Secuenciación del ADN por medio de nanoporos en grafeno

Secuenciación del ADN por
medio de nanoporos en
grafeno
Marcelo Bustelo y Pedro Martin Granovsky Moroni
Docente: Alicia Liliana Calendino
C.E.M N°98 “Quimeln Niyeu”
Las Grutas, Río Negro
Introducción
Los avances en el campo de la ciencia y la tecnología, han permitido estudiar y experimentar cada vez con
sustancias más pequeñas hasta el punto de manipular moléculas y átomos. A la rama de la tecnología que
trabaja con esta escala (1nm = 10 -9 m) se la llama nanotecnología. Para dar un ejemplo, una cadena doble de
ADN esta dentro de esta escala, midiendo de 2,2 nm a 2,6 nm de diámetro. A este nivel las propiedades de la
materia cambian, se presentan fenómenos y propiedades nuevas. Esto permite crear materiales con propiedades únicas. Uno de estos nanomateriales es el grafeno, al que se lo puede utilizar para secuenciar el ADN de
cualquier especie, de lo cual hablaremos en esta monografía. Además, trataremos sobre la situación en nuestro
país sobre este tema, sus aplicaciones y los dilemas éticos a los cuales nos lleva este avance en el campo de la
nanotecnología.
En particular nos interesó investigar acerca de este tema por las características únicas del grafeno como nanomaterial, ya que éste es un elemento accesible, y es muy apropiado para secuenciar el ADN, debido a que
es más rápido y económico que otros métodos actuales. Para abordar este tema específico, primero desarrollaremos conceptos básicos, tales como el carbono, el grafeno y el ADN y luego nos avocaremos a explicar la
secuenciación de ADN a través de nanoporos en grafeno.
1. Carbono
Se estima que el Carbono es uno de los elementos químicos más abundantes en el Planeta Tierra, junto al
Hidrogeno, el Oxígeno y el Silicio. El mismo tiene increíbles propiedades, como la de combinarse consigo
mismo formando cadenas y ciclos carbonados. El Carbono presenta diferentes formas alotrópicas. Según su
hibridización, algunas de ellas son el diamante (hibridización sp3) o el grafito (hibridización sp2). El grafito
está compuesto de muchas capas de grafeno.
2. Grafeno
El grafeno es una lámina de un átomo de carbono de grosor (0,34 nm). El origen de la palabra procede de
grafito: del griego γράφειν graphein, “dibujar/escribir” (por su uso en lápices) + terminación eno.
El enlace químico y su estructura fue calculada como una “estructura límite del grafito” en el año 1949 por
Phillip Russel Wallace. Hasta el año 1994 se lo conocía como “monocapa de grafito”, sin embargo en este
año se lo nombro oficialmente como grafeno. El impulso definitivo se produjo, cuando Andréy Gueim y el
que fuera su alumno de doctorado, Konstantín Novosiólov, de la Universidad de Manchester, en el año 2004,
aislaron las primeras muestras de grafeno a partir de grafito mediante un proceso de exfoliación mecánica. El
proceso fue muy simple y consistió en la exfoliación de láminas de grafito mediante el uso de una cinta adhesiva reiteradas veces. Por este descubrimiento ellos recibieron el Premio Nobel de Física 2010.
El grafeno está compuesto por átomos de carbono entramados hexagonalmente. La longitud del enlace Carbono-Carbono es de 0,142 nm. Los Carbonos se unen mediante enlaces covalentes formados a partir de la
superposición de los orbitales híbridos sp2. Cada uno de estos carbonos tiene 4 electrones de valencia. Tres
de esos electrones se alojan en híbridos sp2 formando los enlaces covalentes simples (σ) de la estructura, y
el electrón sobrante estará en el orbital atómico p puro, de forma perpendicular al plano de los híbridos. El
solapamiento lateral de estos orbitales p originará los orbitales π, generando un gigantesco orbital molecular
deslocalizado. Debido a esta deslocalización de los electrones π por sobre y debajo del plano de los átomos de
carbono, se explica la alta conductividad eléctrica.
