biologia molecular

La biología Molecular en
diagnóstico de
MICOBACTERIAS
Olga lucia ALZATE
bioMérieux Colombia
TUBERCULOSIS
8.6 millones de nuevos casos en 2012
1.3 millones de muertes
320.000 de casos asociados a VIH
500.000 casos MDR
50.000 casos XDR
Global repport WHO 2013
Lawn SD, Zumla AI. Lancet. 2011 Jul 2;378(9785):57-72.
ACCIONES PRIORITARIAS PARA 2015 -OMS
1. Llegar a los casos inadvertidos.
 Ampliación de los servicios en los sistemas de salud,
 Notificación obligatoria en más países, y mejor recopilación de
datos.
2. Abordar la TB-MR como una crisis de salud pública.
3. Acelerar la respuesta a la TB/VIH. Aumentar la cobertura TAR
en pacientes con TB VIH-positivos
4. Aumentar la financiación para eliminar todo déficit de recursos.
Se estima que en 2014 y 2015 serán necesarios US$ 70008000 millones anuales .
5. Garantizar la adopción rápida de innovaciones. La adopción
rápida de nuevas herramientas y estrategias para un mejor
diagnóstico, tratamiento y prevención de todas las formas de TB.
Plan Colombia libre de Tuberculosis
ACCIONES PRIORITARIAS PARA 2015
1. Llegar a los casos inadvertidos.
 Ampliación de los servicios en los sistemas de salud,
 Notificación obligatoria en más países, y mejor recopilación
de datos.
ACCIONES PRIORITARIAS: AMPLIACIÓN DE SERVICIOS
New Laboratory Diagnostic Tools for Tuberculosis Control. 20009
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Complejo Mycobacterium tuberculosis :
(M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum)
Bacilos Ácido alcohol resistentes (BAAR).
El M. tuberculosis es un bacilo aerobio estricto de 0.2 a 0.6
de ancho por 1 a 10 μ de largo, que se caracteriza por
Tener una pared celular gruesa, de alta complejidad y con
abundante cantidad de lípidos, lo que le da su principal
característica de ácido alcohol resistencia.
El M. tuberculosis es muy resistente al frío, a la congelación
y a la desecación, siendo además muy sensible al calor, la luz
solar y la luz ultravioleta.
Su velocidad de replicación es muy lenta (20 horas en
promedio) por lo que requiere alrededor de 2 a 4
semanas (en medios sólidos, como el de Löwenstein-Jensen)
para ser cultivado.
Pared celular
Velayati AA, y col. Chemotherapy. 2009;55(5):303-7
TUBERCULOSIS
BACILOSCOPIA
VENTAJAS:
Técnica sencilla
Bajo costo
Variaciones en:
 La muestra
 La técnica
Al profesional
Rápidos resultados
No requiere equipo especial
Amplia cobertura

JAMG-2006-INDRE/SSA5
COLORACION BAAR
(Bacilos ácido alcohol resistentes)
Sencillo- Confiable - Seguro
http://www.who.int/tb/publications/2011/led_microscopy_diagnosis_97
89241501613/en/
TBC RIESGO OCUPACIONAL
TINCIONES
DE ALTO RIESGO
“Ser verde”
Manejo de desechos
CULTIVOS
• En caso de que las dos baciloscopias iniciales sean negativas,
se deberá cultivar la segunda muestra de esputo.
• Todas las muestras de origen extrapulmonar.
• Para diagnóstico de TB infantil.
• Poblaciones de alto riesgo (personal de salud, población
indígena, personas privadas de la libertad, personas que viven
en la calle, pacientes inmunosuprimidos, entre otros).
CULTIVO SÓLIDO Y LIQUIDO
El cultivo complementa a la baciloscopia ya que permite poner en evidencia
bacilos viables presentes en escasa cantidad en una muestra de lesión.
METODO GOLD ESTANDAR: primedio 3 a 4 semanas
Cultivo liquido
BTA
Colorimetrico
MIGT_ Fluorescencia
Cultivo de muestras pulmonares
y extrapulmonares: Promedio de 9 a 14 días
Permitir identificar y realizar perfil de susceptibilidad
ACCIONES PRIORITARIAS PARA 2015
.
2.
Abordar la TB-MR como una crisis de salud pública.
Tuberculosis
multirresistente
MDR-TB
Tuberculosis
extensivamenteresistente
XDR-TB
• Tuberculosis causada por
cepas de Mycobacterium
tuberculosis que son
resistentes al menos a
isoniazida y rifampicina.
• Tuberculosis
multirresistente,
con
resistencia
a
fluoroquinolonas y al menos un
inyectable de segunda línea
(kanamicina, amikacina y/o
capreomicina)
Lawn SD, Zumla AI. Lancet. 2011 Jul 2;378(9785):57-72.
TUBERCULOSIS
Lawn SD, Zumla AI. Lancet. 2011 Jul 2;378(9785):57-72.
