiente adecuado para su germinación y posterior desarrollo debe estar libre de micro-organismos patógenos. Para este efecto, se utilizó un producto ya elaborado: Sun grow Mix 2 Basic, diseñado especialmente para la germinación de semillas pequeñas. El sustrato se preparó haciéndolo pasar por una malla número 16, con el propósito de eliminar el material grueso, luego se humedeció y se le aplicó una solución de fungicida. Después de 24 horas de aplicada la solución de fungicida, se le aplicó una solución de fertilizante foliar al sustrato. Estas soluciones se aplicaron a manera de humedecer el material sun grow mix previamente cernido. Este medio ofreció una capacidad de retención de agua ideal, y al mismo tiempo un porcentaje de espacio poroso drenable, que permitió una aireación adecuada durante el proceso de germinación y primeras etapas de crecimiento. El material preparado se colocó dentro de las bandejas o recipientes de germinación con un espesor de 1 cm. Figura 6. Preparación del medio de siembra. 36 6.9.3 Siembra de esporas La siembra de esporas se hizo utilizando un pincel para una distribución uniforme y un eppendorf, en cuya boca se colocó una pieza de papel aluminio muy bien ajustada y sobre la cual se perforaron varios orificios pequeños con la punta de un alfiler (Como una especie de salero). Se especifica que las esporas sembradas fueron pesadas en una balanza analítica, con el fin de sembrar la misma cantidad de esporas en los diferentes tratamientos, para un mejor manejo de la investigación. Se sembraron 50 mg de esporas en cada unidad experimental. Para reducir el riesgo de contaminación al momento de la siembra, se utilizó agua destilada, tanto para humedecer la mezcla de musgo como para realizar las aspersiones. Se tomaron en cuenta condiciones estrictas de higiene, como lavado de manos con jabón, la provisión y uso de mascarillas, herramientas limpias y un ambiente limpio por parte del operario, y el sitio donde se llevó a cabo la siembra (Mendoza et al., 2005). Figura 7. Siembra de esporas. 37 6.9.4 Germinación de esporas Las esporas sembradas en el material colocado en las bandejas, se protegió cubriéndolas con un plástico de envoltura, conocido como sarán wrap y sellando de tal manera que se minimizó la pérdida de humedad del material de siembra durante la germinación. Este hecho, por una parte evitó cualquier contaminación en el medio y también mantuvo un ambiente de alta humedad relativa, que es el ambiente propicio para la germinación de las esporas y para el posterior desarrollo de estas como prótalos. La bandeja con el material de siembra y esporas debidamente selladas se colocó a una distancia de 15 – 20 cm de una lámpara de 20 watts, que iluminó completamente la superficie sembrada a través de la cubierta del plástico. Lo anterior agilizó el periodo de germinación que fue de 4 – 6 semanas. Después de 2 semanas de sembradas las esporas se noto sobre el material de cultivo (sun grow mix) una diminuta alfombra color verde, significando que las esporas iniciaron la germinación. A la cuarta semana el color de las esporas germinadas fue de verde intenso y la alfombra germinada se hizo cada vez más notoria (Mendoza et al., 2005). Figura 8. Germinación de esporas. 38 6.9.5 Transplante de esporas germinadas Las esporas germinadas sembradas hace 4 – 6 semanas fueron separadas en pequeños grupos y colocadas en bandejas donde se encontraba material de siembra, preparado de la misma mezcla utilizada para la germinación de las esporas y asperjados con las mismas soluciones y dosis de fertilizante foliar también utilizadas anteriormente. Las esporas germinadas y trasplantadas en grupos llamados rosetas iniciaron un periodo de acelerado crecimiento mediante aplicaciones cada dos semanas de solución de fertilizante foliar y manteniendo las bandejas en un vivero con humedad controlada (80-90%) y una temperatura promedio de 22 – 30 ºC, utilizando riego nebulizado según se necesitaron. El vivero estaba completamente protegido de corrientes de aire y el sarán de protección solar era de 90% de retención de luz, sobre el cual se colocó plástico transparente con protección de UV. Después de 8 semanas de trasplantadas las esporas en grupos llamados rosetas, se separaron en grupos más pequeños y se trasladaron a bandejas siempre conteniendo el mismo material de crecimiento, solo que en este caso no hizo falta cernir el material a través de mallas (Mendoza et al., 2005). Figura 9. Rosetas de esporas germinadas. 