Tesis - Universidad de Colima

UNIVERSIDAD DE COLIMA
Doctorado en ciencias: Área Ciencias Agrícolas y Forestales
Especiación recombinacional y relaciones filogenéticas en Satureja
macrostema var. laevigata.
TESIS
Que para obtener el Grado de
Doctor en Ciencias
Área Ciencias Agrícolas y Forestales
Presenta:
José Mario Aguilar Ramírez
Asesores:
Dr. Víctor M. Villalobos Arámbula
Dra. Martha I. Vergara Santana
Dr. Rafael Salgado Garcíglia
Dr. Alfonso Pescador Rubio
Dr. Sebastián Lemus Juárez
Dr. Roberto Lezama Gutiérrez
Tecomán, Colima, México.
Octubre del 2002
UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS
OFICIO No. 593/2002.
C. JOSE MARIO AGUILAR RAMIREZ
EGRESADO DEL DOCTORADO EN CIENCIAS
AREA: CIENCIAS AGRICOLAS Y FORESTALES PRESENTE.
Con fundamento en el dictamen emitido por el jurado revisor del colegiado del
área: de Ciencias Agrícolas y Forestales de esta Facultad a mi cargo, de su trabajo de
tesis de Doctorado y en virtud de que efectuó las correcciones y acató las sugerencias
que le habían indicado los integrantes del mismo, se le autoriza la impresión de la tesis "
Especiación recombinacional y relaciones filogenéticas en Satureja macrostema
var. laevigata ", misma que ha sido dirigida por los C.C.Dr. Víctor M. Villalobos Arámbula,
Director de la oficina de Asuntos Internacionales de la SAGARPA, México, D.F. y el Dr.
Rafael Salgado Garciglia, Profesor Investigador de la UMSNH.
Este documento reunió todas las características apropiadas como requisito parcial
para obtener el grado de Doctor en Ciencias; Área: Ciencias Agrícolas y Forestales y fue
revisado en cuanto a forma y contenido por los C.C. Dr. Sebastián Lemus Juárez, la Dra.
Martha Imelda Vergara Santana , Dr. Roberto Lezama Gutiérrez y el Dr. Alfonso Pescador
Rubio, Profesores Investigadores de la Universidad de Colima.
Sin otro particular de momento, me despido de usted muy cordialmente.
C.P. EXPEDIENTE ACADEMICO DEL ALUMNO
C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE.
C.C.P. ARCHIVO. Of. No. 593/2002.
VMD/Lety**
Km 40 Autopista Colima-Manzanillo • Tecomán, Colima, México • CR 28100
Tel. 01 (313) 322 94 05 • Ext. 52251 • Fax 52252 • [email protected]
DEDICATORIA
A mi esposa e hijos:
Adriana
Mario Alberto
Y
Michele Ekatherin
Fuente de alegrías y satisfacciones
Razón de mi ser y la fuerza que me impulsa en el logro de mis más grandes
anhelos.
AGRADECIMIENTOS
Al INIFAP por todas las facilidades brindadas.
Al Dr. José Luis Hernández Mendoza. por la oportunidad que nos otorgó de
estudiar en el PICAF.
Al Dr. Víctor M. Villalobos Arámbula, por su apoyo y disposición cuando lo
necesite.
Mi profunda gratitud al Dr. Rafael Salgado Garcíglia, quien siempre mostró su
disposición y apoyo incondicional y porque desde el principio y hasta el final me
respaldo.
Especial agradecimiento a la Dra. Martha I. Santana Vergara, por sus enseñanzas
teóricas y constante estímulo, que permitieron el logro de esta meta y que sin
duda quedaron plasmadas en el documento.
Al Dr. Abraham García Chávez, por su colaboración en el laboratorio de Biología
Molecular del CINVESTAV-lrapuato por todos sus comentarios y apoyos
bibliográficos
Mi reconocimiento a cada uno de mis asesores por sus valiosas sugerencias, Dr.
Alfonso Pescador Rubio, Dr. Sebastián Lemus Juárez y al Dr. Roberto Lezama
Gutiérrez.
A mis compañeros del PICAF
A mis compañeros de trabajo, especialmente a los C. Ing. Jesús Muñoz Flores e
Ing. Miguel Ángel Hernández López, por hacerme fuerte en los momentos de
apuro.
Finalmente a todos mis amigos y familiares de quienes solo recibí su apoyo, por el
sacrificio de su amistad.
CONTENIDO
I
II
2.1
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.1.4
2.1.4.1
2.1.4.2
2.1.4.3
2.1.4.4
2.1.4.5
2.1.4.6
2.1.5
2.1.6
2.1.6.1
2.1.6.2
2.1.6.3
2.1.6.4
III
IV
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
4.10
4.11
4.12
4.13
4.14
4.15
ÍNDICE DE CUADROS
ÍNDICE DE FIGURAS
RESUMEN
SUMMARY
INTRODUCCIÓN
REVISIÓN DE LITERATURA
Evolución
Teoría del equilibrio puntuado
Especiación
Filogénesis y Filogenia
Marcadores moleculares
Marcadores moleculares en plantas
Caracteres moleculares
Secuencias
La región de ITS del ADN Ribosomal del núcleo (nrADN)
La región de los espaciadores internos transcritos (ITS) del
nrADN en angiospermas y gimnospermas
ITSs en angiospermas
Satureja macrostema (Labiatae) como modelo de estudio
Clasificación botánica de Satureja macrostema (Benth) Briq
Descripción de la especie Satureja macrostema (Benth) Briq
Distribución geográfica
Importancia, usos y propiedades curativas del té nurite(S.
macrostema).
Usos actuales y potenciales.
PROBLEMA ESPECÍFICO, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
MATERIALES Y MÉTODOS
Colecta e Identificación del material vegetal.
Extracción y limpieza del ADN
Extracción del ADN
Determinación de la concentración del ADN
Determinación de la calidad del ADN
Espacios transcritos internos (ITS).
Primera amplificación del ADN.
Limpieza.
Segunda amplificación
Purificación de ADN.
Secuenciación
Alineación de secuencias.
Búsqueda y reporte de secuencias en el GenBank.
Determinación de la distancia genética.
Determinación de la distancia genética y filogenia por medio de
Página
i
iii
iv
i
1
5
5
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43
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47
48
48
51
51
51
52
52
53
53
54
55
55
57
4.16
cladogramas.
Filogenia de las secuencias obtenidas.
57
58
V
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
RESULTADOS
Extracción del ADN
Amplificación
Secuencias
Recorte de secuencias
Alineación
Comparación con algunos Géneros de la misma Familia
Dendrogramas
Números de accesión en el GenBank
59
VI
DISCUSIÓN
85
VII
CONCLUSIONES
108
VIII
LITERATURA CITADA
110
60
61
62
63
80
83
84
i
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Características de las localidades donde se colectó
material botánico
de S. macrostema.
Ejemplares de S. macrostema utilizados en el estudio.
Secuencias obtenidas por espécimen de Satureja
macrostema con los
primers ITS1-4.
Longitud del ITS1, 5.8S e ITS2; promedio y contenido de
G+C.
Número de veces que aparecen las "Palabras" formadas
por Trinucleótidos y Dinucleótidos en los ITS1 e ITS2 al
comparar SATIN contra SATIB
Número y porciento de purinas (adeninas-ti minas) y
piridiminas
(citosinas-guaninas), de SATIN-SATIB y SATSJ-SATPA.
Comparación entre secuencias SatIN contra SatIB
Comparación entre secuencias SatSJ contra SatIB
Comparación entre secuencias SatSJ contra SatPA
Comparación entre secuencias SatIN contra SatPA
Comparación entre secuencias SatIN contra SatSJ
Comparación entre secuencias SatPA contra SatIB
Porciento de emparejamiento, alineamiento, deleciones,
inserciones y
mutaciones (transversiones y transiciones)
Tipo de mutación (transversión-transición) y n° de sitio
por ITS
Reporte de alineamiento del gene 5.8S de Satureja
macrostema
Porciento de Similaridad y Divergencia del Gene 5.8S de
S.
Macrostema
Reporte de alineamiento del espaciador ITS1 de S.
macrostema
Reporte de alineamiento del espaciador ITS2 de S.
macrostema
Reporte de alineamiento de la región ITS1-5.8s-ITS2 de
S. macrostema
Página
47
48
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72
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75
76
77
78
ii
20
21
22
Porciento de Similaridad y Divergencia de la región ITS1-5.8sITS2 de
S. macrostema
comparación de Satureja con otras especies de otros géneros
Porcentajes de divergencia y similitud entre plantas de Satureja
y
otras especies de otros Géneros
79
82
84
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Página
Distribución del te nurite (S. macrostema) en el Estado de
42
Michoacán
Gel 1 Electroforesis del DNA de diferentes especimenes de S.
60
Macrostema
Gel 2 Amplificación de la región ITS1-5.8s-ITS2 con los primers
60
ITS 1
Árboles filogenéticos del alineamiento del gene 5.8 S de S.
75
Macrostema
Árboles filogenéticos del alineamiento de la región ITS1-5.8s79
ITS2 de
S. macrostema.
Fenograma de distancias genéticas usando Meg Align de
83
DNASTAR Software, entre géneros de Labiatae, usando a
Ipomea y a Heliopsis como grupos externos. La filogenia de
Satureja macrostema se resalta con las líneas negras más
intensas. Los números de la línea inferior indican el porciento
de disimilitud entre los ITSs de las diferentes especies
Cladograma de máxima similitud usando Meg Align de
83
DNASTAR Software. Los números de la linea inferior indican el
tiempo de divergencia entre los ITSs de las diferentes especies
en decenas de miles de años.
Relaciones evolutivas y distancia genética de S. macrostema
91
en
Estudio
Predicción del posible ARNm que formarían las secuencias 97
ITS1-2 de
las especies de S. macrostema en estudio y reportadas del
Genebank
iv
RESUMEN
Especiación recombinacional y relaciones filogenéticas en Satureja
macrostema var. laevigata.
José Mario Aguilar Ramírez
Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de
Colima, Apartado postal N° 36, C.P. 28100, Tecomán, Colima, México.
La evolución es un cambio genético que sufre una población de organismos en el
transcurso del tiempo, o "descendencia con modificación", y la teoría del equilibrio
puntuado propone que el registro fósil refleja la manera en que ocurrió la
evolución, con largos periodos de rápida especiación, los resultados obtenidos en
el presente estudio sugieren que S macrostema var. laevigata, se encuentra
actualmente en período de especiación rápida (híbrida o recombinacional), la cual
es de tipo puntuado y el análisis de las secuencias de la región de los ITS de S.
macrostema var. laevigata sugiere que las plantas en estudio pueden ser
consideradas como especies. La gran utilidad de las técnicas moleculares es que
permiten observar diferencias directamente en el ADN, es decir en la molécula
química que contiene toda la información genética del organismo, este es el
máximo nivel de resolución posible y así pueden inferirse las relaciones
filogenéticas en especies y subespecies.
Palabras Clave: Evolución, Especiación, Secuencias, ADN.
v
SUMMARY
Recombinational speciation and phylogenetic relationships in
Satureja macrostema var. laevigata.
José Mario Aguilar Ramírez
Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de
Colima, Apartado postal N° 36, C.P. 28100, Tecomán, Colima, México.
The evolution is a genetic change that a population of organisms suffers in the
course of the time, or "descendant with modification", and the theory of the
punctuated balance intends that the fossil registration reflects the way in that
happened the evolution, with long periods of quick speciation. The results obtained
in this study suggest that S macrostema var. laevigata, is at the moment in period
of quick speciation (hybrid or recombinational) which is of punctuated type. The
analysis of the sequences of the region of the ITS of S. macrostema var. laevigata
suggests that the plants in study can be considered as species. The great utility of
the molecular techniques is that they allow to observe differences directly in the
DNA, that is to say in the chemical molecule that contains all the genetic
information of the organism, this it is the maximum leve) of possible resolution and
the phylogenetic relationships can be inferred this way in species and
subspecieses.
Key Words: Evolution, Speciation, Sequences, DNA.
1
I.
INTRODUCCIÓN
El concepto de evolución, es esencial en el desarrollo de las ciencias de la
vida, y ha aportado nuevas y revolucionarias maneras para responder a las
preguntas que el hombre se ha planteado durante siglos, de las cuales las más
importantes son: "¿porqué estoy aquí, cuál es el propósito de la existencia
humana?", y "¿en que consiste la naturaleza del mundo de vida que nos rodea? "
(Dobzhansky, 1982).
Actualmente la llamada "Teoría Sintética de la Evolución" se apoya en la
"Teoría Darwinista de la Selección", en los conocimientos de la genética y del
tratamiento matemático de la dinámica de poblaciones, abarcando la teoría del
gen, la teoría cromosómica, y la evolución molecular. Las investigaciones
evolucionistas se desarrollan principalmente en dos direcciones: por una parte la
biología evolucionista especial (relativo al concepto de especie), que trata de
explicar la filogénesis y el parentesco de grupos de especies más o menos
grandes y por la otra la biología evolucionista general (Ayala et al., 2000).
Tras establecerse esta nueva gran síntesis de genética de poblaciones se
planteó la cuestión de sí los procesos filogenéticos más importantes como son, el
proceso evolutivo y la formación de nuevas especies, quedaban explicadas por
esta teoría (Ayala et al. 2000; Filchak et al., 2000), o si se requerían otras
explicaciones complementarias, dicho de otro modo: ¿son suficientes los tres
mecanismos (mutación, selección y aislamiento) propuestos por la Teoría Sintética
de la Evolución, para explicar cualquier fenómeno evolutivo, o por el contrario,
proponer otros posibles mecanismos?
Los tres mecanismos estudiados se han promovido como respuesta al gran
desafío de la biología evolutiva: el entender los procesos genéticos involucrados
en la formación de especies, ya que estos procesos son responsables de la
diversidad biológica existente. Estos procesos han sido difíciles de estudiar por los
distintos
2
mecanismos de especiación que se han reportado. Cada uno con rasgos únicos
que dificultan su estudio (Rieseberg y Ungerer, 1999).
Entre otras teorías surgidas con la finalidad de aportar explicación a
mecanismos evolutivos se encuentra la "Teoría del Equilibrio Puntuado", la cual a
través del registro fósil propone que la evolución ocurre con largos periodos de
rápida especiación (surgimiento de una o más especies), estos periodos de rápida
especiación pueden ser causados por grandes cambios en el ambiente, cuando se
rompe el equilibrio por la acumulación de mutaciones (Sheldon, 2000)
Un reflejo o manifestación del proceso de evolución, puede ser observado a
través de la ubicación de los organismos en el llamado "árbol de la vida", que es
un gráfico que representa las relaciones filogenéticas entre los diferentes taxones,
resultando en una hipótesis sobre las relaciones filogenéticas de un taxón
(Christoffersen, 1995; Bush, 2001), construidos mediante semejanzas de
secuencias y basados en métodos de distancias (Swofford et al., 1996). Así, la
filogenia, ocupa un lugar central en la sistemática y en la taxonomía, al ayudar a
resolver problemas de ubicación y nomenclatura de organismos (Forey, 1992),
entre los métodos empleados para inferir filogenia, los que consideran la obtención
de datos moleculares proporcionan registros indirectos de los eventos de
especiación y ofrecen un enorme potencial para la investigación de las causas
generales y las tasas de especiación dentro de clados (Barraclough y Nee, 2001).
La técnica de análisis molecular que permite el estudio de la región de los
espaciadores internos transcritos (ITS) ha sido considerada como una fuente muy
útil de caracteres para estudios filogenéticos en angiospermas (Baldwin et al.
1995). Dado que los ITS se encuentran altamente representados en el genoma, se
pueden amplificar con cantidades pequeñas de ADN y las secuencias altamente
conservadas dentro de la mayoría de los genes del nrADN son muy útiles en el
diseño de oligonucleótidos ("primers") "universales", lo que facilita la amplificación
de los ITS mediante el uso de la reacción en cadena de la polímerasa (PCR)
(Liston 1992;
3
Planta Y Raué, 1999). Los espaciadores internos transcritos son la parte más
variable de la región de los ITS, la región de los ITS comprende el ITS2, la
subunidad 5.8S y el ITS1, debido a que se encuentran flanqueando a la subunidad
5.8S, que es más conservada y se posibilita la alineación no ambigua de esta
región (Baldwin et al., 1995).
La región de los espaciadores internos transcritos (ITS) ha sido
ampliamente usada para el esclarecimiento de las relaciones entre taxa a niveles
inter e intragenéricos, así como intraespecíficos en angiospermas (Hamby y
Zimmer, 1992; Baldwin et al., 1995; Buckler y Holtsford 1996; Liston et al., 1996).
Respecto al proceso de especiación, se han reportado diferentes
modalidades del mismo, entre estas, la especiación simpátrica (en que las nuevas
especies surgen sin el aislamiento geográfico es decir, en el mismo lugar
geográfico) es el origen de dos o más especies de una sola población local
(Kondrashov y Kondrashov, 1999; Dieckmann y Doebeli, 1999), puede ocurrir
cuando el flujo genético es eliminado entre las poblaciones y se forman especies
nuevas, por rangos de distribución, dado que se genera aislamiento en el mismo
sitio por variación de nichos (Mousseau y Olvido, 2001), e Incluye la poliploidía e
hibridización que son mecanismos importantes de especiación en plantas
(Rieseberg, 1999, Widmer y Baltisberger, 1999; Rieseberg y Ungerer, 2001)
El mecanismo de hibridación o "recombinación" puede dar origen a nuevas
especies, y se señala que la "especiación recombinacional" utiliza este mecanismo
para tal fin, al hibridizarse especies paternales divergentes genética o
cromosómicamente; además la teoría predice que este modo de especiación es
puntuada, pero ha sido poca la evidencia empírica generada para apoyarla
(Ungerer et. al., 1998). Los estudios de especiación pueden ser estudiados en
plantas sujetas a selección artificial, como es el caso de Satureja macrostema.
4
McVaugh y Schmid (1967) mencionan que existen dos variedades dentro
de Satureja macrostema y son; S. macrostema var. macrostema y S. macrostema
var. laevigata señalando que ambas variedades se han reportado para el estado
de Michoacán, y que quizás actualmente se traslapan en algunas áreas del centro
de la entidad, por lo que cabría la posibilidad de que ambas hibridicen, asimismo
mencionan que algún flujo de genes entre las dos variedades parece probable.
El género Satureja ha sido tradicionalmente usado como estimulante,
estomático, carminativo, expectorante y afrodisíaco. El aceite esencial ha
demostrado actividad antimicrobial y antidiarreica por los compuestos fenólicos
que contiene y ha sido usado en el tratamiento contra el cáncer (Simon, et al.,
1984; http://www.hort. purdue.edu. Newcrop /med.aro/savory.), como antioxidante
(Lagouri y Boskou, 1996); también ha mostrado actividad contra los virus HSV-1 y
VSV (Abad et al., 1999) y actividad anti-HIV-1 (Yamasaki et al., 1998).
Con base en lo anterior, Satureja macrostema var. lavígata fue considerado como
modelo de estudio para determinar las relaciones filogenéticas entre cuatro
poblaciones de esta variedad presentes en el estado de Michoacán, e inferir el
proceso de especiación que podría estar en desarrollo.
5
II. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. Evolución.
Para Dobzhansky (1982), la evolución es un hecho histórico completamente
establecido, y pregunta ¿qué factores son responsables del cambio evolutivo?, y
menciona que la evolución es ante todo un proceso genético, y la genética de
poblaciones es la disciplina biológica que suministra los principios teóricos de la
evolución. Para Mayr (1997), la evolución no es solamente un cambio en la
frecuencia genética sino una mejor respuesta de la capacidad de adaptación. La
evolución es la transformación hereditaria de los organismos, a través de las
generaciones y las especies, por cambios en el material genético. Dado que los
organismos interactúan con su ambiente, los cambios de éste influyen directa o
indirectamente en el curso de la evolución (Myers y Knoll, 2001).
Para Stebbins (1999), la evolución es un proceso de dos pasos que
requiere de la variación genética inicial dentro de las poblaciones, así como de la
modelación de esta variación vía la recombinación del gen y de la selección
natural, y una de sus preguntas de estudio es ¿la aplicación indiscriminada de
insecticidas y herbicidas a las poblaciones de plantas con el propósito de la
eliminación de pestes y cizañas esta induciendo su evolución hacia la resistencia a
las mismas?, y menciona que la crisis biótica y la pérdida de la biodiversidad están
afectando los procesos de evolución.
Resumiendo, la evolución es la teoría que explica la diversidad de los seres
vivos, se ocupa de los mecanismos que producen cambios en los organismos y
del mismo cambio, así como la repercusión que para los organismos suponen
estos cambios (Reznick, 2000; Sheldon, 2000,Callahan, 2001).
6
La biología moderna se construye actualmente alrededor de dos
paradigmas centrales 1) la evolución como centro de un gran rango de disciplinas
(como la sistemática, ecología, paleontología, historia natural y genética), y 2) la
expresión del gen (enfoque de la bioquímica, biología molecular, biología celular,
fisiología, biología del desarrollo y genética); la unión de estos dos grandes
paradigmas es lo que constituye actualmente la última síntesis (Schneider, 1999).
La era genómica revolucionó la biología evolucionarla, y algunas de sus
preguntas actuales son: ¿cuánta de la diversidad genómica y fenómica en la
naturaleza es adaptada y procesada por la selección natural?, ¿cuál es el origen y
evolución de los procesos de adaptación y especiación bajo variables ambientales,
espacio temporales macro y microgeográficas? (Nevo, 2001); otras grandes
preguntas son: ¿cuánto de la diversidad del genoma codificado y no codificado
afecta los procesos de adaptación y especiación?, y ¿cuánta de esta diversidad
codificada y no codificada contribuye a la regulación y adaptación diferencial de
los organismos y está sujeta a la selección natural?, ¿qué proporción de la
diversidad génica y no génica observada es mantenida por la selección?, ¿cuánta
de la diversidad no codificada en el ADN está adaptada y regula la expresión del
gen, la transcripción, translación, recombinación y reparación? (Nevo, 2001),
¿cómo surgen o se originan nuevas especies? (Korol, 2000); ¿cómo el ambiente y
las interacciones ecológicas influyen en la formación de nuevas especies?
(Schneider, 2000), se agregan las preguntas de Francis y Kingston (2001): ¿Cómo
puede el mismo gen recordar que esta apagado en un linaje celular y encendido
en otro?. Estas preguntas de la biología evolucionarla esperan respuestas.
Respecto al problema de la diversidad, Darwin lo estudia y en su obra "El
origen de las especies", Darwin propuso la explicación a ese problema. Sin
embargo, de acuerdo con Harder (2001), el problema no es solo explicar la
diversidad de la vida así como el número de especies y la variedad de sus
fenotipos.
7
La teoría científica aceptada actualmente para explicar la evolución, fue
propuesta por Darwin en su obra "On the Origin of species" (Bowler 1999; Reznik,
2000; Filchak et al., 2000) y puede ser resumida en los siguientes principios:
(1) Los individuos dentro de una especie y toda población biológica pueden tener
genes similares, pero aún así, diferirán en las características del fenotipo y en su
comportamiento debido a las diferencias existentes también en el genotipo y a las
respuestas ambientales, este es el principio de la "variación" (Harrison, 2000).
(2) Las variaciones pueden ser transmitidas de una generación a la siguiente, y la
progenie de los individuos que presentan una variación particular, tenderán a tener
esa misma variación, ese es el principio de la "herencia" (Harrison, 2000).
(3) Algunas de estas variaciones le dan a los poseedores de la misma una ventaja
en su vida (ó impiden una desventaja, lo que en términos relativos es lo mismo),
permitiendo que el organismo obtenga más alimento, escape más eficientemente
de sus predadores, utilice los recursos de su medio ambiente con mayor eficacia,
etc.. Esta progenie, debido al principio de la herencia, tiende a poseer las mismas
variantes benéficas que sus predecesores, lo que hace que a través del tiempo, la
frecuencia de estas variaciones ventajosas se incremente. Este es el principio de
la "selección natural" (Harrison, 2000; Reznik, 2000).