Estudios nacionales de vigilancia de la
resistencia de
M. tuberculosis a fármacos antituberculosos
Casos nuevos
n
Resistencia total
MDR-TB
Primer estudio 1992
829
14,1%
1,8%
Segundo estudio 1999 - 2000
1087
15,6%
1,5%
Tercer estudio 2004 – 2005
926
11,8%
2,4
n
Resistencia total
MDR-TB
Tercer estudio 2004 - 2005
264
44,3%
31,4%
Fracaso
60
50%
Abandono
110
25%
Recaída
72
19%
Casos previamente tratados
Archivo: LNR - INS
Georeferenciación de casos de tuberculosis
Multirresistente y Extensivamente resistente
según frecuencia. Colombia, 2001 – 2010
Fuente: Consolidado de casos MDR 2001 – 2010 LNR – INS
RESISTENCIA FENOTÍPICA VS
RESISTENCIA GENOTÍPICA
Fármaco
Gen
Sensibilidad
Especificidad
RIF
rpoB
97,1
93,6
INH
katG
inhA
katG e inhA
85,4
16,5
90,6
100
100
100
EMB
embB
78,6
93,1
MDR (RIF+INH)
rpoB y katG o
inhA
90,8
94,7
Campbell PJ, y col. Antimicrob Agents Chemother. 2011 May;55(5):2032-41.
Pobreza
B
Alcoholismo
A
C
Tabaquismo
MDR
Tratamientos
inadecuados
E
D
Cavidades pulmonares
Barroso, E. C., y col J Pneumol 2003 29: 350-357.
Barroso, E. C., y col J Pneumol 2003 89-97.
Resistencia
Smith PA, Romesberg FE.
Nat Chem Biol. 2007
Sep;3(9):549-56.
Resistencia
Smith PA, Romesberg FE.
Nat Chem Biol. 2007
Sep;3(9):549-56.
Smith PA, Romesberg FE.
Nat Chem Biol. 2007
Sep;3(9):549-56.
Sociomicrobiología
Parsek MR, Greenberg EP. Trends Microbiol. 2005 Jan;13(1):27-33.
Mutaciones
Actividad
Genes involucrados
en la resistencia
Isoniazida
Bactericida frente a los bacilos metabólicamente activos.
Bacteriostática en las demás poblaciones
katG (42–58%). Promotor
mabA-inhA (21–34%)
Rifampicina
Bactericida; bacilos metabólicamente activos. Actividad
en los latentes y con crecimiento intermitente
rpoB (96–98%)
Pirazinamida
Bactericida, bacilos en estado de latencia en el interior
de los macrófagos
pncA (72–97%)
Bactericida, bacilos metabólicamente activos
rpsL (52–89%);
Fármaco
Estreptomicina
rrs (8–21%)
Etambutol
Bacteriostático, bacilos metabólicamente activos
embCAB
(47–65%)
Zhang Y, Yew WW. Int J Tuberc Lung Dis. 2009 Nov;13(11):132030.
Hormesis
Davies J, Spiegelman GB, Yim G. Curr Opin Microbiol. 2006 Oct;9(5):44553
Drlica K, Zhao X. Clin Infect Dis.2007 Mar
1;44(5):681-8
PK/PD
Definiciones
•La farmacocinética estudia el curso temporal de las
concentraciones de los fármacos en el organismo y
construye modelos para interpretar estos datos y por
tanto para valorar o predecir la acción terapéutica o
tóxica de un fármaco.
Dosis- Concentración
•La farmacodinamia estudia los mecanismos de acción
de los fármacos y los efectos bioquímicos/fisiológicos
que estos producen en el organismo.
Concentración-Efecto
ACCIONES PRIORITARIAS PARA 2015 -OMS
. Aumentar la financiación para eliminar todo déficit de recursos. Se
estima que en 2014 y 2015 serán necesarios US$ 7000-8000
millones anuales .
5. Garantizar la adopción rápida de innovaciones. La adopción
rápida de nuevas herramientas y estrategias para un mejor
diagnóstico, tratamiento y prevención de todas las formas de TB.
PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES
Moore DA, Shah NS. J Infect Dis. 2011 Nov;204 Suppl 4:S1110-9.
ACCIONES PRIORITARIAS PARA 2015
5. Garantizar la adopción rápida de
innovaciones.
La adopción rápida de nuevas herramientas y
estrategias para un mejor diagnóstico,
tratamiento y prevención de todas las formas
de TB.
Avances en el diagnóstico rápido de tuberculosis y de la resistencia a los fármacos
antituberculosos
RED NACIONAL DE LABORATORIOS
LNR
PSF -EED
BK – ZN
O–K
ADA
Proporciones L J
Bactec MGIT 960 ® MGIT TBc Nitrato Reductasa
GeneXpert ®
Genotype ®
LSP
D x – PSF - EED
BK – ZN
O–K
ADA
Laboratorios Nivel III
-IV
BK – ZN
O–K
ADA
Proporciones L J
Bactec MGIT 960 ®
Laboratorios Nivel
Il
Laboratorios Nivel l
BK – ZN
MGIT TBc
O–K
Nitrato Reductasa
MGIT TBc Nitrato Reductasa
GeneXpert ®
GeneXpert ®
Genotype ®
Genotype ®
ACCIONES PRIORITARIAS PARA 2015
5. Garantizar la adopción rápida de innovaciones.
La adopción rápida de nuevas herramientas y
estrategias para un mejor diagnóstico,
tratamiento y prevención de todas las formas de
TB.
