Actividad enzimática en frutos - Actiweb crear paginas web gratis

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
TALLER
MULTIDISCIPLINARIO
DE PROCESOS
TECNOLÓGICOS DE
FRUTOS Y
HORTALIZAS
PRACTICA 3. DETERMINACIÓN
DE ENZIMAS RELACIONADAS
CON LA MADURACIÓN DE
PRODUCTOS VEGETALES
Dra. Ma. Andrea Trejo Márquez
I.A. Selene Pascual Bustamante
En esta práctica se desarrollan los métodos
para la determinación de enzimas causantes
del pardeamiento como son PDO y PPO.
El alumno desarrollará el conocimiento
sobre estas enzimas, así como en el uso de
equipos y material de laboratorio.
Procesos Tecnológicos de Frutos y Vegetales
OBJETIVO
Determinar la actividad de polifenoloxidasa y peroxidasa en diversos productos
hortofrutícolas en diferentes estadios de maduración para asociarla la actividad de estas
enzimas al tipo de manejo postcosecha del producto.
ANTECEDENTES
1. Polifenoloxidasa (PPO)
1.1. Función de PPO en frutas y hortalizas.
La polifenoloxidasa, conocida como catecol oxidasa, fenolasa, o o-difenol oxigeno
oxireductasa (E.C. 1.14.18.1), cataliza la oxidación difenoles en presencia de oxigeno
molécular. Se encuentra distribuida ampliamente en la naturaleza generalmente en
plantas. La localización de la enzima en las células de las plantas depende de la especie y
estado de madurez. La distribución de PPO en diferentes partes de frutas y vegetales
puede ser diferente ya que la proporción de enzimas solubles varía con la madurez.
Dentro de su papel en la naturaleza, la PPO es participe en la cadena de respiración de
plantas como una de las oxidasas terminales, sin embargo esto ha sido cuestionado.
Mucho más importante es el papel que juega en la resistencia a infecciones
microbiológicas o virales en las plantas en un clima adverso. Participa indirectamente en
la biosíntesis de auxinas. Por lo que jugar un papel importante en la regulación del
crecimiento de las plantas junto con la enzima degradante de la auxina (POD). También
participan en el fenómeno denominado pardeamiento enzimático, el cual es consecuencia
indirecta del la acción de la PPO en alimentos procesados.
1.2 Bioquímica y mecanismos de reacción
Es una enzima que contiene cobre y que cataliza dos diferentes reacciones: (a) la
hidroxidación de monofenoles a o- difenoles y (b) la oxidación de o- dihidroxifenoles a oquinonas, para llevar a cabo estas reacciones se requiere oxígeno molecular. Los
extractos enzimáticos de diferentes fuentes poseen estas dos actividades en diferentes
proporciones, se ha reportado que en preparaciones de papas, manzanas, champiñones
posee ambas actividades y las de tabaco, mango, plátano y pera, se presenta solamente
una actividad.
El mecanismo que describe la reacción catalizada por PPO es el siguiente:
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Procesos Tecnológicos de Frutos y Vegetales
1.3. Sustratos
Las frutas y hortalizas poseen una amplia variedad de compuestos fenólicos, de los cuales
sólo una pequeña parte de estos son sustrato para la PPO.
Los más importantes son catequinas ( 3-hidroxiflavanes), ésteres de ácido cinámico ácido
clorágenico ( 3- O-cafeoyl-D-ácido quinico) el cual, es el sustrato más encontrado en la
naturaleza, el 3,4-dihidroxipenilalanina (L-DOPA) que es el producto de la hidroxilación de
tirosina; y la Tirosina la cual siendo un fenol y al mismo tiempo un aminoácido
constituyente de proteínas, se encuentra en cada tejido de las plantas. 0
1.4 pH y temperatura óptima de actividad
El valor de pH óptimo de actividad de PPO varía dependiendo la fuente de la enzima, así
como también el sustrato en un intervalo relativamente amplio, en la mayoría de los casos
va desde pH 4.0 a 7.0. Muchas preparaciones muestran un sólo pH óptimo de actividad y
en algunos casos se presenta un segundo pH óptimo que puede ser atribuido a una
insuficiente purificación.
