ESTUDIOS MOLECULARES REALIZADOS CON Hevea

I.
INTRODUCCIÓN
Hevea brasiliensis es un árbol perenne que pertenece al género Hevea, del orden
Euphorbiales y de la familia Euphorbiaceae. El género Hevea incluye diez especies,
todas originarias de las cuencas Amazónicas de Brasil (Schultes, 1990). H. brasiliensis,
tiene la particularidad de producir látex. Las propiedades de este producto, que durante
mucho tiempo han sido conocidos y utilizados por los indios de América del Sur, fue
descubierto por los Europeos hacia el siglo XVIII (Jacob et al., 1994).
El látex natural en fresco está constituido por el citoplasma de las células laticíferas, que
contienen el citosol, partículas de goma y organelos subcelulares (entre ellas, los
vacuolisosomas o lutoides) que se encuentran formando una suspensión coloidal. Todos
estos componentes participan en el proceso de coagulación del látex, que se produce
cuando el árbol sufre una herida o incisión (Funkhouser, 1993). El caucho natural de H.
brasiliensis es altamente valorado, ya que no tiene sustituto sintético comparable debido
a su elasticidad y resistencia a altas temperaturas (Lynen, 1969).
La especie de H. brasiliensis, es prácticamente la única fuente natural de caucho, por lo
general es cultivada clonalmente. El cultivo de las plantas de H. brasiliensis, que se
obtienen a través de propagación de semillas no reproducen las características deseables
de sus progenitores, por lo que se usa la propagación asexual que reproduce toda la
información genética de la planta madre. El árbol de hule se propaga vegetativamente
en forma comercial por injerto de yema, el cual consiste en añadir una tallo con yema
del árbol seleccionado sobre una planta patrón ó pie franco (se pueden obtener por
semillas). De esta forma una planta injertada se compone de dos porciones: el patrón
que constituye la parte subterránea, y una variedad o parte aérea que una vez
desarrollada producirá hojas, flores y frutos idénticos a la planta donde fue obtenida.
Este método de clonación se usa para reproducir un número de individuos provenientes
de un solo árbol (AMSDA, 2005).
Dentro de este panorama la biotecnología, específicamente el campo de la biología
molecular, ha permitido el desarrollo de marcadores genéticos. Los marcadores
genéticos tienen diversas aplicaciones en la conservación y mejoramiento genético de
distintas especies forestales (Araya et al., 2005). Generalmente un marcador genético se
define como cualquier gen cuya expresión permite un efecto fenotípico que puede ser
detectado fácilmente y puede ser utilizado para identificar su progenie. Además permite
la identificación de individuos o células que contienen un determinado genotipo
(Valadez y Kahl, 2000). Dentro de los marcadores moleculares o genéticos, los más
conocidos son los RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified
Fragment Lenght Polymorphism), los microsatélites o SSR (Simple Sequence Repeat) y
los RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) (Caetano-Anollés y Gresshoff,
1997).
El polimorfismo a nivel de ADN en los organismos, pueden ser detectados mediante
técnicas moleculares, algunas de las cuales han sido empleadas en H. brasiliensis. El
análisis de los polimorfismos en H. brasiliensis, se han usado para construcción de
mapas de ligamiento, estrategias de selección asistida por marcadores, pruebas de
parentesco, identificación de especies y estudios de genética de poblaciones.
Para determinar los tipos de clones y conocer el nivel de polimorfismo que existe en las
plantaciones de H. brasiliensis del Estado de Tabasco se han empleado los marcadores
moleculares de microsatélites. La importancia de caracterizar el genotipo de los clones
de hule nos permitirá identificar que clon es el más recomendable para propagar
vegetativamente, tomando en cuenta las características fenotípicas de interés como: alto
rendimiento en producción de látex, resistencias a vientos y resistencias a
enfermedades.
