Avances de la Caracterización de electrodos de bajo costo

AVANCES EN LA CARACTERIZACIÓN DE ELECTRODOS DE BAJO COSTO
PARA LA DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO
[1]
Galván-Valencia M1, Durón-Torres S.M1.
Unidad Académica de Ciencias Químicas Km. 0.5 Carretera a Cd. Cuauhtémoc
Guadalupe, Zacatecas, México 98600. Tel 9231006; Fax 9276062. e-mai:l
[email protected]
Resumen
Dado que el ácido L-ascórbico (AA) es ampliamente usado como suplemento
dietético y aditivo de alimentos procesados y medicamentos, la regulación en el
contenido de AA en estos productos exige métodos más específicos y sensibles que
los colorimétricos. También a nivel clínico, el desarrollo de dispositivos de
diagnóstico rápido para monitorear los niveles de AA en fluidos corporales es de
gran importancia. La insuficiencia de AA genera deficiencias en funciones como la
reparación y crecimiento de tejidos, la absorción del hierro, síntesis de
neurotransmisores y la respuesta antioxidante durante episodios de estrés e
infecciones. Sin embargo, un exceso de ácido ascórbico acarrea trastornos como
irritación gástrica, diarrea y problemas renales. Las técnicas electroquímicas son
una opción adecuada para la detección y cuantificación de AA. En este trabajo
presentamos los avances en el desarrollo y caracterización de electrodos
electroquímicos para detectar la oxidación del AA. El electrodo fue construido con
grafito y demostró selectividad para la reacción de oxidación del AA en
medicamentos y jugos comerciales, además de sensibilidad en el rango milimolar.
De esta manera hemos demostrado que las técnicas de voltamperometría son
adecuadas para la determinación del AA en muestras con una composición
compleja. A partir de estos resultados preliminares, continuaremos optimizando la
actividad de los electrodos tanto usando otras formas de carbón y empleando
mediadores o aceleradores de la transferencia de electrones. Una de las
aplicaciones
más
electroquímicos
de
interesantes
sustancias
para
estos
bioactivas.
En
electrodos
particular,
son
el
los
estudios
desarrollo
de
1
bioelectrodos sensibles y específicos para detectar los niveles corporales de
neurotransmisores involucrados en procesos neurodegenerativos, es una de las
áreas de mayor crecimiento e interés en el campo de las ciencias biomédicas.
Palabras clave
Electroanálisis, ácido ascórbico, electrodos de grafito, voltamperometría cíclica.
1. Introducción
Actualmente, el uso generalizado del ácido L-ascórbico como suplemento
dietético, en alimentos procesados y medicamentos ha suscitado preocupación. El
exceso de ácido ascórbico (AA) puede causar irritación gástrica y diarrea, además
de que su metabolito, el ácido oxálico puede causar problemas renales
[1]
. La
cuantificación del contenido de ácido ascórbico en alimentos, suplementos y
medicamentos es uno de los principales parámetros de calidad que debe ser
controlado en estos productos.
La técnica a elegir para la determinación de una especie química en
particular, debe ser específica, reproducible, sensible, rápida, simple y económica.
Entre los métodos usados para la evaluación del ácido ascórbico (AA) son los
espectrofotométricos que se basan en el cambio de propiedades ópticas de un
reactivo al ser reducido por el AA [2]. Sin embargo estos carecen de especificidad y
son susceptibles a interferencia por otros agentes reductores presentes en la
muestra. Un método alternativo es la cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC)
[3]
, que permite eliminar interferencias previo a la detección, pero demanda
de mayor tiempo y costo. Los métodos electroquímicos como la voltamperometría
y amperometría permiten estudiar la reacción de oxidación del AA y en el caso de
la voltamperometría, la reacción se traduce en una señal de corriente eléctrica que
va cambiando conforme el potencial entre los electrodos de trabajo y de referencia
se va modificando externamente. Los registros o voltamperogramas (corriente vs
2
voltaje) que se obtienen proporcionan información de la cinética de transferencia
de electrones y de hecho la corriente de oxidación máxima es linealmente
proporcional a la concentración de AA en la muestra
[4]
.
Las dificultades con los métodos electroanalíticos radican en la construcción
de los sensores electroquímicos que detecten la oxidación del AA. Actualmente se
buscan materiales para la construcción del electrodo en si, pues este deberá
reconocer específicamente al analito, percibir el evento químico (oxidación) y
traducirlo en una señal eléctrica cuantificable [5]. El empleo de materiales para este
fin está restringido por la reproducibilidad, la estabilidad de la señal y obviamente
el costo. Por otro lado, frecuentemente ocurre contaminación de la superficie del
electrodo con productos de oxidación diferentes al ascorbato, lo cual altera los
resultados y hace necesaria la limpieza de la superfice
de la reacción es demasiado lenta
[6]
; y por último, la cinética
[7]
.