Estos principios se combinan para formar el núcleo del modelo evolutivo (Bowler,
1999). El punto de vista Darwiniano tradicional afirma que pequeños cambios
incrementales en la estructura y comportamiento de los organismos, ocasionados
por la selección natural de las variaciones, producen, luego de un largo periodo de
tiempo, organismos tan diferentes a sus ancestros, que ya no son más los mismos
organismos, y deben ser entonces clasificados como especies diferentes (Ayala et
al., 2000).
8
La teoría de la evolución biológica ve en las poblaciones y en las especies
las unidades básicas de la evolución. El cambio evolutivo se realiza mediante:
mutaciones genéticas, cambios en la estructura y número de los cromosomas,
mutaciones de los portadores extranucleares de la herencia, recombinación,
selección, aislamiento, hibridación y alteraciones casuales de las frecuencias
génicas en poblaciones pequeñas o por fluctuaciones del tamaño de la población
(Johnston, 1999; Ennis, 2000; Bazzaz, 2001; Cupples, 2001).
Por otro lado, la palabra "mutación" término de origen latín mutare cambiar, fue usado para indicar un cambio hereditario por el botánico holandés y
biólogo evolutivo Hugo De Vries (Johnston 1999). Es decir cualquier alteración del
material genético heredable, incluye fenómenos diversos tales como: cambios en
el número de cromosomas, cambio en la estructura de conjunto de los
cromosomas y cambios dentro de los genes mismos (Harrison 2000). La pregunta
fundamental acerca de la naturaleza de las mutaciones, es ¿qué mecanismos y
que factores controlan y tasan la mutagénesis? Esta pregunta ha estado en el
centro de un intenso estudio durante las últimas décadas, los Investigadores que
han trabajado sobre la mutagénesis han realizado estudios para comprender los
orígenes de las mutaciones y sus efectos en los procesos biológicos como la
carcinogénesis y la evolución. (Harrison 2000; Ennis 2000; Cupples 2001).
De Vries "descubridor" de Mendel, publicó "Die mutations theorie", y concluyó en
gran parte que la evolución se efectúa por medio de cambios discretos repentinos,
o "mutaciones", como él las llamó aunque sus ideas fueron inaceptables como una
teoría evolutiva general, y muchos de los cambios repentinos que observó
resultaron que no eran debido a las mutaciones, sino debido a la redistribución de
la variación genética existente por la recombinación (Johnston, 1999). De Vries
reconoció la importancia de la mutación como un proceso genético fundamental.
En realidad, la mutación es la fuente principal de toda nueva variación genética y
sin ella no habría sido posible la evolución (Johnston, 1999). "La causa principal
de variabilidad que hace posible el proceso evolutivo de la vida son las
mutaciones, que no son sino
9
alteraciones espontáneas del material hereditario (Grant y Shoemaker, 2000;
Harrison, 2001).
En relación con lo anterior se reconocen varios tipos de mutaciones, la más
común es la llamada "mutación puntiforme" causada por un cambio dentro del gen
al nivel molecular (Ennis, 2000), en contraste con las mutaciones que resultan de
una pérdida o deleción (deficiencia) de una porción de un cromosoma. La mayoría
de las mutaciones puntiformes son mutaciones espontáneas. Estas mutaciones a
menudo son reversibles en el sentido del que el gen puede mutar en retroceso, o
sea, regresar a su condición original mientras que las mutaciones por deleción o
deficiencia no pueden invertirse (Johnston, 1999). Las mutaciones también
pueden originarse por la transferencia y readhesión de un segmento cromosómico
u otro cromosoma, fenómeno conocido como "translocación" cromosómica (Ennis,
2000). La situación particular en la que un cromosoma se rompe en uno o más
segmentos, se reconstituye pero en orden diferente se le llama "inversión" y puede
ocasionar también mutaciones (Harrison, 2001; Cupples, 2001).
Otro aspecto importante es la variabilidad genética, que se puede definir
como: "la habilidad genética para variar", y por lo tanto, es tener la capacidad para
responder tanto a variaciones de índole ambiental como a cambios en los
objetivos de selección, por lo que la variabilidad genética constituye la base del
progreso genético (Rochambeau et al., 2000). En una especie determinada, la
variabilidad puede representarse de tal modo que las diferencias entre individuos
sean graduales y en este caso se habla de variabilidad continua y estas
diferencias pueden ser debidas a factores ambientales que solo afectan al fenotipo
y que por tanto no son heredables (Burd, 2000). La variabilidad discontinua, en
cambio, es brusca y se debe a cambios que no responden a las leyes de la
herencia, es decir, que aparecen de forma espontánea en el seno de una
población y estos cambios se llaman mutaciones (Reeve y Sherman, 1999). La
variación es la materia prima sobre la cual la selección actúa (Ayala et al., 2000).
El resultado, a través del tiempo, de la interacción de ambos procesos es la
evolución y "La variación hereditaria es el
10
producto de la mutación, el paso de material genético entre poblaciones y la
recombinación de factores genéticos, unidos con una selección que moldea el
patrón de la variación (Barton y Keightley, 2002; Reznick, 2000).
Dentro de los elementos que contribuyen a la evolución de las poblaciones
cuando estas son pequeñas, es el azar el cual puede provocar cambios en sus
frecuencias génicas (Hastings, 2001), sin embargo, en una población muy grande,
los eventos al azar no son importantes para la población en su totalidad, mientras
que en una población pequeña, dichos eventos pueden cambiar drásticamente el
pool génico (Hastings, 2001), y cuando se presenta un aumento o disminución en
la frecuencia de un gen en generaciones sucesivas de una población que resulta
del azar, se llama deriva génica, (Ayala et al., 2000).
Otro de los procesos evolutivos es la migración, que es el movimiento de
organismos de un lugar a otro y puede ser en dos sentidos: cuando los individuos
salen de una población se habla de emigración; la llegada de individuos a una
población se conoce como inmigración y permite el cambio evolutivo ya que causa
el movimiento de genes hacia dentro o hacia fuera de una población y a este
fenómeno se llama flujo génico (Mousseau y Olvido, 2001). La migración puede
conducir a cambios de las frecuencias de los alelos (Tonsor y Moore, 2001),
cuando implican animales en movimiento o plantas que cambian de ambiente y los
patrones geográficos de la variación genética intraespecífica están determinados
por la historia de la migración. (Hagen, 2001).
Sin duda un aspecto básico de la teoría de la evolución es la selección
natural, la cual es consecuencia de la reproducción diferencial de unas variantes
respecto a otras, es decir, de la selección natural la cual actúa sobre los dos
principales recursos de la variación genética: la mutación y la recombinación; esta
acción de la selección natural sobre la variabilidad hace posible que sobrevivan
individuos en la población que interaccionen de una manera más eficiente con el
ambiente (Reznick, 2000). Darwin y Wallace propusieron en 1859 que la
naturaleza produce un número
11
excesivo de organismos y luego selecciona las condiciones genéticas más
favorables (Whitlock y Phillips 1999), en esencia, la selección natural es
reproducción diferencial de unas variantes genéticas respecto de otras. Se puede
definir de manera más rigurosa como el proceso que resulta del cumplimiento de
las tres condiciones siguientes: (1) variación fenotípica entre los individuos de una
población, (2) supervivencia o reproducción diferencial asociada a la variación, y
(3) herencia de la variación. Si en una población de organismos se dan estas tres
condiciones, entonces se sigue necesariamente un cambio en la composición
genética de la población por selección natural (Reznick 2000; Mitton 2001).
Algunas de las preguntas actuales en selección natural son: ¿qué tan fuerte
es la selección sobre los rasgos cuantitativos en la naturaleza?, ¿es fuerte la
selección direccional común?, ¿la selección de viabilidad es típicamente más
fuerte o más débil que la selección sexual?, ¿está la fuerza de la selección
correlacionada con el período de tiempo sobre el cual este es medido? (Hoekstra
et al., 2001). Brandon, (1990), menciona que lo que se encuentra bajo discusión,
es el intento de respuesta a las siguientes preguntas: ¿dónde actúa la selección
natural? o ¿cuál es el nivel de acción de la selección natural?, ya que los mismos
biólogos están en desacuerdo al intentar dar respuesta a las interrogantes
anteriores y quizá lo que haga falta es una revisión teórica sobre las implicaciones
o consecuencias que se derivan de la teoría de la evolución por selección natural
(Brandon, 1990). Las respuestas a éstas preguntas y otras similares son
fundamentales para entender cómo la selección determina el cambio evolutivo y la
adaptación (Hoekstra et al., 2001).
La adaptación, por otro lado, ha sido una idea central en biología evolutiva
desde Darwin, pero ha sido difícil de caracterizar las adaptaciones en un solo
término unificado y continúa generando controversia; sin embargo, no hay ninguna
discordancia en que la selección natural es el único proceso que crea las
adaptaciones (Reeve y Sherman 1999; Burd 2000). Los biólogos evolutivos usan
el término adaptación de dos maneras distintas pero relacionadas: la adaptación
es un proceso evolutivo y un producto de selección natural, en ambos casos, la
evolución
12
se maneja por la selección natural. El uso del término es dado por Mitton (2001)
de la siguiente manera: (1) 'la adaptación' es un proceso de evolución en que los
rasgos en una población son modificados por la selección natural para enfrentar
los desafíos del ambiente local. (2) 'una adaptación' es un rasgo del fenotipo
amoldado por la selección natural. El rasgo podría ser fisiológico, de
comportamiento, de desarrollo o morfológico.
Con la combinación de la Teoría de la Evolución de Darwin y con los
aportes de la Genética, se generó lo que se conoce como Neodarwinismo o teoría
sintética de la evolución (T.S.E.), la que se sustenta en los siguientes principios:
1. La unidad sobre la que actúa la evolución no es el individuo sino otra de
orden superior: la población (Schaal y Olsen, 2000).
2. En las poblaciones hay variabilidad entre los individuos. Esto se observa
en la especie humana y en cualquier otra, si se analiza con detalle (Schaal
y Olsen, 2000). Sobre la variabilidad del contenido genético, actuaran la
selección natural, la mutación, la migración y la deriva genética provocando
cambios en las frecuencias génicas. (Hoekstra, 2001).
Actualmente la teoría sintética de la evolución se apoya en la teoría
darwinista de la selección, en los conocimientos de la genética y del tratamiento
matemático de la dinámica de poblaciones abarcando la teoría del gen, la teoría
cromosómica, la evolución molecular y las investigaciones evolucionistas se
desarrollan principalmente en dos direcciones: por una parte la biología
evolucionista especial que trata de explicar la filogénesis y el parentesco de
grupos de especies más o menos grandes y por la otra la biología evolucionista
general (Ayala et al., 2000).
La mayoría de los investigadores interesados en las filogenias asumen
explícitamente dos supuestos (Farris, 1986): 1) La evolución es "descendencia con
modificación", 2) Las similitudes observadas son explicables por herencia y
ancestría
13
común)
La "Teoría Sintética moderna" basada en una concepción de la transmisión de los
caracteres estrictamente mendeliana, tiene como premisas fundamentales:
1.- La Evolución es un proceso gradual de sustitución de alelos en el seno de una
población. La fuente de variabilidad de estos alelos son las mutaciones puntuales
o micromutaciones (Schaal y Olsen, 2000; Harrison, 2001).
2.- El material genético es sólo la materia prima, lo que dirige el proceso evolutivo
es la selección (Bowler 1999; Reznick, 2000; Hoekstra et al., 2001).
En "Sobre el Origen de las Especies", Darwin propuso que la selección
natural tenía un papel fundamental sobre la especiación, pero este punto de vista
ha disminuido con la aparición del concepto de la "Teoría sintética de la evolución"
o "Síntesis moderna" (Bowler 1999; Filchak et al., 2000), fortalecida en el siglo
veinte por Stebbins con su obra "Variación y evolución en plantas"; Dobzhansky
con su obra "Genética y el origen de las especies"; "Sistemática y el origen de las
especies" de Mayr; y "Modo y tiempo en evolución" de Simpson (Ayala et al.,
2000).
En 1908, Hardy y Weinberg efectuaron independientemente una deducción
a partir de las leyes de Mendel que constituiría el inicio de la genética evolutiva y
de poblaciones, la cual se fundamenta en que las frecuencias relativas de los
genes en una población permanecerán constantes de una generación a la
siguiente si: a) La población es grande. b) No hay selección en favor o en contra
de un gen o alelo específico, es decir, si el apareamiento ocurre al azar. c) No hay
mutaciones. d) No hay inmigración o emigración en la población. (Hastings, 2001;
Harrison, 1999), y surge la interrogante ¿cómo medir los cambios evolutivos?
2.1.1. Teoría del equilibrio puntuado. En 1977, el biólogo francés P. Grassé
escribía sobre la comprobación en la naturaleza de la actuación de la selección
14
natural: "...Es sencillamente la observación de factores demográficos, de
fluctuaciones locales de genotipos y de distribuciones geográficas. ¡A menudo las
especies observadas han permanecido prácticamente sin cambios durante cientos
de siglos!". La constatación de este fenómeno, se ha plasmado finalmente en la "
Teoría del equilibrio puntuado", propuesta en 1972 por los paleontólogos Eldredge
y Gould (Sheldon, 2000). Los dos postulados de esta teoría son (Gould y Elredge,
1993):
1º.- La estasis: la mayoría de las especies no exhibe cambio direccional alguno
durante su estancia sobre la tierra. Aparecen en el registro fósil con una apariencia
muy similar a cuando desaparecen.
El cambio morfológico es generalmente limitado y no direccional.
2º.- La aparición repentina: en cualquier área local, una especie no surge
gradualmente por la transformación constante de sus antecesores, sino que
aparece de una vez.
En la actualidad, las investigaciones evolucionistas se desarrollan
principalmente en dos direcciones: por una parte la llamada biología evolucionista
especial que trata de explicar la filogénesis y el parentesco de grupos de especies
más o menos grandes, y por otra, la biología evolucionista general, que investiga
el ulterior desarrollo de la teoría de la evolución, de las fuerzas activas, de la
interacción de los factores y de las leyes que gobiernan los procesos de
microevolución y macroevolución (Reznick, 2000; Sheldon, 2000; Callahan, 2001)
Una de las más recientes teorías evolutivas es, la teoría neutralista de la
evolución molecular, propuesta por Kimura en 1968 y apoyada por otros autores,
admite que la evolución de los caracteres morfológicos, etnológicos y ecológicos
está gobernada mayoritariamente por la selección natural. Estos autores
proponen, sin embargo, que la evolución de la mayoría de las proteínas y de los
genes que las
15
codifican se debe en su mayor parte al azar. Kimura (1983), señala que el carácter
diferenciador del Neodarwinismo es el papel central que da a la selección en la
producción de diferencias genéticas entre las especies. Este punto de vista resulta
del todo razonable al considerar el material hereditario como un paquete de genes,
cada uno de los cuales tiene algún papel importante.
Kimura (1983), propone en su teoría neutralista que la mayor parte de las
substituciones mutantes no son mantenidas por una selección darwiniana positiva
sino que son fijadas aleatoriamente por deriva genética, aunque este autor no
renuncia a que, una vez fijadas en el tiempo, lleguen a tener importancia cuando
las especies se vean sometidas a cambios ambientales. Kimura ve confirmada su
hipótesis al observar la constancia de la tasa de substitución encontrada en los
aminoácidos de las hemoglobinas y la de los nucleótidos de los pseudogenes
(Hasatoshi, 1983), Así, Kimura llegó a dos conclusiones:
1ª La mayoría de las sustituciones de nucleótidos son el resultado de la
fijación al azar de mutantes neutros, o casi neutros, más que el resultado de una
selección darwiniana.
2ª Muchos de los polimorfismo proteínicos son selectivamente neutros o
casi neutros y su persistencia en la población se debe al equilibrio existente entre
la aportación de polimorfismo por mutación y su eliminación al azar.
Según Bromham (2001), una consecuencia de la teoría neutralista de la
evolución es la existencia de un reloj molecular aleatorio, según el neutralismo, el
ritmo en el que se sustituyen las variantes genéticas en las poblaciones es
proporcional a la tasa de mutación neutra, así, cuando dos poblaciones o especies
se separan, el número de diferencias genéticas que le separan será proporcional
al tiempo que hace que han divergido las dos especies, de este modo, el número
de diferencias que existe entre un conjunto de secuencias correspondientes a
distintas especies puede usarse como un reloj molecular que permite ordenar los
tiempos
16
relativos de divergencia entre esas especies, la idea sería equivalente a utilizar el
número de kilómetros de las calles de varias ciudades para predecir el orden
relativo de los tamaños de las ciudades. El reloj molecular es una herramienta muy
útil para establecer los tiempos relativos de ramificación de árboles evolutivos
2.1.2. Especiación
La especiación es definida como la formación de dos o más nuevas
especies de una especie ancestral (Wood y Rieseberg, 2001). El proceso de
especiación es el responsable de la basta cantidad de diversidad biológica que se
encuentra actualmente, sin embargo se conoce poco acerca de los mecanismos
biológicos de la formación de especies, debido al largo tiempo de los procesos y a
que son pocas las excepciones que pueden ser observadas en la naturaleza o en
un laboratorio (Wood y Rieseberg, 2001).
Más de 150 años después del origen de la publicación de "On the Origin of
species" de Darwin, la pregunta del cómo dos especies divergen de una sola
especie ancestral sigue todavía vigente, así como ¿cuántos cambios genéticos
son necesarios para crear nuevas especies?, ¿todos los genes cambian en una
cantidad pequeña?, o ¿la especiación depende de un solo grupo de genes
conectados con la reproducción? (Gee, 2000). Por otro lado, la formación de dos
especies separadas a partir de un solo antepasado y el mantenimiento.
subsecuente de estas nuevas especies sin la hibridación, es un problema central
en la biología evolutiva (Gee, 2000b). Una de las preguntas más persistentes en la
biología evolutiva es: ¿cómo surgen o se originan nuevas especies? (Korol, 2000).
El entendimiento de la especiación es un problema fundamental en biología
(Dieckmann y Doebeli, 1999). Las especies difieren en el número y forma de
cromosomas así como en la anatomía, fisiología y genética. La reestructuración
del cromosoma juega un papel importante en la evolución de especies debido a
como sus genomas se expresan y a los mecanismos de aislamiento reproductor
(Burt,
17
2001). De acuerdo con Otte (2001), las especies pueden surgir por dos
mecanismos: la anagénesis y la cladogénesis, sea de una forma o de otra, para
que exista especiación debe haber divergencia genética y aislamiento reproductivo
entre dos poblaciones antes relacionadas, estos dos procesos pueden ocurrir de
dos maneras conduciendo a la especiación alopátrica o a la especiación
simpátrica.
De acuerdo con Rieseberg y Ungerer (2001), la cladogénesis es el modo
fundamental de especiación y el responsable directo de la biodiversidad, la
cladogénesis se produce por aislamiento reproductivo de las poblaciones de una
especie y las barreras reproductoras se pueden dividir en precigóticas y
postcigóticas; las barreras precigóticas son mecanismos de aislamiento que tienen
lugar antes o durante la fecundación y las más importantes son:
a) La reproducción que se produce en diferentes épocas del año.
b) Los mecanismos conductuales que utilizan las especies para
reconocerse entre ellas por ejemplo, el cortejo de muchos animales, o el canto de
numerosas especies de aves; cuya finalidad es la del reconocimiento mutuo entre
los individuos de la misma especie.
c) La incompatibilidad de las estructuras utilizadas en el acoplamiento, por
ejemplo, la genitalia de los insectos, aunque determinadas especies son muy
semejantes exteriormente, su genitalia presenta diferencias que hacen imposible
el acoplamiento de un macho de una especie con una hembra de otra.
d) Aunque algunas especies viven en el mismo hábitat, difieren en el micro
ambiente al que están adaptados, por ejemplo, determinados parasitoides
(Hymenoptera, Chalcidoidea) que aún viviendo juntos parasitan a especies
hospedadoras diferentes y;
18
e) Cuando los gametos no reconocen los de otro a nivel molecular, por
ejemplo, los granos de polen pueden llegar al estigma de diferentes especies pero
sólo pueden fertilizar óvulos de la suya propia, o de especies muy semejantes.
Mientras que las barreras postcigóticas (Howard, 2000), son los abortos
espontáneos, esterilidad del híbrido, muerte prematura e híbridos débiles; el
aislamiento reproductor se produce mediante mecanismos de aislamiento
postcigóticos, es decir, posteriores al apareamiento y formación del cigoto, y por
medio de mecanismos de aislamiento precigóticos, esto es, mecanismos que
impiden que se llegue a formar el cigoto.
Por otro lado, la especiación alopátrica, vicariante o geográfica, es aquella
que se presenta cuando las poblaciones comienzan a divergir y el flujo de genes
entre ellas se restringe o se ve totalmente interrumpido como una consecuencia
de la dispersión y divergencia en diferentes ambientes (Mousseau y Olvido, 2001).
El aislamiento geográfico es, a menudo, la primera etapa de este proceso
(Howard, 2000). La separación espacial durante un largo periodo de tiempo da
lugar a la aparición de novedades evolutivas en una o en las dos poblaciones
(Wood y Rieseberg, 2001).
Mientras que la especiación simpátrica se refiere a las nuevas especies que
surgen sin el aislamiento geográfico es decir, en el mismo lugar geográfico y que
es el origen de dos o más especies de una sola población local (Kondrashov y
Kondrashov, 1999; Dieckmann y Doebeli, 1999). Puede ocurrir cuando se genera
aislamiento en el mismo sitio por rangos de distribución, ocasionando que el flujo
genético sea eliminado entre las poblaciones y se forman especies nuevas
(Mousseau y Olvido, 2001), por variación de nichos o por el conjunto de
mecanismos que produce una o más especies nuevas a partir de una especie
ancestral sin segregación geográfica de las poblaciones, existe alguna barrera de
tipo biológico (Wood y Rieseberg, 2001).
19
La especiación híbrida o "recombinacional" se refiere al origen de nuevas
especies vía hibridación entre especies paternales divergentes cromosómica o
genéticamente y de acuerdo con los estudios de simulación realizados por
Ungerer et. al.,(1998), sugieren que este tipo de especiación es puntuado, es decir
con largos períodos de estasis, en los cuales la mayoría de las especies no exhibe
cambio direccional alguno durante sus estancia, seguido por abruptas transiciones
en las cuales las especies paternales individuales son desplazadas rápidamente
por las neoespecies híbridas (McCarthy, 1995; Ungerer et al., 1998).
En relación con la formación de subespecies esta se presenta cuando una
población debilita su entrecruzamiento reproductor con el resto de las poblaciones
de la especie, por encontrarse en periodo de especiación o cladogénesis. Esta
población puede seguir dos caminos diferentes (O'Hara, 1993):
1.- La población debilita sus relaciones reproductoras y posteriormente se
produce una ruptura permanente entre la población y el resto de la especie. En
este caso estaríamos ante un verdadero fenómeno de diferenciación, una
tendencia evolutiva propia que conlleva un destino histórico concreto: la
separación y formación de una nueva especie. La tendencia evolutiva propia
implica la adquisición de novedades evolutivas o, autapomorfías. Es una
subespecie que formará una especie.
2.- La población debilita sus relaciones reproductoras pero posteriormente
es absorbida por el resto de la especie, con lo que la separación es sólo temporal.
Es la misma situación que en el apartado anterior (diferenciación de una
población). Sin embargo, tiene un destino histórico diferente en el que no se forma
una nueva especie, debido a la falta de tendencias evolutivas propias. Es una
subespecie que no formará una especie.
20
2.1.3. Filogénesis y Filogenia
Dobzhansky declaró que "Nada tiene sentido en biología excepto a la luz de
la evolución", y un corolario muy particular sobre el tema central de este
documento, es que todo tiene mucho más sentido a la luz de la filogenia (Soltis y
Soltis, 2000).
Los términos filogénesis y filum fueron acuñados por Haeckel en 1866 del
siguiente modo: la filogénesis hace referencia a un proceso particular, mientras
que la filogenia es la ciencia que estudia los procesos y sus resultados (Ax, 1987).