El grafeno perfecto está constituido exclusivamente de celdas hexagonales, aunque en presencia de impurezas
pueden presentarse celdas pentagonales o heptagonales que podrían modificar las propiedades del mismo. Se
observa que existen interacciones entre las distintas capas de anillos hexagonales densamente empaquetados,
formando una red cristalina.
2.1 Propiedades
Entre las más destacadas propiedades del grafeno, se incluyen las de la impermeabilidad, conductividad eléctrica, dureza, flexibilidad, auto regeneración, resistencia, menor efecto Joule, transparencia y alta densidad.
Nos interiorizaremos en este trabajo en la conductividad eléctrica. Los electrones móviles que se trasladan
sobre el grafeno se comportan como cuasi-partículas eléctricas sin masa, llamadas fermiones. Estos fermiones
se mueven a velocidad constante, de manera independiente de su energía, como ocurre con los fotones, a una
velocidad de 106 m/s. Además, el grafeno presenta el efecto Hall Cuántico mediante el cual la corriente toma
valores discretos o cuantizados. Por lo tanto, la conductividad del grafeno nunca puede ser 0. Los electrones
pueden moverse libremente por toda la lámina de grafeno, y nunca quedar aislados en una zona. Este es el
efecto llamado “localización de Anderson”.
2.2. Obtención
Para obtener el grafeno se han empleado diferentes técnicas. Las podemos dividir en “Bottom Up”, cuando se
obtiene la estructura de grafeno a partir de átomos de carbono generados mediante descomposición de moléculas orgánicas; y “Top Down”, cuando se obtiene grafeno de un espesor nanométrico a partir de un material de
espesor micrométrico.
Una de las técnicas Bottom Up es la de deposición química en fase vapor (CVD) y la otra es la de descomposición térmica de obleas de SiC en ultra alto vacío.
En cuanto a las técnicas Top Down, se destacan la exfoliación química y la mecánica.
3. ADN
La sigla ADN significa Acido Desoxirribonucleico. Es el componente químico primario de los cromosomas
y el material por el cual los genes están formados. El papel del ADN es guardar la información genética y entregarla intacta a la nueva generación. Además, el ADN contiene las “instrucciones” necesarias para construir
otros componentes de las células como las proteínas o las moléculas de ARN.
En el año 1869 el médico suizo Friederich Miescher descubrió los ácidos nucleicos, los llamó nucleina. Phoebus Levene en el año 1930 identificó que un nucleótido está formado por una base nitrogenada, un azúcar y un
fosfato. El y su maestro Albrecht Kossel comprobaron que la nucleina es ácido desoxirribonucleico (ADN),
formado por cuatro bases nitrogenadas: Adenina, Timina, Citosina y Guanina, el azúcar desoxirribosa y un
grupo fosfato. No fue hasta el año 1953 cuando James Watson y Francis Crick descubrieron la estructura de
doble hélice del ADN. Esto dejaba claro que el ADN se podía “desenrollar” para que fuese posible su lectura
o copia.
Una hebra de ácido nucleico está compuesta por una base nitrogenada, un ácido fosfórico (de fórmula química
H3PO4) y una pentosa (de fórmula química C5H10O4), que están unidas mediante enlaces covalentes.
Cada base nitrogenada está siempre unida a su complementaria de la otra hebra: Adenina-Timina y GuaninaCitosina. La unión entre Adenina y Timina es por puente Hidrogeno doble mientras que la unión entre la Citosina y Guanina es por puente Hidrogeno triple. Cuando se realizan estas uniones, la hebra se enrolla alrededor de otra hebra complementaria formando un par entrelazado. Así las bases de cada cadena se encuentran
hacia el interior de la hélice y la desoxirribosa-P forma el esqueleto exterior.