Actualmente se investigan diferentes estrategias que permitan superar estas
dificultades y dentro de estas, destaca la fabricación de electrodos baratos
construidos con diferentes formas de carbono como material de soporte
[6,8]
y el
uso de electrocatalizadores (mediadores de la transferencia de electrones)
inmovilizados en la superficie del electrodo o disueltos en el medio de reacción que
mejoren la actividad electroquímica de los electrodos
[9-12]
.
En el presente trabajo nos propusimos utilizar la técnica de voltametría
cíclica para detectar la reacción de oxidación del AA en medio acuoso, empleando
electrodos construidos a base de grafito. Los datos generados fueron procesados
para determinar el contenido de AA en diferentes sustratos como jugos y
medicamentos. A partir de los resultados obtenidos podemos concluir que la
técnica de voltamperometría cíclica resulta adecuada, simple y económica para la
detección y cuantificación de AA presente aun en matrices complejas. Por otro lado
el empleo del grafito como electrocatalizador de la transferencia de electrones para
3
la construcción del electrodo reduce los costos del sistema de electroanálsis del
AA.
2. Material y Métodos
2.1 Reactivos y Soluciones
Todos los reactivos utilizados fueron grado analítico; las soluciones y
muestras fueron preparadas con agua desionizada. Como electrolito soporte se
utilizó una solución saturada de cloruro de potasio (Sigma, Aldrich) y la solución de
referencia de ácido ascórbico se preparó diariamente (ácido L-ascórbico, Sigma,
Aldrich) a una concentración de 0.3 M acidificada con HNO3 3 M. Las formulaciones
farmacéuticas que se analizaron fueron Cevalin® (Eli Lilly y Compañía de México
S.A. de C.V.) y Ferranina Complex® (ALTANA Pharma, S.A de C.V.) y un néctar
comercial (Boing® S.A. de C.V.). Las muestras se prepararon diariamente a las
concentraciones requeridas. Previo a la medición, tanto las soluciones como las
muestras fueron desoxigenadas por burbujeo de nitrógeno. En general las
muestras a analizar no requirieron ningún procedimiento de purificación o
separación.
2.2 Electrodos y celda electroquímica
La celda electroquímica para las mediciones se mantuvo en un sistema de
agitación y a temperatura ambiente. La celda contenía a los tres electrodos: el
electrodo de trabajo, el cual fue construido con una punta de grafito de 0.5 mm de
diámetro, que se colocó dentro de una micropunta de plástico y se rellenó con
resina epóxica. Como contraelectrodo se utilizó una malla de platino y el electrodo
de referencia fue de calomel saturado (Hg / HgCl / KCl (sat)) cuyo potencial es de
0.244 V respecto al electrodo normal de hidrógeno (ENH). Durante los
experimentos los electrodos fueron sumergidos en la solución del electrolito
soporte y cantidades crecientes de la solución AA de referencia se fueron
adicionando como se describe más adelante. Al inicio de cada experimento, el
electrodo de trabajo se pulió con polvo de alúmina (0.05 µ de diámetro) sobre
4
papel-lija con un tamaño de grano de 600 C (Silicon Carbide) en una pulidora
rotatoria, para eliminar impurezas y dejar la superficie lo más homogénea posible.
2.3 Mediciones Voltamperométricas
Para las mediciones voltamperométricas se utilizó un potenciostato /
galvanostato 283-A (EG&G Instruments), desde el cual se controló el barrido de
potencial entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo. Al mismo
tiempo se midió la corriente eléctrica generada entre el electrodo de trabajo y el
contraelectrodo, debida al movimiento de cargas eléctricas en la interfase
electrodo-solución. El potenciostato conectado a una computadora se controló con
el programa del equipo y se utilizaron diferentes protocolos de medición.
Brevemente, los electrodos se colocaron en la celda con 80 ml del electrolito
soporte y el electrodo de trabajo fue ciclado entre –0.4 a 1.2 V de potencial a una
velocidad de 50 mV s1. hasta tener ciclos estables. Posteriormente se colocó la
muestra en la celda y se activó la superficie del electrodo aplicando dos pulsos de
potencial a 1.2 V durante 30 s para después cambiarlo a -0.4 V durante 30 seg. En
seguida,
el
voltaje
fue
barrido
desde
-0.4
a
1.2
V
obteniéndose
el
voltamperograma de barrido lineal a una velocidad de 30 mV s-1. A continuación se
realizaron de manera secuencial los siguientes pasos: adición cada vez de 200 µl
del estándar de AA 0.3 M, agitación durante 30 s, polarización del electrodo,
estabilización de la solución sin agitación y registro del voltamperograma a una
velocidad de 30 mV s-1.