Otros autores enfatizan la bifurcación como el eje central de la filogenia, por
ejemplo, O'Hara (1988) utiliza la siguiente definición: filogenia es la crónica
evolutiva: la secuencia ramificada del cambio de caracteres en los organismos a
través del tiempo. De acuerdo con estas ideas, el objetivo de la investigación
filogenética es descubrir los productos de la filogénesis y su ordenación o relación
en la secuencia de especiación en el tiempo, es llamado sistemática filogenética y
el resultado de este empeño es llamado sistema filogenético (Wagner, 2000). Por
lo tanto, la filogenia se encarga mayoritariamente del estudio de la cladogénesis,
esto es: el proceso de origen de nuevos linajes (ramas) como resultado de la
bifurcación de las especies (Ax, 1987).
La filogénesis cubre la génesis de todas las unidades en la Naturaleza y la
anagénesis es el proceso de cambio evolutivo en los linajes, es decir, el origen de
novedades evolutivas en las poblaciones de especies (Wiley, 1981) Este término
es sinónimo de "evolución filética" y es el proceso por el cual un carácter genético
o fenotípico cambia en una especie. No hace referencia a la bifurcación sino al
cambio gradual de un órgano en el transcurso del tiempo. A nivel de especie las
filogenias inferidas a través de datos moleculares proporcionan registros indirectos
de los eventos de especiación que han dirigido la expansión de las especies y
ofrece un enorme potencial para la investigación de las causas generales y las
tasas de especiación dentro de clados (Barraclough y Nee, 2001). Una especie
filogenética es un grupo de organismos que comparten rasgos únicos morfológicos
o genéticos que
21
les hacen distintos de otros grupos, estos rasgos compartidos se infieren por ser el
resultado de un linaje común y este concepto (especie filogenética) tiene sus
raíces en la rama de biología evolutiva que se enfoca en reconstruir la historia
evolutiva de los organismos (Wood y Rieseberg, 2001).
La filogenia ocupa un lugar central en la sistemática y en la taxonomía, al
ayudar a resolver problemas de posición y nomenclatura (Forey, 1992). El centro
del concepto de la sistemática filogenética es el uso de caracteres apomórficos o
derivados para reconstruir las relaciones ancestrales más comunes y la
agrupación de taxa basadas en el linaje común. ¿Por qué debemos estar
interesados en este enfoque en el que la sistemática filogenetica es diferente de la
sistemática tradicional? la respuesta es simple: las clasificaciones que son
conocidas por no ser filogenéticas, son posiblemente artificiales y son por
consiguiente, útiles sólo para la identificación y no para responder a preguntas
acerca de la evolución (Wiley et al., 1991).
Para la de reconstrucción filogenética, existen los métodos de distancia y
hay dos grupos importantes de análisis para examinar lazos filogenéticos entre las
secuencias: métodos fenéticos o de distancia y métodos cladísticos. El principio en
que se fundamentan los métodos de distancia (fenéticos) es que los organismos
más parecidos deben de ser los filogenética mente más emparentados, el
problema es que el parecido puede conducir a conclusiones erróneas y la solución
que se ha propuesto es utilizar una gran cantidad de caracteres: algunos serán
influenciados por la selección, pero la mayoría reflejarán los patrones evolutivos
(Sneath y Sokal, 1973; Hull, 1988).
En los métodos de distancia calcula un índice de distancia entre pares de
taxa, tomando en cuenta cuáles son los caracteres que comparten y, a partir de
ellos, siguiendo una serie de reglas se obtiene un árbol filogenético (Sokal, 1985).
En otras palabras, reducen todos los caracteres analizados a un solo número (la
distancia "evolutiva") entre un par de taxa. La elección del método para obtener las
distancias evolutivas es importante, ya que los diferentes estimadores de distancia
se
22
construyen a partir de distintos supuestos del proceso evolutivo (Nei, 1987).
Una vez transformada la matriz de caracteres original a una matriz de
distancia entre pares de taxa, se requiere elegir el método de reconstrucción
filogenética para lo cual existen gran cantidad de métodos, que tienen diferentes
supuestos y diferentes capacidades y entre los más utilizados se tienen al UPGMA
y al Neighbor-joining (Unión de vecinos), UPGMA (unweigthed pair group method
with arithmetic mean), este fue uno de los primeros métodos cuantitativos para la
reconstrucción filogenética y fue propuesto originalmente por Sokal y Michener
(Sneath y Sokal, 1973).
Este es uno de los pocos métodos que presentan directamente una "raíz"
(la mitad de la distancia entre la última rama y el resto del árbol), y las distancias
de las ramas son simplemente las medias entre las distancias de cada grupo de
organismos. La ventaja más grande que tiene este método es que es rápido, y
puede ser bastante eficiente en la reconstrucción de la filogenia, si las tasas de
cambio son relativamente constantes (Sokal, 1985). Si existe heterogeneidad en la
tasa de cambio evolutivo entre linajes, el método de UPGMA puede conducir a
errores en la reconstrucción del árbol filogenético (Nei, 1991).
Uno de los métodos de distancia más extensivamente usados actualmente
es el de Neighbor-Joining (Unión de vecinos) (Saitou y Nei 1987), ya que es
mucho más confiable a los problemas de diferencias en las tasas de substitución
que el UPGMA y otros algoritmos, y es razonablemente rápido en la búsqueda de
la reconstrucción filogenética (Hillis et al., 1994), en este método, se buscan
secuencialmente los taxa ("vecinos") que minimizan el largo total del árbol y cada
vez que une un par de taxa, se vuelve a ajustar el largo de las ramas del árbol
para cada par de nodos, basándose en la divergencia promedio entre los pares de
nodos, por lo tanto no requiere que exista un reloj molecular estricto (Li, 1997). Por
otra parte, se ha demostrado que si se emplea el análisis de distancia adecuado,
el método de distancia puede ser tan bueno o mejor que los de parsimonia para
encontrar el árbol
23
filogenético verdadero (Nei, 1991; Hillis et al., 1994).
De acuerdo con Simpson (1961), los "fenetistas" analizan los datos
mediante uno o más programas de ordenador que harán que se agrupen las
OTU's (Unidades Taxonómicas Operativas), concepto introducido por Sneath y
Sokal (1973), en función de índices de semejanza, o de diferencia, global y
producen un diagrama ramificado (dendrograma) denominado fenograma, los
fenogramas son dendrogramas utilizados por el feneticismo y las hipótesis
filogenéticas pueden generarse con base en el fenograma que resume los
patrones de similitud total.
De acuerdo con Kumar y Fiplipski (2001), las técnicas computacionales han
pasado a ser una herramienta fundamental para el manejo y análisis de la
información biológica. Si bien esto es aplicable a cualquier área de la biología, es
particularmente importante en la biología molecular, esto se evidencia en el
desarrollo, mantenimiento y permanente actualización de gigantescas bases de
datos públicas de secuencias biológicas tanto de ácidos nucleicos (GenBank,
EMBL, JDB, etc.) como de proteínas (SwissProt, PIR, PDB, etc.); y en la tendencia
creciente en el uso de herramientas bioinformáticas o de biocomputación como
apoyo a las técnicas experimentales (Taylor, et al., 1995).
El desarrollo de la bioinformática y la biocomputación ha generado técnicas
de análisis de secuencias de ácidos nucleicos y proteínas con múltiples objetivos:
determinación de homología, alineamiento de secuencias homólogas, predicción
de estructura, filogenia, evolución molecular, diseño de fármacos, entre otros
(Brock, 1994).
Por análisis de secuencias se entiende el proceso de hacer inferencias
biológicas a partir de las estructuras primarias de las proteínas, el ARN y el ADN;
una de las inferencias más ambiciosas del análisis de secuencias es que, a partir
de la estructura primaria (secuencia de aminoácidos), se pueda predecir la
estructura y
24
función de la proteína; o incluso hacer esta predicción a partir de la secuencia de
bases nitrogenadas del gen codificante (Bodmer, 1995).
Desde la determinación de la estructura y función del ADN por Watson y
Crick, se conoce con detalle cómo se interpreta una determinada secuencia de
bases nitrogenadas para sintetizar la secuencia de aminoácidos de una proteína,
esto constituye el llamado dogma central de la biología. Se afirma además que en
teoría es posible determinar las propiedades de una proteína a partir de su
secuencia de aminoácidos (Welsh y McClelland, 1990).
Sin embargo, esta información se conoce, no ha sido posible la
implementación de métodos certeros, por medio de los cuales, dada una
secuencia de ADN, se pueda deducir la función de la proteína para la cual éste
codifica (Steffen, 1995). A pesar de esto, el análisis de secuencia continúa siendo
un área de mucho interés. A tal punto, que el lograr obtener un método preciso de
análisis de secuencia se ha convertido per se en un objetivo de la investigación
científica que agrupa a biólogos, matemáticos, estadísticos, computistas, físicos,
etc., (Brock, 1994).
Nei y Kumar (2000), mencionan que el análisis de secuencias se realiza en una
primera instancia sobre las cadenas de caracteres que representan aminoácidos o
nucleótidos sin importar a priori su estructura y función, de hecho el análisis de
secuencias biológicas tiene muchas aplicaciones en el procesamiento de textos en
computación y por otro lado, el análisis de secuencia no está siendo utilizado
exclusivamente por aquellos interesados en predecir estructura, también es
empleada para determinar relaciones evolutivas entre organismos.
El análisis de secuencias está siendo empleado por algunos investigadores
para construir nuevos árboles filogenéticos que están revolucionando la
sistemática de los organismos vivos y es tal vez en esta área donde el análisis de
secuencias ha dado los mayores resultados inmediatos (Kumar y Filipski, 2001).
En las secciones
25
siguientes se hacen unas breves descripciones de los conceptos centrales que
implican el trabajo con análisis de secuencias.
Los proyectos de secuenciamiento de genomas de organismos biológicos
como el del Genoma Humano, están generando inmensa cantidad de información
de secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos. Esta información es
almacenada en Bases de Datos internacionales, a las cuales los investigadores
envían las secuencias una vez que son determinadas (Taylor, et al., 1997).
El explosivo crecimiento de la información genómica y las complejas
relaciones a través de las cuales debe ser relacionada, está exigiendo a las
ciencias de la computación el desarrollo de cada vez más sofisticados esquemas
de diseño y administración de bases de datos y se puede decir que en los últimos
años la información biomédica está "empujando" el desarrollo de las bases de
datos. (Waldrop, 1995).
Estas bases de datos son esfuerzos coordinados, que intentan en lo
posible, almacenar la información de una manera no-redundante. Existen
principalmente dos bases de datos de este tipo en el mundo, para secuencias de
ADN: El Genbank en el National Center for Biotechnology Information de los
Estados Unidos y el EMBL en el European Bioinformatics Institute de Europa. Del
mismo modo, existen diversas bases de datos de secuencias de proteínas a nivel
mundial, como el PIR, SwisProt y PDB (Taylor, et al, 1997).
Un ejemplo de la tendencia a que el uso de estas bases de datos sea
sencillo e integrado directamente con la información bibliográfica, lo muestra el
National Center for Biotechnology Information, que administra dos bases de datos
distintas, una de ácidos nucleicos y otra de aminoácidos; y junto con el Medline, la
base de datos de citas bibliográficas de la literatura biomédica de la National
Library of Medicine, conforman un sistema integrado de datos de genomas
biológicos. Para la navegación fluida a través de esta data, el NCBI creó el Entrez,
un sistema de
26
navegación entre las tres bases de datos, que permite un fácil acceso de toda la
información relativa a determinada secuencia (Waldrop, 1995).
Si bien el diseño de estas bases de datos y su sistema de navegación
resulta atractivo, algunos autores consideran que los tipos de búsquedas que
pueden hacerse sobre ellos son muy limitadas (Waldrop, 1995)
De acuerdo con Taylor et al., (1997), estas son sólo algunas de las bases
de datos existentes para biología molecular, existen otros tipos de servidores más
específicos, tanto para ADN como para proteínas, por ejemplo, servidores de
dominios de proteínas, de oligonucleótidos, de enzimas y sus sitios de restricción,
de mutaciones, entre otras. Estas bases de datos pretenden actualizar
mutuamente su información, de tal modo que solicitar o enviar una secuencia a
una de ellas sea prácticamente lo mismo que hacerlo a otra. Sin embargo esto no
siempre es así, por lo cual es conveniente familiarizarse con sus interfaces, y
hacer las solicitudes de secuencias a todos ellos.
BLAST y FASTA se han convertido en los algoritmos estándares de
comparación de secuencias problema en la Intemet, la operación de ejecutar
comparaciones con estos organismos también es llamada "búsqueda de similitud
de
secuencias"
(sequence
similarity
searches).
Estos
dos
algoritmos,
suficientemente probados y mejorados desde su creación, emplean distintos
enfoques estadísticos al momento de comparar secuencias.
Sus diferencias estriban principalmente en velocidad y precisión. Un
enfoque es conectarse a servidores remotos de BLAST, de FASTA y obtener a
partir de ellos los resultados de interés. Más aún, cuando este acceso es gratuito y
mundialmente actualizado (Waldrop, 1995)
BLAST fue desarrollado por Altschul et al., (1990) y es el algoritmo más
empleado por el NCBI (National Center for Biotechnology Information). Los
usuarios
27
del GenBank, tienen la posibilidad inmediata de emplear el BLAST al hacer allí las
búsquedas de sus secuencias (Brock, et al, 1995).
La principal característica del BLAST es su velocidad, pudiendo tomar
pocos minutos cualquier búsqueda en la totalidad de la Base de Datos. De hecho,
los resultados del BLAST ejecutados a través de la página Web del NCBI se
presentan en pantalla inmediatamente después de calculados (aunque también
pueden ser recibidos por correo electrónico).
Además de velocidad, el BLAST posee otras fortalezas, en primer lugar las
bases de datos que emplea, por ejemplo la nr (non redudant) que posee los
registros no redundantes entre las dos bases de datos principales a nivel mundial:
GenBank en USA y EMBL en Europa (Taylor, et al, 1997).
FASTA, desarrollado por Lipmann y Pearson en 1985, es empleado
mayormente por el EMBL - EBI (European Molecular Biology Laboratories European Bioinformatics Institute), resulta notablemente más lento, empleando
para búsquedas equivalentes hasta varias horas. Por esta razón, sus resultados
sólo pueden recibirse vía correo electrónico. Sin embargo este algoritmo posee
algunas ventajas:
a) Posibilidad de comparación contra secciones del GenBank como de
secuencias de Mamíferos, Plantas, Bacterias, etc.
b) Mayor precisión bajo ciertas configuraciones iniciales de sus parámetros.
El FASTA resulta conveniente para búsquedas avanzadas de mayor
precisión, ambos algoritmos proveen como primer resultado una medida
cuantitativa de la similaridad de la secuencia problema contra cada una de las
secuencias de la bases de datos. BLAST y FASTA son además herramientas de
alineamiento local por pares (pairwise), que dan como resultado un alineamiento
de nuestra secuencia problema con cada una de las secuencias resultantes de
alta similitud. Este segundo resultado
28
es una medida cualitativa de la similitud de la secuencia problema con las
secuencias de las bases de datos (Gaeta, 1995).
De acuerdo con Kumar y Filipski (2001), el alineamiento es una herramienta
cualitativa que permite dar los primeros pasos hacia la conclusión de que dos o
más secuencias son homólogas y consiste en hacer coincidir las secuencias en
aquellas regiones en las que se repitan el mayor número de monómeros
(caracteres) posibles, como se muestra a continuación.
ATCGGGCATGCATTACGCTG
|
| | |
|| || | |||||
ACAGGCAGTGCATTACGCCC
Esta técnica, aparentemente sencilla se hace más compleja en la medida
en que el tamaño de las secuencias a comparar es mayor y más aún, cuando se
comparan más de dos secuencias, por ello se emplean computadores y distintos
programas que dadas las secuencias, generan el mejor alineamiento (Kumar y
Filipski, 2001).
El alineamiento global intenta hacer coincidir las secuencias en el mayor
número posible de caracteres, a lo largo de toda la banda, en cambio, el
alineamiento local busca conseguir pequeñas regiones de secuencias consenso.
El alineamiento local, además de ser más efectivo desde el punto de vista
computacional, tiene mayor sentido biológico, pues es sabido que sólo una región,
relativamente pequeña de la secuencia de aminoácidos de una proteína es la que
constituye su sitio activo y por ende la que le confiere su función, los algoritmos
BLAST y FASTA, así como la mayoría de los programas de alineamiento emplean
el enfoque de alineamiento local (Gaeta, 1995)
Como el nombre lo indica, el alineamiento por pares, consiste en hacer coincidir
un par de secuencias. El alineamiento múltiple lo hace con un conjunto de
secuencias mayor de dos. Los algoritmos BLAST y FASTA, sólo producen
29
alineamientos por pares de la secuencia problema con cada una de las
secuencias de la base de datos con las que muestra alta similitud.
El alineamiento múltiple resulta provechoso para encontrar secuencias
consenso entre un grupo de genes distintos. En algunos casos estas secuencias
consenso pueden orientar hacia la exploración de nuevas estructuras relacionadas
con cierta función o para aplicaciones prácticas como la de encontrar secuencias
comunes para su donación en organismos transgénicos (Gaeta, 1995)
La complejidad en la realización de un alineamiento múltiple es función
geométrica del número de secuencias sumadas al proceso; por lo cual se
requieren programas especializados más exigentes en cuanto a capacidad de
cómputo que aquellos que sólo realizan alineamientos por pares. Una vez
obtenidas las secuencias similares a la de estudio, resulta importante realizar un
alineamiento múltiple entre todas ellas, en busca de secuencias consenso. Existen
diversas herramientas en Internet disponibles para ello, así como un buen número
de herramientas comerciales. Una de las herramientas estándares más
empleadas para la generación de alineamientos múltiples es el CLUSTAL-W
(Thompson et al, 1994) disponible gratuitamente para fines académicos vía FTP
en el URL: http://www.csc.fi/molbio/progs/clustalwlclustalw.html .
Ésta es una aplicación que debe ser instalada localmente y que requiere
como datos de entrada, las secuencias (en formato FASTA) que se desean
alinear. CLUSTAL-W genera además los datos necesarios para dibujar un árbol
filogenético entre los organismos estudiados respecto a la secuencia comparada.
El árbol no es dibujado por CLUSTAL W, sólo genera los datos necesarios para
hacerlo. Con estos datos, el árbol puede ser dibujado manualmente o con otro
programa, como el PHYLIP (Jeanmougin, 1996).
30
Para comparar dos o más secuencias, es necesario alinear los residuos
conservados y no conservados de todas las secuencias (la identificación de
lugares de inserciones y deleciones que han ocurrido desde la divergencia de un
antepasado común). Estos residuos forman un patrón a partir del cual las
relaciones entre las secuencias puede determinarse con los programas
filogenéticos. Cuando las sucesiones se alinean, es posible identificar situaciones
de inserciones o deleciones desde su divergencia de su antepasado común.
(Kumar y Filipski, 2001); existen tres posibilidades:
1) Las bases se emparejan: esto significa que no hay ningún cambio desde
su divergencia.
2) Las bases desigualan o emparejan mal: esto significa que hay una
substitución desde su divergencia.
3) Hay una base en una secuencia, ninguna en el otro: hay una inserción o
una deleción desde su divergencia.
Una buena alineación es importante para el próximo paso: la construcción
de árboles filogenéticos. La alineación afectará las distancias entre las 2 especies
diferentes y esto influirá en la filogenia inferida (Stackebrandt, 1998).
2.1.4. Marcadores moleculares
Avise (1994), menciona que el interés de estudio en la evolución molecular
se puede centrar en dos áreas: (a) la caracterización de las bases moleculares de
la variación en sistemas genéticos particulares o (b) la aplicación de datos
genéticos a preguntas sobre historia natural y evolución de organismos y se hace
la pregunta ¿por qué emplear marcadores genéticos moleculares? Y responde:
porque la filogenia es "el flujo de la herencia," solo los rasgos genéticamente
transmitidos son informativos para la estimación de la filogenia.
31
Con el descubrimiento de la estructura de DNA y el RNA, los pasos en la
síntesis de las proteínas y otros grandes descubrimientos de la biología molecular,
se revolucionó el estudio de las plantas a todos los niveles desde las células a los
ecosistemas, con el uso de las técnicas moleculares se están descubriendo
muchas respuestas y mecanismos que no fueron accesibles en el pasado (Filipski,
2001). Ahora es posible identificar con precisión genes particulares responsables
de algunos rasgos o características, introducir o eliminar genes, alterar la
taxonomía presente y la filogenia, el hombre puede crear nuevas especies
(Bazzaz, 2001). Y las bases de ello se encuentran en los ácidos nucleicos como a
continuación se describe:
2.1.4.1. Marcadores moleculares en plantas. Las tres grandes áreas de
aplicación de la sistemática molecular son: 1) la estructura genética de
poblaciones (como variación geográfica, heterocigosidad), 2) delimitación de
especies (incluyendo híbridos) y 3) inferencia filogenética (Baverstock y Moritz,
1996). El uso de marcadores moleculares para resolver problemas taxonómicos
en plantas se inició en la década de los setenta con técnicas de electroforesis de
enzimas (Gottlieb, 1971), y hacia los ochenta las técnicas de manipulación y
análisis de ADN y ARN habían avanzado lo suficiente como para poder estudiar la
variación (Moritz y Hillis, 1996; Filipski, 2001).
La popularidad de estos métodos se basa en que cualquier carácter utilizado para
un análisis sistemático debe reflejar cambios genéticos. La eficacia sistemática del
carácter utilizado será mayor si no es el resultado de la influencia del medio sobre
el fenotipo, por lo que el uso directo del material genético debe aportar los
caracteres más fundamentales para una clasificación (Crawford, 1990), con la
ventaja adicional de que el número de datos que se pueden obtener está limitado
sólo por el tamaño del genoma (Lafontaine y Tollervey, 2001b). Estos datos,
debido en parte al gran número de caracteres involucrados, se analizan por
métodos de distancia, parsimonia o máxima similitud con los que se obtiene una
filogenia (Swofford et al.,
1996).
32
La incorporación de nuevos tipos de datos, particularmente los caracteres
moleculares, han sido necesarios en taxa donde los caracteres morfológicos, por
sí solos, no han resuelto los problemas taxonómicos. Estos datos pueden provenir
de biomoléculas como proteínas y ácidos nucleicos, e incluyen reacciones
inmunológicas, isoenzimas, las secuencias de proteínas, la hibridación de ADN,
las enzimas de restricción del ADN ("RFLPs" [polimorfismo en la longitud de los
fragmentos de restricción] y mapas génicos), los "RAPDs" (polimorfismo del ADN
amplificado al azar), el "fingerprinting" (huella digital) del ADN y las secuencias de
genes particulares. Los méritos intrínsecos del uso de este tipo de datos en
sistemática ya se ha discutido en la literatura (Buth, 1984; Pauterson, 1987; Hillis y
Moritz, 1990; Bruns et al., 1991; Soltis et al., 1992; Doyle, 1993).
Para Sunnucks (2000), tres componentes importantes han venido ha
eficientizar los estudios sobre genética de poblaciones: 1) técnicas eficientes para
examinar los segmentos informativos del DNA, 2) estadísticas para analizar datos
del DNA y 3) la disponibilidad de paquetes computacionales de fácil uso, con lo
cual se podrá dar respuesta a las preguntas biológicas más eficientemente. El
progreso de la genética evolucionaria, es una novedad científica en la cual se
asume que el desarrollo del control de genes, es el aspecto principal de los
cambios evolucionarios en la morfología y comprendiendo la filogenia del
desarrollo del control de genes se podrá comprender la forma de la evolución de
plantas y animales (Theissen et al., 2000).
2.1.4.2. Caracteres moleculares. En los últimos años el uso de caracteres
moleculares en estudios taxonómicos ha aumentado considerablemente y las
técnicas más comúnmente utilizadas provienen de las enzimas de restricción y la
secuenciación de genes o regiones particulares de ADN (Wats 2000). El estudio
de las secuencias de genes presentan potencialmente ventajas sobre otros
caracteres moleculares. Entre los procedimientos para secuenciar, destacan la
aplicación generalizada de los métodos enzimáticos y la tendencia hacia el uso de
marcadores
33
no radiactivos, así como la secuenciación automatizada (Kumar y Filipski, 2001).
