elaboración, determinación y estabilidad de queso fresco funcional

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Campus Irapuato-Salamanca
XII CONGRESO NACIONAL DE CIENCIA
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Jueves 27 y Viernes 28 de Mayo de 2010
Guanajuato, Gto.
ELABORACIÓN, DETERMINACIÓN Y ESTABILIDAD DE QUESO
FRESCO FUNCIONAL ADICIONADO CON ACIDO LINOLÉICO
CONJUGADO.
José Israel Castillo Rodrígueza, Graciela Garcia Diaza, Manuel López-Cabanillas Lomelíb,
Elizabeth Solís Pérezb y Blanca Edelia Gonzalez Martinezb
a
Facultad de Ciencias Biologicas, Universidad Autonoma de Nuevo León, San Nicolas de
los Garza, Nuevo León, México
b
Facultad de Salud Publica y Nutricion Universidad Autonoma de Nuevo León. Dr. Agurre
Pequeño y Yuriria S/N Mitras Centro. Monterrey Nuevo León México.
* [email protected]; [email protected]
El ácido linoléico conjugado (CLA), es una mezcla compleja de isómeros
posiciónales y geométricos del ácido linoléico en configuraciones cis y/o trans.
Estos compuestos son capaces de reducir la deposición de grasa corporal, los
triglicéridos, etc.
En algunos paises se han realizado investigaciones clínicas de CLA en humanos,
con resultados positivos en la actividad reductora de grasa corporal. Actualmente
en España se elaboran productos lacteos funcionales adicionados con CLA.
En este trabajo se estandarizó en HPLC (Cromatografia de Liquidos de Alta
Resolucion) la técnica para cuantificacion de los principales isómeros (09cis11trans y 10trans-12cis) con una columna 5 lipid con una fase móvil de hexano,
éter etílico y acetonitrilo.
Se elaboró un queso fresco de vaca con CLA al 3%, se cuantificó retención,
estabilidad durante la vida de anaquel y dos pruebas sensoriales.
Los resultados obtenidos fueron de un incremento promedio en los isomeros
10trans-12cis y 09cis-11trans de 521.37% y 211% con estabilidad de 80% y 25%
al final de la vida de anaquel respectivamente.
Los resultados organolépticos demostraron que el queso adicionado con CLA es
diferente al queso control y tiene mejor aceptación en sabor y textura.
ABSTRACT
Conjugated linoleic acid (CLA) is a complex mixture of positional and geometric
isomers of linoleic acid cis configurations and / or trans. These compounds are
able to reduce the deposition of body fat, triglycerides, etc.
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In some countries there have been clinical trials of CLA in humans, with positive
results in reducing activity of body fat. Currently in Spain functional dairy products
are made with added CLA.
This work was standardized in HPLC (High Performance Liquid Chromatography
Resolution) technique for quantification of the major isomers (09cis-11trans and
10trans-12cis) with a lipid column 5 with a mobile phase of hexane, ethyl ether and
acetonitrile.
Was prepared fresh cow cheese with 3% CLA was quantified retention, stability
during shelf life and two sensory tests.
The results were an average increase in the isomers 10trans-12cis and 09cis11trans of 521.37% and 211% with stable 80% and 25% at the end of shelf life,
respectively.
The sensory results showed that the cheese added with CLA is different from the
control cheese and has better flavor and texture acceptance.
PALABRAS CLAVE
Ácido linoléico conjugado (CLA), queso fresco, HPLC.
INTRODUCCIÓN
El ácido linoléico es un ácido graso esencial para el organismo humano, ya que no
puede sintetizarlo y tiene que ser ingerido por la dieta. Perteneciente al grupo
omega-6, es precursor de otros ácidos grasos como el acido araquidónico. Entre
sus funciones se encuentra la participación en la agregación de plaquetas y
vasoconstricción (Bean, 1999; Lamarche y Desroches 2004; Rodríguez y
Fontecha 2007).
El consumo del ácido linoléico a experimentado un gran auge en el mundo,
sobretodo en EUA, donde 1967 a 1997 aumentó de un 4 a un 7% de las calorías
totales su dieta, presentándose este fenómeno debido a sus cualidades de
disminuir el colesterol sanguíneo (Topol et al.1997)
El ácido linoléico conjugado (CLA por sus siglas en ingles), es una mezcla
compleja de isómeros posiciónales y geométricos en configuraciones cis y/o trans
frecuentemente encontrados en las posiciones 8 y 10, 9 y 11, 10 y 12, entre otros.