2.4 Obtención y Análisis de Datos
El método utilizado para cuantificar el contenido de AA fue el de la adición
de un estándar, en el cual se asume que la señal medida es proporcional a la
concentración del analito y es recomendable en casos donde la matriz de la
muestra es compleja, es decir, existen en la muestra varios elementos diferentes al
analito
[4]
. En este método, cantidades conocidas del analito puro se van
adicionando a la muestra problema y el incremento en la señal se va registrando.
5
El incremento relativo en la señal permite inferir la cantidad original del analito en
la muestra problema. Para el procesamiento de los datos se utilizó la hoja de
cálculo y graficador Excel ®.
3. Resultados y Discusión
3.1 Fabricación del electrodo
Los electrodos de trabajo fueron construidos de forma que fueran fáciles de
manipular, compactos y mecánicamente resistentes, además de tener buena
actividad electroquímica y conductividad. En esta primera parte se decidió utilizar
al grafito como electrocatalizador por ser económico y fácil de conseguir en el
comercio como barras de diferentes diámetros. Las que se utilizaron fueron de un
diámetro de 0.5 mm. Para agregar resistencia mecánica, la barra de grafito se
colocó dentro de puntas de plástico y se fijó con resina epóxica. Esta resina es un
buen aislante eléctrico que no interfiere en el contacto del material catalítico con la
interfase electroquímica
[13]
.
3.2 Voltamperometría Ciclica
Un protocolo de voltamperometría cíclica se aplicó barriendo el potencial
entre -0.4 a 1.2 V a una velocidad de 50 mV s-1 con el objetivo de activar el
electrodo y detectar señales de oxidación o reducción diferentes a las generadas
por el analito (AA). En la Figura 1 se muestra el voltamperograma cíclico registrado
con el electrodo de grafito en una solución saturada de KCl contra el electrodo de
calomel saturado.
6
2.5
2
I / µA
1.5
1
0.5
0
-0.5
-1
-500
0
500
1000
1500
E / mV
Figura 1. Voltamperometría cíclica del electrodo de grafito en la
solución del electrolito soporte KCl saturado, contra un electrodo de
calomel saturado a una velocidad de 50 mV s-1
La presencia del electrolito soporte en el medio asegura la conductividad
eléctrica en la solución y elimina el problema de la contribución por migración a la
corriente total [14]. Sin embargo, es importante que no genere señales de oxidación
en el rango de potencial que se utilice. En el voltamperograma cíclico de la Figura
1, podemos observar que no hay señal de oxidación en la solución de KCl en el
rango de potencial establecido, es decir, no existe ninguna especie química en el
electrolito soporte que se oxide a esos potenciales. Si bien la presencia del
electrolito soporte no es indispensable en matrices complejas que contienen otros
electrolitos, éste podría contribuir disminuyendo el potencial para la oxidación del
AA a valores de potencial más cercanos a cero. Actualmente se realizan estudios
adicionales para estudiar este efecto.
7
3.3 Voltamperometría lineal
Los voltamperogramas de barrido lineal obtenidos para las muestras de
Ferranina®, y un jugo comercial se muestran en las Figuras 2 y 3. En la Figura 2
podemos observar la aparición de un pico de corriente a un potencial cercano a los
445 mV respecto al electrodo de calomel saturado, correspondiente a la oxidación
del AA
[12]
. Como es evidente en los voltamperogramas, no se aprecia ningún otro
pico, lo cual indica que en la muestra no existían otras especies oxidables en el
rango de potencial estudiado. Al ir agregando cantidades sucesivas del estándar de
AA, se observó un incremento progresivo en la corriente pico al mismo potencial
que en la muestra inicial, lo que confirmó que el pico observado correspondía a la
oxidación del AA. El pequeño desplazamiento de la corriente máxima en cada
voltamperograma se debió a la disminución del pH por el ácido nítrico incluido en
el estándar
[4]
. La coincidencia de la línea base con el cero de corriente antes de la
oxidación de AA, indica una mínima contribución de la matriz al proceso estudiado.
La cantidad máxima de estándar adicionado (1.2 ml) incrementó aproximadamente
tres veces la señal de corriente inicial, lo cual asegura un rango de valores
adecuado para el análisis estadístico de los resultados.