Los microsatélites son segmentos cortos de ADN con una secuencia repetitiva de
nucleótidos como por ejemplo, CACACA que tienden a aparecer en regiones no
codificantes del genoma (Zane et al., 2002). En algunos microsatélites, la unidad
repetitiva, por ejemplo CA, puede ocurrir de dos a cuatro veces, en otros, podrían ser
siete veces, etc. En los organismos diploides como las plantas, cada individuo tendrá
dos copias de un segmento microsatélite particular. Por ejemplo, una planta podría tener
un genotipo de 12 repeticiones y 19 repeticiones, y otra de 18 y 15 repeticiones mientras
que el hijo de ambas podría tener repeticiones de 12 y 15. A medida que ocurren los
cruces sexuales entre los individuos, los microsatélites se recombinarán y la población
mantendrá una variabilidad de microsatélites que es característica para esa población
particular y que la distingue de otras poblaciones con las cuales ella no se cruza
(Morgante y Olivieri, 1993; Zane et al., 2002).
La forma más usual de detectar microsatélites es el diseño de iniciadores para la
Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction o PCR), los cuales
son únicos para un determinado locus en el genoma y cuyas bases se aparean a ambos
lados de la porción repetitiva. Por lo tanto, un solo par de iniciadores (directo y reverso)
diseñados para “flanquear” la región microsatélite, será útil para amplificar el ADN de
cada individuo en la especie bajo estudio del cual se obtendrán productos de diferentes
tamaños para cada microsatélite. Los productos de la PCR, son separados mediante
electroforesis en gel para determinar su tamaño molecular (Johnson et al., 2004).
Dada la importancia de seleccionar adecuadamente los clones de H. brasiliensis,
en la presente investigación se utilizarán “primers” que han reconocido secuencias
simples repetidas (SSR) en H. brasiliensis recomendada por Saha et al., 2005. Estos
“primers” serán evaluados en la especie H. brasiliensis, con el fin de determinar la
huella genética de los clones y conocer la diversidad genética, distancia genética y
grado de parentesco entre ellos. La aplicación de los microsatélites viene a ofrecer una
nueva herramienta de apoyo al programa de mejoramiento y conservación genética de
H. brasiliensis.
ANTECEDENTES
H. brasiliensis es una planta de rápido crecimiento, su altura oscila entre los 20 a 35 m
(Cilas et al., 2004). El árbol de hule tiene un tronco recto en forma de columna y es
grueso en la base; la corteza es de color verde grisáceo y presenta ramificaciones
irregulares. Las hojas son compuestas, trifoliadas y alternas, su coloración en el envés es
verde obscuro y en el haz es verde claro. Sus nervaduras están bien marcadas, tiene un
peciolo largo y su sistema radicular es raíz pivotante (Nieto y Rodríguez, 2003).
Sus flores son monoicas, chicas, de color amarillo claro. Las flores masculinas tienen de
8 a 10 mm de largo y las flores femeninas tienen de largo, de 10 a 12 mm. El fruto es una
capsula trilocular que contiene una semilla, raramente posee de 4 a 6 lóbulos. Las
semillas son largas, ovoides, brillosas y tienes un color grisáceo pálido, con puntos
ovalados de color café obscuro. El diámetro de la semilla es de 3 a 6 cm. Tienen un
tejido esponjoso que les permite flotar en el agua, esto contribuye a la diseminación de la
especie. La semilla es recalcitrante por lo que tiene grandes contenidos de aceites y agua
(Nieto y Rodríguez, 2003). Las semillas pesan entre 4 y 6 gr, las semillas producidas por
diferentes clones varían en tamaño, tamaño y peso.
Las plantas de H. brasiliensis son difíciles de propagar mediante semillas y las semillas
que se obtienen mediante esta técnica, no reproducen las características deseables de
sus progenitores, debido a que estas especies tiene las siguientes características: son
endogámicas (solo se reproducen con sus parientes más cercano) y son diploide
(contienen 2n=36 cromosomas). La fecundación cruzada para la formación de una
semilla genera variabilidad genética mediante la mezcla de genes y es por esta razón
que se usa la propagación asexual que reproduce toda la información genética de la
planta madre. El árbol de hule se propaga vegetativamente en forma comercial por
injerto de yema, el cual consiste en añadir una tallo con yema del árbol seleccionado
(planta madre) sobre una planta patrón ó pie franco (Que se puede obtener mediante
semillas). Este método de clonación se usa para reproducir un número de individuos
provenientes de un solo árbol.
Esta especie crece bien en suelos de al menos 1 m. de profundidad con pH de 4.0 a 6.5.