En cuanto la temperatura óptima de actividad que ha sido mucho menos investigada que
el pH óptimo, los datos disponibles indican que la temperatura óptima depende de los
mismos factores que depende el pH óptimo. La actividad en melocotones se incrementa
de 3°C- 37°C y decrece arriba de 45°C.
1.5 Inhibidores
Debido a que la PPO es una metaloproteína con cobre puede ser inhibida por agentes
metalo quelantes tales como cianuro, monóxido de carbón, dietil- ditiocarbamato de
sodio( DIECA), mercaptobenztiazol , dimercaptopropanol, azide o xanato metilpotasio.
Algunos de estos reaccionan también con las quinonas formadas.
1.6 Extracción y purificación
Existen tres problemas para extracción de PPO (1) latencia, (2) solubilización de la
actividad límite de la célula, y (3) prevención de la oxidación inducida de la enzima y la
subsecuente polimerización y precipitación en la proteína enzimática, o fenoles
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Procesos Tecnológicos de Frutos y Vegetales
endógenos. Para prevenir la oxidación de fenoles durante la extracción enzimática se
remueven los sustratos por medio de ligamiento de estos a un polímero insoluble, de los
cuales el más utilizado es el Polyvinylpyrrolidone (PVP), es un fuerte receptor de protones
y es neutral a pH ácidos en los cuales los fenoles no se encuentran ionizados. Para la
purificación de los extractos crudos se utiliza la precipitación con sulfato de amonio a
diferentes saturaciones, o por cromatografía en gel en Sephandex G 100 o G 200 y
cromatografía de intercambio iónico o diálisis.
1.7 Determinación de actividad enzimática
Esta puede ser determinada midiendo (a) la velocidad de desaparición de sustrato o (b) la
velocidad de formación de producto.
Para determinar la desaparición de sustrato generalmente se mide la absorción de O2
manométricamente en Wasburg respirómetro, o polarográficamente con un electrodo de
oxígeno.
La
velocidad
de
formación
de
producto
puede
ser
determinado
espectrofotométricamente mediante la medida de la densidad óptica de compuestos
coloreados formados por las quinonas. Este método es muy simple y se presta para
análisis de rutina. La linealidad es mantenida por relativamente largos periodos similar al
método polarográfico.
2. Peroxidasa (POD)
2.1Función en fruta y hortalizas
La peroxidasa (EC 1.11.1.7; Donador; Peróxido de hidrógeno oxirreductasa, POD) es
similar a la PPO, ya que pertenecen al grupo de oxidoreductasas. Las cuales descomponen
peróxido de hidrógeno en presencia de un donador de hidrógeno es una de las enzimas
que controlan el crecimiento fisiológico de las plantas, su diferenciación y desarrollo. Es
bien conocido, que esta enzima participa en la construcción y lignificación de la pared
celular, la biosíntesis de etileno a partir del ácido 1- aminociclopropanocarboxílico y
peróxido de hidrógeno (H2O2), la regulación de niveles de auxina, la protección contra el
deterioro de tejidos e infección por microorganismos patógenos, la oxidación de ácido
indolacético, etc. . Por otro lado, hoy día existe un gran interés por la POD debido a sus
múltiples aplicaciones prácticas (industria maderera, industria de alimentos, bioquímica
clínica, etc.).
Se encuentra presente en animales, plantas y microorganismos. En las plantas localizada
en la célula parcialmente en forma soluble y en el citoplasma de manera insoluble. La
fracción de POD soluble, puede ser extraída de tejidos homogenizados con un buffer de
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Procesos Tecnológicos de Frutos y Vegetales
fuerza iónica baja La POD se encuentra ampliamente distribuida en las plantas, sin
embargo, en la actualidad, la POD de la raíz de rábano silvestre (Armoracia lapothifolia) es
la única que tiene aplicación práctica debido a que es la fuente que posee la mayor
actividad de esta enzima.
2.2 Bioquímica y mecanismo de reacción
La peroxidasa cataliza cuatro tipos de reacción: (a) Peroxidativas (b) Oxidativas (c)
Cataliticas y (d) de hidroxilación.