39 6.9.6 Separación de plantas Las rosetas separadas crecieron a niveles donde las hojas de las futuras plantas empezaron a emerger de los prótalos, teniendo un tamaño de aproximadamente 0.2 – 0.4 cm, así una a una las plantas fueron separadas con pinzas y colocadas en bandejas, de tal manera que pudieron iniciar su crecimiento en forma individual. La fertilización siempre consistió en solución de fertilizante foliar cada dos semanas y supervisión continua para evitar el crecimiento de hongos. Se hicieron aplicaciones de solución de fungicida. Figura 10. Rosetas de esporas separadas. 40 6.9.7 Trasplante final de plantas Las plantitas individualizadas permanecieron como tales durante aproximadamente 6 – 8 semanas, antes de ser transplantadas de las bandejas directamente al suelo o a un vivero de crecimiento y en un sustrato a base de tierra, aserrín y arena (Mendoza et al., 2005). Las plantas se siembran en el suelo en arriates a una densidad de 22 – 25 plantas por metro cuadrado, protegidas con sarán de 90% y plástico transparente (Mendoza et al., 2005). Cuadro 5. Tiempo de cada fase de la investigación. No. Fases de la investigación Tiempo 1. Recolección de esporas 2-3 días 2. Preparación de el medio de siembra 2 días 3. Siembra de las esporas 1 día 4. Germinación de las esporas 4-6 semanas 5. Transplante de esporas germinadas 8 semanas 6. Separación de plantas 6-8 semanas 7. Transplante final de plantas 22 semanas 6.10 VARIABLES RESPUESTAS 6.10.1 Germinación de prótalos (%) Esta variable fue medida tomando como parámetro el porcentaje, y se llevó a cabo la toma de lectura de las unidades experimentales, a los 15 días después de la siembra de las esporas. 41 6.10.2 Población de esporofitos por unidad de área (4 cm²) Esta variable respuesta se midió a los tres meses de establecida la siembra y se tomó como parámetro el porcentaje, en las diferentes unidades experimentales. 6.10.3 Biomasa (g) Esta variable se midió a los 5 meses después de la siembra de las esporas. El procedimiento seguido fue poner a secar el material experimental y posteriormente calcular la biomasa con el parámetro de peso. 6.10.4 Altura de esporofitos (cm) Esta variable se midió al final de la cosecha. Los esporofitos fueron separados y colocados en la mesa de trabajo, y por medio de una regla se midió desde su base hasta el ápice. 6.11 ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN 6.11.1 Análisis estadístico Para la presente investigación se realizó un análisis de varianza para el modelo de una distribución completamente al azar con arreglo bifactorial, de nueve tratamientos y cuatro repeticiones, también los datos de las variables de respuesta se sometieron a un análisis de normalidad. Posteriormente resultaron significativos los ANDEVAS de las variables de respuesta, por lo que se procedió a realizar la prueba múltiple de medias de Tukey, con una significancia del 5%, a fin de establecer que tratamiento y combinación fueron los más adecuados para cada variable en estudio. 42 VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Luego de tabulados los datos, fueron ordenados con la ayuda de Excel y analizados por medio del paquete de diseños experimentales Infoestática, utilizando un análisis de varianza (ANDEVA), para un diseño completamente al azar con arreglo bifactorial. 