El rango óptimo de temperatura para este árbol es de 22 a 33°C, y el mínimo de
temperatura es de 15°C. La humedad relativa no debe exceder los 70 a 80%. La
precipitación anual tiene que estar entre 1500 a 3000 mm y requiere de 1,500 a 1800
horas anuales de rayos solares (Nieto y Rodríguez, 2003).
HISTORIA DEL CULTIVO DEL ÁRBOL DEL HULE
El Árbol del hule es originario de las cuencas bajas del río Amazonas en Brasil, los
indígenas de estas zonas usaban el látex para protegerse de la humedad, sumergiendo sus
calzados y bolsas en la savia de H. brasiliensis. El descubrimiento del hule no tuvo usos
prácticos inmediatamente, principalmente porque no se sabía como evitar que el hule se
volviera pegajoso con el calor y quebradizo con el frió, si no fue hasta el siglo XIX, que
se sentaron las bases para el uso del hule en miles de artículos. En 1836 Charles
Goodyear, descubrió que calentando el hule con azufre quedaba estable sin ser afectado
por los cambios de temperatura, a este proceso se le llamo vulcanización (AMSDA,
2005)
En 1850, la mayor parte del látex, para la industria mundial provenía de Hevea, Ficus
elástica y Castilla elástica los cuales crecían de forma silvestre, en los bosques de
Centroamérica, Sudamérica, India, África, Madagascar, etc. Sudamérica y Centroamérica
fueron los principales proveedores de látex, contribuyendo con el 71% de este producto.
Durante esta época, la industria británica se encontró con una difícil situación, ya que
tenían limitado este recurso proveniente América tropical (Compagnon,1998).
En junio de 1873, hubo un intento fallido de introducir semillas de Hevea brasiliensis a
otros países. Charles Farris llevo 2000 semillas a Kew, Inglaterra, de estas semillas solo
12 germinaron y en 1873, seis de esas plántulas fueron transportadas al jardín botánico
de Calcuta, pero como las condiciones climáticas no fueron las adecuadas, no pudieron
sobrevivir (George y Kuruvilla, 2000).
Hasta finales del siglo XIX, Brasil era el único productor y proveedor de hule en el
mundo, y no fue hasta 1876 que el inglés Henry Wickham llevó 70,000 semillas a los
jardines Botánicos de Kew (AMSDA 2005). De las 70 mil semillas que llegaron a
Londres solo 2,700 germinaron. En agosto de 1987, se transportaron a Sri Lanka
(anteriormente Ceilán) 1,919 plántulas de las cuales solo el 90% de ellas sobrevivieron;
18 fueron enviadas al jardín botánico en Bogor (Indonesia) y solo dos sobrevivieron y
probablemente 1 de las 50 plántulas que se llevaron a Singapur sobrevivieron. Sri Lanka
y los jardines botánicos de Heneratgoda en Colombo se convirtieron en los centros de
mayor distribución de semillas y plántulas para la exportación. Las plantaciones
experimentales no solo se expandieron a las colonias británicas de Sri Lanka, Java e
india si no también a colonias Holandesas (hoy Indonesia) las cuales recibían semillas de
hule provenientes de Sri Lanka (George y Kuruvilla, 2000).
En México se tienen registro de que los cultivos de hule empezaron en 1882, estos
árboles fueron traídos de Asia por compañías inglesas y holandesas, estableciéndose las
primeras plantaciones en los municipios de Tezonapa, en Veracruz; Tuxtepec, Ojitlán y
Santa María Chimalapa, en Oaxaca; y en la hacienda Zanjón Seco y Zacuala, en Chiapas.
En Zacuala se sembraron 8,500 Ha con árboles de Hule por lo que fue considerada la
plantación mas grande del mundo (Rébora, 1982). El material Vegetativo y la tecnología
utilizada en esas plantaciones, procedieron de diferentes países y no se conoce con
certeza el éxito alcanzado, pues estas plantaciones, fueron abandonadas en 1910 durante
la revolución mexicana y algunas se talaron para la siembra de maíz (AMSDA, 2005).