El CLA se encuentra en los aceites vegetales y en la grasa animal (Kramer et al.
2004; Rodríguez y Fontecha 2007).
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Es han descrito numerosos efectos beneficiosos del acido linoléico conjugado para
la salud, entre ellas las propiedades anti-ateroscleróticas y anti-bacterianas, así
como efectos favorables sobre el sistema inmune y el metabolismo lipídico
(Sébédio et al. 2003; Risérus et al. 2006).
El CLA es capaz de reducir la deposición de grasa corporal, contribuye en el
control de la diabetes tipo 2, reduce las lipoproteínas de alta intensidad (LDL o
colesterol “malo”) y los triglicéridos. En algunos países se han comprobado los
efectos beneficos en experimentos en humanos para la reducción de grasa
corporal, ademas de encontrar una actividad especial en la grasa abdominal y en
la talla de la cintura, así como la reducción del colesterol de alta densidad (HDL)
en adultos con problemas de obesidad, sin embargo, estos efectos son variables,
ya que no hay una concordancia en los resultados diferentes estudios debido a
que unos confirman y otros rechazan este efecto (Belury et al. 2003; Risérus et al.
2006).
El ácido linoléico conjugado ha sido aprobado consumo humano en Estados
Unidos por la FDA (Agencia de Alimentos y Medicamentos) y en Europa por el
Codex Alimentarius por lo que es considerado un suplemento seguro, incluso si se
suministra en la etapa de lactancia (Ritzenthaler et al. 2005).
Actualmente se pueden encontrar suplementos y alimentos adicionados con CLA
de diversos fuentes, desde la inclucion directa al alimento o alimentando a los
animales para que este presente desde su origen, estos productos son
unicamente lácteos (leche, yogurt, queso) debido a que naturalmente ya cuentan
con el, ademas, se ha demostrando que los productos gozan de aceptabilidad de
parte de los consumidores (Kramer, et al. 2004, Ritzenthaler et al. 2004. Khanal et
al. 2005, Rodríguez y Fontecha 2007).
En el caso específico de México, el CLA se encuentra disponible en la
presentación de suplementos alimenticios en forma de capsulas, pero no existe
ningún alimento funcional con el CLA, por lo que representa un campo en el
cuapo puede empezar a utilizarse el CLA ya que es considerado como un aditivo
seguro y beneficioso para la salud del consumidor.
METODOLOGIA
Se estandarizó la técnica con un HPLC Spectra Systems marca Thermo Electron
con estándares Nu-Check en 5 puntos por triplicado, usando una fase móvil
compuesta por hexano - éter etílico - acetonitrilo (97.5: 2.0: 0.5).
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El instrumento se acondicionó durante una hora minimo antes de su uso, en la
cual también incluyó la limpieza de la columna para obtener resultados
reproducibles y estables durante los estudios.
La especificación deseada en la curva de calibración consistío en que los picos de
cada isómero deben estar bien diferenciados uno del otro a tiempos específicos.
El software computacional empleado fue Chrom Quest, proporcionado por
Finnigan el cual lleva a cabo los cálculos de correlación entre los puntos de la
curva de calibracion para obtener cuan relacionados están entre si.
El desarrollo del queso fresco se realizó de la manera tradicional, usando leche
pasteurizada, renina liofilizada para la cuajada, drenado de suero, adicion de sal y
prensado para dar la forma típica del queso.La diferencia radicó en la adicion de
CLA para el queso fresco funcional en la leche antes de agregar la renina y la
ausencia de este en el queso control.
Una vez listo el queso fresco, se extrajeron las grasas por medio del método de
Folch de extracción en frió. El procedimiento comenzó por homogenizar la muestra
con la mezcla cloroformo - metanol, después se llevó a un volumen de dilución 20
veces peso/volumen (5.0g), se filtró con un papel Whatman de numero 1 y
después se pasó el filtrado a un embudo de separación o decantación, al término,
se agregó 0.2 veces peso/volumen de agua y se dejó reposar toda la noche para
la separación de las fases, se recuperó la fase clorofórmica inferior y se evaporó a
no más de 40°C para recuperar los lípidos de la muestra (1.0g).