Algunas de las razones para usar secuencias génicas en estudios sistemáticos
son:
1) Representan una fuente abundante de caracteres (potencialmente cada
nucleótido de la secuencia);
2) tienen diferentes propiedades estructurales y funcionales y
3) presentan diferentes tasas evolutivas.
Estas tres propiedades se han podido observar tanto en plantas como en
animales (Ritland y Clegg, 1987; Field et al., 1988; Soltis et al., 1990; Giannasi et
al., 1992).
2.1.4.3. Secuencias. Los recientes adelantos espectaculares en las
tecnologías y estrategias para la secuenciación del ADN han acelerado el análisis
detallado del genoma de miríadas de organismos, el más notablemente, el
humano (Green, 2001). El uso de secuencias es actualmente uno de los métodos
más comúnmente utilizados, a diferencia de las enzimas de restricción, con las
que se muestrean partes del genoma, las secuencias analizan todas las unidades
básicas de información de un organismo (Hillis et al., 1996; Lafontaine y Tollervey,
2000).
Los caracteres están representados por la posición en la secuencia del gen,
mientras que los estados de carácter son los nucleótidos que se encuentran en
esa posición (Swofford et al., 1996; Dragon y Filipowics, 1999). Por eso es muy
importante alinear las secuencias obtenidas lo mejor posible antes de utilizarlas y
descartar las zonas dudosas (Giannasi et al., 1992; Bult y Zimmer, 1993).
2.1.4.4. La región de ITS del ADN Ribosomal del núcleo (nrADN). Los
genes ribosomales y sus regiones espaciadoras asociadas, que en conjunto son
llamados ADN ribosomal nuclear (nrADN) tienen un amplio rango de aplicación,
desde el origen de la vida hasta los eventos evolutivos más recientes (Híllis y
Dixon, 1991; Lafontaine y Tollervey, 2000). El nrADN ha sido ampliamente
utilizado, ya que
34
permite la inferencia de relaciones filogenéticas entre taxa muy distantes, debido a
que presentan secuencias de bases altamente conservadas con tasas de
evolución muy lentas (Hillis y Dixon, 1991; Hamby y Zimmer, 1992; Baldwin et al.,
1995; Lafontaine y Tollervey, 2000).
De acuerdo con Hillis y Dixon (1991); Baldwin et al., (1995) y Planta y Raué
(1999), el arreglo del ADN ribosomal nuclear (nrADN) de un genoma eucariótico,
típicamente consiste de algunos cientos de copias repetidas en tándem. Cada una
de estas copias se compone de la unidad transcrita y de la región de los
espaciadores externos no transcritos (Planta y Raué, 1999).
En procariontes existen de una a varias copias de genes de ADN ribosomal
y estos genes pueden estar organizados en un operón único (junto a cada gen
bacteriano existe un segmento de ADN conocido como promotor). Este es el lugar
sobre el cual la ARN polimerasa, enzima responsable de la producción de ARNm,
se adhiere al ADN e inicia la trascripción. Entre el promotor y el gen existe con
frecuencia otro segmento de ADN que recibe el nombre de operador, donde otra
proteína -el represor- puede adherirse. Cuando el represor se une al operador,
detiene el desplazamiento de la ARN polimerasa a lo largo del cromosoma y la
producción de ARNm, por lo tanto el gen se inactiva (Baldwin et al., 1995).
Sin embargo, la presencia en la célula de una sustancia química
determinada puede provocar que el represor se separe y el gen se active. Otras
sustancias pueden afectar el grado de actividad del gen al alterar la capacidad de
la ARN polimerasa de unirse al promotor. Un gen que recibe el nombre de
regulador produce la proteína represora. En las bacterias, varios genes pueden
estar controlados de forma simultánea por un promotor y uno o más operadores.
El sistema completo se denomina entonces operon) o pueden estar dispersos por
todo el genoma (Planta y Raué, 1999).
En eucariontes, generalmente existen tres o cuatro subunidades de nrADN (18S,
35
5.8S 26S (tres) en plantas; 18S, 5S y 28S (tres) en animales y 16S, 5S, 5.8S y
25S (cuatro) en Hongos, por lo que se dice que hay 3 o 4 subunidades en
eucariotes). Estas subunidades son caracterizadas por su velocidad de
sedimentación que se representa por la letra S (S, por Svedburg), y consisten en:
a) la subunidad larga cuyo rango en tamaño va desde 16S (alrededor de 1500
nucleótidos) hasta 28S (mas de 4000 nucleótidos); b) la subunidad pequeña 5.8S
(de 160 nucleótidos); c) la subunidad 18S (1800 nucleótidos); y en algunos
organismos d) la subunidad 5S (con 120 nucleótidos). En eucariontes, dos
espaciadores internos transcritos (ITS) separan las subunidades 18S, 5.8S y 28S
(o sus homólogos), el ITS1 y el ITS2. Copias adyacentes de la unidad repetida de
nrADN ("nrDNA repeat") son separadas por la región del espaciador no transcrito
(NTS), también llamado espaciador intergénico (IGS) por algunos autores.
La de los ITS contiene elementos que sirven como estimuladores de la
transcripción (Hillis y Dixon, 1991; Baldwin et al., 1995; Planta Y Raué, 1999). La
región de los espaciadores internos transcritos (ITS) ha sido ampliamente usada
para el esclarecimiento de las relaciones entre taxa a niveles inter e
intragenéricos, así como intraespecíficos en angiospermas (Hamby y Zimmer,
1992; Baldwin et al., 1995; Buckler y Holtsford 1996; Liston et al., 1996).
2.1.4.5. La región de los espaciadores internos transcritos (ITS) del
nrADN en angiospermas y gimnospermas. Las copias de nrADN en el genoma
de las plantas, están distribuidas en uno o varios loci cromosómicos denominados
regiones organizadoras nucleares (NORs) (Hamby y Zimmer, 1992; Brown et al.,
1993; Planta Y Raué, 1999; Shaw, 1999). El número de NORs determina de
alguna manera la velocidad de los procesos de homogenización. En angiospermas
se encuentran entre uno y dos, mientras que el número de NORs en algunas
gimnospermas es de 10 a 12 (Karvonen y Savolainen, 1993). La familia de genes
repetidos experimenta una homogenización rápida en sus secuencias de bases,
un proceso conocido como evolución concertada (un mecanismo genético no
mendeliano) y cuyos mecanismos principales lo constituyen el entrecruzamiento
36
desigual y la conversión génica (Baldwin et al., 1995, Wendel et al., 1995). La
evolución concertada y la recombinación sexual tienden a promover la uniformidad
de los ITS dentro de individuos y entre individuos de poblaciones (Hillis et al, 1991;
Soltis y Kuzoff, 1993; Shaw, 1999), por lo que en teoría basta muestrear solo
algunos individuos para establecer las relaciones filogenéticas entre distintas
especies, debido a que la región de los ITS se encuentra relativamente
homogénea dentro del genoma, por lo que puede decirse que una sola secuencia
sirve para caracterizar a los individuos de una determinada especie (Baldwin et al.,
1995; Planta y Raué, 1999).
La variación en las secuencias de genes en familias multigénicas y su
distribución entre y dentro de poblaciones es determinada por las tasas de
mutación y el efecto de fuerzas evolutivas (flujo génico, selección natural, deriva
génica
y
sistemas
de
apareamiento),
que
actúan
a
nivel
poblacional
(Charlesworth, et al., 2001). Sin embargo, el proceso de evolución concertada, un
mecanismo genético no Mendeliano, afecta la variabilidad de las familias
multigénicas a nivel molecular. La tasa de homogenización de las unidades
repetidas del nrADN mediante evolución concertada, depende del número de
copias, el número de loci y cromosomas en los cuales se encuentran las copias de
estos genes, la localización de los loci en los cromosomas y la tasa de intercambio
dentro y entre cromosomas (Hillis et al., 1991; Suh et al., 1993; Wendel et al.,
1995; Lafontaine y Tollervey, 2000). Se conocen poco los factores que afectan la
evolución de los ITS en gimnospermas, pero la evidencia encontrada en pinos
(Pinus spp) sugiere que tanto el número de copias del nrADN como de loci es
mayor que en angiospermas, por lo que se espera encontrar tasas de
homogenización relativamente bajas en gimnospermas (Karvonen y Savolainen,
1993).
2.1.4.6. ITSs en angiospermas
La filogenetica molecular de las angiospermas se ha efectuado a partir de la
inferencia de tres genes (rbcL, atpB, 18S rDNA) lo que ha permitido una
37
reclasificación de las angiospermas y esta reclasificación es quizás lo más
importante que ha sucedido en la taxonomía de las angiospermas en los últimos
200 años (Soltis y Soltis, 2000).
La región de los ITS ha sido considerada como una fuente muy útil de
caracteres para estudios filogenéticos en angiospermas (Baldwin et al. 1995),
dado que los ITS se encuentran altamente representados en el genoma, se
pueden amplificar con cantidades pequeñas de ADN y las secuencias altamente
conservadas dentro de la mayoría de los genes del nrADN son muy útiles en el
diseño de oligonucleótidos ("primers") "universales", lo que facilita la amplificación
de los ITS mediante el uso de la reacción en cadena de la polímerasa (PCR)
(Liston 1992; Planta Y Raué, 1999). Los espaciadores internos transcritos (ITS)
son la parte más variable de la región de los ITS, la región de los ITS comprende
el ITS2, la subunidad 5.8S y el ITS1, debido a que se encuentran flanqueando a la
subunidad 5.8S, que es más conservada y se posibilita la alineación no ambigua
de esta región (Baldwin et al., 1995)
Una limitación en la utilidad de los ITS en la sistemática de angiospermas,
es que este locus presenta una cantidad relativamente pequeña de nucleótidos.
En angiospermas, los ITS tienen de 565 a 700 pares de bases (bp) en longitud
(Baldwin el al.. 1995). Puesto que la subunidad 5.8S (163-164 bp) exhibe niveles
muy bajos de variación en su secuencia, solamente los 400-535 bp del ITS1 y el
ITS2 son útiles para la reconstrucción filogenética entre géneros y especies
relacionadas.
En contraste, la región de los ITS de gimnospermas es considerablemente
más larga y tiene un mayor rango de variación que va desde 750 bp en
Welwitschia mirabilis hasta 3125 bp en Pícea abies (Qu et al., 1993; Liston et al.,
1996). Recientemente se realizó un estudio detallado sobre la variación en la
longitud de la región de los ITS en gimnospermas, incluyendo 32 especies de
gimnospermas, en catorce familias y cuatro órdenes, y se construyeron mapas de
sitios de restricción de los ITS amplificados con PCR (PCR-RFLP) (Liston et al.,
1996). El análisis de los
38
sitios de restricción indica que el ITS2 junto con la subunidad 5.8S está compuesto
de 350-425 bp, y es relativamente constante para todas las especies estudiadas.
Por lo tanto el ITS1 es el responsable de la mayor parte de la variación en la
longitud de los ITS en gimnospermas.
39
2.1.5. Satureja macrostema (Labiatae) como modelo de estudio.
El propósito de utilizar modelos de estudio es obtener conocimiento
partiendo de lo general, a lo particular, y para ello se utilizan ciertos organismos
específicos como modelo de todos los demás. Así, Mendel usó chícharos, Morgan
usó Drosophila; Anand (1992) menciona que casi toda la información disponible
sobre cómo es física y genéticamente el genoma de los hongos proviene de
estudios realizados usando levaduras o ascomicetos como modelos.
El Proyecto Genoma Humano tiene como objetivo descubrir y localizar los
más de 30.000 genes del hombre y poner toda esta información a disposición de
la comunidad de investigadores en biomedicina y paralelamente, se están
secuenciando otros organismos modelo (ratón, bacterias, levadura), como ayuda
al desarrollo de tecnología y a la interpretación de la funcionalidad de los genes
humanos. http://biotic.isciii.es/informacion/biosalud/biosalud.html. En la mayoría de
los estudios sobre evolución y diversidad floral, se han utilizado las plantas de
Arabidopsis thaliana que son miembros de la familia Brassicaceae (Coen y
Meyerowitz, 1991).
Kellogg y Shaffer (1993), argumentan que utilizar organismos modelo es
práctico dado que no se tiene el tiempo ni recursos para estudiar todas las
especies, y para muchas interrogantes, sería una pérdida de recursos innecesaria.
Señalan, que la meta principal de la mayoría de los estudios en biología: es
entender los procesos de cómo funciona el organismo y las partes que lo forman,
por lo tanto, cualquier organismo puede ser utilizado como modelo de estudio. De
acuerdo con estos autores, un organismo puede ser elegido si en él se pueden
cumplir al menos las siguientes causas:
a) Que sea accesible, es decir que exista disponibilidad y variabilidad.
b) Que sea de fácil manejo tanto en laboratorio como en ciertas condiciones
especiales.
40
c)
Que sea fácil de generalizar a otros organismos.
Con base en las consideraciones anteriores, en el presente estudio se eligió
a Satureja macrostema como organismo modelo para realizar estudios de
especiación y relaciones filogenéticas cuando la planta se desarrolla en hábitat
naturales pero con intervención del hombre, manifestada a través de la actividad
de recolección, funcionando ésta última como una fuerza de selección artificial.
Por evidencias empíricas reportadas, como las de McVaugh y Schmid
(1967) quienes mencionan que hay dos especies en México pertenecientes a la
sección Gardoquia: S. macrostema y S. jaliscana y una especie asociada con
bosques en barrancas es descrita como nueva. Mencionan también que existen
dos variedades alopátricas, reconocibles por las diferencias en pubescencia y son;
S. macrostema var. macrostema y S. macrostema var. laevigata, sin embargo los
rangos de distribución de las dos variedades se aproximan una a otra y quizás
actualmente se traslapan en algunas áreas del centro de Michoacán, ya que
algunos especimenes parecen ser típicamente de la var. laevigata y otros que se
han referido dudosamente a la var. macrostema, porque las ramillas son
escasamente hirsutas, pero considerablemente menos que algunos especimenes
del Valle de México. En otros individuos de Michoacán las hojas jóvenes y las
ramillas son escasamente vellosas, más de lo usual que en la var. laevigata, pero
menos que macrostema. Estos mismos autores sugieren que más trabajo de
campo es necesario en las áreas donde las dos variedades se traslapan (se
aproximan tanto que se mezclan) y no es improbable que las dos hibriden donde
ellas están ocurriendo juntas y los individuos de Michoacán pueden ser indicativo
de esto. También mencionan que algún flujo de genes entre las dos variedades
parece probable.
S. macrostema, ya ha sido utilizado como organismo modelo en estudios de
variación genética (Aguilar, 2001), fenología, (Aguilar, 2001), organogénesis y
embriogénesis somática (Aguilar, 2001), y en la determinación de nuevas
propiedades y usos de S. macrostema (Aguilar, 2001).
41
2.1.6. Clasificación botánica de Satureja macrostema (Benth) Briq.
Reino
Vegetal
División
Espermatofitas
Subdivisión II
Angiosperma
Clase
Dicoteledóneo
Subclase
Magnoliophyta
Magnoliopsida
Asteridae
Orden
Tubiflorales
Labiales
Familia
Labiateaeo
Lamiaceae
Genero
Satureja
Especie
macrostema
(Watson and Dallwitz, 1992)
(http://biodiversity.uno.edu/delta/.)
2.1.6.1. Descripción de la especie Satureja macrostema (Benth) Briq.
(Calamintha macrostema Benth.) Planta arbustiva, con olor a menta al estrujar, de
1 a 2 (3) m de alto; tallos erectos, ramas arqueadas, pubescentes; hojas con
pecíolos de 2 a 5 mm de largo, limbo ovado u oblongo a lanceolado, de 1 a 4cm
de largo por 0.6 a 1.5 cm de ancho, ápice agudo, aserradas, base redondeada;
flores solitarias o en grupos de 2 a 3 en las axilas de las hojas, pedicelos de 2 a
6(10) mm de largo, pubescentes; cáliz 5-dentado, bilabiado, de 7 a 10 mm de
largo con la garganta pilosa; corola roja o anaranjada (cambiando a blanquecina o
rosada en el secado), de 2 a 3.5 cm de largo; estambres exsertos, tecas de las
anteras divergentes; estilo saliente de la corola; mericarpios ovoides, lisos o
reticulados. (Rzedowski, 1985).
Nombre vulgar o común que recibe: Nurite, tabaquillo, hierba del borracho,
tuche, Garañona, té de monte, Atóchietl, poleo, Cuencuenzpatli (Náhuatl), Guiezaa (Oaxaca, Zapoteco), Nurhitini té (purépecha), Tragorigano quauhnahuacense,
toronjil, Tunché, tarepe, etc. "Té de monte", "tabaquillo", "toronjil".
Es una especie vegetal que crece silvestre en las regiones de clima
templado. Cuajimalpa a Tlalpan y Milpa Alta; Tialmanalco y Amecameca. Alt.
2450-3500 m.
42
Principalmente en bosques de pino, de encino y de oyamel, a veces en matorrales
cercanos a los bosques. Fuera del Valle de México, se le localiza de Jalisco a
Veracruz y Oaxaca. Planta medicinal, utilizada localmente contra algunas
molestias de los conductos digestivos (Rzedowski, 1985).
2.1.6.2. Distribución geográfica. En México se le localiza de Jalisco a
Veracruz y Oaxaca (Standley, 1924), a lo largo de la Cordillera Neovolcánica, en
bosques de pino, encino y oyamel en alturas de 2400-3200 m.s.n.m.; en
Michoacán (Figura 1) se distribuye en los Municipios de Uruapan, Paracho, Nuevo
San Juan Parangaricutiro, Zinapécuaro, Zitácuaro, Coalcomán, Aguililla, Charo,
Chiltota, Cd. Hidalgo, Angangueo, Nahuatzen, Ocampo, Pátzcuaro, Salvador
Escalante, Senguio y Táncitaro. De acuerdo con el estudio complementario
realizado como parte de esta investigación y con base en la temperatura (9 a 16
°C); precipitación (1,200 a 1,600 mm); altura sobre el nivel del mar (2,000 a 3,200
msnm); suelos andosoles y una pendiente del 0 al 35%, se elaboraron mapas
mediante Sistemas de Información Geográfica (SIG), en los cuales se localizan las
áreas homogéneas y que presentan las mejores condiciones medio ambientales
para la presencia natural o introducida del te nurite (Satureja macrostema) en las
que puede expresar todo su potencial veaetal en el estado de Michoacán (Aguilar,
Inédito)
43
2.1.6.3. Importancia, usos y propiedades curativas del té nurite (S.
macrostema). Planta de gran importancia en la medicina tradicional de los
pueblos P'urhépecha, quienes la consideran un símbolo de fertilidad y por ello es
usada en las Bodas; el nurite es utilizado como un eficiente aperitivo si se toma en
ayunas o antes de los alimentos. Se utiliza para combatir las infecciones
intestinales como estomático, excitante de los movimientos gástricos o
gastrointestinales y favorece la digestión cuando esta es lenta y dolorosa. Es
utilizado como un carminativo poderoso y se utiliza también para evitar o eliminar
los cólicos. Es un agente digestivo eficaz si se toma después de los alimentos
también se toma el té nurite para eliminar las molestias producidas por a ingestión
de bebidas alcohólicas: agruras y nauseas, de este uso le viene el nombre de
"hierba del borracho". Otro uso que se le dé al nurite es el de aliviar un tipo de
diarrea denominada " diarrea de Tierra Caliente"; como remedio y buen tónico
después de sufrir malaria y otras fiebres. Tradicionalmente se toma un atole de
Nurite para aumentar la fertilidad y lograr la concepción en algunas mujeres que
padecen cierto tipo de esterilidad, (Martínez, 1986), de este uso se le conoce con
el nombre de "garañona" (Standley, 1924; Rodríguez, 1997; Rezedowski, 1985).
En síntesis, el género Satureja ha sido tradicionalmente usado como
estimulante, estomático, carminativo, expectorante, antidiarreico y afrodisíaco. La
esencia del aceite ha demostrado actividad antimicrobial y antidiarreica por los
fenoles del aceite y ha sido usada en el tratamiento del cáncer (Simon, et al.,
1984; http://www.hort.purdue.edu.Newcrop/med.aro/savory.), como antioxidante
(Lagouri y Boskou, 1996); también ha mostrado actividad contra los virus HSV-1 y
VSV (Abad et al., 1999) y actividad anti-HIV-1 (Yamasaki et al., 1998.
2.1.6.4. Usos actuales y potenciales. En recientes estudios fotoquímicos se ha
encontrado que el "té nurite" contiene una mezcla de compuestos químicos
llamados flavonoides los cuales han sido extensamente estudiados en los últimos
10 años (Catapano, 1997), dado que entran en la conocida categoría de los
antioxidantes de origen natural (Maridonneau-Parini, 1986; Chen, 1990; Facino,
44
1990). Entre los antioxidantes mas conocidos están las vitaminas E y C, que son
los antioxidantes "clásicos" pero en los últimos años se han descubierto otros,
tales como los flavonoides, que están ampliamente distribuidos en los tejidos
vegetales. Satureja incana; S. brevicalix; S. pulchela y S. sericea, son utilizadas en
la etnomedicina andina para tratar las vías respiratorias, como digestivos,
relajantes y antiflatulentos (Chumacero, et al., 2001). Satureja hortensis ha sido
utilizada en el tratamiento de algunos desórdenes gastrointestinales, como
antiespasmódico y antidiarreico (Hajhashemi et al., 2000); S. Thymbra, como
antioxidante y carcinógeno (Lagouri y Boskou, 1996); S. boliviana tiene actividad
contra los virus HSV-1 y VSV (Abad et al., 1999); efectos vasodilatorios a partir del
ingrediente activo de S. obovata (Sánchez et al., 1999); S. brownwi ha sido
comprobada para ser utilizada contra infecciones respiratorias provocadas por
bacterias Gram positivas como Staphylococcus aureus, Streptoccus pneumoniae y
Streptococcus pyogenes (Cáceres et al., 1991). En un estudio de las hierbas de la
familia Labiatae sobre su actividad anti-HIV-1, S. montana, mostró potente
actividad contra anti-HIV-1 (Yamasaki et al., 1998); S. parvifolia, mostró actividad
antimicrobial
contra
microorganismos
Gram
positivos
y
Gram
negativos
(Hernández et al., 2000).
Por lo anterior, Satureja macrostema puede considerarse como una planta
con uso potencial tanto la industria alimentaria como en la farmacéutica, que se
desarrolla en las zonas Templado-Frías, por lo que obtener información sobre ésta
planta, es de gran relevancia, dada la necesidad de contar con modelos de estudio
de los ambientes ecológicos donde se desarrolla y por otro lado, generar
conocimiento sobre plantas de interés social y económico. Asimismo, con base en
la literatura señalada, es probablemente que exista hibridación y flujo genético
entre poblaciones presentes en el estado de Michoacán, y posiblemente esté
presente un proceso de especiación del modo recombinacional o rápido.
45
III. PROBLEMA ESPECÍFICO, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Problema específico:
Una pregunta fundamental en biología evolucionarla es: ¿la especiación es
gradual o puntuada?, es decir, el proceso evolutivo se presenta de manera gradual
(que ocurre a un ritmo más o menos constante, y no se observa en la secuencia
de los fósiles porque ésta es incompleta),o de manera punteada (cuando el
registro fósil refleja con fidelidad la manera en que ocurrió la evolución: largos
periodos de rápida especiación y cuando se rompe el equilibrio por la acumulación
de mutaciones, estos periodos relativamente cortos de evolución activa son
seguidos por largos periodos de estasis), esta pregunta ha sido difícil de
responder principalmente porque la historia evolucionarla de la mayoría de las
especies de plantas y animales es pobremente conocida (Rieseberg y Ungerer,
2001)
Así, la biología evolutiva tiene como un tema de estudio principal el proceso
de especiación, y como parte del mismo los diferentes mecanismos que participan
en el proceso. En cuanto al modo de especiación conocida como especiación
híbrida o "recombinacional" la teoría predice que el proceso evolutivo que origina
esta cladogénesis es del tipo puntuado, pero a la fecha existe poca evidencia
empírica para apoyarla (Ungerer et. al.,1998). Las técnicas moleculares aplicadas
a estudios evolutivos permiten la obtención de datos para apoyar posibles
explicaciones del proceso biológico (especiación), así como la propuesta de las
relaciones filogenéticas que se han establecido durante el proceso mismo.