En 1941 durante la segunda guerra mundial, los Estados Unidos de Norteamérica
reintrodujeron a México clones desarrollados en Indonesia, Malasia y Filipinas. Esto fue,
porque nuestro país presenta condiciones edafológicas y climatológicas favorables, para
el desarrollo del cultivo, además de encontrarse más cerca de los Estados Unidos de
Norteamérica, quien tuvo problemas de abastecimiento de hule por el bloqueo del libre
transporte del lejano oriente (Rojo-Martínez et al., 2005).
Actualmente el cultivo de hule en México, se encuentra distribuido en los estados
Veracruz, Oaxaca, Chiapas y Tabasco.
México cuenta con alrededor de 27,000 Ha en producción y 25,000 en desarrollo para la
producción de látex (SAGARPA, 2006). Tabasco cuenta con 3930.832 Ha, las cuales se
encuentran en los municipios de Huimanguillo, Macuspana, Teapa, Jalapa y Tacotalpa
(AMSDA, 2005).
IMPORTANCIA ECONÓMICA, ECOLÓGICA Y SOCIAL DEL CULTIVO DE
H. brasiliensis
El cultivo de hule tiene grandes ventajas Económicas, Ecológicas y Sociales. El hule es
de gran importancia económica, ya que el látex que se obtiene de este árbol, es un
polímero que consiste en unidades de isopropeno unidas entre si a una configuración-cis
(cis-1,4-poli-isopropeno), haciéndolo único para muchas aplicaciones que no tienen
equivalente sintético (Van Beilen y Poirier, 2007) es por esta razón que el 99% del látex
natural proviene de H. brasiliensis (George y Kuruvilla, 2000).
El látex es sintetizado por 2000 especies de árboles, de las cuales solo 300 pertenecen al
género Hevea. Sin embargo H. brasiliensis es el único recurso económicamente viable
para la producción de látex natural, principalmente por que es una árbol abundante, es un
recurso renovable y este puede ser fácilmente aprovechado (Venkatachalam et al., 2004).
El Látex natural tienes más de 40 000 usos, incluyendo 400 productos médicos. Aparte,
posee propiedades únicas e importantes para la industria, en las cuales se incluyen
resistencia, eficiente dispersión al calor y maleabilidad a altas temperaturas (Cornish y
britcha, 2002).
Para el comienzo de la producción económica del árbol del hule se tienen que esperar por
lo menos 4 años, pero como este cultivo no tiene efectos alelopáticos, puede asociarse
con otras especies, permitiendo el establecimiento en la misma área física de cultivos de
rápido crecimiento, como el plátano, maíz, piña; entre otras especies, que pueden generar
ganancias a corto plazo (George y Kuruvilla, 2000).
El tiempo productivo del hule es de alrededor de 25 a 30 años y una vez finalizado el
ciclo productivo de este árbol, su madera es aprovechada para la producción de carbón,
muebles y lápices (Ordoñez et al., 1997). A nivel Mundial más de 50 millones de
personas viven del árbol del hule, y muchas regiones de países en desarrollo, se han
estabilizado gracias a la actividad económica generada por este cultivo.
Desde el punto de vista ecológico, el cultivo tiene gran importancia, en las que se
pueden resumir las siguientes (Rojo et al., 2005. George y Kuruvilla, 2000):
1. Recicla nutrientes muy eficientemente.
2. Permite el buen uso y protección del suelo si se siembra en pendientes, incluso
aquellas superiores al 12%.
3. Aporta nichos ecológicos adecuados para varias especies, lo que permite mantener
mas integra la biodiversidad de las áreas en que el hule crece.
4. Durante el crecimiento del árbol la atmósfera es purificada a través de la fotosíntesis,
ya que esta especie absorbe más bióxido de carbono que muchas otras especies.
5. Contribuye al balance hídrico local y por lo tanto a la regulación entre los periodos
secos y excesivamente húmedos. Es decir, suministra agua en lugares en que los
mantos freáticos de los acuíferos están muy profundos, y por otro, consume agua en
lugares de exceso temporal de ésta.
En cuanto a lo social, el establecimiento de Plantaciones de hule es un generador de
empleo, ya que requiere mano de obra permanente, no sólo en el sector primario, sino en
la industria. Este cultivo es recomendado para zonas marginadas, debido a que no es
exigente en condiciones de fertilidad.