DETECCION Y VIGILANCIA DE LA RESISTENCIA
DNA•STRIP® TECHNOLOGY
POLIMORFISMOS GENÉTICOS
GenoType”
polimorfismo de la estructura genética de la micobacteria.
Un factor importante es el uso de PCR para alcanzar el máximo de sensibilidad.
DNA•Strip® technology
Principio
Punto de inicio:
Aislamiento del ácido Nucleico
El método DNA•STRIP® requiere
amplificación selectiva del
acido nucleico aislado
DNA•Strip® technology
Hibridación:
El DNA/RNA es amplificado en la
matriz DNA•STRIP® donde se
localizan sondas específicas de DNA
La reacción de Hibridación permite
el desarrollo de bandas visibles sobre
la tira (DNA•STRIP® matrix)
Principio
DNA•Strip® technology
Interpetación de resultados
Se realiza
comparando el
perfil de bandas
desarrolladas en
la tira DNA•Strip®
con una
evaluación del
amplificado.
DNA•Strip® technology
Interpretación de resultados
Los resultados son validados por 3
controles:
Control del conjugado: para
asegurar la eficiencia en la reacción de
color
Control amplificación: para asegurar la
implementación del método

Control de sensibilidad: Verificar una
sensibilidad optima en la reacción de
hibiridación
RIFAMPICINA REGIÓN DE RESISTENCIA RPOB GENE
rpoB WT2
rpoB WT1
505
508 509
rpoB WT3
511
rpoB WT4
rpoB WT5
513 514 515 516
518
rpoB WT6
rpoB WT7
522
rpoB MUT1 (D516V)
526
rpoB WT8
531
533
rpoB MUT2B (H526D)
rpoB MUT3 (S531L)
rpoB-Wildtype-probes: WT 1 to WT 8
rpoB-Mutation-probes: MUT D516V, H526Y, H526D, S531L
Detección demutaciones por la perdida de la señal del wildtype
Detección demutaciones porla presencia de laseñal de la mutación
Gen que codifica sub unidad B de la RNA polimerasa
Cada tira tiene 27 sitios de reacción
Controles
Conjugate Control (CC)
Amplification Control (AC)
M. tuberculosis complex (TUB)
rpoB Locus Control
rpoB wild type probe 1 (rpoB WT1)
rpoB wild type probe 2 (rpoB WT2)
rpoB wild type probe 3 (rpoB WT3)
rpoB wild type probe 4 (rpoB WT4)
rpoB wild type probe 5 (rpoB WT5)
rpoB wild type probe 6 (rpoB WT6)
rpoB wild type probe 7 (rpoB WT7)
rpoB wild type probe 8 (rpoB WT8)
rpoB mutation probe 1 (rpoB MUT1)
rpoB mutation probe 2A (rpoB MUT2A)
rpoB mutation probe 2B (rpoB MUT2B)
rpoB mutation probe 3 (rpoB MUT3)
katG Locus Control
katG wild type probe (katG WT)
katG mutation probe 1 (katG MUT1)
katG mutation probe 2 (katG MUT2)
inhA Locus Control
inhA wild type probe 1 (inhA WT1)
inhA wild type probe 2 (inhA WT2)
inhA mutation probe 1 (inhA MUT1)
inhA mutation probe 2 (inhA MUT2)
inhA mutation probe 3A (inhA MUT3A)
inhA mutation probe 3B (inhA MUT3B)
colored mar ker
Identificaciónn
banda para
M.tb complex
Resistencia a
Rifampicina
Resistenica a
isoniazida
GENOTYPE®MTBDR

GenoType MTBDRplus
PLUS
MTBC y su resistencia a Rifampicina y/o Isoniazida
PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES
FLQ: 90.6%
AMK: 84.8%
CAM: 86.7%
EMB: 69.2%
Hillemann D, Rusch-Gerdes S, Richter E. J Clin Microbiol. 2009 Jun;47(6):1767-72.
PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES
PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES
PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES
Falkinham JO, 3rd. Clin Chest Med. 2002 Sep;23(3):529-51.
PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES
Pitombo MB, Lupi O, Duarte RS. Rev Bras Ginecol Obstet. 2009 Nov;31(11):529-33.
PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES
Lee AS, Jelfs P, Sintchenko V, Gilbert GL. J Med Microbiol. 2009 Jul;58(Pt 7):900-4.
GenoType Mycobacterium CM
Differentiation between 14 common atypical mycobacterial species and MTBC
AB
GenoType Mycobacterium AS
Differentiation between 16 additional atypical mycobacterial species
Gracias
[email protected]