Molecular Gram negativos - Secretaría Distrital de Salud

BETALACTAMASAS COMO
MECANISMO DE RESISTENCIA EN
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Y SU
DETECCIÓN POR PCR CONVENCIONAL
SANDRA YAMILE SAAVEDRA ROJAS
Bacterióloga UCMC MSc Microbiología UN
Laboratorio de Microbiología facultad de Medicina
Universidad Nacional de Colombia
SECRETARIA DISTRITAL DE SALUD
BETALACTÁMICO
Suárez C.(2009). Enferm InfeccMicrobiolClin. 27(2):116–129
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ETAPAS DE FORMACIÓN DE LA PARED
CELULAR
Suárez C.(2009). Enferm InfeccMicrobiolClin. 27(2):116–129
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MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS
BETALACTÁMICOS
Suárez C.(2009). Enferm InfeccMicrobiolClin. 27(2):116–129
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MECANISMOS DE RESISTENCIA A
BETALACTÁMICOS
Betalactamasas
Alteración de permeabilidad de la
membrana externa (perdida o reducción de
porinas).
Aumento de bombas de extrusión
Modificación de dianas de acción
(Mutación en las proteínas de unión a la
penicilina).
Suárez C.(2009). Enferm InfeccMicrobiolClin. 27(2):116–129
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BETALACTAMASAS
1. Definición: Enzimas catalíticas que actúan
hidrolizando el enlace amídico del anillo
betalactámico.
2. Existen dos esquemas de clasificación para las
betalactamasas:
Clasificación molecular según Ambler
Clasificación Funcional según Bush-JacobyMedeiros
Bush, K. (2010). AAC. 54 (3): 969 - 976
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ESQUEMAS DE CLASIFICACIÓN DE LAS
BETALACTAMASAS
AMBLER
A
GRUPO BUSHJACOBY (2009)
2a
2b
2be
2br
2ber
2c
2ce
2e
B
C
D
2f
3a
3b
1
2d
2de
2df
INHIBIDO POR
Ac. Clav. EDTA
Penicilinas
Si
No
Penicilinas y cefalosporinas de primera generación
Si
No
Cefalosporinas de espectro extendido y monobactámicos
Si
No
Penicilinas
No
No
Cefalosporinas de espectro extendido y monobactámicos
No
No
Carbenicilinas
Si
No
Carbenicilina y cefepime
Si
No
Cefalosporinas de espectro extendido (no actúa e sobre
Si
No
monobactámicos)
Carbapenemes
Variable No
Carbapenemes
No
Si
Carbapenemes
No
Si
Cefalosporinas y cefamicinas
No
No
Cloxacilina
Variable No
Cefalosporinas de espectro extendido
Variable No
Carbapenemes
Variable No
SUSTRTO
REPRESENTANTE
PC-1
TEM-1, TEM-2, SHV-1
TEM-3, SHV-2, CTX-M-15, PERTEM-30, SHV-10
TEM-50
PSE-1, CARB-3
RTG-4
CepA
KPC, IMI, SME
IMP, VIM, GIM, SPM, SIM
CAU, GOB, FEZ
AmpC, CMY-2, FOX, MIR, ACT,
OXA-1, OXA-10
0XA-11, OXA-15
OXA-23, OXA-24, OXA-48
Bush, K. (2010). AAC. 54 (3): 969 - 976
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BETALACTAMASAS DE ESPECTRO
EXTENDIDO
Definición: Son enzimas capaces de conferir
resistencia a penicilinas, cefalosporinas de
primera, segunda y tercera generación y
aztreonam (pero no a carbapenémicos y son
inhibidas por inhibidores de betalactamasas
como acido clavúlanico).
Enzimas clase molecular A y D
Paterson. (2005). CMR. 18 (4): 657 - 686
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BETALACTAMASAS DE ESPECTRO
EXTENDIDO (BLEE)
ENZIMAS CLASE A
Enzimas tipo SHV (excepto SHV-1).
Enzimas tipo TEM (excepto TEM-1 y TEM-2).