La ecuación global del mecanismo de reacción es el siguiente:
ROOH
Donde:
AH 2
POD
H 2O
ROH
A
R = H+, CH3, C2H5
AH2 = Donador de hidrógeno en forma reducida
A = Donador de hidrógeno en forma oxidada
Una gran variedad de compuestos pueden actuar como donadores de hidrógeno,
incluyendo fenoles (p-cresol, guayacol, resorcinol) aminas aromáticas (anilina, bencidina,
o-fenildiamina, o-dianisedina) nicotinamida-adenina dinucleotida reducida y nicotinamidaadenina dinucleotida fosfato reducida.
La reacción oxidativa de POD puede tener lugar en ausencia de peróxido de hidrógeno.
Se requiere de O2 y cofactores como Mn 2+ y un fenol.
2.3 Sustratos

Peróxido
POD es altamente específica al peróxido, por lo tanto su principal sustrato es H 2O2, sin
embargo la enzima es inactivada por altas concentraciones de peróxido.

Sustrato donador
La POD tiene una baja especificidad por los sustratos donadores de hidrógeno: esto es
interpretado como resultado de las diferentes especificidades de las isoenzimas de POD
presentes en las plantas. Alguno de estos sustratos son: guayacol, o-dianisedina, ofenildiamina, o-tolidina,3-amino-9-etil-carbazol, 3, 3’-diaminobencidina tetraclorada(DAB)
p-fenildiamina y o-toludina.
-5-
Procesos Tecnológicos de Frutos y Vegetales
La afinidad de la POD por el sustrato donador depende de la fuente de la enzima y del
grado de pureza de ésta.
2.4 pH y temperatura óptima de actividad
El pH óptimo de actividad de la POD varía dependiendo de la fuente de la enzima, la
composición de isoenzimas, el sustrato donador y el buffer aplicado. La pérdida de
actividad observada en acidificación es atribuida al cambio en la proteína de estado
nativo a un estado reversible de desnaturalización. Los cambios de actividad que ocurren
con los cambios de pH están relacionados a los cambios estructurales en la molécula de la
enzima.
2.5 Inhibidores
Similarmente a la PPO, la inactivación de la POD pude ser por químicos que actúan con la
enzima misma , o con uno de los sustratos o productos de reacción, tales como cianuro,
sulfuro, óxido nítrico , hidroxilamina, DIECA, metabisulfito de sodio. Los inhibidores más
utilizados en la práctica industrial son SO2 y sulfitos, los cuales previenen la pérdida de
sabor, pero solo reducen parcialmente la regeneración de la enzima.
2.6 Extracción y purificación
Como en muchas frutas y vegetales la enzima está presente en forma soluble. Esta
fracción soluble puede ser extraída con agua o con buffer de fuerza iónica baja.
2.7 Determinación de actividad enzimática
Puede ser determinada por los métodos espectrofotométricos basados en la formación
de compuestos coloreados que ocurre durante la reacción con el hidrógeno y el sustrato
donador. También puede ser estimada por el método de densitometria visual, o por la
actividad residual después de un tratamiento por calentamiento, así como por la
composición de las isoenzimas.
EQUIPO:
Espectrofotómetro
Centrifuga
Agitador Vortex
Balanza analítica
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Procesos Tecnológicos de Frutos y Vegetales
MATERIAL:
2 Espátulas
12 Tubos de Microcentrífuga de 1.5 ml
1 Micropipeta 1000 l
1 Micropipeta de 200 l
1 Micropipeta de 100 l
Puntas de micropipeta.
1 Cronómetro
4 Celdas para espectrofotómetro.
Hielo
10 Tubos de ensaye 20ml
Gradilla
1 Guantes
Parafilm
MUESTRAS Y REACTIVOS:
Una o dos especies del producto hortofrutícola en tres estadios de madurez por equipo.
Buffer fosfatos 0.2 M, pH 7
Buffer fosfatos 10mM, pH 7.5
Buffer fosfatos 0.05M, pH 5
Dopamina hidroclorada 0.07M
Peróxido de hidrogeno (15ml/l)
p-fenilendiamina (10mg/ml)
Albúmina sérica bovina (1mg/ml)
Na2CO3 al 2% en NaOH 0.1M
CuSO4.5H2O al 1%
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Procesos Tecnológicos de Frutos y Vegetales
Tartrato de Na y K al 2%
Reactivo de Folin-Ciocalteu
Reactivo A
Reactivo B
PROCEDIMIENTO:
Preparación de los extractos crudos.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Pesar 200 mg del tejido
Triturar en manualmente en mortero utilizando nitrógeno líquido
Colocar en tubo de micro centrifuga y agregar 1 ml de buffer fosfatos 0.2M.