7.1 VARIABLE GERMINACIÓN DE PRÓTALOS (%) Los datos de la variable porcentaje de germinación de prótalos, se midieron a partir de los quince días después de la siembra de las esporas, se tabularon y ordenaron presentándose en el cuadro 6. Cuadro 6. Resultados obtenidos para la variable porcentaje de germinación de prótalos, en la investigación en campo. TRATAMIENTOS R. 1 R. 2 R. 3 R. 4 MEDIAS T1 80 75 75 60 72.50 T2 75 80 75 80 77.50 T3 85 70 70 80 76.25 T4 50 75 75 50 62.50 T5 75 50 75 75 68.75 T6 50 80 80 75 71.25 T7 80 50 60 75 66.25 T8 75 75 75 50 68.75 T9 60 75 60 80 68.75 Los datos anteriormente descritos, se sometieron a un proceso de normalidad, para poder analizarse estadísticamente con un modelo matemático de varianza, mediante la fórmula de √; el cuadro siete presenta los resultados de la variable porcentaje de germinación de prótalos transformados para poder evaluarse en el ANDEVA. 43 Cuadro 7. Datos transformados, para la variable porcentaje de germinación de prótalos. TRATAMIENTOS R. 1 R. 2 R. 3 R.4 MEDIAS T1 9.000 8.717 8.717 7.810 8.561 T2 8.717 9.000 8.717 9.000 8.858 T3 9.273 8.426 8.426 9.000 8.781 T4 7.141 8.717 8.717 7.141 7.929 T5 8.717 7.141 8.717 8.717 8.323 T6 7.141 9.000 9.000 8.717 8.464 T7 9.000 7.141 7.810 8.717 8.167 T8 8.717 8.717 8.717 7.141 8.323 T9 7.810 8.717 7.810 9.000 8.334 Con base en los resultados presentados en el cuadro anterior, se realizó el análisis de varianza, obteniendo los resultados que se detallan en el cuadro 8. Cuadro 8. Resultados del análisis de varianza, para la variable porcentaje de germinación de prótalos. F.V. SC G.L. CM F Valor de p Modelo 2.74 8 0.34 0.68 0.7023 NS Tipo 1.85 2 0.93 1.85 0.1771 NS Dosis 0.71 2 0.36 0.71 0.5014 NS Tipo*Dosis 0.18 4 0.04 0.09 0.9851 NS Error 13.55 27 0.50 Total 16.30 35 C.V. 8.48% NS= Diferencia no significativa Con base en los resultados del análisis de varianza, se determinó que estadísticamente (con un coeficiente de variación de 8.48%) no existe diferencia significativa en los tipos de fertilizantes, dosis, y combinaciones de los mismos (p>=0.05) para la variable porcentaje de germinación de prótalos. Por lo que significa que los tratamientos evaluados fueron iguales. 44 Porcentaje de germinacion de protalos 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Trat. 1 Trat. 2 Trat. 3 Trat. 4 Trat. 5 Trat. 6 Trat. 7 Trat. 8 Trat. 9 TRATAMIENTOS Figura 11. Porcentaje de germinación de prótalos, de los tratamientos evaluados en la investigación. En la figura anterior se representa gráficamente el comportamiento de los tratamientos evaluados, en donde el tratamiento 2 (Bayfolán forte con dosis media) presenta una mayor tendencia, a los otros. 45 7.2 VARIABLE POBLACIÓN DE ESPOROFITOS POR UNIDAD DE ÁREA (4 cm²) Esta variable respuesta se midió, a los tres meses de establecida la siembra, y se tomo como parámetro el porcentaje. Se determino el número de plántulas existentes en un área de cuatro centímetros cuadrados de material, en las diferentes unidades experimentales. Los datos se ordenaron y se tabularon presentándose en el cuadro 9. Cuadro 9. Resultados obtenidos para la variable población de esporofitos por unidad de área, en la investigación en campo. TRATAMIENTOS R. 1 R. 2 R. 3 R. 4 MEDIAS T1 25 22 11 16 18.50 T2 37 34 28 32 32.75 T3 36 14 14 11 18.75 T4 8 18 10 13 10.25 T5 13 14 11 12 12.50 T6 21 19 25 24 22.25 T7 23 7 25 19 18.50 T8 24 17 11 14 16.5 T9 22 23 27 18 22.5 Con base en los resultados presentados en el cuadro anterior, se realizó el análisis de varianza, obteniendo los resultados que se detallan en el cuadro 10. 46 Cuadro 10. Resultados del análisis de varianza, para la variable esporofitos por unidad de área. F.V. Modelo Tipo Dosis Tipo*dosis Error Total SC 1220.56 353.56 161.06 705.94 976.00 2196.56 C.V. 31.01% G.L. CM F 8 152.57 4.22 2 176.78 4.89 2 80.53 2.23 4 176.49 4.88 27 36.15 35 * * = Diferencia altamente significativa * = Diferencia significativa NS = Diferencia no significativa población de Valor de p 0.0022 * * 0.0154 * 0.1272 NS 0.0043 * * Con base en los resultados del ANDEVA, se determinó que estadísticamente, existió diferencia significativa para la variable población de esporofitos por unidad de área, en cuanto al tipo de fertilizante y las combinaciones de tipo y dosis (p<0.05); en lo que se refiere a dosis, no existe diferencia significativa (p>0.05). Con base en los resultados del análisis de varianza, fue necesario realizar una prueba de media (Tukey al 5%) para determinar los mejores tratamientos. Cuadro 11. Prueba múltiple de medias de Tukey al 5% de significancia, para tipo de fertilizante, según la variable población de esporofitos por unidad de área. TIPO 2 3 1 MEDIAS 15.67 19.17 23.33 GRUPO A A B Tomando en cuenta la información detallada en el cuadro 11, estadísticamente y a un nivel de significancia de 5%, el tipo número 1 (Bayfolán forte) fue mejor que los otros, ya que fue el que presentó la mayor población de esporofitos por unidad de área (23.33). 