Enzimas tipo CTX-M
Enzimas BLEE menores tipo PER, GES, VER
ENZIMAS CLASE D
Enzimas tipo OXA de espectro extendido
(OXA-11, OXA-13, OXA-15, OXA-18)
Paterson. (2005). CMR. 18 (4): 657 – 686. Poirel (2010). AAC. 54: 24 - 38
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DETECCIÓN DE BETALACTAMASAS
DE ESPECTRO EXTENDIDO
1. Las pruebas fenotípicas solo permiten establecer
expresión de enzimas BLEE
2. Detección del tipo especifico de enzima BLEE
(evaluar presencia de genes codificantes de
estas enzimas como genes: blaTEM, blaSHV,
blaCTX-M, blaOXA, blaPER).
3. Técnicas moleculares como la reacción en
cadena de la polimerasa (técnica gold estándar).
Paterson. (2005). CMR. 18 (4): 657 – 686. Poirel (2010). AAC. 54: 24 - 38
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CARBAPENEMASAS
1. Es la familia más versátil de betalactamasas.
2. Carbapenemasas tipo serina de las clases A (KPC,
NME, IMI, SME) y D (OXA-23, OXA-24, OXA-58).
3. Carbapenemasas clase B (VIM, IMP, SPM, GIM,
SIM).
4. Las carbapenemasas poseen el más amplio perfil
de hidrólisis descrito para betalactamasas y puede
ser utilizado para la orientación en las pruebas
fenotípicas.
Poirel (2010). AAC. 54: 24 – 38. Nordmann (2009). Lancet Inf Dis. 9: 228-236
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CARBAPENEMASAS
Queenan A. (2007). CMR. 20 (3): 440 - 457
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CARBAPENEMASAS
1. Las pruebas fenotípicas solo permiten establecer
expresión de enzimas carbapenemasas tipo A y
B y no D.
2. La detección del tipo especifico de enzima
carbapenemasa se realiza (evaluando la
presencia de genes codificantes de estas
enzimas como genes: blaKPC, blaVIM, blaIMP, ,
blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-58).
3. La reacción en cadena de la polimerasa (técnica
gold estándar).
Poirel (2010). AAC. 54: 24 – 38. Nordmann (2009). Lancet Inf Dis. 9: 228-236
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ENZIMAS AmpC O
CEFALOSPORINASAS
1. Se diferencian de las cefalosporinasas clase
A por su perfil de inhibición ya que las
enzimas AmpC son resistentes a la inhibición
por ácido clavulánico y son más activas
frente a cefamicinas como cefoxitin.
2. Pueden ser codificadas a nivel de
cromosoma o plásmidos.
Jacoby (2009). CMR. 22: 161 - 182
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ENZIMAS AmpC O CEFALOSPORINASAS
1. Codificada cromosomalmente e inducible
Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Serratia
marcescens y Pseudomonas aeruginosa
2. Codificada cromosomalmente no inducible en A.
baumannii y E. coli.
3. Adquiridas o plásmidicas (CMY, FOX, ACT, MIR,
DHA, MOX) en Klebsiella spp, Salmonella spp y
Proteus mirabilis (no poseen AmpC cromosomal).
Jacoby (2009). CMR. 22: 161 - 182
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ENZIMAS AmpC O CEFALOSPORINASAS
1. En E. coli un fenotipo AmpC puede ser
sobrexpresión de AmpC cromosomal o presencia de
AmpC plásmidica
2. Detección fenotípica no permite determinar las
diferentes enzimas AmpC plásmidicas, es necesario
realizar técnicas como la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR).
3. La sobrexpresión del gen AmpC se realiza a través
de una PCR-transcriptasa reversa (RT-PCR) en
tiempo real.
Jacoby (2009). CMR. 22: 161 - 182
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TÉCNICAS MOLECULARES PARA
DETECCIÓN DE BETALACTAMASAS
1. Existen diversas técnicas moleculares para realizar la
detección de genes codificantes de betalactamasas siendo
el método estándar y convencionalmente utilizado la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del ingles
Polimerase Chain Reaction) ya sea la PCR de tipo
convencional o la variante PCR en tiempo real.
2. La secuenciación del producto de amplificación (permite la
genotipificación de la enzima) estas es la técnica gold
standard para conocer la secuencia de aminoácidos de la
enzima en estudio
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REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA
1. Síntesis in-vitro de grandes cantidades de un
segmento de acido nucleico.