Agitarlo en el vortex durante 1 minuto
Centrifugar en micro centrifuga a 14 000 rpm durante 15 minutos.
Extraer el sobrenadante, colocándolo en otro tubo de micro centrifuga y descartar
el pellet.
7. Colocarlo en hielo hasta su determinación.
Determinación de la actividad de polifenoloxidasa.
La actividad de la polifenol oxidasa se determinara espectrofotométricamente por lo que
es importante mencionar algunas consideraciones para el uso del espectrofotómetro.
 Se debe encender 30 minutos antes de su uso.
 Ser cuidadosos de no derramar ningún reactivo dentro de este al colocar la
celda ya que esto pudiera dañarlo.
 Ajustar la longitud de onda para cada determinación.
1. En una celda limpia agregar 1.45 ml de buffer fosfatos 10mM con 0.07M de
dopamina hidroclorada.
2. Agregar 100 l del extracto crudo
3. Inmediatamente mezclarlo con ayuda de parafilm
4. Rápidamente colocarla en el espectro y medir el aumento en la absorbancia a 420
nm por 4 minutos.
5. Calcular la actividad de la polifenol oxidasa con base en la pendiente de la
proporción lineal de la curva 420 nm contra el tiempo.
Cálculo: Absorbancia / mg proteína*min*ml.
Determinación de la actividad de peroxidasa.
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Procesos Tecnológicos de Frutos y Vegetales
1. En una celda limpia agregar 1.35 ml de buffer fosfatos 0.05 M con 50 l de
Peróxido de hidrogeno y 100 l de p-fenilendiamina (10mg/ml)
2. Agregar 100 l del extracto crudo
3. Inmediatamente mezclarlo con ayuda de parafilm
4. Rápidamente colocarla en le espectro y medir el aumento en la absorbancia a 485
nm por 4 minutos.
5. Calcular la actividad de la peroxidasa con base en la pendiente de la proporción
lineal de la curva 485 nm contra el tiempo.
Cálculo: Absorbancia / mg proteína*min*ml.
Determinación de Proteína.
La cantidad de proteína de los extractos se determinará utilizando el método de Lowry.
Preparación del reactivo A y reactivo B.
 Para el reactivo A: se prepara mezclando 100 partes de Na2CO3 (2%) en NaOH
0.1M, una parte de CuSO4.5H2O (1%) y una parte de Tartrato de Na y K (2%).
 Para el reactivo B: Esta solución se prepara al momento de utilizarla. Reactivo
de Folin-Ciocalteu al 40% (v/v), se mantiene en agitación hasta el momento de
su uso.
1. Construir la curva patrón utilizando como estándar albúmina sérica bovina (ASB).
Para lo cual en tubos de ensaye se van colocar las cantidades de la solución de ASB
y agua destilada que se muestran en la tabla 1.
2. Agregar 1 ml del reactivo A, agitar en el vortex y dejar a temperatura ambiente
durante 10 min.
3. Posteriormente agregar 10 l del reactivo B, agitar en vortex y dejar a temperatura
ambiente 1 hora.
4. Realizar la lectura en espectro a 750 nm.
5. Registrar los resultados para cálculos posteriores.
Tabla 1. Preparación de tubos para la construcción de la curva patrón de proteína
Muestra
Solución de ASB ( l)
Agua destilada ( l)
Blanco
0
100
1
10
90
2
20
80
5
50
50
7
70
30
10
100
0
Muestra PROBLEMA
80
Alícuota 20 l
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Procesos Tecnológicos de Frutos y Vegetales
Calculo de proteína.
Los valores de concentración de proteína se determinarán por interpolación gráfica en la
curva patrón obtenida.
Partiendo de la ecuación de la recta
Proteína (mg/ml) = (Absorbancia – b) / pendiente * el factor de dilución.
Factor de dilución= V final / V inicial
Diagrama:
Muestras problema
Muestras
almacenadas
Muestras
congeladas
Hacer observaciones,
Apariencia (peso, color).