47 Los otros tipos de fertilizantes (Raizal *400 y Aminoleaf) fueron estadísticamente iguales, ya que como se aprecia en el cuadro 11, formaron un solo grupo. Poblaciòn de esporofitos por unidad de àrea (4 cm²) 25 20 15 10 5 0 RAIZAL 400 AMINOLEAF BAYFOLAN FORTE Tipo de fertilizante Figura 12. Variable población de esporofitos por unidad de área. En la figura anterior se representa gráficamente el comportamiento de los tipos de fertilizantes evaluados, en donde el tipo 1 (Bayfolán forte) presenta diferencia, con respecto a los otros tipos. 48 Cuadro 12. Prueba múltiple de medias de Tukey al 5% de significancia, para tipo y dosis de fertilizante, según la variable población de esporofitos por unidad de área. TIPO 2 2 3 3 1 1 2 3 1 DOSIS 1 2 2 1 1 3 3 3 2 MEDIAS 12.25 12.50 16.50 18.50 18.50 18.75 22.25 22.50 32.75 GRUPO A A A A A A A A B Tomando en cuenta la información detallada en el cuadro 12, estadísticamente y a un nivel de significancia de 5%, la combinación tipo 1 (Bayfolán forte) y dosis 2 (media) fue mejor que las otras, ya que es la que presentó la media más alta de población por unidad de área (32.75). Las otras combinaciones fueron estadísticamente iguales, ya que como se aprecia en el cuadro anterior, formaron un solo grupo. 49 Poblaciòn de esporofitos por unidad de àrea (4 cm²) 35 30 25 20 15 10 5 0 Trat. 1 Trat. 2 Trat. 3 Trat. 4 Trat. 5 Trat. 6 Trat. 7 Trat. 8 Trat. 9 Tratamientos Figura 13. Combinaciones de fertilizante evaluadas, para la variable población por unidad de área. En la figura anterior se representa gráficamente el comportamiento de las diferentes combinaciones de fertilizantes evaluados, en donde el tratamiento 2 (Bayfolán forte con una dosis media) presenta una diferencia, con relación a las otras combinaciones, obteniendo la mayor población de esporofitos por unidad de área. 7.3 BIOMASA (g) Esta variable respuesta se determino a los cinco meses después de la siembra de las esporas. El procedimiento a seguido fue, el de poner a secar el material experimental y posteriormente se calculo la biomasa con el parámetro de peso. 50 Los datos se ordenaron y se tabularon presentándose en el cuadro 13. Cuadro 13. Resultados obtenidos para la variable biomasa, en la investigación en campo. TRATAMIENTO R. 1 R. 2 R. 3 R. 4 MEDIAS T1 0.498 0.487 0.485 0.505 0.493 T2 0.511 0.509 0.525 0.521 0.516 T3 0.509 0.499 0.521 0.489 0.504 T4 0.499 0.478 0.505 0.498 0.495 T5 0.494 0.515 0.501 0.498 0.502 T6 0.456 0.478 0.501 0.512 0.486 T7 0.478 0.498 0.525 0.488 0.497 T8 0.514 0.535 0.520 0.525 0.523 T9 0.515 0.497 0.525 0.505 0.510 Con base en los resultados presentados en el cuadro anterior, se realizó el análisis de varianza, obteniendo los resultados que se detallan en el cuadro 14. Cuadro 14. Resultados del análisis de varianza, para la variable biomasa. F.V. Modelo Tipo Dosis Tipo*dosis Error Total SC 4.4E-03 1.6E-03 2.2E-03 6.6-E04 0.01 0.01 C.V. 2.82% G.L. CM F 8 5.5E-04 2.75 2 7.8E-04 3.85 2 1.1E03 5.52 4 1.6E-04 0.81 27 2.0E-04 35 * = Diferencia significativa * * = Diferencia altamente significativa NS = Diferencia no significativa Valor de p 0.0233 * 0.0339 * 0.0098 * * 0.5273 NS 51 Con base en los resultados del ANDEVA, se determinó que estadísticamente existió diferencia significativa para la variable biomasa, en cuanto al tipo de fertilizante y a las dosis (p<0.05); en lo que se refiere a la interacción no existió diferencia significativa (p>0.05). Con base en los resultados del análisis de varianza, fue necesario