Con base en lo anterior, las preguntas planteadas en este estudio fueron:
¿Qué tipo de especiación está presente en Satureja macrostema var. laevigata? y
¿Si la especiación recombinacional está presente, ésta es de tipo puntuada como
lo predice la teoría?.
46
Hipótesis
"Es probable que en Satureja macrostema var. laevigata se encuentre presente un
proceso de especiación recombinacional y que éste sea de tipo puntuado"
Objetivos
1.- Determinar el probable modo de especiación en poblaciones de Satureja
macrostema var. laevigata presentes en el estado de Michoacán.
2.- Establecer las relaciones filogenéticas de poblaciones de Satureja
macrostema var. laevigata presentes en el estado de Michoacán.
47
IV. MATERIALES Y MÉTODOS
Para el logro de los objetivos y metas del presente estudio se plantearon
cuatro etapas bien definidas: 1) la colecta e identificación tradicional del material
vegetativo de Satureja macrostema de las diferentes localidades en estudio, 2)
aplicación de las diferentes técnicas de biología molecular al material vegetal
obtenido, 3) la aplicación de las técnicas computacionales para el manejo y
análisis de las secuencias obtenidas por biología molecular y 4) la obtención y
descripción de los resultados anteriores para inferir la filogenia de los
especímenes en estudio. La primera y cuarta fase se llevó a cabo en las
instalaciones del Campo experimental Uruapan del INIFAP en la ciudad de
Uruapan, Michoacán. La segunda y tercera fase se realizaron en los laboratorios
del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CIVESTAV-IPN) Unidad
Irapuato, en Irapuato, Guanajuato. El desarrollo de cada fase se describe a
continuación:
4.1. Colecta e Identificación del material vegetal
Las colectas de los materiales de la especie S. macrostema se realizaron
en tres localidades de la Sierra Puhrepecha, Estado de Michoacán, México, en el
cuadrol se mencionan las características generales de las localidades.
Cuadro 1.- Características de las localidades donde se colectó material botánico de
S. macrostema.
Localidad
A (m
N (°)
W (°) Exposición suelo
San Juan
2100
102° 15" 19° 27"
E
Uruapan
1611
102° 11" 19° 46"
Z
Paracho
¿
102º08'
S
19º 39
A= Altura sobre el nivel del mar. N= Latitud Norte.
Clima
Andosol Templado
subhúmedo
Andosol Templado
Andosol Templado
subhúmedo
W= Longitud Oeste
Vegetación
Fecha de
asociada
colecta
Bosque Pinus Nov 2000
y Abies sp.
Jardín
Nov 2000
botánico
Bosque Pinus Nov 2000
y Abies sp
48
Se colectaron 5 ejemplares por cada localidad, cada localidad (4) se
consideró como representante de una población diferente de S. macrostema y la
denominación de los ejemplares tratados en este estudio se resumen en el cuadro
2:
Cuadro 2.- Ejemplares de Satureja macrostema utilizados en el estudio
Localidad
Nombre común en la
localidad
Nomenclatura para este
Estudio
INIFAP, Uruapan
Blanco
Té Nurite Blanco (SATIB)
INIFAP, Uruapan
Negro
Te Nurite Negro (SATIN)
San Juan
?
Té Nurite San Juan (SATSJ)
Paracho
?
Té Nurite Paracho (SATPA)
INIFAP= Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias.
4.2. Extracción y limpieza del ADN
De los especímenes colectados, se seleccionaron dos ejemplares al azar por
localidad, con la finalidad de obtener por duplicado los resultados de cada
localidad, y de cada uno de ellos se separaron las hojas para la extracción de
ADN.
4.3. Extracción del ADN
Los procedimientos para extracción de ADN genómico de plantas incluyen
tratamientos que rompen las paredes y membranas celulares para liberar los
constituyentes celulares dentro de un buffer de extracción que contiene
compuestos para proteger al ADN de la actividad de nucleasas endógenas (Griffin
et al., 1994).
Todas las muestras fueron congeladas con nitrógeno líquido y finamente
maceradas. El ADN total fue aislado de tejido verde de cada una de las
localidades tratadas por el método propuesto por Doyle y Doyle (1990).
49
Se prepararon los siguientes reactivos de acuerdo al protocolo de Doyle y Doyle
(1990).
Soluciones para extracción de ADN.
Buffer de extracción: CTAB 2% PN, NaCI 1.4 M, EDTA 20 mM pH 8.0, a
mercaptoetanol 0.2% v/v. ( Doyle y Doyle, 1990. cita al 0.1 %; en el presente caso
se utilizó al 0.2%)
* EDTA0.5MpH8.0
* Tris-HCI 1 M pH 7.5 *Ácido maleico 1 M *Acetato de sodio 2.5 M
* Fosfato de sodio monobásico
* SDS 20 % (p/v)
* Cloruro de litio 4 M
* Etanol absoluto
* Etanol al 70% (v/v)
* NaCI 5 M
* MgC12 2 M
* N-Lauril-Sarcosina 1 M
* SSC 1Ox pH 7.0 * Tween 20 al 20%
* Citrato de sodio 1 M
* Fosfato de sodio dibásico.
El protocolo se describe a continuación (Sambrock, 1989; García et al., 2001):
1. Moler de 0.5 a 2.0 g de material fresco o congelado con nitrógeno líquido en un
mortero con pistilo, hasta obtener un polvo fino.
50
2. Transferir directamente a un tubo de 30 ml (nalgene o falcon) y esperar a que
todo el nitrógeno se evapore. Agregar 10 ml de buffer de extracción precalentado
a 60°C, mezclar bien, tapar el tubo e incubar por 30 min. a 60°C con agitación
ocasional.
3. Extraer con 10 ml de cloroformo-alcohol isoamílico 24:1, centrifugar a 10,000
r.p.m. por 10 min. y recuperar la fase acuosa (superior).
4. Colocar la fase superior en un tubo eppendorf, agregar 2/3 partes del volumen
de la muestra de alcohol isopropílico y agitar suavemente para precipitar los
ácidos nucleicos (se puede dejar precipitar toda la noche a 20°C o por 3 horas
mínimo durante el día). Centrifugar a 10,000 r.p.m. por 10 min. y decantar el
sobrenadante (si se forma como hebra este se puede retirar con una asa de
vidrio).
5. Lavar el pastilla con etanol al 80% y dejar secar a temperatura ambiente. (Doyle
menciona realizar un solo lavado, en el presente estudio se realizaron dos)
6. Después de secar el pastilla, disolverlo en 500 ? l de TE y agregar 4 ? l de
ARNasa (a una concentración de 10 pg/? l).
7. Incubar a 37°C por 1 h con la ARNasa.
8. Centrifugar por 5 min a 12000 r.p.m, y recuperar el sobrenadante.
9. Agregar 10 % de acetato de sodio 3 M pH 5.2 y 2/3 partes del volumen de
isopropanol.
10. Reposar por 5 min.
11. Transferir el ADN a tubos eppendorf.
12. Decantar todo el sobrenadante, dejando solo el ADN en el tubo y luego se deja
secar.
13. Enjuagar con 1 ml de una solución de etanol al 75% y 10 mM de acetato de
amonio por 1 min.
14. Si se desea se puede dejar a -20°C hasta su uso.
(Doyle y Doyle, 1990).
Una vez obtenido el ADN se realizó la limpieza del ADN por el método de
GenClean utilizando los reactivos del Biorad (kit Prep-A-Gene DNA Purification
Systems) y siguiendo las instrucciones citadas por los fabricantes.
51
Las concentraciones de ADN fueron determinadas midiendo la absorbencia
a X260 nm con un espectrofotómetro Cary3 de la Compañía Varían. El ADN se
almaceno a -20°C hasta su uso.
4.4. Determinación de la concentración del ADN
De acuerdo con Maniatis (1989), para calcular la concentración de ADN de
tejido fresco se utilizó la ecuación 1 en donde los resultados se expresan en µg/µ l.
[ ]= Abs 260 nm * Factor de dilución / 20
1
4.5. Determinación de la calidad del ADN
El cálculo de la calidad del ADN involucra las absorbancias a 260 y 280 nm
y se utilizó la ecuación 2. Si el resultado está dentro del rango de 1.8 a 1.9,
significa que el ADN es de buena calidad. (Maniatis, 1989)
Calidad = Abs 260 / Abs 280
2
Una vez determinada la concentración del ADN de cada muestra se
procedió a su amplificación como se describe a continuación:
4.6. Espacios transcritos internos (ITS).
El desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) potenció,
entre otras cosas, el uso de secuencias génicas en el estudio de las relaciones
filogenéticas entre poblaciones o especies. Las secuencias génicas más utilizadas
actualmente incluyen a los genes ribosomales, en especial a los espaciadores
transcritos internos (ITSs) (Walsh, 1998). Para la amplificación de estos
espaciadores existe un protocolo ampliamente generalizado y es el que a
continuación se describe:
52
Para la amplificación se utilizó el mismo ADN de la sección anterior
mostrado en la figura 2 y con la limpieza con fenol-cloroformo y el GenClean con
el kit Prep-AGene DNA Purification Systems de BIO-RAD
4.7. Primera amplificación del ADN
Se mandaron sintetizar a la compañía Gifco BRL los iniciadores ITS1 e
ITS4, que permiten la amplificación de la región ITS1-5.8S-ITS2 de los genes
ribosomales de eucariotes. La secuencia de estos iniciadores se muestra a
continuación:
ITS1 5'tccgtaggtgaacctgcgg 3' 10 nucleótidos
ITS4 5'tcctccgcttatttgatatgc 3' 10 nucleótidos
Las condiciones de reacción se muestran a continuación:
Para preparar 1 reacción de PCR bajo las condiciones anteriores se
requirieron: 14.8 ? l de H2O mQ, 2.5 µ l de buffer 1OX+Mg 10x, 0.5 µ l de dNTP 10
mM, 1 µ l de iniciador ITS1 10 pM/µ l, 1 µ l de iniciador ITS4 10 pM/? l, 0.2 µ l de Taq
2.5 U/ ? l, 0.5 ? l de DNA geonómico por tubo y 50 ? l de aceite mineral (Williams, et
al., 1995).
Los productos amplificados se aplicaron en geles de agarosa al 1.2 % a 85 V,
luego se visualizaron las bandas en una fuente de luz UV.
4.8. Limpieza
Estos fragmentos se cortaron para someterse a una nueva limpieza con el
kit Prep-A-Gene DNA Purification Systems de BIO-RAD,
siguiendo
las
instrucciones de los fabricantes, para corroborar que se encontraban limpios y que
la amplificación correspondía, efectivamente, al fragmento de ITS, ITS1-5.8S-ITS2
y fueron
53
observados nuevamente en un gel de agarosa al 1.2% produciendo nuevamente
fragmentos de 700 pb. Estos fragmentos fueron cortados y limpiados nuevamente
de la misma manera como se describe en párrafo anterior y mandados a
secuenciar.
4.9. Segunda amplificación
Los productos amplificados se aplicaron en geles de agarosa al 1.2 % a 85
V, luego se visualizaron las bandas en una fuente de luz UV. Antes de ser
secuenciados dichos productos fueron limpiados usando el Kit de Purificación
Nucleón Phytopure® de BIO-RAD, siguiendo las instrucciones provistas por este
kit.
4.10. Purificación de ADN
protocolo segundo:
?
Cortar el fragmento del gel que contiene la banda de DNA deseada y poner en
un tubo de 1.5 ml. No usar más de 250 ml en cada tubo.
?
Adicionar de 2 a 3 volúmenes de KI - Nal (500 µ l) e incubar a 50°C por 5' hasta
que se disuelva completamente la agarosa.
?
Adicionar 30 µ l de la suspensión de glass milk (1 µl por cada 0.5 pg de DNA) e
incubar a 4°C por 10'.
?
Centrifugar por 30" (un pulso en la microcentrifuga). Guardar el sobrenadante.
?
Lavar la pastilla tres veces con 500 µ l de la solución de etanol 50 %,
resuspendiendo la pastilla con una pipeta Pasteur sellada. Para cada lavado
centrifugar 30" y guardar todos los sobrenadantes.
?
Resuspender la pastilla final con 30 µ l de H2O dd para eluir el DNA desde el
glass milk. Esta pastilla fácilmente se resuspende en un volumen de agua que
es igual al volumen de la pastilla. Incubar el tubo a 45-55°C por 10' y luego
centrifugar por 30" para producir una pastilla sólida. Remover cuidadosamente
el sobrenadante que contiene el DNA eluido y colocar en tubo nuevo (aquí se
obtiene un 70 % de DNA, una segunda elución libera el 30 % restante).
54
Soluciones: (el kit trae preparadas estas soluciones, si no se pueden preparar
como se describe a continuación)
* Glass milk.- Se prepara a partir de pipetas Pasteur molidas en un vaso
pulverizador. El polvo resultante se suspende en H2O dd y se deja precipitar en
una probeta de cristal durante 15'. La solución "lechosa" sobrenadante (las
partículas más pequeñas que no se precipitaron) se pasa a tubos Falcon y se
centrifuga de 2-3' a 3000 rpm. Desechar el sobrenadante y resuspender la pastilla
en un volumen mínimo de H2O dd (20 mi).
* KI.-Se disuelven 180g de KI - Nal en 95 ml de H2O dd caliente filtrada en
papel Whatman No. 1 (...se forman cristales). Se agregan 0.5g de Na SO3 como
antioxidante. La solución resultante se guarda en la oscuridad a 4°C.
* Etanol 50 %.- 50 ml de etanol absoluto en 50 ml de la solución: Tris HCI
20 mM (1 ml de 1M) pH 7.4, EDTA 1 mM (0.1 mi de 0.5 M) y NaCI 0.1 M (5ml de 1
M). Guardar a -20°C (Sambrook, et al., 1989).
4.11. Secuenciación
Las reacciones de secuenciación fueron realizadas por amplificación con
PCR en un volumen final de 20 µ l usando 100 ng de los productos amplificados de
ITS, 10 pmol de cada iniciador y 9.5 µ l de DyeTerminators premix part No 402079
de acuerdo al protocolo de Applied Biosystems, para cada muestra. Después de
calentar a 94°C por 2 minutos, la reacción consistió de 30 ciclos de 94°C un
minuto, 55°C un minuto y 72°C un minuto, con 72°C por 7 minutos en el ultimo
ciclo (9600 thermal cycler Perkin Elmer). Se removió el exceso de Dye
Terminators usando columnas Quick Spin (Boehringer Mannheim). Las muestras
fueron directamente secadas en centrífuga al vacío y disueltas con 4 µ l de EDTA
formamida desionizada a pH 8.0. Las muestras fueron cargadas dentro del
secuenciador ABI Prism TM 377
55
ADN Sequencer y corridas por 12 horas en gel de acrilamida al 4.5% en
condiciones desnaturalizantes. Todas las secuencias se obtuvieron por duplicado,
a partir de dos ejemplares diferentes para cada taxa (White et al., 1990)
4.12. Alineación de secuencias
Una vez obtenidas las secuencias, estas fueron recortadas individualmente
en la región 5' del ITS1 y 3' del ITS2, se retiraron las secuencias correspondientes
a los iniciadores decameros usados para su amplificación en cada extremo y se
uso el gene 5.8s como anclaje, basándose en la secuencia reportada para
Labiatae en el GenBank para este gene.
Para esto se utilizaron los programas DNASIS de DNASIS Inc. y MegAlign
de DNASTAR 3.0 SOFTWARE Co. bajo el método Clustal de máxima parsimonia
(Thompson et al. 1994).
4.13. Búsqueda y reporte de secuencias en el GenBank
Con la finalidad de construir un árbol filogenético y del cual se puedan
realizar inferencias filogenéticos más confiables, se procedió a bajar secuencias
de especies similares reportadas por internet en el Genbank del mismo género y
géneros relacionados, las cuales se alineaban entre sí para la determinación de
distancias genéticas y su filogenia. El tipo de análisis empleado fue el de la
búsqueda de similaridad, que consiste en efectuar una comparación de una
secuencia problema con la totalidad de secuencias existentes en una base de
datos. Estas búsquedas se realizan con distintos programas que aplican
algoritmos de comparación y como resultado generan un listado de organismos
cuyas secuencias resultan similares a la de estudio. Los algoritmos más comunes
disponibles en la Internet son el BLAST y el FASTA. En el presente caso se uso el
algoritmo de Blast como se describe a continuación:
56
* Las búsquedas de similaridad a través del BLAST del NCBI se hicieron en el
URL: http://www.ncbi.nim.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-blast?Jform=0
Una vez conectados a este URL se especificó lo siguiente:
1. La secuencia problema (cada una de las secuencias obtenidas).
2. El programa a ejecutarse, según sea el caso de las secuencias a
comparar, entre blastp, blastn, blastx, tblastn, tblastx. (en este caso tblastn).
3. La base de datos contra la cual se desea hacer la comparación. Se
recomienda para empezar la no-redundante (nr).
4. El formato de los resultados: HTML (con lo cual aparecerá el resultado en
pantalla en tanto esté listo) o por correo electrónico (para lo cual se
especificó nuestra dirección electrónica). En ambos casos, la operación
puede durar algunos minutos.
Se Introduce cada secuencia y se configuran los parámetros según sea
cada caso y se pulsa el botón Submitt Query. Con base en lo elegido en el formato
del resultado, apareció el resultado en pantalla o se recibió por correo electrónico.
En ambos casos, se almacenaron los resultados en un archivo local, para análisis
posteriores.
Las secuencias —bajadas- de internet se cargaron en el programa Editseq
de DNASTAR con el propósito de convertirlas en archivos legibles para el
programa MegAlign. El programa MegAlign fue usado para alinear las diferentes
secuencias obtenidas y así obtener la filogenia de tales secuencias por medio del
análisis Neighbor-Joining y bootstrapping utilizando el método CLUSTAL W
(Thompson et al. 1994).
57
4.14. Determinación de la distancia genética
Las distancias genéticas fueron calculadas por el programa DNADIST en
PHYLIP v. 3.5 usando el modelo de parámetro'2 de Kimura de base de
substitución. El análisis UPGM de la distancia genética fue también realizado
usando el programa DNADIST con el método NEIGHBOR, (Felsenstein, 1993)
4.15. Determinación de la distancia genética y filogenia por medio de
cladogramas.
Una de las herramientas más interesantes en el análisis de secuencias, es
el dibujo de dendogramas que permitan tener una idea relativa de las distancias y
filogenia que separan a las secuencias estudiadas. En una primera instancia, se
pueden dibujar dendogramas basados en el grado de similaridad entre las
secuencias y un árbol filogenético podrá ser dibujado al considerarse un número
estadísticamente significativo de caracteres (que para este caso pueden ser varios
nucleótidos polimórficos) y contemplar otros factores como genomas completos,
registros fósiles, características fenotípicas, entre otros, destacando una vez más
que, un árbol filogenético es una hipótesis que se plantea como primera
aproximación a la relación evolutiva entre los organismos estudiados (Thompson
et al. 1994).
El MegAlig, es un programa que permite entre otras cosas, calcular
distancias entre caracteres y dibujar dendogramas basados en estas distancias.
Para lograr esto, el MegAlig requiere como data de entrada un archivo con las
distancias y relaciones entre las secuencias. Este archivo puede ser generado con
herramientas de alineamiento múltiple como el CLUSTAL-W, tal como se señala
en la sección de análisis de secuencias. En este estudio se empleó el software
Editseq para la generación de cada archivo correspondiente a cada secuencia en
estudio. (Thompson et al. 1994).
58
4.16. Filogenia de las secuencias obtenidas
El dendrograma fue ilustrado por MegAlign, la longitud de las secuencias, el
contenido de % de GC y el número de diferencias de base fue calculado por
EditSeq de DNASTAR 3.0. El software de estos programas está disponible de
manera gratuita en Internet. (el DNASTAR no lo esta, pero los métodos que usa
como el CLUSTAL sí están en otros software de Internet), (Thompson et al. 1994).
59
V. RESULTADOS
La determinación del modo de cómo probablemente se este realizando
algún evento de especiación en Satureja macrostema var. laevigata en el estado
de Michoacán y el establecimiento de sus relaciones filogenéticas fue establecido
con base en la secuenciación de sus espacios transcritos internos ITS de su ADN
ribosomal, con el cual se definió que se encuentra en un proceso de especiación
rápida, híbrida o recombinacional, que se refuerza con la inferencia de sus
relaciones filogenéticas, las cuales se han realizado en un período corto de tiempo
geológico (20-30,000 años), observándose además en sus secuencias internas de
su ADN, que se continúan realizando en las plantas actuales mutaciones de punto
(perdida o ganancia de una o dos bases), las cuales a menudo son suficientes
para recorrer la información genética y se encontró que las hay de dos tipos
(transversiones: sustituciones de purina por pirimidina, y transiciones: purina por
purina y pirimidina por pirimidina que son las formas más simples de mutación)
(Ennis, 2000).
5.1. Extracción del ADN.
La calidad del ADN genómico, aislado de tejido fresco, evaluado por electroforesis
en gel de agarosa al 1.2% teñido en bromuro de etidio (figura 2) resultó adecuada
para los análisis llevados a cabo.
La concentración total promedio de DNA, medida con la absorbencia en un
espectrofotómetro, estuvo en un rango de 102 a 900 ng/µ l de solución, distribuidos
de la siguiente manera: SATIB 102 ng/µ l, SATPA 295 ng/µ l, SATIN 430 ng/µ l y
SATSJ 927 ng/pl de promedio de dos repeticiones.
60
La calidad del ADN resultó adecuada para los análisis llevados a cabo. 5.5
Amplificación.
La
amplificación
de
la
región
de
los
ITS
generó
bandas
de
aproximadamente 690 pb, visualizados en un gel de agarosa al 1.2%, corrido a 80
volts por una hora, variando la intensidad de las bandas con base en su peso
molecular entre los diferentes individuos representantes de poblaciones diferentes
(Figura 3). Esto podría interpretarse como la variación genética existente entre las
plantas en estudio.
61
A pesar de que en la figura 3 no todos los carriles muestran la banda
correspondiente a la amplificación de la región ITS1-5.8s-ITS2, con los primers
ITS 1-4 de aproximadamente 700 pb, sí se observa que para cada "te nurite" hay
por lo menos un carril con fragmento amplificado.
Los fragmentos que amplificaron fueron cortados y limpiados con
GenClean, tal y como se describe en la sección de materiales y métodos, y
secuenciados, esto es: el tratamiento de GenClean permitió obtener ADN limpio,
sin residuos de carbohidratos y RNA; al ser cortados resultaron aptos para
secuenciación.
5.3. Secuencias.
La secuenciación de los 4 fragmentos correspondientes a los ADN de
diferentes plantas, se muestra en la cuadro 3. En todos los casos se obtuvieron las
secuencias ITS1, 5.8S e ITS2, así como sus reversos y complementos (estos
últimos no mostrados).
Cuadro 3.- Secuencias obtenidas por espécimen de Satureja macrostema con los
primers ITS1-4.