Tomar muestras
Pesar muestras
Preparación de los
extractos crudos
Determinación
actividad de
Polifenoloxidasa
Determinación
actividad de
Peroxidasa
Realizar cálculos
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Determinar
proteína
Procesos Tecnológicos de Frutos y Vegetales
Hoja de resultados.
Tabla de resultados de muestras almacenadas (Apariencia).
Condición de almacenamiento
Peso (g)
Color
Defectos
Observaciones
1
2
3
Tabla de peso de muestras para enzimas y proteína.
Num. De Muestra
1
2
3
4
5
6
Peso (g)
Gráfico de Curva patrón.
Tabla de resultados de actividad de Polifenol oxidasa y Peroxidasa.
Num. Muestra
Actividad Polifenol
oxidasa
Actividad de
Peroxidasa
Proteína
1
2
3
4
5
6
0.004
0.0035
420/mg.prot.*min.
0.004
0.0035
0.003
0.0025
0.002
0.0015
Abs
Abs
420/mg.prot.*min.
Gráfico de actividad de polifenol oxidasa.
0.001
0.0005
0.003
0.0025
0.002
0.0015
0.001
0.0005
0
0
preclimaterio
inicio climaterio
máximo climaterio
Estadios
S/envase
Bolsa
Caja PET
Condiciones de Alm acenam iento
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Procesos Tecnológicos de Frutos y Vegetales
Gráfico de actividad de peroxidasa.
CUESTIONARIO:
1) ¿Cómo actúan las polifenoloxidasa en los frutos y vegetales?
2) ¿Qué función fisiológica tienen estas enzimas en los productos vegetales?
3) ¿En qué productos vegetales se encuentran presentes estas enzimas más
frecuentemente?
4) ¿La actividad de estas enzimas cambia con la maduración? ¿Por qué?
5) ¿Qué sustratos para estas enzimas se encuentran presentes en su producto?
6) ¿La actividad de estas enzimas cambia con las condiciones de almacenamiento?
¿Por qué razón? Explique.
7) ¿Qué importancia tiene el conocer la actividad de polifenoloxidasa y peroxidasa
bajo diferentes condiciones de almacenamiento?
8) ¿Sería benéfico o contraproducente la inhibición de estas enzimas durante el
proceso de los productos vegetales?
9) ¿En qué casos es deseable la acción de estas enzimas y en que casos no lo es?
10) ¿Qué métodos crees que inhiben la acción de estas enzimas? Proponga una
metodología para inhibirlo para el caso de su producto.
11) ¿Por qué es importante la inhibición de estas enzimas en los procesos
industriales?
12) ¿Qué otras enzimas sería importante determinar en productos vegetales? ¿por
qué razón?
13) ¿Qué métodos para la determinación de actividad enzimática existen?
Descríbalos.
14) ¿Qué otros métodos para la determinación de proteína en productos vegetales
conoce? ¿Qué ventajas y desventajas tiene el método de Lowry contra otros
métodos utilizados para determinar proteína?
15) ¿Explique el principio del funcionamiento del espectrofotómetro?
16) ¿A qué se debe el aumento en la absorbancia durante la determinación de la
actividad de estas enzimas?
17) Investigue que tipo de compuestos se determinan en el intervalo del espectro de
420, 485 y 750 nm y si corresponde al intervalo utilizado para la determinación en
la práctica.
REPORTE POR EQUIPO:
Antecedentes: Breve Información relativa al producto con el cual se trabajo, fundamentos
de las técnicas utilizadas.
Resultados: Tablas que contengan los resultados obtenidos en cada determinación,
CÁLCULOS, análisis de estos y discusión con respecto a lo que se encuentra reportado en
la bibliografía.
Cuestionario.
Bibliografía consultada.
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Procesos Tecnológicos de Frutos y Vegetales
REFERENCIAS
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ripening and chilling stress in “Manila” mangoes, Journal of Horticultural Science &
Biotechnology, 78,1:104-107
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Procesos Tecnológicos de Frutos y Vegetales
Material elaborado como parte del proyecto PAPIME: “Elaboración de materiales educativos para
fortalecer la enseñanza en el taller multidisciplinario de ingeniería en alimentos-procesos
tecnológicos de frutas y hortaliza de la carrera de ingeniería en alimentos (PE 202610)”.
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