realizar una prueba de media (Tukey al 5%) al tipo y dosis de fertilizante, para determinar los mejores tratamientos. Cuadro 15. Prueba múltiple de medias de Tukey al 5% de significancia, para tipo de fertilizante, según la variable cantidad de biomasa. TIPO 2 1 3 MEDIAS 0.49 0.50 0.51 GRUPO A A B Tomando en cuenta la información detallada en el cuadro 15, estadísticamente y a un nivel de significancia de 5%, el tipo número 3 (Aminoleaf) fue mejor que los otros, ya que fue el que presentó la media más alta de biomasa (0.51). Los otros tipos de fertilizantes (Bayfolán forte y Raizal *400) fueron estadísticamente iguales, ya que como se aprecia en el cuadro anterior, formaron un solo grupo. 52 0.6 Peso de Biomasa (g) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Bayfolán forte Raizal *400 Aminoleaf Tipo de fertilizantes Figura 14. Tipos de fertilizantes evaluados, para la variable biomasa. En la figura anterior se representa gráficamente el comportamiento de los tipos de fertilizantes evaluados, en donde el tipo 3 (Aminoleaf) superó a los otros tipos. Cuadro 16. Prueba múltiple de medias de Tukey al 5% de significancia, para dosis de fertilizantes, según la variable biomasa. DOSIS 1 3 2 MEDIAS 0.50 0.50 0.51 GRUPO A A B 53 Tomando en cuenta la información detallada en el cuadro 16, estadísticamente y a un nivel de significancia de 5%, la dosis número 2 (media) fue mejor que las otras, ya que fue la que presentó la media más alta de biomasa (0.51). Las otras dosis de fertilizantes (baja y alta) fueron estadísticamente iguales, ya que como se aprecia en el cuadro anterior, formaron un solo grupo. 0.6 Peso de Biomasa (g) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Baja Alta Media Dosis de fertilizantes Figura 15. Dosis de fertilizantes evaluadas, para la variable biomasa. 54 En la figura anterior se representa gráficamente el comportamiento de las diferentes dosis de fertilizantes evaluadas, en donde la dosis 2 (media) presenta una diferencia, a las otras. 7.4 VARIABLE ALTURA DE ESPOROFITOS (cm) Esta variable se midió al final de la investigación. Los esporofitos fueron separados y colocados en la mesa de trabajo, y por medio de una regla se midió desde su base hasta el ápice, la longitud en centímetros. Los datos se ordenaron y se tabularon presentándose en el cuadro 17. Cuadro 17. Resultados obtenidos para la variable altura de esporofitos (cm), en la investigación en campo. TRATAMIENTO R. 1 R. 2 R. 3 R. 4 MEDIAS T1 1.80 1.79 1.76 1.78 1.782 T2 1.85 1.89 1.89 1.89 1.880 T3 1.88 1.88 1.91 1.91 1.895 T4 1.75 1.72 1.71 1.71 1.722 T5 1.78 1.77 1.78 1.76 1.772 T6 1.79 1.80 1.78 1.78 1.787 T7 1.75 1.74 1.74 1.75 1.745 T8 1.77 1.77 1.78 1.77 1.772 T9 1.80 1.80 1.80 1.79 1.797 Con base en los resultados presentados en el cuadro anterior, se realizó el análisis de varianza, obteniendo los resultados que se detallan en el cuadro 18. 55 Cuadro 18. Resultados del análisis de varianza, para la variable altura de esporofitos. F.V. Modelo Tipo Dosis Tipo*dosis Error Total SC 0.10 0.06 0.04 0.01 4.6E-03 0.11 C.V. 0.73% Gl 8 2 2 4 27 35 CM 0.01 0.03 0.02 1.5E-03 1.7E-04 F 75.07 72.43 110.45 8.70 Valor de p <0.0001 * * <0.0001 * * <0.0001 * * * * = Diferencia altamente significativa Con base en los resultados del ANDEVA, se determinó que estadísticamente, existió diferencia significativa para la variable altura de esporofitos, en cuanto al tipo, dosis de fertilizantes y las interacciones (p<0.05). Con base a los resultados del análisis de varianza, fue necesario realizar una prueba de media (Tukey al 5%) a tipo, dosis de fertilizantes y las combinaciones, para determinar los mejores tratamientos. Cuadro 19. Prueba múltiple de medias de Tukey al 5% de significancia, para tipo de fertilizante, según la variable altura de esporofitos. TIPO 2 3 1 MEDIAS 1.76 1.77 1.85 GRUPO A A B Tomando en cuenta la información detallada en el cuadro 19, estadísticamente y a un nivel de significancia de 5%, el tipo número 1 (Bayfolán forte) fue mejor que los otros, ya que fue el que presentó la media más alta de altura de esporofitos (1.85). Los otros tipos de fertilizantes (Raizal *400 y Aminoleaf) fueron estadísticamente iguales, ya que como se aprecia en el cuadro anterior, formaron un solo grupo. 