Imagen 2. Estructura química del ADN. http//es.wikipedia.org/wiki/Ácido Desoxirribonucleico
El diámetro de la doble cadena de ADN es de 2,2 nm a 2,6 nm. Un nucleótido, una unidad de ADN, mide 0,33
nm de largo. Una hélice de ADN mide 3,4 nm de paso de rosca y 2,37 nm de diámetro.
4. Secuenciación de ADN
Se llama secuenciación de ADN al conjunto de métodos y técnicas, cuya finalidad es la determinación del
orden de los nucleótidos Adenina (A), Timina (T), Citosina (C) y Guanina (G) en una cadena de ADN de
cualquier especie.
Existen distintas técnicas que se han aplicado para la secuenciación del ADN. Entre las más destacadas están
las de Maxam-Gilbert, el Método de Sanger y la Pirosecuenciación.
Las aplicaciones que se le pueden dar a la secuenciación del ADN son variadas y abarcan un campo
muy amplio. Desde el punto de vista científico ayudaría a resolver cuestiones básicas del conocimiento
de la estructura y la fisiología celular; aplicándolo al campo social ayudaría a la identificación inequívoca de personas, con fines policiales o legales; en el campo de la salud prevendría y diagnosticaría enfermedades genéticas; y con respecto a la eugenesia, se podría modificar la información genética
para intentar obtener individuos con características determinadas.
Los conocimientos sobre la manipulación del genoma humano avanzan a un ritmo acelerado y por esto se
ha visto la necesidad de legislar en este sentido. Por ejemplo, la UNESCO, hizo una declaración sobre la
protección del genoma humano; que determina que no hay que dejar de tener en cuenta la reflexión sobre las
consecuencias de estas investigaciones y la imposición de límites para proteger la individualidad e intimidad
de las personas.
Desde el año 1995 se estudia la posibilidad de secuenciar el ADN por medio de nanoporos en distintos
materiales como silicona o grafeno.
Actualmente se está intentando crear dispositivos portátiles capaces de secuenciar todo el genoma en
15 minutos, con un valor de 1000 dólares; aunque esto aún se esté investigando y todavía no pueda
ser comercializado.
4.1. Secuenciación de ADN por nanoporos en grafeno
Se ha reconocido recientemente que los nanoporos en estado sólido en membranas de grafeno de un solo
átomo de espesor pueden ser usados para detectar electrónicamente cada una de las bases que componen al
ADN. Las ventajas potenciales del uso de nanoporos en grafeno incluyen la alta sensibilidad y una resolución
a escala nanométrica a lo largo del polímero que puede ser secuenciado a través del nanoporo.
Un grupo de investigadores de la Universidad de Harvard en EEUU, integrado por Jene Golovchenko y Daniel Branton, entre otros, se han dedicado a investigar desde el año 1996 la secuenciación del ADN por medio
de nanoporos en diversos materiales.
Desde el aislamiento del grafeno en el año 2004, se ha experimentado con este material, ya que tiene excelentes condiciones químicas y físicas que reemplazarían a otros materiales experimentados por este grupo
anteriormente. El último trabajo de este grupo de investigadores trata de la secuenciación del ADN por nanoporos usando como material al grafeno. El mismo fue lanzado en mayo del año 2013, “Molecule-hugging
graphene nanopores” y es en el cual nos basaremos en la presente monografía.
4.2. Materiales y métodos
La membrana de grafeno se obtuvo por medio de deposición química en fase vapor (CVD) en un papel de
cobre y luego fue transferida sobre un film de Nitruro de Silicio (SiN) de 200 nm x 200 nm, colocado sobre
un marco de silicona.
A esta membrana de grafeno se le realizó un nanoporo en su centro por medio de un microscopio electrónico
llamado “JEOL 2010F EM”, operando a 200 kV, el cual hizo pasar electrones a través de la membrana de
grafeno. Los nanoporos son orificios creados artificialmente a escala nanométrica, en un material, en este caso,
grafeno. El diámetro del nanoporo obtenido en la membrana de grafeno varía entre 3 nm y 7 nm.