2. El procedimiento requiere:
ADN en estudio
Dos oligonucleótidos iniciadores específicos
(forward y reverse).
Polimerasa estable al calor.
Desoxirribonucleótidos (dNTPs) dATP, dGTP,
dTTp, dCTP
Torres (1995). Elementos. 3: 16 - 21
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REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
1. La reacción requiere de ciclos repetidos de
tres pasos que incluyen cambios en
temperatura :
Denaturación del acido nucleico.
Alineación
Extensión
Torres (1995). Elementos. 3: 16 - 21
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REACCIÓN EN CADENA
DE LA POLIMERASA (PCR)
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REACCIÓN EN CADENA
DE LA POLIMERASA (PCR)
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PCR SIMPLE Y PCR MÚLTIPLEX
1. PCR simple: Se analiza un único segmento
de ADN o un único gen en la reacción.
2. PCR Múltiplex: Se analizan diferentes genes
en una sola reacción, este tipo de ensayo
busca reducir costos. Para su realización se
necesita tener en cuenta:
Diseño de oligonucleotidos inicidores.
Productos de amplificación
Torres (1995). Elementos. 3: 16 - 21
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EVALUACIÓN DE PRODUCTOS
OBTENIDOS EN LA PCR
1. Para la detección de los productos obtenidos
en la PCR (amplímeros) en una PCR
convencional son evaluados por electroforesis
en geles de agarosa y visualizados a través
de tinciones como bromuro de etidio o SYBR
GREEN
2. Pero también se pueden evaluar por
hibridización utilizando sondas especificas
(técnica Hyplex) .
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EJEMPLO DE PCR SIMPLE
CONVENCIONAL
A continuación se muestra un ejemplo de una
PCR simple para la detección del gen blaKPC en
aislamientos de Klebsiella pneumoniae resistentes
a carbapenémicos, positivos para la prueba de
Hodge y negativos para prueba fenotípica de
metaloenzimas
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EJEMPLO DE PCR SIMPLE CONVENCIONAL
INICIADOR
TAMAÑO
ESPERADO DEL
AMPLIMERO
SECUENCIA 5’ – 3’
blaKPC F 5’ ATG TCA CTG TAT CGC CGT CT TTT 3’
blaKPC R 5´TCA GAG CCT TAC TGC CC 3’
893 pb
Bradford (2004). Clin Inf Dis. 39: 55 - 60
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EJEMPLO DE PCR SIMPLE CONVENCIONAL
Foto Laboratorio de Microbiología Universidad Nacional de Colombia
M: Marcador de peso molecular 1 Kb Invitrogen
1 a 7: Muestras positivas para el gen blaKPC
CN: Control negativo
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REPORTE DE PCR SIMPLE CONVENCIONAL
El
resultado
que
reportamos
es
aislamientos de K. pneumoniae positivos
para el gen blaKPC sin establecer la
variante de la enzima que poseen estos
aislamientos, para esto es necesario
realizar una reacción de secuenciación del
producto de amplificación.
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EJEMPLO DE PCR MÚLTIPLEX
CONVENCIONAL
A continuación se muestra un ejemplo de una
PCR multiplex para detectar los genes
codificantes de carbapenemasas tipo OXA en
aislamientos de A. baumannii resistentes a
carbapenémicos.
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EJEMPLO DE PCR MÚLTIPLEX
CONVENCIONAL
NOMBRE DE
INICIADOR
blaOXA-23-like
blaOXA-24-Like
blaOXA-51-Like
blaOXA-58-Like
SECUENCIA DE INICIADORES
Forward 5’ GAT CGG ATT GGA GAA CCA GA 3’
Reverse 5’ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT 3’
Forward 5’GGT TAG TTG GCC CCC TTA AA 3’
Reverse 5’ AGT TGA GCG AAA AGG GGA TT 3’
Forward 5’ TAA TGC TTT GAT CGG CCT TG 3’
Reverse 5’TGG ATT GCA CTT CAT CTT GG 3
Forward 5’AAG TAT TGG GGC TTG TGC TG 3’
Reverse 5’ CCC CTC TGC GCT CTA CAT AC 3’
TAMAÑO
501 pb
246 pb
353 pb
599pb
Woodford (2006). Int J Antimicrob agents. 27: 351-353
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EJEMPLO DE PCR MÚLTIPLEX CONVENCIONAL
Foto tomada de Woodford (2006)
Muestra 1: Marcador de peso molecular 1 Kb Invitrogen
Muestras 2 – 7:: Muestras positivas para diferentes genes blaOXA
Woodford (2006). Int J Antimicrob agents. 27: 351-353
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REPORTE DE PCR MÚLTIPLEX CONVENCIONAL
Aislamientos 2 y 4 positivos para carbapenemasas del
subgrupo OXA-23 Like y a la carbapenemasa de ocurrencia
natural OXA-51 Like.
