SC00-026. BIO-PCR, un nuevo método de detección de

Investigación y Desarrollo Agroalimentario - 1999-2000
SC00-026. BIO-PCR, un nuevo método de detección
de "grasa" en semilla de judía (Phaseolus vulgaris).
Caracterización genética y patogénica de
Pseudomonas syringae patovares phaseolicola y
syringae
Investigador principal
Organismo
Ana J. González Fernández
SERIDA
Equipo investigador
Juan José Ferreira Fernández
Elena Landeras Rodríguez
Mª Carmen Mendoza Fdez.
SERIDA
Lab. Sanidad Vegetal
Universidad de Oviedo
Objetivos
nOptimizar y valorar la técnica BIO-PCR para la
detección de P. syringae pv. phaseolicola en
semilla de judía.
nEstablecer el mapa epidemiológico de las
bacteriosis en el Principado de Asturias.
nProponer un sistema de tipificación genético
para P. syringae.
nCaracterización patogénica de P. syringae pv.
phaseolicola para determinar las razas presentes en Asturias.
Resultados
Optimización y valoración de la
técnica BIO-PCR para la detec ción de P. syringae pv. phaseoli cola (denominada actualmente
P. savastanoi pv. phaseolicola)
en semilla de judía
Se ensayó el método con las cepas de la
colección del SERIDA que están identificadas y
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caracterizadas, y con tres cepas de referencia
de la Colección Española de Cultivos Tipo
[CECT 321 (pv. phaseolicola), 94 (pv. sin especificar) y 126 (pv. tomato)]. El total de cepas
ensayadas fue de 63, de las cuales 13 correspondían al pv. syringae, 48 al pv. phaseolicola y
dos fuera de tipo. Los resultados que se presentan a continuación son todavía parciales.
Partiendo del ADN total de las cepas, se
realizó tanto la PCR-anidada o "nested-PCR" tal
como se ha descrito en el método (Schaad et
al., 1995), como los dos pasos por separado,
es decir, con el par externo por una parte y con
el interno por otra. También se han ensayado
los iniciadores descritos por Prosen et al.
(1993).
Mediante PCR-anidada se encontró que de
la totalidad de las cepas del pv. phaseolicola
ensayadas aparecía la banda descrita por los
autores (400 pb) en 40 de ellas, lo que supone
la detección de un 85% de las cepas. De las
cepas del pv. syringae ensayadas (cinco en
este caso) se detectó la banda en dos de ellas,
contrariamente a lo esperado.
Cuando se realizó la PCR con el primer par
de iniciadores (5.1-3.1), se encontró que las
trece cepas del pv. syringae ensayadas daban
un resultado negativo, que era el esperado, y
de las 48 cepas del pv. phaseolicola, el 44%
amplificaban la banda de 500 pb descrita por
los autores. Con el segundo par de iniciadores
(5.2-3.2), de las trece cepas del pv. syringae
ensayadas, en tres casos se detectaba la banda
de 400 pb descrita, contrariamente a lo esperado, y en 42 cepas del pv. phaseolicola ensayadas, amplificaban la banda sólo el 33,3% de
las mismas.
Área de Cultivos Hortofrutícolas y Fores tales
A la vista de los resultados, no podemos
considerar que la técnica sea universal y específica para el pv. phaseolicola, puesto que en
nuestra serie no es capaz de clasificar correctamente todas las cepas. Sin embargo, dadas
las ventajas de las técnicas de PCR para realizar diagnósticos rápidos, vamos a seguir los
ensayos para intentar conseguir ajustar al máximo la correcta clasificación de las cepas de
nuestra serie. Por otro lado, estos resultados
nos indican que existen diferencias en la faseolotoxina entre las cepas ensayadas que podrían servirnos para caracterizar mejor las bacterias en estudio.
Con los iniciadores descritos por Prosen et
al., se ensayaron 54 cepas en total, de las cuales en las correspondientes al pv. syringae
(siete) no hubo amplificación, resultado concordante con lo esperado. Sin embargo, de las 47
cepas ensayadas correspondientes al pv. pha seolicola, sólo en seis se obtuvo amplificación
de la banda de 1,9 Kb descrita por los autores,
lo que representa la detección de sólo el
12,76% de las cepas.
Recogida de muestras de semi llas y análisis de las mismas
Se analizaron dos muestras de semillas, de
las cuales una dio resultado negativo y en la
otra se aisló P. syringae pv. syringae. Se dispone, además, de otras cuatro muestras de semilla procedentes de fincas infectadas por P.
syringae pv. phaseolicola, interesantes para
contrastar la utilidad del método BIO-PCR.
Además, se recogieron cinco cepas del pv.
phaseolicola y cuatro del pv. syringae, a partir
de 13 muestras de hojas y vainas analizadas,
que se han incluido en los ensayos.
Caracterización genética de las
cepas
Se realizó PCR-ribotipificación utilizando los
cebadores rib1 y rib2 (Kostman et al., 1992),
con los que se consiguió diferenciar muy pocos
tipos, de forma que todas las cepas de la serie
correspondientes a los pvs phaseolicola y syrin gae dan dos perfiles diferentes indistintamente
del patovar al que pertenezcan. Se van a ensayar otros cebadores descritos para genes ribosomales y todas las combinaciones posibles de
los mismos. También se dispone ya de los
cebadores REP y ERIC que nos permitirán
ensayar la caracterización de las cepas
mediante esta técnica, y se han iniciado los
ensayos mediante RAPD.
Caracterización patogénica de P.
syringae pv. phaseolicola
Se multiplicaron las variedades enviadas por
el Dr. J.D. Taylor y se dispone de semilla para
comenzar los ensayos de patogenicidad,
excepto en el caso de Ph. acutifolius que habrá
que multiplicar en el ciclo de primavera para
conseguir mayor cantidad de semilla.
Referencias bibliográficas
Kostman, J.R.; Edlind, T.D.; LiPuma, J.J.; Stull,
T.L.; 1992. Molecular epidemiology of
Pseudomonas cepacia determined by polimerase chain reaction ribotyping. J. Clin.
Microbiol. 30: 2084-2087.
Prosen, D.M.; Hatziloukas, E.; Schaad, N.W.;
Panopoulos, N.J. 1993. Specific detection of
Pseudomonas syringae pv. phaseolicola
DNA in bean seed by polimerase chain
reaction-based amplification of a phaseolotoxin gene region. Phytopathology 83: 965970.
Schaad, N.W.; Cheong, S.S.; Tamaki, S.;
Panopoulos, N.J.; Hatziloukas, E.; Panopoulos, N.J. 1995. A combined biological and
enzymatic amplification (BIO-PCR) technique to detect Pseudomonas syringae pv.
phaseolicola in bean seed extracts.
Phytopathology 85: 243-248.
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