ESTUDIOS MOLECULARES REALIZADOS CON Hevea brasiliensis.
En H. Brasiliensis se han realizados importantes estudios moleculares, entre los mas
importantes se encuentran: mejoramiento, expresión génica, estudios de resistencia a
plagas o enfermedades, aislamiento de genes específicos, entre otras.
Kush et al., (1989) llevaron acabo una investigación sobre la expresión génica en los
laticíferos de H. brasiliensis, para esto usaron como material vegetal árboles de 30 años
de edad y encontraron que la transcripción de las proteínas HMGS (hidroximetilglutaril
sintetasa CoA) y HMGR (hidroximetilglutaril reductasa CoA) que son las responsables
de las biosíntesis de látex, se expresan en niveles más elevados en células laticíferas que
en hojas y que dos proteínas importantes para la fotosíntesis (1,5-bifosfato carboxilasa y
la unión b) tienen mayor expresión en células de las hojas que en las células laticíferas.
Broekaert et al., (1990) clonaron y secuenciaron el gen que codifica la heveína (HEV1).
La heveína es una proteína pequeña, de una sola cadena de 43 aminoácidos, usualmente
rica en cisteína y glicina. Se ha demostrado que la heveína se encuentra unida a la quitina
y que inhibe el desarrollo de hongos que atacan a través de la quitina, por lo cual se
sugiere que la heveína tiene un papel importante para proteger los cortes que se realizan
en los árboles contra el ataque de hongos. Describieron el aislamiento y en análisis de la
secuencia de un clon de cDNA que codifica heveína. Encontraron que el clon cDNA de
HEV1 tiene una secuencia 1018 nucleótidos de largo y se traduce en 204 aminoácidos
incluyendo 17 aminoácidos de la parte amino terminal. La parte del carboxilo terminal
tiene 144 aminoácidos de largo. Para conocer como reaccionaba el gen de heveína al
acido abscisico, etileno y al picado, algunas partes de la plantas fueron sometidas a
estrés. Esto ocasiono el incremento niveles de ARNm de heveína en algunos órganos de
las plantas como hojas, tallos y el látex de los tallos seccionados, sin presentarse
incremento en la transcripción de heveína en las raíces.
Le Guen et al., 2003 realizaron un mapa molecular de los genes que confieren resistencia
a la SALB (caída de la hoja sudamericana) en ciertos clones de H. brasiliensis, para este
trabajo inocularon clones resistentes, con cepas de Microcyclus ulei. Su búsqueda se
baso en encontrar QTLs (sitios con caracteristicas cuantitativas) con resistencia al SALB.
En el clon RO38 se encontraron estas regiones localizadas en el cromosoma g8 y g13. En
el clon PB 260 que es poco resistente a esta enfermedad, no se encontraron regiones de
resistencia. Los parámetros AT (severidad del ataque), RT (tipo de reacción) y ST
(presencia de stromata) que fueron observados en los árboles de hule inoculados por M.
ulei, pueden ser considerados, como indicadores de la intensidad del daño causado por
una epidemia de SALB, la tasa de multiplicación del hongo y su capacidad para
completar su ciclo biológico.
Sobha et al., (2003) elaboraron un protocolo eficiente para la transformación genética de
H. brasiliensis por medio de Agrobacterium tumefaciens con el gen SOD (superoxido
disminutasa). Este gen es el responsable de proteger a la planta del estrés oxidativo
ocasionando que el árbol de hule incremente la tolerancia al efecto TPD (Tapping Panel
Dryness), que es un desorden fisiológico caracterizado por secado de la corteza, seguido
por la interrupción del flujo de látex.
Priya et al., (2006) clonaron el gen REF (Factor de Elongación del Hule) que es el
responsable de la polimerización y la biosíntesis de la molécula de hule, para integrarlo
dentro del genoma de Nicotiana tabacum. Para esto se extrajo ARN de hojas del clon
RRII 105. El ADNc de RFE fue sintetizado por PT-PCR con “primers” específicos y
éstos fueron clonados dentro de un vector, generando un plásmido recombinado. Este
plásmido recombinado fue transformado dentro de E. coli y después fue movilizado
dentro de una cepa Agrobacterium tumefaciens, para poder transferir el gen dentro del
genoma del Tabaco (Nicotiana tabacum). Al final se confirmo por medio de PCR que las
hojas del tabaco fueron transformadas con el en gen HbREF y que éste se integro estable
dentro del genoma del huésped.