56 2 Altura de esporofitos (cm) 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Bayfolán forte Raizal Aminoleaf Tipo de fertilizantes Figura 16. Tipos de fertilizantes evaluados, para la variable altura de esporofitos. En la figura anterior se representa gráficamente el comportamiento de los tipos de fertilizantes evaluados para la variable altura de esporofitos, en donde el tipo 1 (Bayfolán forte) supero a los otros tipos. Cuadro 20. Prueba múltiple de medias de Tukey al 5% de significancia, para dosis de fertilizantes, según la variable altura de esporofitos. DOSIS 1 2 3 MEDIAS 1.75 1.81 1.83 GRUPO A B C 57 Tomando en cuenta la información detallada en el cuadro 20, estadísticamente y a un nivel de significancia de 5%, la dosis número 3 (alta) fue mejor que las otras, ya que presentó la media más alta de altura de esporofitos (1.83). 2 Altura de esporofitos (cm) 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Baja Media Alta Dosis de fertilizantes Figura 17. Diferentes dosis de fertilizantes evaluados, para la variable altura de esporofitos. 58 En la figura anterior se representa gráficamente el comportamiento de las diferentes dosis de fertilizantes evaluadas, en donde la dosis 3 (alta) superó a las otras. Cuadro 21. Prueba múltiple de medias de Tukey al 5% de significancia, para las combinaciones tipo y dosis, según la variable altura de esporofitos. TIPO 2 3 2 3 1 2 3 1 1 DOSIS 1 1 2 2 1 3 3 2 3 MEDIAS 1.72 1.75 1.77 1.77 1.78 1.79 1.80 1.88 1.89 GRUPO A A B B C C C D D Tomando en cuenta la información detallada en el cuadro 21, estadísticamente y a un nivel de significancia de 5%, la combinación tipo 1 (Bayfolán forte) y dosis 3 (alta) fue mejor que las otras, ya que es la que presentó la media más alta de altura de esporofitos (1.89). La combinación tipo 1 (Bayfolán forte) y dosis 2 (media) presenta una media aceptable. 59 1.95 Altura de esporofitos (cm) 1.9 1.85 1.8 1.75 1.7 1.65 1.6 Trat. 1 Trat. 2 Trat. 3 Trat. 4 Trat. 5 Trat. 6 Trat. 7 Trat. 8 Trat. 9 Tratamientos Figura 18. Combinaciones de fertilizante evaluadas, para la variable altura de esporofitos. En la figura anterior se representa gráficamente el comportamiento de las diferentes combinaciones de fertilizantes evaluadas, en donde el tratamiento 3 (Bayfolán forte con una dosis alta) supero a las otras combinaciones, obteniendo los mejores resultados de la variable altura de esporofitos. El tratamiento 2 (Bayfolán forte con una dosis media) fue igual a la anterior. 60 VIII. CONCLUSIONES La formación de prótalos no fue afectada significativamente por los tipos y dosis de fertilizantes foliares evaluados, en el cultivo de esporas de calahuala. La población de esporofitos por unidad de área (4 cm²) fue afectada por el tipo de fertilizantes foliar aplicado. Mayor población se obtuvo con la aplicación de Bayfolán forte con su dosis media (2 ml/L). La biomasa de esporofitos, en el cultivo de esporas de calahuala fue afectada por el tipo y dosis de fertilizante foliar aplicado. Mayor biomasa se obtuvo con el Aminoleaf, con una dosis media (2 g/L). La altura de esporofitos provenientes del cultivo de esporas de calahuala, fue afectada por el tipo y dosis de fertilizante foliar aplicado. Mayor altura se determinó en el tratamiento que incluyó la aplicación de Bayfolán forte, en una dosis alta (3 ml/L). 61 IX. RECOMENDACIONES Para el cultivo de esporas de calahuala, utilizar en una primera fase (germinación de esporas) el fertilizante Bayfolán forte en dosis de 2 ml/L. Una vez formados los prótalos (segunda fase), utilizar una dosis de 3 ml/L. Se recomienda continuar estudios en el desarrollo del cultivo de esporas de calahuala y evaluar la rentabilidad de la misma, atravez de un análisis económico. 