Por encima y por debajo de la membrana de grafeno se colocaron dos cámaras que fueron llenadas con solución de Cloruro de Potasio (KCl) 3M, a pH 10, cada una con su respectivo electrodo de Ag/AgCl. Cada cámara
fue cargada eléctricamente, generándose una corriente iónica en la solución. La carga aplicada a la solución
fue de 160mV ya que el grafeno mantiene estables sus propiedades químicas y físicas en estas condiciones
eléctricas. Esto se comprobó cuando a las membranas de grafeno se les aplicó una carga de 500 mV, en donde
las mismas perdieron una gradual resistencia eléctrica que podría afectar resultados posteriores. Así, el único
camino a través del cual los iones podrían trasladarse de un electrodo al otro es mediante el nanoporo. Esta
solución salina genera una conductividad eléctrica de 27,5 S/m. Estas 3 condiciones óptimas no permitirían
la posible adsorción entre el ADN y la superficie del grafeno.
Aquí se muestra la base de silicona, el marco de SiN,
la membrana de grafeno, el nanoporo, el ADN siendo
secuenciado, los electrodos de Ag/AgCl, la fuente
con la carga aplicada y el medidor de bloqueos de
corriente iónica (indicado con A). En la imagen no se
muestran las cámaras con solución de KCl, las cuales
están en contacto con los dos electrodos.
Imagen 3. Método de secuenciación de ADN
“Molecule-hugging nanopores in graphene”.
El proceso de secuenciación consiste en el paso del ADN cargado electroforéticamente a través del nanoporo.
A medida que este polímero atraviesa el nanoporo, surgen bloqueos de corriente iónica de diferentes magnitudes dependiendo cuál sea la base que en ese momento esté pasando por el nanoporo (A, C, T, G). Así, el registro de las diferentes magnitudes de bloqueo permite saber el orden de las bases que componen la molécula
del ADN secuenciado.
Además de las pruebas con nanoporos en grafeno, se experimentó con nanoporos en SiN y esto demostró que
el grafeno es un nanomaterial óptimo para este proceso, ya que en él las magnitudes de bloqueo, al pasar las
bases de ADN por el nanoporo, son más pronunciadas que en otros materiales.
En la imagen 4, las membranas de SiN con las que se ha experimentado están representadas por las líneas de
color violeta, azul y negra, de 5 nm, 10 nm y 30 nm de espesor, respectivamente.
Imagen 4. “Molecule-hugging nanopores in graphene”. Mayo 2013
Esta imagen muestra resultados experimentales en donde se muestra la variación de la corriente iónica ΔI en
nano amperes (nA) según el diámetro D del nanoporo (nm).
De esta forma se comprueba que mientras menor sea el diámetro del nanoporo, más marcada será la variación
de corriente iónica generada por el bloqueo.
Además de que el nanoporo en grafeno tiene que ser del menor diámetro posible para generar una mejor resolución en las variaciones de corriente, el ADN muestra mejores resultados siendo de doble hélice (ADN-hd)
respecto al ADN simple (ADN-hs), obteniéndose un pico de corriente más pronunciado. Esto lo muestra la
imagen 5.
Imagen 5. “Molecule-hugging nanopores in graphene”. Mayo 2013.
En esta imagen se comparan los eventos de secuenciación de ADN de doble hélice (azul) y simple hélice
(negro). Se puede notar la diferencia en cuanto a la variación de corriente iónica producida por los bloqueos,
que al ser ADN de doble hélice los picos son más marcados. Además de esto, se puede concluir que el tiempo
(micro s) que tarda la secuenciación de la muestra de ADN de doble hélice es mucho menor al tiempo que
tarda la muestra de hélice simple. Esta variación de tiempo se debe a las interacciones entre los electrones π
del grafeno y las bases nitrogenadas del ADN de hélice simple (Interacciones de van der Walls).