Por otra parte, en la Figura 3 podemos observar la contribución mayor que
tiene una matriz compleja como la del jugo, en el desplazamiento de la línea base
respecto del cero de corriente. A pesar de esto, es posible detectar la oxidación del
AA a un potencial similar al observado en la muestra de Ferranina®. Un pico
adicional se presentó a un potencial cercano a los 700 mV, debido a la oxidación
de una especie no identificada. Sin embargo, no interfiere con la resolución del
pico de oxidación del AA, pues se encuentra alejado aproximadamente 200 mV.
8
3.5
3
Muestra
+ 400
2.5
+ 200
I / µA
2
+ 200
+ 200
1.5
+ 200
1
0.5
0
-400
-200
0
200
-0.5
400
600
800
1000
1200
E / mV
Figura 2. Voltamperometría lineal de la oxidación del AA en una muestra
del complejo vitamínico Ferranina®. Se utilizó el electrodo de grafito
contra un electrodo de calomel saturado. La velocidad de barrido del
potencial fue de 30 mV s -1
I / µA
2.5
Muestra
2
+200
+200
1.5
+200
+200
1
+200
+400
0.5
0
-400
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
-0.5
E / mV
Figura 3. Voltamperometría lineal de la oxidación del AA en una muestra
de jugo. Se utilizó el electrodo de grafito contra un electrodo de calomel
saturado. La velocidad de barrido del potencial fue de 30 mV s-1
9
3.4 Cuantificación del AA
Para el análisis de los datos obtenidos en las Figuras 2 y 3 se utilizó la
ecuación de la adición de estándar
[4]
:
[ X ]i
I
= x
[ X ] f + [ S ] f Is + x
............ 1
En donde :
[X]i = concentración del AA originalmente en la muestra
[X]f = concentración final del AA en la mezcla
[S]f = concentración final del estándar
Puesto que al volumen inicial (V 0) se le adicionó un volumen de estándar
(V s) con una concentración [S]i ;
V = V0 + Vs
Entonces :
V 
[ X ] f = [ X ]i  0 
V 
V 
[S]f = [ S ]i  s 
V 
Sustituyendo y re-arreglando la ecuación 1:
V
I s+ x 
 V0

V 
Ix
[ S ]i  s  ................. 2
 = Ix +
[ X ]i

 V0 
Los gráficos de Is+x (V/V 0) (corriente corregida) versus la función [S]i(V s/V 0)
se presentan en las Figuras 4 y 5. La relación entre estas funciones se ajustó a una
línea recta, en donde el intercepto en el eje de las x representa la concentración
inicial en la muestra. A partir de los cálculos encontramos que la concentración de
AA en la Ferranina fue de 2.179 mM, mientras que en el jugo fue de 1.175 mM.
Para el caso de la Ferranina la concentración determinada experimentalmente
difiere en un 23% del reportado por el fabricante. Esta discrepancia podría
explicarse por la diferencia en los métodos analíticos empleados, ya que de
10
acuerdo a la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos el contenido de AA se
cuantifica por colorimetría
[15]
siendo este un método menos preciso.
3.5
Is+x (V/Vo) / µ A
3
2.5
2
1.5
y = 0.4736x + 1.0319
R2 = 0.9892
1
0.5
0
0
1
2
3
4
5
[S]i*(V s /V o) / mM
Figura 4. Análisis de regresión lineal para la cuantificación de AA
en una muestra del compuesto Ferranina
2
1.8
1.6
Is+x(V/Vo) / µ A
1.4
1.2
1
0.8
y = 0.284x + 0.3339
2
0.6
R = 0.9994
0.4
0.2
0
0
1
2
3
4
5
6
[S]i*(Vs/Vo) / mM
Figura 5. Análisis de regresión lineal para la cuantificación de AA
en una muestra de un jugo comercial.
11
4. Conclusiones y Perspectivas
Los electrodos de grafito descritos en este trabajo pueden ser utilizados
como sensores de bajo costo para la detección voltamperométrica del AA en
solución del electrolito KCl. La presencia del electrolito no parece ser indispensable
en muestras con una matriz compleja, pero pudiera disminuir el potencial al cual
se alcanza la corriente pico, aunque esto deberá de comprobarse con futuros
estudios. Este sistema presenta adecuada sensibilidad, selectividad y estabilidad
para la detección directa del AA en muestras en solución. Además resulta
conveniente debido al bajo costo y sencillez en la preparación del electrodo y de
las muestras, en la obtención de las curvas y el análisis de los datos.
Actualmente se llevan a cabo experimentos adicionales que nos permitan
validar la técnica de voltamperometría para aplicarla en la detección y
cuantificación del AA en muestras complejas, sin que represente un costo excesivo.