62 X. BIBLIOGRAFÍA ALTERTEC. (1993). Cultivo, aprovechamiento y uso de plantas medicinales. Guatemala. Andrade, J.C. (2003). Búsqueda de sustratos opcionales para la producción bajo cultivo de calahuala Phlebodium pseudoaureum (Cav.) Lellinger. Tesis Ingeniero Agrónomo, Universidad San Carlos de Guatemala, Guatemala. Bertsch, F. (1998). La fertilidad de los suelos y su manejo. Costa Rica: Asociación Costarricense de la Ciencia del Suelo. Caballer, V. y Girón, L. (1991). Proyecto de capacitación en estrategias de exportación; informe del primer taller y primera gira de visitas del sector plantas medicinales y hierbas. Cáceres, A. (1996). Plantas de uso medicinal de Guatemala. Guatemala: Editorial Universitaria. Campezo, S.N. (1999). 1000 plantas medicinales, aromáticas y culinarias. España: Servilibro. CONAP. (2001). Listado de especies de flora silvestre amenazadas de extinción. Guatemala: Secretaria Ejecutiva Departamento de Vida Silvestre. Costa Rica. (1999). Legislación sobre producción orgánica y legislación relacionada. Costa Rica: Ministerio de Agricultura y Ganadería; Servicios Fitosanitarios del Estado. Cronquist, A. (1987). Introducción a la botánica. México: Continental. 63 Demarco, F. y Sarrugeri, H. (1999). Producción orgánica y buenas prácticas de plantas medicinales. Argentina. Dorling Kidersley, U.S. (1983). Un jardín dentro de casa. México: Readers Digest. Hoshizaki, B. (1979). Fern growers manual. New York. Jones, L. ( 1987). Enciclopedia of ferns. Portland: Timber Press. Martínez, V; Bernal, H y Cáceres, A. (2000). Fundamentos de agro tecnología del cultivo de plantas medicinales iberoamericanas. Santa Fe de Bogotá: Convenio Andrés Bello (CAB) programa iberoamericano de ciencia y tecnología para el desarrollo (CYTED). Méndez, G. (2000). Leather leaf, hoja de cuero Rumora adiantifornis. Tesis Ingeniero Agrónomo, Universidad Rafael Landivar, Guatemala: Facultad de Ciencias Agrícolas y Ambientales. Mendoza, J; Ruiz, G y Vargas, A. (2005). Nuevo procedimiento para la propagación por esporas de Phlebodium decumanum y Phlebodium pseudoaureum. Tegucigalpa. Rosales, J.M. (2005). Micro propagación de calahuala Phlebodium pseudoaureum (Cav.) Lellinger con tres tipos de explantes en diferentes medios de cultivo in vitro. Tesis Ingeniero Agrónomo, Universidad de San Carlos de Guatemala, Guatemala. Tánchez, L. (2000). Helechos. Guatemala: Universidad Rafael Landívar. 64 XI. ANEXOS 65 Anexo 1. Costos de producción. Costo del establecimiento y mantenimiento del primer año, para una hectárea del cultivo de calahuala. COSTOS DE CONSTRUCCIÓN E Unidades INSTALACIÓN Postes Total Total Q. Q. 24.00 1168 28032 28032 Alambre tipo cable 2.60/m 8649m 22487 22487 Alambre acerado calibre 10 2.25/m 8649m 19460 19460 Alambre acerado calibre 12 2.4/m 8649m 20758 20758 Alambre acerado calibre 14 2.6/lb 216 562 562 31.0/qq 173 5363 5363 60/m 3 173 10380 10380 115/m 3 86 9890 9890 35/jornal 865 30275 30275 75.00 43 3225 3225 Jornales para aplicación 35/jor 86 3010 3010 Broza /mantillo 5/ qq 865 4325 4325 100/ qq 1297 129700 129700 Q35/jor 865 23975 23975 35/jor 1297 45395 45395 35/jor 216 7560 7560 12.5/ 15222 190275 190,275 Cemento Arena Piedrín Mano de obra total para instalación completa Transporte de la calahuala al lugar SUSTRATOS Turba de calahuala con todo y rizomas. Limpieza del área Siembra Mantenimiento por año Control de malezas Sarán Total 554,672.00 Fuente: Proyecto OEA de plantas medicinales, 2008. 66 Anexo 2. Resultados obtenidos para la variable porcentaje de germinación de prótalos, de la investigación en campo. Repetición 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Tipo de fertilizante Bayfolan Forte Bayfolan Forte Bayfolan Forte Raizal 400 Raizal 400 Raizal 400 Aminoleaf Aminoleaf Aminoleaf Bayfolan Forte Bayfolan Forte Bayfolan Forte Raizal 400 Raizal 400 Raizal 400 Aminoleaf Aminoleaf Aminoleaf Bayfolan Forte Bayfolan Forte Bayfolan Forte Raizal 400 Raizal 400 Raizal 400 Aminoleaf Aminoleaf Aminoleaf Bayfolan Forte Bayfolan Forte Bayfolan Forte Raizal 400 Raizal 400 Raizal 400 Aminoleaf Aminoleaf Aminoleaf Dosis % Germinación de prótalos 1 ml 2 ml 3 ml 1g 2g 3g 1g 2g 3g 1 ml 2 ml 3 ml 1g 2g 3g 1g 2g 3g 1 ml 2 ml 3 ml 1g 2g 3g 1g 2g 3g 1 