Aislamiento 3 positivo para carbapenemasas del subgrupo
OXA-24 Like y a la carbapenemasa de ocurrencia natural
OXA-51 like.
Aislamiento 5 y 6 positivo para carbapenemasa de
ocurrencia natural OXA-51 like.
Aislamiento 7 positivo para carbapenemasa OXA-58 like.
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CASO 1
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ENUNCIADO Y PREGUNTA 1
Observe la siguiente tabla que describe los
iniciadores utilizados para amplificar genes que
codifican enzimas AmpC de tipo plasmidicas y
compare los tamaños del amplímero esperado
con el resultado visualizado en el gel.
¿en el aislamiento en estudio se obtuvo
amplificación utilizando que juego de
iniciadores?.
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OLIGONUCLEOTIDOS INICIADORES PARA
AMPLIFICAR GENES AmpC PLASMÍDICOS
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FOTO. Amplificación de genes AmpC plasmídicos
M: Marcador de peso molecular de 1Kb (invitrogen)
1: Aislamiento en estudio
CN: Control Negativo
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RESPUESTA 1
Iniciadores FOX ó iniciadores
FOX-F y FOX-R
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PREGUNTAS 2
¿Como reportaría el resultado
observado en el gel?
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RESPUESTA 2
Aislamiento productor de enzimas
AmpC tipo FOX o aislamiento
productor de enzimas FOX
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CASO 2
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ENUNCIADO Y PREGUNTA 1
Observe la siguiente tabla que describe los
iniciadores utilizados para amplificar genes tipo
blaKPC que codifican enzimas KPC y compare el
tamaño del amplimero esperado con los
resultados visualizados en el gel.
¿En los aislamientos 1 y 2 como reportaría el
resultado?.
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OLIGONUCLEOTIDOS INICIADORES PARA
AMPLIFICAR GENES blaKPC
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FOTO. Amplificación de genes blaKPC
M: Marcador de peso molecular de 1Kb (invitrogen)
CP: Control Positivo
CN: Control Negativo
1: Aislamiento 1 del estudio
2: Aislamiento 2 del estudio
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RESPUESTA 1
Aislamientos productores de enzimas
KPC
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SECUENCIACIÓN
1. Técnica gold estándar para determinar la secuencia de
nucleótidos de una molécula de ADN en estudio.
2. Para realizar la secuenciación de ADN es necesario emplear
los oligonucleótidos iniciadores (Forward y Reverse) que
permitan amplificar y secuenciar el fragmento de ADN de
interés.
3. Los análisis de los resultados obtenidos de la secuenciación
se realiza con el uso de herramientas bioinformáticas para
establecer los nucleótidos y la identidad de la secuencia
evaluada (en el caso de un amplímero del gen blaKPC
posterior a la secuenciación podemos especificar que el
aislamiento es portador de la enzima KPC-3).
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OTRAS TÉCNICAS MOLECULARES PARA
IDENTIFICACIÓN DE VARIANTES DE
BETALACTAMASAS
Sin embargo existen otros métodos que no usan la
secuenciación para identificar la variante de las
betalactamasas como son:
Análisis del polimorfismo del gen amplificado por PCR
(PCR-RFLP) ,
Análisis del polimorfismo conformacional de cadenas
sencillas de ADN (SSCP por las siglas del inglés: Single
Strand Chain Polymorphism).
Ensayos de restricción del producto de amplificación
Microarreglos
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