ITS1 SATIB (253 b)
cctgcaaagcagaccgccgaacacgttcaacacaaaacccggcgccgcggagtgggggcgaccccccggccggcgtgtgcgctcgcgtcgcgtcc
gtgtcggtctaacaaacttgggcgcggcgcggaatgcgcgcaaggaaatcgaaaattgagcatccccctccccagacgcgcccggttcgcgggcgac
ggggagacaggatgcctatcgaaatgtctaaacgactctcggcaacggatatctggctctc
ITS1 SATIN (250 b)
cctgcaaagcagaccgcgaacacgttcaaacacaaaacccggcgccgcggagtgggggcgacccccccgccggcgtgtgcgctcgcgtcgcgccg
tgcggtctaacaaacttgggcgcggcgcggaatgcgccaaggaaaacgaaattgagcatccccctccccgacgcgccccgttcgcggggcgacggg
gagaaagggatgcctatcgaatgtctaaacgactctcggcaacggatatctcggctctc
ITS1 SATPA (254 b)
cctgcaaagcagaccgccgaacacgttcaacacaaaacccggcgccgcggagtgggggcgacccccccgccggcgtgtgcgctcgcgtcgcgtccg
tgtcggtctaacaaacttgggcgcggcgcggaatgcgcgcaaggaaatcgaaaattgagcatccccctccccagacgcgccccgttcgcgggcgacg
gggagacagggatgcctatcgaaatgtctaaacgactctcggcaacggatatctggctctc
ITS1 SATSJ (252 b)
cctgcaaagcagaccgccgaacacgtttcaaacacaaaacccggcgccgcggagtgggggcgacccgcccgccggcgtgtgcgctcgcgtcgcgc
cgtgcggtctaacaaacttgggcgcggcgcggaatgcgccaaggaaaacgaaattagcatccccctccccgacgcgccccgttcgcggggcgacgg
ggagaaagggatgcctatcgaaatgtctaaacgactctcgacaacggatatctcggctctc
5.8S SATIB (166 b)
62
Gcatcgatgaagaacgtacgaaatgcgatacttggtgtgaattgcagaatcccgtgaaccatcgagtcttagaacgcaagttgcgcccgaagccatt
agcccgagggcacgcctgcctgggcgtcacgcatcgcgtcgccccctcctcccactcgactaactccgg
5.8S SATIN (166 b)
gcatcgatgaagaacgtacgaaatgcgatacttggtgtgaattgcagaatcccgtgaaccatcgagtctttgaacgcaagttgcgcccgaagccatta
ggccgagggcacgcctgcctgggcgtcacgcatcgcgtcgccccctcctcccactcgactaactccgg
5.8S SATPA (166 b)
Gcatcgatgaagaacgtacgaaatgcgatacttggtgtgaattgcagaatcccgtgaaccatcgagtcttagaacgcaagttgcgcccgaagccatt
agcccgagggcacgcctgcctgggcgtcacgcatcgcgtcgccccctcctcccactcgactaactccgg
5.8S SATSJ (166 b)
gcatcgatgaagaacgtacgaaatgcgatacttggtgtgaattgcagaatcccgtgaaccatcgagtctttgaacgcaagttgcgcccgaagccatta
ggccgagggcacgcctgcctgggcgtcacgcatcgcgtcgccccctcctcccactcgactaactccgg
ITS2 SATIB (190 b)
gagaaggcggggccggagattggccccgggccggcccaaatgcgatcctcggcggcgcacgtctcgaccagtggtggttgaacgatcaactcgc
gtgctgtcgtgcctcaaggcgccgccgtcagggaaatcgaagccgtccggagaagaccgcaggacccaacggagcgatcccgcaacgctccca
cga ITS2 SATIN (192 b)
gggaaggcgggggcggagattggccccccgccggcccaaatgcgatcctcggcggcgcacgtcacgaccagtggtggttgaacgatcaactcgc
gtgcttcgtgcctcaaggcgccgccgtcagggaaatcgaaggccgtccggagaagaccgcaaggacccaacggagcgatcgcgcatcgctccca
cga ITS2 SATPA (190 b)
gggaaggcggggccggagattggcccccggccggcccaaatgcgatcctcggcggcgcacgtcacgaccagtggtggttgaacgatcaactcgc
gtgctgtcgtgcctcaaggcgccgccgtcagggaaatcgaagccgtccggagaagaccgcaggacccaacggagcgatcccgcaacgctccca
cga
ITS2 SATSJ (194 b)
Gggaaggcgggggcggagattggcccccggccggcccaaatgcgatcctcggcggcgcacgtcacgaccagtggtggttgaacgatcaactcg
cgtgctgtcgtgcctcaaggcgccgccgtcagggaaatcgaaggccgtccggagaaagaccgcaaggacccaacggagcgatcgcgcattcgct
cccacga
La longitud de las secuencias obtenidas de la región ITSI-5.8S-ITS2 varió de entre
658 pb
para SATIN
hasta 661 pb
de SATPA, que indica nuevamente la
variabilidad existente entre las plantas en estudio.
5.4. Recorte de secuencias
Una vez ubicado el gen 5.8S en las secuencias obtenidas se procedió a
"quitar" los decámeros correspondientes a los iniciadores en los extremos 5' y 3'de
cada secuencia, esto provocó una disminución en la longitud de las secuencias,
que al ser recortadas para su correcta alineación, quedaron de la siguiente
manera: SATIB 609 pb, SATIN 608 pb, SATSJ 612 pb y SATPA 610 pb,
observándose que la variación en la longitud de las cuatro secuencias varió de
608 a 612 pb.
La longitud del ITS1, 5.8S e ITS2 se observa en el cuadro 4, la variación
significativa en la longitud del ITS1 ocurrió de 250 a 254 bases y la relación G+C
en
63
el ITS1 varió de 64.3 a 65.2 % con un promedio de 64.6%; La longitud del gen
5.8S fue constante en el número de bases de 166 pb y la relación G+C también
fue constante de 58.4 %, mientras que el ITS2 varió de 190 a 194 pb con una
relación G+C que varió de 67.0 a 67.9%, con un promedio de 67.5 %; mientras
que el promedio de ITS1-5.8S-ITS2 vario de 63.2 a 63.8%. lo que corrobora
nuevamente la variabilidad existente entre las plantas en estudio.
5.5. Alineación
Las secuencias presentaron una longitud de 620 pb por planta (cuadro 19);
comparando únicamente los ITS1 e ITS2 de la manera siguiente: la comparación
SATIN contra SATIB (cuadro 7); en el cuadro 8, SATSJ contra SATIB; en el
cuadro 9, SATSJ contra SATPA; en el cuadro 10, SATIN contra SATPA; en el
cuadro 11, SATIN contra SATSJ y en el cuadro 12, SATPA contra SATIB.
Cuadro 4.- Longitud del ITS1, 5.8S e ITS2; promedio y contenido de G+C.
ITS1 pb % G+C 5.8S pb % G+C ITS2 pb % G+C Total pb Promedio G+C
IB
253
64.4
166
58.4
190
67.4
609
63.4
IN
250
65.2
166
58.4
192
67.7
608
63.8
PA
254
64.6
166
58.4
190
67.9
610
63.6
SJ
252
64.3
166
58.4
194
67.0
612
63.2
Promedio G+C
64.6
58.4
67.5
En los cuadros 7 a 12 se presentan las secuencias ITS1 e ITS2 alineadas
por planta y su comparación entre sí, marcándose los residuos comunes con una
barra vertical, y donde no son comunes, es decir, que existe deleción o inserción
en alguna de las secuencias se indica con rectángulos verticales de color verde o
azul y con rectángulos de color rojo las mutaciones (transversiones/transiciones),
las cuales se indican en los cuadros 7 a 12 en azul y violeta, observándose en el
cuadro 7, también el uso de "palabras (una palabra es un conjunto de residuos
contiguos en la misma posición que se consideran como una unidad y su longitud
es variable).
64
En el cuadro 5 se observan entre otras, las palabras; "AGA" (color rojo),
que se presenta 2 veces en IN y 3 veces en IB; "AAA" (color negro), se, presenta
11 veces en SATIN y 8 veces en SATIB; "CTC" se presenta 9 veces en SATIN y 9
veces en SATIB; "CCG" se presenta 13 veces en SATIN y 13 veces en SATIB;
"CGC" se presenta 18 veces en SATIN y 16 veces en SATIB, y "CG" (color violeta
dentro de rombos rojos), que se presenta 62 veces en SATIN y 61 en SATIB, y
que en realidad son, "motivos" es decir, series de repeticiones de secuencias
cortas de nucleótidos no codificantes, de los cuales no se tiene clara su origen y
función. Su variabilidad es alta y difieren de un individuo a otro, por lo que con el
análisis de estas regiones es posible identificar individuos.
En el cuadro 6 se observa el número y porcentaje de purinas (adeninastiminas) y
piridiminas (citosinas-guaninas), de SATIN-SATIB y SATSJ-SATPA.
Cuadro 5.- Número de veces que aparecen las "palabras" formadas por trinucleótidos y
dinucleótidos en los ITS1 e ITS2 al comparar SATIN contra SATIB.
AGA
%
AAA
%
CTC
%
CCG
%
CGC
%
CG
%
ITS1 IN
1
2
10
12
5
6
6
8
12
15
35
28
ITS2IN
1
2
1
2
4
7
7
11
6
10
27
29
TOTAL
2
ITSI IB
2
3
7
9
5
6
6
8
11
13
35
28
ITS2IB
1
2
1
2
4
7
7
11
5
8
26
28
TOTAL
3
11
8
9
9
13
13
18
16
62
61
observándose que el número de Adeninas, Timinas, Guaninas y Citocinas es muy
variable por ITS, pero se acentúa más en los ITSI-ITS2 de PA, sin embargo en
cuanto a porcentaje son muy similares. La relación GC varió de 63.3 a 67.9 %. Lo
anterior permite establecer diferencias entre las secuencias, las cuales al
analizarse por su distancia genética permiten establecer sus divergencias y
similitudes.
65
En los cuadros 11 y 12 se observa que precisamente el mayor porcentaje
de emparejamiento de las secuencias se da entre las plantas más estrechamente
relacionadas de acuerdo al árbol filogenético resultante, teniéndose para la
relación SATIN-SATSJ un 97 y 98 % de emparejamiento de bases en sus ITS1 e
ITS2 respectivamente y un número de solo 9 mutaciones de nucleótidos; mientras
que la relación SATPA-SATIB muestra un 98% de emparejamiento y tan solo 6
cambios, lo que define más lo estrechamente relacionados que se encuentran. Sin
embargo dichos cambios son indicadores de un probable evento de especiación y
el árbol generado a partir de estos datos es indicativo de ello, al separar a las
plantas en estudio como descendientes de un ancestro común.
Cuadro 6.- Número y porcentaje de purinas (adeninas-timinas) y piridiminas
(citosinas-guaninas), de SATIN-SATIB y SATSJ-SATPA.
A
%
T
%
G
%
C
%
G+C
ITS 1 I N
54
21.6
33
13.2
78
31.2
85
34
65.2
ITS2 IN
39
20.3
23
12
67
34.9
63
32.8
67.7
TOTAL
93
21
56
12.7
145
32.8
148
33.5
63.3
ITS1 IB
54
21.3
36
14.2
79
31.2
84
33.3
64.4
ITS2 IB
39
20.5
23
12.1
65
34.2
63
33.2
67.4
TOTAL
93
21
59
13.3
144
32.5
147
33.2
65.7
ITS1 SJ
56
22.2
34
13.5
77
30.6
85
33.7
64.3
ITS2 SJ
39
20.5
22
11.6
65
34.2
64
33.7
67.9
TOTAL
95
21.5
56
12.7
142
32.1
149
33.7
65.8
ITS1 PA
39
17.9
39
17.9
66
30.3
74
33.9
64.2
ITS2 PA
40
20.6
24
12.4
68
35
62
32
67
TOTAL
79
19.2
63
15.3
134
32.5
136
33
65.5
66
67
68
69
70
71
72
En el cuadro 13 se observa, el por ciento de emparejamiento con respecto a la
secuencia consenso resultante de alinear todas las secuencias, y el número de
deleciones, mutaciones e inserciones por comparación; aclarando que la primera
Cuadro 13.-Porcentaje de emparejamiento, alineamiento, deleciones,
inserciones y mutaciones (transversiones y transiciones)
Planta %
IN-IB
D
IN ITS1 94
D M 1
D
SJ-PA
D
M
1
6
4
7
4
5
0
D
IN-PA
D
M
1
4
4
6
4
2
0
D
IN-SJ
PA-IB
D M 1 D D M 1 D D
4
4
7
2
7
0
0
IB ITS2 95
7
SJITSI 93
IB ITS1 93
0
SJITS2 94
IB 1TS2 94
6
SJITS1 94
0
PAITS1 94
SJITS2 96
7
PAITS2 96
3 2 7
INITS1 95
0
PAITS1 95
INITS2 96
2 4 0 3
PAITS2 96
1 2 3
INITSI 97
2
SJITS1 97
0 1 2
INITS2 96
SJITS2 98
0
PAITS1 98
1
IBITSI 98
2 0
0
PAITS2 98
0
IBITS2 96
Total
MI
7
IB ITS1 94
INITS2 95
SJ-IB
7
24
7
26
6
20
% de emparejamiento y alineamiento. D= deleción. M= mutación. 1= inserción.
7
3 0
6
18
5
9
0
73
columna de deleciones siempre pertenece a la primera planta en comparación y la
segunda delecion pertenece a la segunda planta en comparación.
Por otro lado, en el cuadro 14 se observan los sitios en los cuales se
presentaron mutaciones puntuales de tipo transversión (purina por pirimidina) y
transición (purina por purina á pirimidina por pirimidina), por ITS, observándose
para la comparación SATIN-SATIB, 11 sitios polimórficos de los cuales 4 están en
ITS1 y 7 en el ITS2, tratándose por. lo tanto de las plantas más divergentes y más
distantes, siguiéndole en ese orden la relación SATSJ-SATPA con 6 sitios
polimórficos, que permiten establecerse como especies derivadas de un ancestro
común de acuerdo al árbol filogenético resultante (figura 6).
Cuadro 14.- Tipo de mutación (transversión-transición) y su número de sitio por ITS.
ITS 1 SATIN-SATIB
Número de sitio
Tipo de transversión
70
CxG
145
AxT
180
CxG
202
AxC
2
ITS2 SATIN-SATIB
ITS1 SATSJ-SATPA
GxA
13
GxC
28
CxG
29
CxG
64
AxT
176
GxC
181
TxA
67
GxC
146
AxT
203
AxC
238
ITS2 SATSJ-SATPA
Tipo de transición
AxG
13
GxC
177
GxC
74
En el cuadro15 se observa el reporte de alineamiento del gen 5.8S de las
cuatro plantas de Satureja macrostema, observándose, como se esperaba, que se
trata de una región conservada, con excepción de los sitios 71 y 100 (rombo color
violeta) en los cuales se observan inserciones de Adenina y Citosina
respectivamente y solamente presentes en el gen de las plantas correspondientes
a SATIB y SATPA.
En el árbol filogenético (figura 4), obtenido para este gen 5.8S con ClustalW
y Jotun Hein, se observan los mismos valores de similaridad y divergencia de 98.8
y 100% y 1.2 respectivamente (Cuadro 16), separando en dos pares de clados a
cada una las secuencias obtenidas.
75
En el cuadro 17 se observa el reporte del alineamiento del ITS1 de las
cuatro plantas de Satureja, en el cual existen 20 sitios polimórficos, mientras que
en el cuadro 18 se observa el alineamiento del ITS2 de las cuatro plantas de
Satureja en el cual solo existen 11 sitios polimórficos lo que manifiesta la
variabilidad genética entre las plantas en estudio, mostrando un mayor
polimorfismo los ITS1 uno que los ITS2.
76
En el cuadro 19 se reporta el alineamiento de la región ITS1-5.8s-ITS2 de
Satureja macrostema, en el cual se observan los mismos cambios descritos
anteriormente de el ITS1 e ITS2 con la única salvedad de que el número de sitio
cambia, ya que se inserto el gene 5.8S el cual muestra cambios de recorte por
motivo de lograrse el mejor alineamiento posible, de tal manera que en el sitio 265
existe deleción de Guanina en SATIN, SATPA e SATIB y en el sitio 278 existe
deleción de Guanina en SATPA e SATIB que no aparecen en el alineamiento del
5.8S; en el sitio 331 y 360 se observan las transversiones correspondientes a los
sitios 71.
También en el cuadro 19 se observa el alineamiento de las secuencias de
las cuatro plantas en estudio, detectándose un total de 36 sitios polimórficos, de
los cuales algunos son coincidentes, los coincidentes son regiones de variación de
77
reciente
aparición
y
donde
seguramente
sigue
el
evento
de
divergencia/especiacion, y por tanto las no coincidentes son regiones conservadas
que, sí presentan un cambio, este debe tener mayor tiempo; por planta se tienen
las siguientes mutaciones: 8 para SATSJ; 5 para SATPA; 4 para SATIN y 10 para
SATIB; los Indels (deleciones/inserciones) se consideraron aparte debido a que
estos son necesarios solo para lograr la mejor alineación y lograr obtener el árbol
más parsimonioso y para SATI B se necesitaron 11; para SATI N, 12; para
SATPA, 11; y para SATSJ, 7, de tal manera que SATSJ necesito menor número
de Indels ya que sus secuencias tienen mayor número de bases (612), mientras
que las secuencias de menor número de bases (SATIB-SATPA) de 609 y 608
pares de bases necesitaron el mismo número de Indels y SATIN fue el que
necesitó mayor numero (12) porque es el que tiene el menor número de bases
(608).
En la figura 5 se observan los árboles resultantes de este alineamiento y en
el cuadro 20 sus porcientos de similaridad y divergencia.
78
79
80
5.7. Comparación con algunos Géneros de la misma Familia.
En el cuadro 21, se aprecia la comparación de las plantas de Satureja
macrostema contra siete especies de otros géneros de la misma familia y
Heliopsis longipes como organismo externo (familia Asteraceae) y son; Faradaja
Iehuentei; Ipomea pestidigris; Nepeta sibirica; Oxera rugosa; Oxera vanuctensis;
Sideritis algarviensis y Stachys hirta. Al comparar las plantas de Satureja con otras
especies de otros géneros de la misma familia y con Heliópsís longipes como
organismo externo para comparación; se observan básicamente las inserciones,
deleciones y mutaciones descritas anteriormente en Satureja, pero además, un
mayor número de Indels que son necesarios para alinear satisfactoriamente a
todas las secuencias, observándose en los sitios 14 y 15 deleciones en todas las
especies excepto en Heliopsis longipes; lo que sugiere que esta ausencia de
bases es característica de la familia Lamiaceae; en el sitio 20 sucede lo mismo; en
los sitios 53 y 54 hay dos deleciones en todas las especies excepto en Heliopsis
longipes; en los sitios 68 a 73 sucede lo mismo; en los sitios 78 al 82 hay deleción
en Satureja lo que sugiere que esta ausencia de bases puede ser característica
del género Satureja; en los sitios 98 y 99 hay deleción en todas las especies
excepto en Heliopsis longipes; en los sitios 112 a 120 se observa lo mismo;
igualmente en los sitios 147 a 149; en el sitio 167 se observa inserción de Guanina
solo en IB y PA.
En el sitio 201 a 205 se observa la palabra "AGACG" en SATIB y SATPA y la
palabra "GACD" en SATIN y SATSJ que puede ser utilizada como marcador
especifico para las especies de Satureja y para elaborar uprimers» de las mismas;
lo mismo sucede con la palabra "AGA" del lugar 222 a 224, característico de
Satureja; en el sitio 452 al 454 se observa la palabra "ACT" característico solo de
Satureja; en los sitios 487 al 505 se observan deleciones muy particulares solo de
las Satureja en los sitios 603 al 606 se presenta la palabra "TCAG" solo en
Satureja; en el sitio 600 al 604 se presenta la palabra "AATCG" solo en Satureja;
en el sitio 523 al 527 se observa la palabra "TCCGG" solo en Satureja; en el sitio
529 al 531 se observa la palabra "GAA" solo en Satureja; la palabra "GA" se
81
observa solo en Satureja en los sitios 633 a 634; "CG" en los sitios 636 a 637; en
los sitios 644 al 649 se observa la palabra "ACCCAA" solo en Satureja.
En los sitios 652 al 654 y 656 al 658, se observan las palabras "GAG" y
"GAT" respectivamente y en los sitios 662 al 665 las palabras "GCAA" para IB Y
PA y las palabras "GCAT' para SATIN y SATSJ; estas últimas pueden ser
utilizadas para la identificación de la Satureja SATPA-SATIB y SATIN-SATSJ
específicamente. Las palabras anteriores sirven para identificar exclusivamente a
Satureja, y se encuentran dentro del cuadro de color violeta.
En el cuadro 22, se observan los porcentajes de similitud (97.5 y 93.6%)
entre las plantas de Satureja comparadas, observándose que las de mayor
porcentaje corresponden precisamente a las más estrechamente relacionadas de
acuerdo con el fenograma de la figura 6, además de que las mismas plantas
(SATPA-SATIB
y
SATIN-SATSJ)
respectivamente,
también
muestran
los
porcientos de divergencia entre ellas solo en una cantidad menor de (0.7 y 0.5%),
corroborándose lo estrechamente relacionadas que se encuentran. También se
observan los porcentajes entre Satureja al compararse contra otras ocho especies
de otros géneros de la misma familia Labiatae, usando a Ipomea y a Heliopsis
como grupos externos.
Es necesario señalar que entre más especies sean comparadas más se
fortalecerá el árbol filogenético resultante, ya que la secuencia consenso es la mas
cercana al origen, hasta completar el Arbol de la vida.
84
83
5.7 Dendrogramas.
El árbol filogénetico obtenido con base en las secuencias reportadas en el
cuadro 21, de acuerdo al programa MegAling y bajo el método de Clustal, se
muestra en la Figura 6, en el cual se observa con más claridad la distancia
genética y la filogenia entre las diferentes especies y en la figura 7 el cladograma
resultante.
84
5.8 Números de accesión en el GenBank
Las secuencias generadas en el presente estudio fueron enviadas para ser
indexadas al GenBank (NCBI, USA) por medio del software Sequin y en respuesta
se les dieron los números de accesión que abajo se describen y aparecieron en el
mes de mayo del 2002, y se encuentran en la Web para su uso y consulta a partir
del 6 de mayo de 2002.
Números de accesión.
AY094152 al ITS1 de SATIB, AY094153 al ITS2 de SATIB
AY094154 al ITS1 de SATIN, AY094155 al ITS2 de SATIN
AY094156 al ITS1 de SATPA, AY094157 al ITS2 de SATPA
AY094158 al ITS1 de SATSJ, AY094159 al ITS2 de SATSJ
85
VI. DISCUSIÓN
Uno de los principios centrales en biología evolutiva sostiene que toda la
biodiversidad comparte una historia evolutiva común; esto significa que existe una
sola genealogía para todos los organismos y todos los individuos existentes y
extintos están unidos por relaciones de descendencia en un patrón jerárquico de
grupos anidados en otros grupos más inclusivos (Wiley, 1981).
De acuerdo con Dobzhanzky (1982), la evolución consiste en una serie de
de transformaciones parciales o completas e irreversibles de la composición
genética de las poblaciones, basadas principalmente en interacciones con el
ambiente, mientras que actualmente Eldredge y Gould (1972), postulan en su
teoría del equilibrio puntuado, que la anagénesis (los cambios morfológicos
experimentados por un mismo linaje) y la cladogénesis (la división de una especie
en dos) están relacionadas, y mantienen además, que se da una breve
aceleración del cambio morfológico precisamente cuando una población de censo
reducido diverge de su especie original para formar otra nueva, con largos
periodos de rápida especiación (surgimiento de una o más especies). Estos
periodos de rápida especiación pueden ser causados por grandes cambios en el
ambiente, cuando se rompe el equilibrio por la acumulación de mutaciones. La
noción contraria, que los puntualistas atribuyen a la teoría sintética, consiste en
que el cambio morfológico gradual lleva consigo su división en razas y
subespecies mucho antes de que pueda afirmarse que han surgido especies
nuevas.
Por otro lado, la especiación híbrida o "recombinacional" se refiere al origen
de nuevas especies vía hibridación entre especies paternales divergentes
cromosómica o genéticamente y de acuerdo con los estudios de simulación
realizados por Ungerer et. al., (1998), sugieren que este tipo de especiación es
puntuado, es decir con largos períodos de estasis, en los cuales la mayoría de las
especies no exhibe cambio direccional alguno durante sus estancia, seguido por
abruptas transiciones en las
86
cuales las especies paternales individuales son desplazadas rápidamente por las
neoespecies híbridas (McCarthy, 1995; Ungerer et al., 1998).