Además del interés para el control de calidad de productos adicionados con AA [10];
en el área clínica y de investigación básica, el electroanálisis representa una
herramienta valiosa para la detección y cuantificación de sustancias bioactivas[5,79,11]
. De esta manera optimizando las condiciones de actividad del electrodo e
incrementando su sensibilidad y específicidad, podrán ser empleados para el
electroanálisis de sustancias en muestras biológicas. Especialmente en sistemas
biológicos, el AA interfiere con la detección del neurotransmisor dopamina, pues
comparten
un
comportamiento
electroquímico
muy
similar,
pero
concentraciones de DA son considerablemente inferiores a las de AA
las
[16]
. La
dopamina se relaciona con enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson y
hasta el momento no existen métodos adecuados para su identificación y
cuantificación en sistema in vitro o in vivo
[17]
.
12
6. Referencias
[1] Levine M. New Concepts in the biology and biochemistry of ascorbic acid. N
England J Med 1986; 314:892-902.
[2] Kleszczewska E. FIA-spectrophotometric determination of ascorbic acid in rat’s
lung by reduction of iron(III). J trace Microprobe Techn 2003; 21:85-94
[3] Lykkesfeldt J. Determination of ascorbic acid and dehydroascorbic acid in
biological samples by high-performance liquid chromatography using substraction
methods: reliable reduction with tris[2-carboxyethy]phosphine hydrochloride. Anal
Biochem 2000; 282:89-93
[4] Harris Daniel C. Exploring Chemical Analysis. Chapter 16, Instrumental Methods
in Electrochemistry, 343-356. 2th edition; W.H. Freeman and Company, New York,
2001
[5] Gerard M, Chaubey A, Malhotra BD. Application of conducting polymers to
biosensors. A review Biosens Bioelectron 2002; 17:345-359
[6] Kiema GK, Aktay M, McDermott MT. Preparation of reproducible glassy carbon
electrodes by removal of polishing impurities. J Electroanal Chem 2003; 540:7-15
[7] Pournaghi-Azar MH, Ojani R. Catalytic oxidation of ascorbic acid by some
ferrocene derivative mediators at the glassy carbon electrode. Application to the
voltammetric resolution of ascorbic acid and dopamine in the same sample.
Talanta 1999; 42:1839-1848
[8] Sotiropoulou S, Gavalas V, Vamvakaki V, Chaniotakis NA. Novel carbon
materials in biosensor systems. Biosens Bioelectron 2003; 18:211-215
[9] Fernandes J C, Kubota LT, De Oliveira Neto G. Potentiometric biosensor for Lascorbic acid based on ascorbate oxidase of natural source immobilized on
ethylene-vinylacetate membrane. Anal Chim Acta 1999; 385:3-12
[10] Fatibello-Filho O, da C. Vieira I. L-ascorbic acid determination in
pharmaceutical formulations using a biosensor based on carbon paste modified
with crude extract of zucchini (Cucurbita pepo). J Braz Chem Soc 2000; 11:412418
13
[11] Pournaghi-Azar MH, Ojani R. Catalytic oxidation of ascorbic acid by some
ferrocene derivative mediators at the glassy carbon electrode. Application to the
voltammetric resolution of ascorbic acid and dopamine in the same sample.
Talanta 1999; 42:1839-1848
[12] Ensafi A. A. Determination of ascorbic acid by electrocatalytic voltammetry
with methylene blue. Anal Lett 2003; 36:591-604
[13] Durón-Torres Sergio M. Estudio electrocatalítico de compuestos obtenidos por
pirólisis del Ru3(CO)12 para la reducción de oxígeno en medio ácido. Tesis de
Doctorado; Departamento de Química, CINVESTAV; México, D.F. 1999
[14] Bard Allen J, Faulkner Larry R. Electrochemical Methods Fundamentals and
Applications. Chapter 4: Mass transfer by migration and diffusion, 119-135; 2th
edition, John Wiley and Sons, New York, 2000.
[15] Farmacopea de los E·stados Unidos Mexicanos, VII edición; México, D.F.,
2000.
[16] Yu AM, sun DM, Chen HY. Electrochemical determination of dopamine in the
presence of high concentrations of ascorbic acid at poly(indole-3-acetic acid)
coated electrode. Anal Lett 1997; 30:1643-1949
[17] Mo JW, Ogorevc B. Simultaneous measurement of dopamine and ascorbate at
their physiological levels using voltammetric microprobe based on overoxidized
poly(1,2-phenylenediamine)-coated carbon fiber. Anal Chem 2001; 73:1196-202
14