Juárez (2008) realizó estudios a cerca de la diversidad molecular en las plantaciones del
Hule del Estado de Tabasco, usando el análisis de RAPD-PCR en el que obtuvó un
mayor polimorfismo con el primer OPB-18 amplificando 34 bandas polimórficas de los
154 individuos analizados, el cual se encontraron 21 clones y 3 pies francos.
Hérnandez et al (2009) determinaron la variabilidad genética de las plantaciones de
Hevea brasiliensis en el estado de Tabasco mediante microsatélites. Se usaron 4 locus de
microsatélites de los cuales tres resultaron ser polimórficos produciendo de dos a tres
alelos sobre el mismo locus. Esto produjo un total de 49 regiones polimórficas. Con lo
que se determinó que la plantaciones del estado de Tabasco presentan un total de 16
clones diferentes.
JUSTIFICACIÓN
El látex que se obtiene de Hevea brasiliensis, es un producto natural cuya importancia
se ha incrementado debido a que los productos que se elaboran con este material no
tienen sustituto sintético. El árbol de hule crece bien en climas tropicales, por Tabasco,
este ocupa el cuarto lugar nacional en cuanto a la superficie plantada de este árbol.
Los cultivos del árbol del hule, tanto en México como en el mundo han tenido un gran
desarrollo y poseen gran importancia tanto económica como ecológica, por lo que las
investigaciones de biología molecular, relacionados con este cultivo son muy
importantes.
El material vegetal utilizado para las nuevas plantaciones está constituido por clones,
cada clon tiene características propias (fenotipo), como vigor, producción de látex,
tiempo de inicio de producción, resistencia a plagas, resistencia al viento entre otras.
Estas características fenotípicas están dadas por la constitución genética específica de
cada clon. Debido a estos los estudios sobre el ADN constituyen la huella genética y la
forma más confiable de identificación.
Las colecciones de clones se mantienen en jardines de multiplicación. De este material
material vegetal conservado en estos jardines se reproducen las yemas que serán
injertadas para su propagación y posterior traslado a viveros y plantaciones. El
mantenimiento de estos clones sin embargo no está exento de problemas, uno de
contaminación o inclusive inducción de mutaciones por el medio ambiente, por lo tanto
la única forma de asegurar que el material genético de los clones en propagación
pertenecen realmente al clon que se desea multiplicar es realizar la caracterización
molecular de los jardines de propagación, por lo que esta investigación asegurará la
calidad de los mismos, garantizando que en las nuevas plantaciones se presenten las
características deseadas de producción, resistencia a plagas y factores ambientales.
PROBLEMÁTICA.
Los jardines de multiplicación de yemas de hule no están exentos de problemas, como
la contaminación de los clones mantenidos en estos y la adquisición de mutaciones
debidas al medio ambiente. Esto ha provocado que en algunas ocasiones las
plantaciones no presenten las características esperadas, especialmente en la cantidad y
calidad del látex producido, así también pueden presentarse problemas de
susceptibilidad a plagas y enfermedades o a condiciones ambientales. La única forma de
detectar si se ha producido alguna variación en la constitución genética de los clones, es
llevar a cabo la caracterización molecular de los jardines de propagación.
MATERIALES Y METODOS
MUESTREO
Las muestras serán colectadas de los jardines de multiplicación del INIFAP “El
Chichonal” de Aquiles Serdán del Municipio de Jalapa, Tabasco.
Se ha determinado el número de plantas por cada clon presente en los jardines de
multiplicación. Para determinar el número de plantas que es necesario muestrear por
cada clon. Aplicando la siguiente estrategia de muestreo:
K=N/n, K es el intervalo de muestreo, N tamaño de la población, n tamaño de muestra,
que fue el cinco por ciento de cada población (aproximadamente). Para se eligió al azar
(tabla de números aleatorios), un número que se encuentre entre 1 y el valor de k. De
ahí se fue sumando el valor de k hasta obtener los números de las plantas a seleccionar
en cada clon (Muestreo sistemático). NOTA: En las poblaciones pequeñas se
seleccionaron de acuerdo al muestreo sistemático, aunque no se cumple el 5 % de los
árboles seleccionados, por el tamaño de población muy pequeña.