Con base en los resultados obtenidos en el presente estudio, se sugiere que el
tipo de especiación presente en Satureja macrostema var. laevigata es
recombinacional de tipo puntuado, y sus relaciones filogeneticas también apoyan
esta sugerencia ya que los períodos de divergencia entre las plantas en estudio es
de relativamente pocos años, que podrían ser insignificantes respecto al tiempo
geológico, lo que sugiere que actualmente esta ocurriendo una especiación rápida
en esta especie.
Con la determinación de la variabilidad genómica de S. macrostema por medio de
un análisis filogenético, utilizando para ello los genes ribosomales y sus
espaciadores, fue posible detectar las regiones variables informativas, los
marcadores moleculares para la identificación y resolución entre diferentes
especimenes de S. macrostema a distintos niveles, la filogenia, sus relaciones de
parentesco y el tipo de especiación.
Con relación a la región de los ITS, ésta ha sido considerada como una fuente
muy útil de caracteres para estudios filogenéticos en angiospermas (Baldwin et al.,
1998), dado que los ITS se encuentran altamente representados en el genoma y
se pueden amplificar con cantidades pequeñas de ADN (White et al., 1990) En
este estudio, cantidades tan pequeñas como 100 a 300 ng/ml resultaron
adecuadas para la amplificación de los ITS.
Las secuencias altamente conservadas dentro de la mayoría de los genes del
nrADN son muy útiles en el diseño de oligonucleótidos (iniciadores) "universales",
lo que facilita la amplificación de los ITS mediante el uso de la reacción en cadena
de la polímerasa (PCR) (Thompson, et al., 1997). Los espaciadores internos
transcritos son la parte más variable de la región de los ITS, debido a que se
encuentran flanqueando a la subunidad 5.8S, que es más conservada y se
posibilita la alineación
87
no ambigua de esta región (Walsh, et al., 1997). El hecho de que se presenten
cientos de copias por célula de los nrDNA, facilita su amplificación con los
iniciadores específicos, por esta razón la amplificación de la región ITS1-5.8s-ITS2
por medio de los iniciadores específicos ITS1 e ITS4 se llevó a cabo sin dificultad,
una vez encontradas las condiciones adecuadas para la reacción en cadena de la
polimerasa.
Hershkovitz y Zimmer (1996) proponen que el espaciador ITS2, contiene la
información suficiente para diagnosticar linajes a diferentes niveles jerárquicos y
argumentan que el análisis de la composición de las bases muestra que el ITS2 de
las angiospermas es rico en GC, lo cual coincide con lo encontrado en las
secuencias de este trabajo; no así la proporción de Timina, la cual mencionan
estos autores como muy variable. La situación anterior está ausente en Satureja
en donde la proporción de timina se comporta de manera constante (cuadro 6).
Los autores antes señalados proponen como modelo general al ITS2 de
angiospermas, sin embargo, lo encontrado en Satureja y los ITSs2 de las plantas
con las que se compararon (cuadro 7) se concluye que no se puede generalizar su
uso, al menos es inadecuado para las especies aquí reportadas.
Por otro lado, con la utilización de algoritmos estándares para la
comparación de las secuencias obtenidas en aquellos segmentos de alta similitud
se logró un correcto alineamiento de las mismas. El alineamiento es una
herramienta cualitativa que permite dar los primeros pasos hacia la conclusión de
que dos o más secuencias son homólogas; permitiendo detectar el polimorfismo
presente (Swofford, 1999). Todo esto con la finalidad de realizar los análisis
relacionados con el ensamblaje, edición, alineamiento global, búsqueda de
secuencias homólogas, relaciones filogenéticas, detección de motivos, (series de
repeticiones de secuencias cortas de nucleótidos), análisis de uso de codones,
comparación de la secuencia problema con las publicadas en las bases de datos,
(Genebank), etc. (Panero, et al., 1999), como se observa en el cuadro 7.
88
Esta técnica, aparentemente sencilla se hace más compleja en la medida
en que el tamaño de las secuencias a comparar es mayor y, más aún, cuando se
comparan más de dos secuencias. Por ello se emplean computadores y distintos
programas que dadas las secuencias, generan el mejor alineamiento, y por lo
tanto resultados más confiables (Panero, et al., 1997).
Los resultados obtenidos de divergencia y disimilitud, sugieren que hay al
menos dos especies estrechamente relacionadas SATPA-SATIB e SATIN-SATSJ,
lo cual se corrobora con los valores del cuadro 15 y figura 4, donde se observa
que las secuencias de SATPA-SATIB e SATIN-SATSJ son en este gene 5.8S, 100
similares, mientras que SATIN-SATIB, SATIN-SATPA y SATSJ-SATPA son
solamente similares en 98.8 % y 1.2 % divergentes, valor suficiente para algunos
autores para considerarlas como especies diferentes, ya que el 5.8S es un gen
altamente conservado y la mas mínima variación representa gran variabilidad
genética (Panero, et al., 1999).
Se destaca el hecho de que al comparar las 4 secuencias de 166 bases del
gen 5.8S se observen solo dos cambios de bases, ya que las secuencias de
SATIB y SATPA, as¡ como SATSJ-SATIN son idénticas, y los dos cambios
detectados entre estos dos pares de secuencias son, que mientras las secuencias
de SATIN y SATSJ presentan una Timina en la posición 71, IB y PA presentan la
base complementaria Adenina; el otro cambio se da en la posición 100 con una
Citosina en las secuencias de SATIB y SATPA mientras que SATIN y SATSJ
presentan la complementaria Guanina.
Si se toma como base este argumento se tienen dos especies diferentes, lo
cual se refleja en variabilidad genética observada que manifiesta Cladogénesis y
cuya principal evidencia de especiación es el cambio en la composición genética
observada en los ITS de S. macrostema, y principalmente en el gen 5.8S que es
una secuencia altamente conservada, donde la primera esta formada por las
plantas de SATPA, al presentar entre ellas exactamente la misma secuencia en el
gen 5.8S; y la
89
segunda formada por las plantas de SATIN y SATSJ que de igual manera
presentan entre ellas la misma secuencia. Hay que hacer notar que al alinear las
cuatro secuencias en el MegAling la secuencia consenso resultante es idéntica a
las secuencias SATIN y SATSJ, por lo que se puede argumentar que esta es la
especie más ancestral y que SATIB y SATPA forman una especie de más reciente
aparición, lo cual se corrobora con lo observado en los árboles filogenéticos (figura
5)
Con los datos obtenidos de la secuencia del gen 5.8S donde se define la
existencia de dos especies, se puede argumentar que de estas dos especies la
más ancestral es la especie SATIN y la más reciente es SATIB. A su vez la más
ancestral (SATIN) da origen a SATSJ y SATPA que origina a SATIB. Tanto SATSJ
como SATIB se pueden considerar como subespecies, pues con base al gen 5.8S,
SATSJ es idéntico a SATIN, y SATIB es igual a SATPA; donde ocurre variación es
en los ITSs, tanto en el ITS1 como el ITS2. Esta variación, al considerarla
globalmente, arroja una disimilitud de 0.5% entre SATIN y SATSJ y de 0.7% entre
SATPA y SATIB, valores entre el 0.5% y 1 % que es rango común considerado
para subespecies en angiospermas (Urbatch, et al., 1997).
(Urbatch, et al., 1997) considera un máximo de 1 % de disimilaridad entre
taxa de la misma especie, valores mayores de hasta 5 % de disimilaridad se
pueden considerar especies diferentes y valores superiores indican géneros
diferentes (Urbatch, et al., 1997). Por otro lado, el rango de subespecies esta entre
los valores entre 0.5 y 1 % de disimilaridad y valores menores a 0.5% de
disimilaridad son variedades o isoformas.
El análisis de tales secuencias está siendo empleado por algunos investigadores
para construir nuevos árboles filogenéticos en una gran diversidad de especies, lo
que está revolucionando la sistemática de los organismos vivos.
90
Se considera que el gen 5.8s es una secuencia altamente conservada, por
lo que ligeras variaciones en su secuencia pueden interpretarse como especies
diferentes (Panero, et al., 1999).
La filogenia obtenida se presenta de la siguiente manera: como se observa
en el árbol filogenético de la figura 4 del gen 5.8s, se infiere que de un ancestro
común, que representa la secuencia concenso, se originaron las dos líneas de
descendencia hace aproximadamente 20,000 años, ya que según Scrotch (1996),
se considera que un cambio de base en el gen 5,8S refleja un aproximado
promedio de divergencia de 10,000 años y en los ITS1 e ITS2 dependiendo del
lugar varia entre 1000 y 5000 años, en angiospermas.
Para determinar la divergencia de cada línea hay que recurrir a la
variabilidad observada en los ITS1 e ITS2. De esta manera la primera línea formó
un ancestro, que dio origen a SATIN. Siendo SATIN la que presenta la secuencia
más similar a ese ancestro común, e hipotéticamente esto ocurrió hace
aproximadamente 30,000 años por lo que aparece más cercano a la raíz del árbol.
SATSJ presenta mayor disimilitud con ese ancestro común por lo que aparece
mas alejada de la raíz y sería un derivado de SATIN, evento que podría haber
ocurrido hace aproximadamente "18,750" años, ya que entre SATIN y SATSJ hay
una distancia de 11,250 años. Estos valores se calculan teniendo el número total
de cambios del ITS1 e ITS2 de la especie de mas reciente aparición (SATIB),
contra la secuencia en dilema SATIN.
Para lograr lo anterior se desarrolló la siguiente fórmula matemática:
D=(n12)(p) Donde: d= distancia genética en años
n= número total de diferencias de nucleótidos entre dos
secuencias
p= promedio en años del rango de sustitución de nucleótidos
Con base en lo anterior, las relaciones que se establecen entre las especies se
observan de manera aproximada en la figura 8, estos valores concuerdan de
91
manera aproximada con los valores obtenidos en la variabiliad del 5.8S (dos bases
= a 20, 000 años). Ya que la aparición de SATSJ probablemente ocurrió hace
aproximadamente 18,750 años y la de SATPA hace aproximadamente 22,500
años.
Así, si el ancestro que dio origen a Satureja spp. surgió hace más de
±30,000 años. Este divergió y dio origen a dos especies: Una linea se dividió hace
±30,000
92
años dando origen por un lado a la especie SATIN, que mantuvo el linaje del
ancestro de Satureja, y por otro lado dio origen a la subespecie, en posible
proceso de especiación, a SATSJ. La otra linea divergió hace 22,500 años, dando
origen a la especie SATPA; actualmente esta especie presenta un notable evento
de especiación que se manifiesta en la aparición hace aproximadamente 15,000
años, de su subespecie SATI B.
La figura 7 muestra la estrecha relación entre SATIN y SATSJ y entre
SATPA y SATIB, gráficamente se observa la naturalidad con que estos taxa
pueden estar hibridizados, lo cual es evidenciado también por la existencia de
algunos ejemplares que no pueden ser clasificados como S. macrostema var.
laevigata, pero que según la clave pertenecen a esta variedad, a pesar de no
poderse
identificar
completamente
como
tal,
dadas
las
características
morfológicas diferentes reportadas por Aguilar (2001). La figura 7 muestra
claramente la diferenciación en dos "especies", SATIN y SATPA, lo que se apoya
con las diferencias encontradas en el gene 5.8s, lo cual no coincide con la clave
morfológica de satureja, ya que esta indica que se trata de una sola variedad
(laevigata). La misma figura 7 muestra que SATSJ y SATIB podrían haber
evolucionado a partir de SATIN y SATPA respectivamente. El análisis de los sitios
polimórficos como se mostró arriba también conduce a esta conclusión.
Por lo tanto, se argumenta que se tienen dos especies con base a las
diferencias del gen 5.8s y son: SATIN y SATPA; la especie SATIN tiene una
subespecie que es SATSJ y SATPA también tiene una subespecie SATIB, Con los
datos observados en el árbol filogenético se resume teóricamente que la especie
SATIN es la más ancestral; en ella esta ocurriendo un evento de especiación que
da origen a la subespecie SATSJ, tanto la especie SATIN como la subespecie
SATSJ se encuentran en la actualidad; SATSJ por el mayor número de cambios
esta divergiendo a mayor velocidad que SATIN, lo que sugiere una especiación
rápida de tipo puntuado (Eldredge y Gould, 1972).
93
De acuerdo con el cladograma de la figura 7, la especie SATPA es la de
mas reciente aparición; en ella también esta ocurriendo un evento de especiación
que da por origen a la subespecie SATIB, en esta subespecie el proceso de
especiación es mas dinámico que el de la subespecie SATSJ, ya que es la que
presenta mayor disimilitud con el ancestro común (secuencia consenso); tanto la
especie SATPA como la subespecie SATIB se encuentran en la actualidad; SATIB
es el taxa que presenta la mayor divergencia con respecto al ancestro común.
Esto sugiere que sí entre las plantas de Satureja se llevan a cabo procesos de
hibridación, estos estarían ocurriendo, seguramente, entre la subespecie SATSJ y
su especie SATIN. Esta hibridación, y por tanto flujo genético entre las plantas en
estudio, explicaría la estabilidad y similitud de secuencias que a pesar del tiempo,
y por tanto eventos de diversificación genética, mantiene a las secuencias
altamente similares y homogéneas (Avise, 1994).
Para el caso de SATPA se encuentra, evolutivamente hablando, en un
punto intermedio, ya que presenta similaridades genéticas con los demás taxa y
presenta un gene 5.8S idéntico al de SATIB (misma especie), pero sus ITSs son
variables y al comparar sus secuencias, SATPA mantiene mas similaridad con el
ancestro común (secuencia consenso) que SATIB, lo que acerca más a SATPA a
dicho ancestro. SATIN y SATSJ son las que más se parecen a tal ancestro.
Por otro lado, las plantas en estudio presentan divergencia molecular en
sus secuencias ITS de su ADN, para considerarlas como especies (figura 7);
SATIN con respecto a SATIB presenta 24 cambios; SATSJ-SATIB presenta 26
cambios; SATINSATPA=18; SATSJ-SATPA=20; y los de más íntima relación;
SATIN-SATSJ =9 cambios y SATPA-SATIB solamente 6 cambios; y es en estas
dos últimas relaciones donde surge el dilema ¿cuántas diferencias de nucleótidos
se requieren para confirmar la distinción entre especies?; de acuerdo con
Dubouzet y Shinoda (1999), menos de 7 cambios son suficientes para caracterizar
a las subespecies y es el caso de las relaciones más íntimamente relacionadas
SATIN-SATSJ y SATPA-SATIB; ya que se infiere que SATSJ y SATIB son
subespecies de SATIN y SATPA, sin
94
embargo la evidencia molecular apoya la hipótesis de que se les puede calificar
como especies independientes, derivadas de SATIN y SATPA y no como
subespecies. Leclerc (1997), encontró que en Fucus (Phaeophyceae) dos
especies se diferenciaron por solamente cinco nucleótidos.
En otros resultados, al efectuar, la alineación de la secuencia del gen 5.8S
de S. macrostema la cual se realizó por comparación de 32 secuencias similares
de Lamiaceae reportadas en el GenBank usando el programa BLAST del
GenBank. Los resultados obtenidos la distancia genética (que es una medida del
número medio de sustituciones de codones por locus génico, electroforéticamente
detectables, que se han acumulado desde que dos poblaciones se han hecho
divergentes a partir de un antepasado común (Dobzhsansky, 1980), observada en
este estudio, los porcientos de similaridad y divergencia que se dan entre las
diferentes secuencias, obtenidas sobre la base del total de cambios (deleciones,
mutaciones, inserciones, etc) variaron (cuadro 22). Los valores observados son de
93.6 % para SATIN-SATSJ y 97.5% de similaridad para SATPA-SATIB que son
las plantas mas similares o menos divergentes; mientras que las más divergentes
SATSJ-SATIB muestran (82.9%); SATIN-SATIB (84.4%); SATSJ-SATPA (85.4%);
e SATIN-SATPA (86.8%).
Al observar los datos del cuadro 22 se puede detectar cómo se refleja en el
árbol, las dos especies y su respectiva subespecie de Satureja bien definidas,
incluso en este árbol, el ancestro que dio origen a cada subespecie es
prácticamente la misma especie, esto es, que SATIN dio origen a SATSJ y SATPA
a SATIB.
Al analizar el cuadro de los valores de divergencia, se observa que son de
0.5 entre SATIN y SATSJ y de 0.7 entre SATPA e SATIB, rangos, que a pesar de
integrar otros géneros y varias las secuencias consenso, se mantiene, aun dentro
de los valores considerados para una misma especie, sin embargo al comparar
SATIN y SATPA (que son las especies) su valor de divergencia es de 1.2 valor
suficiente para considerarlas como especies diferentes. Este último valor se
encuentra en el rango de 1 a 5 considerado para especies de un mismo género
(Avise, 1994). De hecho es
95
menor al observado entre las dos especies de Oxera donde el valor de divergencia
es de 2.2.
A pesar de que SATIN y SATSJ surgieron primero evolutivamente
hablando, primero hace ±30,000 años que SATPA y SATIB (figura 7), mantienen
desde su surgimiento solo un 0.5% de disimilitud; caso contrario, el valor de
disimilitud mayor observado entre SATPA y SATIB (cuadro 22) es de 0.7% y el
que SATIB sea el taxa de mas reciente aparición (15,000 años) indica que está en
un proceso dinámico de especiacíón, ajeno a los demás taxa de Satureja
estudiados. Esto se corrobora en la alta cantidad de sitios polimórficos en los ITSs
de este taxón con respecto a los demás.
En las secuencias obtenidas se lograron detectar diversos puntos. El
primero destaca que la cantidad promedio de G y C observada entre todas y cada
una de las secuencias fue del 67%, lo que corresponde con lo reportado por
Maxam y Col. (1977) que han encontrado que la relación de adenina a timina, y la
relación de guanina a citosina, están siempre muy cerca de la unidad para el
ácido- ácido y de esta relación el total de G/C es cercano al 60-70 % y de A/T del
30-40%. Lo que significa que la relación G/C esta dentro de los parámetros
esperados, lo que corrobora que la amplificación de las secuencias fue correcta y
que no fue debida a polimerizaciones de los "primers" que suelen ser comunes y
que cuando se presentan reflejan un valor menor al 60% de G/C.
El segundo punto destacable es que observándose las denominadas
"palabras" o "motivos" (series de repeticiones de secuencias cortas de
nucleótidos), se observa que varias de estas repeticiones son muy características
y muy específicas para elaborar "primers" de identificación al separar claramente
al género Satureja de los otros géneros, así como a los taxa en estudio, es decir,
se podrá lograr la identificación rápida de los taxa con tan solo utilizar su marcador
especifico o huella genética.
96
Por otro lado, el polimorfismo observado se manifiesta de manera
específica; en el ITS1 de SATIN-SATIB (cuadro 7), donde se tuvieron 15 sitios
polimórficos coincidentes y en el ITS2 hubo 9; en la comparación SATSJ-SATPA,
se tuvieron 14 sitios polimórficos coincidentes en el ITS1 y 6 en el ITS2; el mayor
número de deleciones, mutaciones, inserciones (cambios)_ (cuadro 6) se encontró
al comparar las plantas SJ-IB, con 7 deleciones en SJ y 26 cambios en SATIB;
SATIN-SATIB (724); SATSJ-SATPA (6-20); SATIN-SATPA (7-18); SATIN-SATSJ
(5-9) y SATPASATIB (0-6), coincidiendo la mayor variabilidad entre las más
ancestrales contra las más recientes y observándose los menores cambios entre
las más estrechamente relacionadas.
Para confirmar de manera más específica la variabilidad existente entre los
taxa en estudio, se, recurrió al programa RNA draw 1.1 (http://isis.cbg.ipn.mx/down
tools/Rnadraw.html) para realizar el ejercicio de visualizar la predicción del posible
RNAm que se formaría si las secuencias codificaran, tal como se observa en la
figura 9. En dicha figura se observan las diferencias entre las secuencias de los
ITSs y se plantea la posible estructura terciaria; aunque los ITSs no son
secuencias que transcriben, por lo que la predicción de su estructura terciaria
(RNAm), es hipotética y únicamente se usa con fines didácticos para visualizar de
manera más sencilla, las diferencias encontradas entre las secuencias en estudio.
El RNA draw tiene la capacidad de representar cualquier secuencia en forma de
RNAm, prediciendo la estructura más estable posible desde un punto de vista
molecular y de máxima estabilidad.
En la figura 9 se observa que la estructura terciaria del SATIN es muy
similar a la de SATSJ, lo que corresponde a la secuencia nucleotídica observada y
de donde se sugiere que SATSJ desciende de SATIN. Un caso similar es el de
SATPA y SATIB donde también la secuencia nucleotídica evidencia que SATIB
proviene de SATPA y esto se refuerza al observar la figura 9, donde SATPA y
SATIB presentan una estructura casi idéntica. Si se considera al tiempo evolutivo
deducido con base en las secuencias nucleotídicas es de esperar mayor similitud
en estructura terciaria
97
98
entre SATPA y SATIB que entre SATIN y SATSJ, ya que los primeros son de más
reciente aparición y su posible estructura tendría, en teoría menos tiempo para
adquirir características estructurales diferentes.
Para el caso de las estructuras correspondientes a los ITS2 se observa el
mismo patrón de similitud entre SATIN y SATSJ y entre SATPA y SATIB, sin
embargo a diferencia de los ITS1, donde se observa una notable diferencia
estructural entre las figuras de sus ITS, en las figuras de los ITS2 se observa una
estructura más consistente y menos variable entre si.
Es necesario señalar que las mutaciones observadas corresponden a
mutaciones génicas o puntuales, las cuales se producen espontáneamente, es
decir, son debidas a causas naturales, No obstante, la frecuencia de incidencia de
las mutaciones puntuales puede aumentar por exposición a radiaciones de alta
frecuencia y por tratamiento con una variedad de sustancias químicas
denominadas mutágenos (Cupples, 2001). Una mutación puntual se produce
cuando un nucleótido es alterado y la nueva secuencia de nucleótidos pasa a la
progenie (Johnston, 1999). El cambio puede ser debido a la sustitución de uno o
más nucleótidos por otros o a la adición o deleción de uno o más nucleótidos y las
sustituciones que tienen lugar en la secuencia de nucleótidos del ADN de un gen
estructural pueden dar como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos
del polipéptido codificado por el gen, si bien éste no es siempre el caso debido al
carácter degenerado del código genético. Por ejemplo si se considera el triplete
del ADN TCG (que corresponde a AGC en el RNA mensajero) que codifica el
aminoácido serina. Si el tercer nucleótido cambia y pasa a ser A (U en el RNAm),
el tripléte seguirá codificando la serina; pero si cambia y pasa a ser C, el codón
resultante (TCC en el ADN, AGG en el RNAm) codificará, en cambio, la arginina
((Cupples, 2001).
De acuerdo con Ennis (2000) y Cupples (2001), las sustituciones de punto más
simples son las llamadas transiciones y transversiones. Las primeras son
sustituciones de una pirimidina por otra pirimidina (T o C) o una purina por otra
purina
99
(A o G) y las transversiones que también son relativamente sencillas y que
consisten en el reemplazo de una purina (A o G) por una pirimidina (T o C), como
las encontradas en S. macrostema (cuadro 14)
Sin embargo, Knight (2002), menciona que actualmente y aunque todavía son los
días tempranos de la nueva biología, las comparaciones de sucesiones de las
especies diferentes sugieren que los eventos como los estallidos de actividad de
"genes saltadores", duplicaciones genéticas y fusiones del cromosoma juegan un
papel importante en la evolución y Los elementos móviles conocidos como
transposons están entre las fuerzas más poderosas que forman la evolución del
cromosoma. Éstos "genes saltadores' llevan las instrucciones para su propia
excision, duplicación e inserción en el genoma. Parece que, en ciertos períodos en
la historia evolutiva, la actividad del transposon hizo extenderse como los
acordeones a los cromosomas. Como resultado, la mayoría de los cromosomas
está ahora lleno con los remanentes silenciosos de transposons. Transposons no
son el único tipo de ADN que puede reproducirse. Si hay una cosa buena es que
el ADN está copiándose. Y como resultado, las duplicaciones que van de los
centenares de bases al complemento entero de la célula de cromosomas han
figurado pesadamente en la evolución de los genomas modernos. Las
duplicaciones más simples producen sucesiones repetidas adyacentes que son
todos orientadas de la misma manera. Las longitudes de éstos 'tándem repetidos'
puede variar grandemente, y a menudo se reproducen los genes enteros. La copia
extra puede aumentar las mutaciones entonces; a menudo éstos lo darán inútil,
pero una nueva y útil función también puede surgir. Y por último se ha encontrado
que los Pericentromeros y subtelomeros pueden ser las incubadoras para los
nuevos genes y las duplicaciones pueden ayudar generar la variación genética.