Los eventos de secuenciación se realizaron con fragmentos de ADN extraídos del virus bacteriófago λ
(Lambda). Cada fragmento de λ-ADN posee 10.000 pares de bases, lo que representa aproximadamente 3.400
nanómetros de largo.
5. Secuenciación en Argentina
En nuestro país también se realizan experiencias de secuenciación de ADN desde hace aproximadamente 10
años. Un grupo de investigadores formó una empresa llamada “Fullgen” en donde científicos de diferentes
ramas de las ciencias (Biología, Química, Física, Electrónica, etc) investigan y analizan el ADN. Uno de estos
temas en los que se interiorizan es en la secuenciación de ADN por nanoporos. Estos proyectos están respaldados en diversos sentidos por instituciones, tales como el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas
y Técnicas (CONICET), la Universidad Tecnológica Nacional (UTN), la Universidad Nacional del Litoral
(UNL), la Universidad de Buenos Aires (UBA), el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) y el
Instituto de Investigaciones Científicas y Técnicas para la Defensa (CITIDEF).
Las condiciones, en general, del método de secuenciación de ADN en Argentina -comparándolo con el de
EEUU experimentado en Harvard-, son similares; manteniendo el mismo diámetro del nanoporo en la mayoría
de los casos (3 nm de diámetro), y el mismo pH alto de valor 10. Sin embargo, en Argentina la membrana en
donde se ubica el nanoporo no es de grafeno si no que es de Silicio.
La idea de este proyecto es secuenciar el ADN a bajo costo y hacerlo rutinario, teniendo en cuenta que actualmente el costo de la secuenciación del genoma humano cuesta de 10.000 dólares a 30.000 dólares aproximadamente, tardando uno o dos días el proceso. Sin embargo, con estos nuevos métodos con nanoporos se estima
que se podría llegar a secuenciar el genoma en una o dos horas y a un costo no mayor de 1.000 dólares. Actualmente montar un equipo de secuenciación de ADN, que no funciona con el método de nanoporos, cuesta
alrededor de 1.500.000 dólares, siendo éste un presupuesto muy elevado. El método de secuenciación por
nanoporos en cambio, promete bajar los costos de la infraestructura a menos de 300.000 dólares, incluyendo
así a un sector de la sociedad el cual hoy en día le es imposible realizar este examen de ADN.
Conclusión
Los avances en el campo de la biología molecular han permitido ampliar enormemente los conocimientos
sobre las enfermedades genéticas, hereditarias o adquiridas, de las que hasta hace algunos años apenas teníamos nociones limitadas, y en la actualidad pueden ser definidas con gran precisión desde el punto de vista
molecular.
Creemos que la secuenciación del ADN se justifica cuando se la utiliza para diagnosticar y clasificar enfermedades de origen genético, siempre considerando los decretos de la UNESCO de protección del genoma y los
derechos de las personas. Para nosotros no es así cuando a estos exámenes se los usa con fines eugenésicos,
como el de idear o modificar personas con características determinadas.
De acuerdo a lo desarrollado en esta monografía, podemos decir que la secuenciación de ADN a través de
nanoporos en grafeno proporciona óptimos resultados y en menor tiempo que con otros métodos, aunque esta
técnica todavía esté en investigación.
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http://www.enciclopedia.us.es/
Agradecimientos
Agradecemos a toda la gente que hizo posible la realización de este trabajo directa o indirectamente, ayudando con buena predisposición y entusiasmo. A Sebastián Ardenghi, investigador del CONICET especializado
en grafeno; Maximiliano Pérez, Doctor en Biología Molecular y Biotecnología; Alicia Calendino, Profesora
de Química; Cecilia Gutiérrez, Profesora de Idioma Extranjero; Luciana Hidalgo, Profesora de Literatura;
Ángel Malvido, Profesor de Historia; Mauro Aguilera, Profesor de Física y Carolina Ardenghi, Profesora
de Historia. Queremos agradecer también el apoyo emocional por parte de nuestras familias, compañeros y
amigos.