CLON
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
PB 330
PB 260
PB 312
RRIC
100
PB 340
RRIM
600
BPM 24
RRIM
901
RRIM
712
NO.
PLANTAS
24
34
22
32
UBICACIÓN
Número de planta a muestrear
JARDIN
JARDIN
CAMPO
JARDIN
2,7,12,17,22
4,9,14,20,26,32
2,6,10,14,20
1,7,13,19,25
32
20
JARDIN
JARDÍN
3,9,15,21,27
1,5,9,14,19
23
22
CAMPO
JARDIN Y
VIVERO
CAMPO Y
VIVERO
3,8,13,18,23
2,6,10,14,18
18 + 2000
Para
18
(2,6,10.14,18),
para
2000
(10,30,50,70,90, 110, etc hasta la 1970) (cada
20)
2,6,10,14,18
RRIM
728
IRCA
109
22
CAMPO
24 + 10 +
1000
Para 24(3,8,13,18,23), para 10 (3,5,7,9), para
1000 (14, 34,54,74,94, hasta 994) (cada 20)
PB 5/51
RRIM
921
IAN 710
IAN 873
IAN 754
PB 235
IRCA
209
PB 314
RRIM
710
RRIM
711
20
24
CAMPO,
JARDÍN Y
VIVERO
JARDÍN
JARDÍN
250
2000
24
20
20
JARDÍN
JARDÍN
CAMPO
JARDÍN
CAMPO
5,24,43,62,81,100,119,138,157,176,195,214,233
9,39,59,79, hasta 1969 (cada 20)
3,8,13,18,23
4,8,12,16,20
3,7,11,15,19
1500
7
VIVERO
JARDIN
17,37,57,77, hasta 1497 (cada 20)
2,3,5,6
22
JARDIN
4,8,12,16,20
1,5,9,14,19
4,9,14,19,24
Material vegetal recolectado
Se colectaran de 9 a 10 hojas jóvenes, que no estén maltratadas, libres de plagas y de
apariencia sana. Las muestras se manipularan con guantes para evitar contaminación e
inmediatamente después del corte, se introducirán a una bolsa de papel estraza y
posteriormente en una bolsa de plástico y selladas con cinta adhesiva; esto se llevará a
cabo en por planta muestreada con el fin de conocer los datos precisos de cada
muestra. Ya empaquetadas las muestras, se colocarán en una nevera con hielo picado,
para que el ADN de las hojas no se degrade y después se transportaran al laboratorio de
usos múltiples de la División Académica de Ciencias Biológicas de la Universidad
Juárez Autónoma de Tabasco para ser procesadas.
Extracción de ADN
Para la extracción del ADN genómico de las hojas colectadas se utilizará la técnica de
CTAB “Cetil Trimethyl Ammonium Bromide” utilizando el protocolo de Doyle and
Doyle (1990), modificada por Bekesiova et al., (1999).
Purificación del ADN
Posterior a la extracción se efectuará
una purificación del ADN, usando RNAsa
seguido de una fenolización y precipitación con etanol y Acetato de Sodio.
Amplificación del ADN usando Microsatélites.
El ADN genómico será amplificado con los siguientes oligonucleótidos específicos
(hmac4, hmac5, hmct1 y hmct5 SIGMA) los cuales fueron diseñados a partir de
secuencias por frecuencias altamente repetidas en el genoma de H. brasiliensis (AC y
CT).
Para la amplificación se utilizarán las siguientes condiciones usando un programa de
gradiente: 7 ciclos 94°C por 30 seg, seguido de 63°C por 1 min Δ ↓ 1°C; 72°C por un
min. A esto seguida un programa de PCR normal de 94 °C por 30 seg, 56°C por 1 min,
72°C por un min durante 23 ciclos; y una amplificación final de 72°C por 10 minutos.
Una vez que el programa concluya las reacciones se detendrán adicionando 10 µl de
azul de bromofenol al 0.1%.