Para la cuantificación del CLA, el extracto lipídico debe tener una base metilada, la
cual se fue preparada de acuerdo con el método oficial numero 969.33 de la
AOAC para aceites, grasas y ácidos grasos. (AOAC-UIPAC 1969, revisión 1997).
Esta técnica consistió en pesar 350mg. de la grasa extraída de la muestra,
después se disolvió en 5ml. de NaOH y se mezcló para después llevar a reflujo en
el condensador durante 15 minutos o hasta que los glóbulos de grasa quedaran
completamente eliminados, se le agregó 6 ml de BF3 y se dejó en ebullición
durante 2 minutos, al cumplirse este lapso se añadieron de 2 a 5ml. de heptano y
fue dejado nuevamente en ebullición durante 1 minuto más. Al término este tiempo
se dejó enfriando en el condensador durante 15 minutos más.
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Por CG (cromatografia de gases) se analizó el perfil completo de los ácidos grasos
de los quesos control y de los quesos adicionado con CLA. Se utilizó el FAME MIX
37 de Supelco USA como estándar de corrida detectándose 22 picos de diferentes
ácidos grasos. Los tiempos de corrida fueron de 40 min.
Los esteres metílicos de los isómeros de CLA fueron analizados para su
cuantificación por HPLC. Las condiciones para el estudio fueron similares a las
que usadas para los estándares, con la única diferencia que se usó la grasa
extraída y tratada de los quesos control y sus tratamientos con CLA en lugar de
los estándares.
La estabilidad de los isómeros de CLA se obtuvo mediante la comparación del
contenido de CLA en las muestras al inicio del estudio (día de elaboración) al final
de su vida de anaquel (21 días).
Las pruebas organolépticas llevadas a cabo fueron dos: la prueba triangular, con
el objetivo de verificar si realmente existe alguna diferencia significativa entre el
queso funcional contra el queso control, se emplearon a 10 jueces no entrenados
contestaran un formato de la prueba diseñado para este fin (Pedrero y Pangborn
1989; Sancho et al. 2002).
La segunda fue una comparación de pares, esta prueba consiste en compara los
quesos control contra el adicionado con CLA y dictaminar cual considera más
agradable al paladar, se emplearon 10 jueces no entrenados un formato de la
prueba diseñado para este fin (Pedrero y Pangborn 1989; Sancho et al. 2002).
Para el estudio de la estabilidad del producto, se tomo una muestra en el dia de
elaboracion y se dejó pasar 21 dias para comparar los resultados al inicio y al final
de la vida util del queso fresco.
Los datos de estabilidad fueron analizados para conocer si existen diferencias
significativas entre los controles y las muestras con CLA, para identificar si existen
diferencia significativa entre los valores iníciales y los finales de ambos quesos
mediante el análisis de varianza de Kruskal-Wallis y la prueba de normalidad de
los datos por Komulgoror-Smirnov. Los datos fueron analizados con el software
SPSS Ver. 17.0.
RESULTADOS
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Se estandarizó la técnica en con una correlación superior a 0.999 entre los puntos,
se obtuvo un tiempo de retención de de 8.5 minutos para el isómero 10trans-12cis
y 9.5 minutos para 09cis-11trans. Figuas 1 y 2.
Figura 1. Cromatograma del estándar 09cis-11trans con un tiempo de retención.
Figura 2. Cromatograma del estándar 10trans-12cis con un tiempo de retención.
Se obtuvo el queso fresco adicionado con CLA sin modificaciones al método
tradicional de elaboración, solo con la variación de la inclusión y homogenización
del acido graso antes de la coagulación de la leche. También se elaboró un queso
sin la adición de ácido linoléico conjugado para su uso como control sin cambios
en el aspecto visual. Figura 3.
Figura 3. Queso fresco adicionado con CLA.