Por otro lado en el informe científico sobre el desciframiento del genoma humano,
(Nature,
2001)
está
plagado
de
términos
como
"misterioso",
"función
desconocida", "enigma no resuelto"... A sus autores les resultan sorprendentes las
"más de doscientas secuencias de origen bacteriano" que han encontrado, así
como las
100
evidencias de transferencia horizontal de genes "relativamente frecuentes ", es
decir, genes "transmitidos por vectores como virus". También han resultado
sorprendentes las enormes cantidades de elementos móviles (transposones y
retrotransposones), secuencias genéticas que pueden "saltar" de una parte a otra
del genoma, bien mediante inserción directa en otra zona, o bien mediante una
duplicación previa de su secuencia. Este último fenómeno es el responsable de
una enorme cantidad de secuencias repetidas (que constituyen el 45% del
genoma) y que antes se consideraban "ADN basura", pero que según la opinión
de los autores del informe: "Como agentes activos, las repeticiones han
remodelado el genoma causando reordenamientos, creando genes enteramente
nuevos, modificando y barajando genes existentes y modulando el contenido total
de Guanina-Citosina ".
En diciembre del año 2000, Nature publicó "el primer genoma completo de
una planta que se libera a la comunidad científica": Arabidopsis thaliana. Una
herbácea elegida por su genoma pequeño (5cromosomas), pero con un número
de genes próximo a los 25.000, de los que casi el 80% están duplicados. Además
de la existencia de una gran cantidad de "elementos móviles", se ha podido
constatar que cerca del 60% de los genes de Arabidopsis los comparte con otras
plantas, animales y hombre (entre estos el "famoso" gen BRCA2, considerado
"uno" de los responsables del cáncer de mama). Y es sólo el primer genoma
vegetal "liberado" por las empresas privadas a la comunidad científica.
Con base en todo lo anterior, se puede hipotetizar que se esta llevando a
cabo una especiación "recombinacional" o híbrida, la cual se refiere al origen de
nuevas especies homoploides vía hibridación entre especies paternales o
maternales divergentes cromosómica o genéticamente (Ungerer, 1998), Este
modo es puntuado (largos periodos de éstasis es decir, donde la mayoría de las
especies no presenta cambio direccional alguno durante su estancia y es seguido
por abruptas transiciones en las cuales las especies paternales o maternales
individuales son desplazadas rápidamente por las nuevas especies híbridas
(McCarthy, 1995). La especiación recombinacional representa solamente uno de
los varios o sospechosos caminos
101
conocidos para una especiación rápida (Avise, 1994). Además, de acuerdo con
Setoguchi y Wuatanabe (2000), la hibridación y la introgresión entre varias
especies, frecuentemente ocurre en las regiones de simpatría (formación de
nuevas especies por rangos de distribución, aislamiento en el mismo sitio y por
variación de nichos) o en los límites de las zonas donde la distribución de las
especies entran en contacto una con otra. Y Fritsche y Kaltz (2000), mencionan
que muchas de las especies íntimamente relacionadas particularmente en las
plantas, la separación reproductiva no es completa y la hibridación ocurre donde
sus rangos geográficos se traslapan, tal y como ocurre en centro de Michoacán
con S. macrostema.
Condiciones medioambientales en el desarrollo de la filogenia de los
especimenes de S. macrostema
Al observar la filogenia de las cuatro plantas en estudio, destaca el hecho
que los cuatro presentan una historia evolutiva que puede alinearse con los
eventos geológicos registrados para la región de colecta de los ejemplares de S.
macrostema. Pero para realizar tal alineación es necesario describir los eventos
allí ocurridos, que se describen a continuación:
Michoacán desde el punto de vista biótico, es uno de los estados más diversos del
país; resultado de su gran diversidad orográfica y heterogeneidad climática. El
estado tiene además una gran variedad de tipos de vegetación con sus propias
floras, que van desde la tropical selvática, pasando por las zonas áridas, para
subir a los pastizales y luego a la montaña con sus pinares y bosques espesos de
abetos. (Moreno, 1998)
Gran parte de esta riqueza biótica es debida a la especial configuración que
presenta el Eje Neovolcánico Transversal o Faja Volcánica Transversal. Se sabe
que la Faja Volcánica Transversal es una región del centro de México con una
historia geológica reciente. Se trata de una zona altamente volcánica en la que
predominan una serie de cuencas endorreicas que dieron lugar a la formación de
grandes extensiones lacustres y en donde la vegetación predominante la
constituyen los
102
bosques de pino y encino. Además, en esta región, importantes culturas
prehispánicas se desarrollaron (Albert y col., 1987) .
A partir del análisis de los registros palinológicos que se han realizado
diversos estudios en diferentes puntos de la Faja Volcánica Transversal, se
establecen en este trabajo las tendencias climáticas del fin del Pleistoceno y
Holoceno.
Según Boer (1994) hace unos 70 000 años antes del presente (AP) se inició
la glaciación de Wisconsin, el último gran avance glacial del Cuaternario, el cual
llegó a su máximo desarrollo aproximadamente hace 20 000 años AP. Durante
este largo período, las masas de hielo fluctuaban, avanzando y retrocediendo al
tiempo que oscilaba el clima y el nivel del mar. Este último, al acumularse grandes
casquetes de hielo que cubrían parte de la tierra, bajaba notablemente, pero en
cambio subía cuando, durante épocas más templadas (interglaciares), se derretían
los glaciares; estas oscilaciones modificaban las líneas costaneras y hacían salir o
sumergirse islas o puentes terrestres. La variación del nivel medio del mar, aunado
a los cambios de temperatura, provoca en todos los continentes una alteración en
los ecosistemas existentes.
Mientras más avanzaban los hielos los biomas de tundra y confieras
prevalecían hacia las latitudes meridionales; por el contrario al retroceder las
masas de hielo, provocaban un abatimiento de los bosques de coníferas y un
consecuente incremento en las áreas con praderas y estepas para las mismas
latitudes (Boer, 1994).
Para
el
centro
de
Michoacán
se
han
identificado
evidencias
geomorfológicas y estatigráficas de dos glaciaciones ocurridas después del
pleistoceno tardío; se registran por lo menos en dos ocasiones tales eventos, una
vez entre 40,000 ó 50,000 años AP y otra vez entre 28,000 ó 10,000 años AP, en
ambos casos, el nivel de la temperatura descendió de tal modo, que la zona
central de México cambió, progresivamente en ese lapso de tiempo, de ser una
región principalmente esteparia
103
(con grandes ungulados que pastaban en las planicies) a una región con
predominancia de bosques de coníferas (incluso en valles y mesetas donde los
grandes ungulados no pudieron sobrevivir) (Chácon, 1991). Para los fines de este
trabajo se resaltan las características del segundo período con inicio hace 28,000
años y una duración de casi 20,000 años.
En la región de la ciénega de Zacapu se han encontrado morrenas
originadas hace más de 11,900 años (probablemente hacia 12,500 años AP) y
provenientes del cerro del Tecolote. Tal glaciación dejó huellas en algunas laderas
arriba de 2,6003,200 msnm, y estuvo muy influida por condiciones de relieves
locales. La morfología de los depósitos sugiere una edad holocénica, y en ciertos
casos ésta podría ser de apenas unos miles de años (Chácon, 1991).
Se señalan climas secos, de fríos a templados de 19,000 hasta 13,000
años AP con la existencia de bosques abiertos de pino y encino. Del final del
Pleistoceno hasta 8,000 años AP, hay evidencias de aumento de humedad, con el
probable establecimiento de climas húmedos, de semifríos a templados. De 8,000
a 6,000 años AP. La tendencia climática es hacia climas templados subhúmedos.
Entre 6,000 a 4,000 años AP. los registros indican la existencia de eventos
volcánicos y una probable reducción en la precipitación. Finalmente, los últimos
4,000 años, además de registrarse el impacto humano, se percibe una tendencia
hacia climas templados húmedos/subhúmedos ( White y Heine 1992)
La comparación de la secuencia glacial del Tecolote con las elaboradas por
White y Heine para diversas montañas del centro de México (en particular el
Iztaccíhuatl) permite proponer algunas correlaciones que evidencian, que hace
más de 12,000 años AP ocurrió un evento climático (la glaciación) de
considerables proporciones que, repercutió, seguramente en los organismos
presentes.
Hoy día se sabe que los cambios climáticos bruscos son un fenómeno
natural que se ha producido en toda la historia geológica. Esto provocó las
migraciones de
104
flora y fauna, incluyendo a los homínidos, en el periodo Cuaternario, hacia
regiones más favorables, y también la extinción de especies o su adaptación a un
ambiente distinto.
Las condiciones actuales del planeta tienen sus antecedentes en un cambio
brusco del clima ocurrido hace 28,000 años, cuando empezó a volverse más
cálido, especialmente en el hemisferio norte. W. Tanner (1983) calcula que los
glaciares retrocedieron durante 10 000 y 15 000 años, con una velocidad promedio
de 10 cm/año. Diversos estudios han demostrado una estabilidad climática en los
últimos 5,000 años, aunque, como es natural, con breves periodos más fríos o
cálidos y de ascensos y descensos del nivel del mar.
Se ha calculado que los glaciares iniciaron su retroceso, con alternancia de
avances, hace unos 18,000 años AP. Pero el máximo retroceso se alcanzó hace
10,000 años AP, al inicio del Holoceno. Como resultado del retroceso de los hielos
las tierras habitables se ampliaron y fueron ocupadas gradualmente por vida
vegetal y animal. En los últimos 10,000 años AP. ha habido una aparente
estabilidad del clima. La hipótesis sobre el desplazamiento que parece más lógica
indica que inicialmente el movimiento debió haber sido más lento, de 3 km/100
años. El gran retroceso de los hielos debe haber durado unos 2,000 años, lapso
en que el espesor se redujo hasta en un kilómetro. El retroceso de los hielos se ha
mantenido estable desde hace 8,000 AP. De manera que las condiciones
medioambientales reinantes desde esa época a la actualidad son relativamente
similares (Milnichuk y Arabagi, 1979)
Hace seis-siete mil años se produjo un óptimo climático, esto es, de alta
temperatura. Posteriormente se han dado alternancias de ascenso y descenso,
pero con una tendencia general al descenso de la temperatura (Palmere, 1984)
Si se relaciona el óptimo de temperatura alcanzado hace 7,000 años AP con los
resultados obtenidos en este trabajo con los ITSs de los especimenes de SATIB y
SATPA, se observa que coincide el tiempo filogenético para la divergencia de
estos ejemplares con el tiempo geológico de óptima temperatura. Desde el punto
de vista
105
evolutivo las condiciones medioambientales de hace 7,000 años AP provocaron,
probablemente, la especiación de S. macrostema, de la que en este trabajo se
detectaron dos casos IB y PA.
Los 10,000 años del Holoceno son insignificantes en la escala geológica,
con respecto del periodo Cuaternario definido precisamente por las glaciaciones.
La opinión más común de los especialistas es que la última glaciación no ha
terminado y nos encontramos muy posiblemente en un lapso interglaciar,
consistente en un calentamiento general iniciado hace 18 000 años y que no
podría durar muchos miles de años más, con la gran posibilidad de un nuevo
avance de los hielos, especialmente sobre Europa y Norteamérica, volviendo a las
condiciones del pasado no muy remoto. (Palmere, 1984)
En el periodo Cuaternario se produjeron cuatro grandes glaciaciones que
duraron cada una algunas decenas de miles de años. Hubo etapas de retroceso
de los hielos que no significaron el fin de la glaciación en sí; duraron algunos miles
de años para después volver a condiciones semejantes a las actuales. Es
probable, y esto lo sostienen la mayoría de los especialistas, que vivimos una
breve etapa interglaciar y hay quienes afirman que la tendencia es ya al
enfriamiento. Este es un proceso natural que de ser real, se produciría el avance
de los hielos sobre las tierras habitadas del norte en decenas de años, cientos o
miles. Este dinamismo geológico pudo sustentar el dinamismo filogenético
encontrado en la actualidad en diversas especies, como lo es el caso de los
especimenes de S. macrostema tratados en este estudio, que denotan una
marcada especiación al presentar cuatro taxa, que a pesar de divergir
recientemente, son genéticamente diferentes al presentar un alto
polimorfismo.
Con lo anterior y conociendo los resultados de la filogenia de las Satureja
se pueden hipotetizar algunos eventos:
A) Es posible que el inicio de la última glaciación (hace 28,000 años AP)
fuera el detonante de la radiación especiativa observada en las Satureja y cuya
evidencia se observa en al árbol filogenético obtenido con las secuencias de ITS,
donde se
106
observa que un ancestro común ubicado cerca de esta fecha dio origen a cuatro
taxa diferentes encontrados en el presente.
B) El hecho de que las clades del filograma se separen hace 30.000 años
AP en dos especies distintas (SATIN y SATPA) y posteriormente cada clade de
especie en dos taxa inferiores hace 18,750 (SATIN y SATSJ) y hace 22,500
(SATPA-SATIB) años evidencian que el cambio climático acontecido provocó el
proceso de especiación que a la fecha no terminado.
C) Es coincidente el hecho que de las tres filogénesis observadas (30,000
años AP (SATIN), SATPA, 22,500, SATSJ, 18,750 y hace 15,000 (PA-IN) en dos
de ellas se den con el inicio y término de la etapas interglaciares (hace 28,000 y
18,000 años AP). Esto daría pauta a pensar que tales eventos potencian, al haber
cambio en el medio ambiente y actuar como selector natural, la diversidad
genética.
D) Es de destacar que la variabilidad encontrada en cuatro taxa de tan
cercana distribución y de un hábitat relativamente estable en los últimos 8,000
años, indica el gran polimorfismo que se puede encontrar en estas plantas.
Por último, la influencia del hombre a través de todas sus acciones (prácticas
agrícolas, alimentación, selección de materiales, contaminación, etc.), han
impactado en mayor o menor grado en la evolución de las especies, las cuales se
han extinguido a través de la historia a un ritmo constante o por catástrofes
naturales, sin embargo actualmente, la velocidad a la que las especies se
extinguen es superior al ritmo al que aumenta la evolución, y Myers y Knoll (2001)
argumentan que las extinciones de especies alterarían no solamente la diversidad
biológica sino también los procesos evolucionarios, los cuales generan diversidad,
y se cuestionan en cuanto a ¿Cómo funcionarían los ecosistemas en un mundo
disminuido de su biodiversidad?,¿la función de los ecosistemas necesariamente
decaerá cuando la diversidad decline y si esto es así, como , cuanto y de que
manera?, ¿Puede la biodiversidad y los humanos del mismo modo prosperar en
un mundo donde la mayoría de la biodiversidad biológica será confinada en
parques y reservas relativamente pequeños?, ¿si la biodiversidad es en realidad
critica para la función
107
de un ecosistema hemos conocido suficiente acerca de los principios de la
evolución para intervenir en los procesos de su recuperación?, ¿Conocemos lo
suficiente para mitigar la perdida de la biodiversidad biológica?. A ese respecto
Hedrick (2001) se pregunta ¿Cómo puede la nueva información genética ser
usada en la conservación?
Todos los indicadores medioambientales sugieren que el medio ambiente
será más variable que el presente (el incremento de la temperatura, el aumento
del CO2, etc.), y por lo tanto la relación genotipo-fenotipo, será más complicada ya
que esa interacción ya no será más (G x E) sino que será mucho más complicado
y podría ser G x E1 E22 E3…. En dependiendo de los cambios ambientales que las
plantas experimenten a través de si ciclo de vida (Bazzaz, 2001).
108
VII. CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en el presente estudio sugieren que S
macrostema var. laevigata, se encuentra actualmente en período de especiación
rápida la cual es de tipo puntuado, con ello se fortalece la teoría de la especiación
recombinacional y se aporta más evidencia empírica para apoyar este modo de
especiación.
El análisis de las secuencias de la región de los ITS de S. macrostema var.
laevigata ha permitido vislumbrar que las plantas en estudio pueden ser
consideradas como especies; de aquí que el uso de S. macrostema var. laevigata
para referirse a esta variedad podría ser descontinuado. Los resultados de este
estudio, indican que existe suficiente divergencia molecular entre SATIN y SATPA
para apoyar su establecimiento como especies separadas, al igual que SATSJ y
SATIB, las cuales pueden ser también consideradas como especies. Los
resultados indican la validez del análisis de secuencias cíclicas para proveer
huellas moleculares de especies de S. macrostema. Por lo tanto, la técnica puede
ser usada para determinar la relaciones entre organismos y las secuencias ITS
pueden además utilizarse para verificar las. relaciones filogenéticas obtenidas de
los análisis morfológicos tradicionales, y por ultimo los marcadores moleculares
determinados específicamente por cada taxa podrán ser utilizados para su
identificación molecular.
La gran utilidad de las técnicas moleculares es que permiten observar
diferencias directamente en el ADN, es decir en la molécula química que contiene
toda la información genética del organismo, este es el máximo nivel de resolución
posible y así pueden encontrarse las diferencias en especies, subespecies o
variedades, que serían idénticas con base en la observación de las caracteres
fenotípicos.
Con todo lo anterior y con los resultados obtenidos en el presente trabajo se
considera que existe evidencia para argumentar que los especimenes hasta ahora
colectados en Michoacán son de dos especies diferentes y no dos variedades
como
109
se argumenta (McVaugh y Schmid, 1967). Ambas especies presentan un proceso
de especiación reciente y el que diferentes autores mencionen la posibilidad de
hibridación se perfilaría más hacia que, dado que es un proceso reciente de
especiación,
ambas
especies
y
sus
respectivas
subespecies
presentan
características comunes, ya que presentan un ancestro común de reciente
aparición.
El hecho que las localidades muestreadas representen 4 poblaciones
diferentes y el que el proceso de especiación sea dinámico, indica que
probablemente existen más individuos diferentes, por lo menos a nivel de
subespecie y variedad, presentando a Michoacán como un centro de
diversificación para estas especies. Por lo que posteriores colectas y estudios
similares son necesarios para completar el proceso de especiación y divergencia
de estos taxa.
Existe evidencia de la probable presencia de otras especies y subespecies,
en el presente caso se realizaron estudios de marcadores moleculares con ITSs,
los cuales podrían complementarse con estudios de hibridación manual que
permitieran confirmar los resultados obtenidos.
110
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UNIVERSIDAD DE COLIMA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIÓN Y
DESARROLLO AGROPECUARIO
Oficio No. 078/02
ING. RODOLFO MORENTIN DELGADO
DIRECTOR DE LA F.C.B.A.
PRESENTE.
En atención a que el M. C. JOSE MARIO AGUILAR RAMIREZ, alumno eosado del Doctorado cn Ciencias, área de ciencias agrícolas y forestales, ha
rcaüzado todas las correcciones al manuscrito de tesis que presentó para su
revisión, me dirijo respetuosamente a usted para informarle que el documento
titulado " Especiaeión recombinacional y relaciones iiloger éticas en SaturEja
mRCr~>,Stezna var, laevigara.", reúne todas las características necesarias para
obtener el grado de Doctor en Ciencias.
Sin otro particular aprovecho la oportunidad para enviarle Un cordial saludo.
C.C.P. DR. ROBERTO GOMEZ AGUILAR, SECRETARIO TÉCNICO DEL PICAF,
UNIVERSIDAD AUT´NOMA DE NAYARIT
C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE.
C.C.P. ARCHIVO.
APR/Angélica*
UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN
NICOLÁS DE HIDALGO
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES QUÍMICO
BIOLÓGICAS
Lab. de Biotecnologia Vegetal
sal8arcle8a~hotwil oom
EdHicfo B-3, Clndad Univenitarfa
58030, M~ Mico. MEXICO.
Tel-Fax.- (443) 3 265788
DR ALFONSO PESCADOR
COORDINADOR DEL POSGRADO (PICAF)
UNIVERSIDAD DE COLIMA
PRESENTE.
Por este conducto me dirijo a Ud. de la manera más atenta, con el fin de informarle
que he revisado el trabajo escrito de tesis del estudiante José Mario Aguilar
Ramírez
titulado
"ESPECIACIÓN
RECOMBINACIONAL
Y
RELACIONES
FILOGENÉTICAS EN Satureja macrostema var. laevigata", con correcciones
menores, el cual para mi opinión está listo para ser defendido ante el examen
doctoral.
Sin otro particular, agradezco su atención y reciba un cordial saludo.
ATENTAMENTE
UNIVERSIDAD DE COLIMA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIÓN Y
DESARROLLO AGROPECUARIO
ING. RODOLFO MORENTIN DELGADO
DIRECTOR DE LA F. C. B. A.
PRESENTE.
De la manera más atenta me dirijo a usted, para informarle que el M. C. JOSE
MARIO AGUILAR RAMIREZ, alumno egresado del Doctorado en Ciencias, ,tres
de Ciencias Agrícolas y Forestales, realizó las correcciones al manuscrito de tesis
que presentó para su revisión, titulado "Especiación recombinacional y relaciones
tilogenéticas en Sature la rnacrostema var, laevigata, documento que reúne los
requisitos para obtener el grado de Doctor en Ciencias.
Sin otro particular, le envio un cordial saludo.
C.C.P. DR. ROBERTO GOMEZ AGUILAR, SECRETARIO TÉCNICO DEL PICAF,
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NAYARIT
C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE.
ARCHIVO.
UNIVERSIDAD DE COLIMA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIÓN Y
DESARROLLO AGROPECUARIO
ING. RODOLFO MORENTIN DELGADO
DIRECTOR DE LA F. C. B. A.
PRESENTE
En atención a que el M. C. JOSE MARTO AGUILAR RAMIREZ, alumno egresado
del Doctorado en Ciencias, área de ciencias agrícolas y forestales, ha realizado
todas las coi-recciones al manuscrito de tesis que presentó para su revisión, me
dirijo respetuosamente a usted para informarle que el documento titulado
"Especiación recombinacional y relacio :es filogenéticas en Satureja macrostema
var, laevigata,", reúne todas las caractcristicas necesarias para obtener cl grado
de Doctor en Ciencias.
Sin otro particular aprovecho la oportunidad para enviarle aun cordial saludo.
C.C.P. DR. ROBERTO GOMEZ AGUILAR, SECRETARIO TÉCNICO DEL PICAF,
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NAYARIT.
C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE
C.C.P. ARCHIVO.
APR/Angélica*
UNIVERSIDAD DE COLIMA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIÓN Y
DESARROLLO AGROPECUARIO
ING. RODOLFO MORENTIN DELGADO
DIRECTOR DE LA F. C. B. A.
PRESENTE.
De la manera más atenta me dirijo a usted, para informarle que el M. C.
JOSE MARIO AGUILAR RAMIREZ, alumno egresado del Doctorado en Ciencias.
área de Ciencias Agrícolas y Forestales, realizó las correcciones al manuscrito de
tesis que presentó para su revisión, titulado " Especiación recombinacional y
relaciones filogenéticas en Satureja »na.:rustemir var. luevigata,°' documento que
reúne los requisitos para obtener el grado de Doctor en Ciencias.
Sin otro particular, le envío un cordial saludo.
C.C.P. DR. ROBERTO GOMEZ AGUILAR, SECRETARIO TÉCNICO DEL PICAF.
UNIVERSIDADAUTONOMA DE NAYARIT
C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE.
C.C.P. ARCHIVO.