ml 2 ml 3 ml 1g 2g 3g 1g 2g 3g 80 75 85 50 75 50 80 75 60 75 80 70 75 50 80 50 75 75 75 75 70 75 75 80 60 75 60 60 80 80 50 75 75 75 50 80 67 Anexo 3. Resultados obtenidos para la variable porcentaje de población por unidad de área, de la investigación en campo. Repetición 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Tipo de fertilizante Bayfolan Forte Bayfolan Forte Bayfolan Forte Raizal 400 Raizal 400 Raizal 400 Aminoleaf Aminoleaf Aminoleaf Bayfolan Forte Bayfolan Forte Bayfolan Forte Raizal 400 Raizal 400 Raizal 400 Aminoleaf Aminoleaf Aminoleaf Bayfolan Forte Bayfolan Forte Bayfolan Forte Raizal 400 Raizal 400 Raizal 400 Aminoleaf Aminoleaf Aminoleaf Bayfolan Forte Bayfolan Forte Bayfolan Forte Raizal 400 Raizal 400 Raizal 400 Aminoleaf Aminoleaf Aminoleaf Dosis 1 ml 2 ml 3 ml 1g 2g 3g 1g 2g 3g 1 ml 2 ml 3 ml 1g 2g 3g 1g 2g 3g 1 ml 2 ml 3 ml 1g 2g 3g 1g 2g 3g 1 ml 2 ml 3 ml 1g 2g 3g 1g 2g 3g Población de esporofitos/unidad de área (4 cm²) 25 37 36 8 13 21 23 24 22 22 34 14 18 14 19 7 17 23 11 28 14 10 11 25 25 11 27 16 32 11 13 12 24 19 14 18 68 Anexo 4. Resultados obtenidos para la variable biomasa, de la investigación en campo. Repetición 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Tipo de fertilizante Bayfolan Forte Bayfolan Forte Bayfolan Forte Raizal 400 Raizal 400 Raizal 400 Aminoleaf Aminoleaf Aminoleaf Bayfolan Forte Bayfolan Forte Bayfolan Forte Raizal 400 Raizal 400 Raizal 400 Aminoleaf Aminoleaf Aminoleaf Bayfolan Forte Bayfolan Forte Bayfolan Forte Raizal 400 Raizal 400 Raizal 400 Aminoleaf Aminoleaf Aminoleaf Bayfolan Forte Bayfolan Forte Bayfolan Forte Raizal 400 Raizal 400 Raizal 400 Aminoleaf Aminoleaf Aminoleaf Dosis 1 ml 2 ml 3 ml 1g 2g 3g 1g 2g 3g 1 ml 2 ml 3 ml 1g 2g 3g 1g 2g 3g 1 ml 2 ml 3 ml 1g 2g 3g 1g 2g 3g 1 ml 2 ml 3 ml 1g 2g 3g 1g 2g 3g Peso (g) 0.498 0.511 0.509 0.499 0.494 0.456 0.478 0.514 0.515 0.487 0.509 0.499 0.478 0.515 0.478 0.498 0.535 0.497 0.485 0.525 0.521 0.505 0.501 0.501 0.525 0.52 0.525 0.505 0.521 0.489 0.498 0.498 0.512 0.488 0.525 0.505 69 Anexo 5. Resultados obtenidos para la variable altura de esporofitos, de la investigación en campo. Repetición 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Tipo de fertilizante Bayfolan Forte Bayfolan Forte Bayfolan Forte Raizal 400 Raizal 400 Raizal 400 Aminoleaf Aminoleaf Aminoleaf Bayfolan Forte Bayfolan Forte Bayfolan Forte Raizal 400 Raizal 400 Raizal 400 Aminoleaf Aminoleaf Aminoleaf Bayfolan Forte Bayfolan Forte Bayfolan Forte Raizal 400 Raizal 400 Raizal 400 Aminoleaf Aminoleaf Aminoleaf Bayfolan Forte Bayfolan Forte Bayfolan Forte Raizal 400 Raizal 400 Raizal 400 Aminoleaf Aminoleaf Aminoleaf Dosis 1 ml 2 ml 3 ml 1g 2g 3g 1g 2g 3g 1 ml 2 ml 3 ml 1g 2g 3g 1g 2g 3g 1 ml 2 ml 3 ml 1g 2g 3g 1g 2g 3g 1 ml 2 ml 3 ml 1g 2g 3g 1g 2g 3g Altura de esporofitos (cm) 1.8 1.85 1.88 1.75 1.78 1.79 1.75 1.77 1.8 1.79 1.89 1.88 1.72 1.77 1.8 1.74 1.77 1.8 1.76 1.89 1.91 1.71 1.78 1.78 1.74 1.78 1.8 1.78 1.89 1.9 1.71 1.76 1.78 1.75 1.77 1.79 70 Anexo 6. Costos de la investigación. INSUMOS RECOLECCION DE ESPORAS Obtención de esporas Tubos de ensayo Silbines de 75 watts Sockets Cable de luz Ciento de hojas papel bond SIEMBRA DE ESPORAS Bandejas tipo jumbo Pet moss (sun grow) Agua desmineralizada Rollo de papel aluminio Rollo de plástico wrap Masking tape Eppendorf Malla cernidora Mesas de madera Fungicida FERTILIZACION DE ESPORAS Fertilizante foliar Bayfolán forte Fertilizante foliar Raizal *400 Fertilizante foliar Aminoleaf Asperjadores Bomba de mochila INSTALACION DE LUZ Cable de luz Sockets Lámparas de 22 watts Cinta de aislar MANO DE OBRA TOTAL UNIDADES TOTAL Q. SUB-TOTAL Q. 50/jornal 5.00 60.00 10.00 6.50/mt 9.00 5 2 3 3 3 5 250.00 10.00 180.00 30.00 19.50 45.00 534.50 2.50 250.00 20.00 10.00 15.00 10.00 1.25 16.50/mt 50.00 160.00 50 1 10 5 5 3 50 1 3 1 125.00 250.00 200.00 50.00 75.00 30.00 62.50 16.50 150.00 160.00 1119.00 65.00 1 65.00 80.00 1 80.00 70.00 1 70.00 15.00 400.00 3 1 45.00 400 6.50/mt 10.00 45.00 7.00 50/jornal 5 3 3 1 50 32.50 30.00 135.00 7.00 660.00 204.50 2500.00 5018.00 71