El contenido de CLA en los quesos con la adición del mismo fue evidentemente
mayor que los controles en ambos isómeros, sin embargo el 10trans-12cis fue el
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que resulto con el mayor porcentaje de aumento significativo, reportando hasta un
538.98% con respecto a los controles, los cuales presentaron aproximadamente
0.400 µg por cada 5 µml del extracto lipídíco metilado. En la tabla 2 y 3 se
muestran los las medias con su desviación estándar de los quesos control y los
adicionados con CLA
Estos resultados nos muestran incremento significativo, los cuales esta dentro de
en un intervalo de 495 a un 539% extra contra el control para el isómero 10trans12cis.
El isómero 09cis-11trans se encontró en menor cantidad en las diferentes
muestras de queso, pero con un incremento significativo, y con un promedio de
211% de aumento con respecto a sus controles, además de mostrar una gran
variación en la retención de este isómero.
Al paso de los 21 días de almacenamiento se les determinó el contenido de CLA
que permaneció en el producto y obtener información sobre la estabilidad de
ambos isómeros. Se observó en las muestras de queso una pérdida de los
isómeros de ácido linoléico conjugado, especialmente del isómero 09cis-11trans,
del cual al final de la vida de anaquel solo se cuantificó el 25.36%, mientras que
del isómero 10trans-12cis en promedio se logró cuantificar un 77.22% con
respecto a su cantidad inicial. Esta disminución del contenido de los isómeros es
significativa estadísticamente.
Tabla 1. Contenido del isomero 10trans-12cis en las muestras de queso con CLA y
control al inicio y al final de la vida de anaquel.
Inicial
Final
Isómero
10trans-12cis
Control
N
9
Media
0.57µg + 0.13
n
11
Media
0.39 µg +0.09
CLA
21
1.99µg + 0.22
18
1.54µg +0.31
Tabla 2. Contenido del isomero 09cis-11trans en las muestras de queso con CLA
y control al inicio y al final de la vida de anaquel.
Isómero
09cis-11trans
Control
CLA
Inicial
n
Final
Media
n
Media
9
0.0006µg + 0.0007
11
0.0007µg + 0.0005
21
0.0043µg + 0.0036
18
0.0011µg + 0.0009
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Al analizar sensorialmente los quesos con la prueba triangular, el adicionado con
CLA con respecto a su control es percibido como diferente de manera significativa
de entre las dos muestras.
De las 40 pruebas, 27 fueron en las que fue diferenciadas las muestras que
contenían el CLA, mientras que 13 no lograron diferenciarla. Los jueces semientrenados participantes expresaron que las diferencias entre los dos quesos
principalmente radicaron en los atributos de sabor y la textura
Para la prueba de comparacion de pares, al confrontar los quesos para encontrar
cual de los dos era el preferido por los panelistas, el adicionado con CLA con
respecto a su control es nuevamente diferenciado de manera significativa de entre
las dos muestras.
De las pruebas, 27 fueron en las que se prefirieron las muestras que contenían el
CLA, mientras que en 13 se inclinaron por las del control.
Los jueces semi-entrenados participantes expresaron que las diferencias entre los
dos quesos principalmente radicaron al igual que en la prueba anterior, en el sabor
y la textura
CONCLUSIONES
Se consiguió estandarizar la técnica para cuantificación de CLA mediante la
extracción de grasa, metilación de los ácidos grasos y posteriormente la
separación y cuantificación de los isómeros del CLA por HPLC usando una
columna con ion plata y la fase móvil compuesta por hexano - éter etílico acetonitrilo en una proporción de (97.5: 2.0: 0.5)
Se logró la elaboración del queso fresco tipo panela y recuperación mayor al 90%
del ácido linoléico conjugado, siendo este producto de aspecto y colores típicos de
un queso panela.
El proceso de elaboración descrito permite la recuperación de un 96% de
eficiencia en la inclusión pero no igual para los isómeros presentándose una
desigual proporción de ellos, siendo el 10trans-12cis el significativamente más
abundante. Los dos isómeros fueron significativamente mayores en los
tratamientos según el análisis estadístico.
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La recuperación del CLA en el queso fresco tuvo una disminución significativa al
llegar a su fin la vida de anaquel del producto perdiendo poco más del 20% del
isómero mayoritario (10trans-12cis).
El análisis sensorial del queso con ácido linoléico conjugado demostró que no solo
es diferente comparado con el control, sino que también fue preferido al queso sin
CLA.
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