Caracterización de la actividad miométrica del intestino de

Comunicación Científica -
CIVA 2006 (http://www.civa2006.org), 249-258
Caracterización de la actividad miométrica del intestino de
Carassius auratus para el estudio del efecto in vitro de la
melatonina en la motilidad gastrointestinal
Elena Velarde, Angel L Alonso-Gómez, Nuria de Pedro, Clara Azpeleta,
Laura Ortiz, María J Delgado
Dpto. de Fisiología (Fisiología Animal II), Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad
Complutense de Madrid (España)
Resumen
Summary
Con el presente estudio se pretende investigar las
posibles acciones de la melatonina (N-acetil-5metoxitriptamina, MEL) en la funcionalidad del tracto
gastrointestinal en peces, y concretamente sobre la
motilidad intestinal del carpín (Carassius auratus). Para
ello hemos utilizado un modelo in vitro de intestino
aislado en un baño de órganos acoplado a un
transductor isométrico, que permite medir los cambios
de tensión generados por el músculo liso de la pared
intestinal por efecto de distintos agentes, y utilizando
como referencia el intestino de otro vertebrado
acuático, el anfibio anuro, Xenopus laevis. En primer
lugar registramos la actividad miógena espontánea,
encontrando un perfil rítmico basal diferente en cada
especie, siendo los ciclos del carpín más frecuentes y
de menor amplitud que los mostrados por el intestino
de Xenopus. A continuación, se han realizado curvas
dosis-respuesta con un agente parasimpaticomimético,
la acetilcolina (ACh) que induce en ambos casos una
respuesta contráctil inmediata y dependiente de la
concentración de ACh. Por último, estudiamos el efecto
de la adición de MEL al baño de órganos tras inducir la
contracción del segmento intestinal del carpín con ACh
(10 µM), observando un efecto relajante y dependiente
de la concentración de MEL. Este efecto relajante es
bloqueado por la preincubación con luzindol,
antagonista general de los receptores de MEL.
Nuestros resultados demuestran por primera vez en los
peces un efecto directo y específico de la MEL sobre la
motilidad intestinal, y constatan la idoneidad del
método para profundizar en los mecanismos de acción
de la MEL en el intestino del carpín.
Characterization of the gut miometric activity from
Carassius auratus for the in vitro study of the
effect of melatonin on the intestinal motility
The present study starts a research line on the
possible
effects
of
melatonin
(N-acetyl-5methoxytryptamine, MEL) on gut function in fish, and
in particular on the intestinal motility of goldfish
(Carassius auratus). We used an in vitro model of
isolated intestine in an organ bath engaged to an
isometric transducer. This model allows the recording
of changes in tension produced in the gut smooth
muscle by the addition of different drugs. We used the
intestine of another aquatic vertebrate, the anuran
amphibian Xenopus laevis as a reference model.
First, we recorded the spontaneous activity, and we
found a different basal rhythmic profile for each
species, cycles have higher frequency and lower
amplitude in goldfish than in Xenopus. Second, we
made concentration-response curves with the
parasympathetic drug acetylcholine (ACh), which
induces an immediate concentration-dependent
contraction in both species. Finally, we studied the
effect of MEL addition to the organ bath after inducing
the intestine contraction with 10 µM Ach. We
observed a relaxing and concentration-dependent
effect on the ACh-induced contraction. This relaxing
effect is blocked by the preincubation with luzindole, a
MEL receptors antagonist. These results reveal for
the first time a direct and specific effect of MEL on fish
gut motility, and demonstrate the suitability of the
method for studying the effects of this indoleamine on
the gastrointestinal physiology of goldfish.
Introducción
La melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina, MEL) ha sido considerada clásicamente como
una señal neuroendocrina producida por estructuras fotosensoriales, la glándula pineal y la
retina e implicada en el sistema circadiano de los organismos (1). Sin embargo, desde
1975, en que se detectó MEL por inmunohistoquímica en células enterocromafines de la
mucosa digestiva (2), varios estudios han sugerido la posible síntesis de MEL en el tracto
gastrointestinal de los mamíferos (3), aunque se desconocen los mecanismos de síntesis y
liberación de dicha MEL de origen gastrointestinal.
La presencia de MEL en el tracto gastrointestinal podría estar revelando una relación
funcional entre la indolamina y el sistema digestivo. De hecho, se han descrito algunos
efectos de la MEL relacionados con aspectos fisiológicos y patológicos gastrointestinales (4,
5), pero en la actualidad se desconocen los mecanismos que subyacen a estas acciones,
pudiendo tratarse de efectos específicos mediados por receptores (6, 7) o bien deberse a
acciones inespecíficas derivadas de sus estructura indólica (8).
IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura
249
En los peces se ha detectado MEL por radioinmunoensayo en el tracto gastrointestinal de
varias especies (Acipenser fulvescens, Oncorhynchus mykiss y Cyprinus carpio) (9).
Además, en el carpín, se ha sugerido que la MEL de origen gastrointestinal podría contribuir
de forma significativa a la MEL circulante diurna (10). En la actualidad no existen estudios
previos sobre el posible papel de la MEL en la funcionalidad del sistema gastrointestinal en
los peces, y sin embargo se ha demostrado un papel regulador de esta indolamina en la
ingestión de alimento (11, 12) y en la regulación del peso corporal (13) en varias especies
de teleósteos. Hasta la fecha se desconoce el mecanismo por el que la MEL ejerce dicha
acción anoréxica en los peces.
Con el presente estudio se inicia una vía de investigación de las posibles acciones de la
MEL sobre la funcionalidad del tracto gastrointestinal en peces, y más concretamente sobre
la motilidad intestinal del carpín. Para ello hemos utilizado un modelo in vitro de intestino
aislado en un baño de órganos acoplado a un transductor isométrico. Este sistema,
anteriormente utilizado para estudiar acciones de la MEL sobre el músculo liso vascular de
rata (14, 15), permite medir los cambios de tensión generados por el músculo liso de la
pared intestinal inducidos por distintos agentes.
Para la puesta a punto de este método en el carpín, utilizamos como referencia el intestino de
otro vertebrado acuático, el anfibio anuro, Xenopus laevis, que muestra condiciones generales
de cultivo en baño de órganos similares a las de la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) (16).
En primer lugar se caracterizó la viabilidad del sistema a partir del registro de la actividad
miógena espontánea mostrada en ambas especies, Xenopus y carpín. A continuación, se
realizaron las curvas concentración-respuesta con un agente parasimpaticomimético, la
acetilcolina (ACh). Por último, y únicamente en el carpín, se ha estudiado el efecto de distintas
dosis de MEL sobre la contracción intestinal inducida por la ACh, y la reversión de dicho efecto
con luzindol, antagonista general de los receptores de MEL.
Material y métodos
Animales
Ejemplares de carpín (Carassius auratus, 50-60 g, peso corporal) obtenidos de un
proveedor comercial, se mantuvieron en acuarios de 60 l con agua continuamente filtrada y
aireada, a una temperatura de 22 ± 1ºC, fotoperiodo 12L:12D, y alimentación diaria (1% del
peso corporal) con una dieta comercial (Sera Biogran). Los ejemplares de Xenopus laevis
(30-40 g, peso corporal) se mantuvieron en acuarios de 10 l a una temperatura de 22 ± 1ºC,
fotoperiodo 12L:12D y alimentación a base de hígado de pollo dos veces por semana.
Preparaciones intestinales
Los animales fueron sacrificados por decapitación y el intestino completo fue rápidamente
extraído y limpiado para eliminar los restos de grasa perivisceral y de comida intraluminal.
El intestino de carpín se deposita inmediatamente en una placa Petri inmerso en solución
Ringer para peces a 25ºC, conteniendo: NaCl 140 mM, KCl 2.5 mM, CaCl2 1.5 mM,
MgSO4•7H2O 0.8 mM, NaHCO3 15.0 mM, KH2PO4 1.0 mM, Hepes 5.0 mM, glucosa
10.0 mM, a pH 7.8-8.0. El intestino de Xenopus se depositó en una placa con medio MKRS
(McKenzie’s Ringer’s solution) a 25ºC conteniendo: NaCl 115 mM, KCl 4.6 mM, NaHCO3
20 mM, MgSO4•7H2O 1.4 mM, CaCl2 1.71 mM, Hepes 5.5 mM y glucosa 16.7 mM y pH 7.8-8.0.
Segmentos intestinales longitudinales de 10 mm de longitud obtenidos de la región más
proximal al estómago fueron introducidos en cámaras de un baño de órganos a 25ºC
conteniendo 10 ml del medio correspondiente (Ringer o MKRS) y burbujeadas de forma
continua con una mezcla de O2 (95%) y CO2 (5%).
IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura
250
Cada segmento intestinal se coloca en sentido longitudinal, con un extremo sujeto a un
soporte fijo de metacrilato y el otro unido a un elemento móvil conectado al transductor. La
tensión basal óptima fue fijada para ambas especies en 10 mN (1 g), y las preparaciones se
dejan estabilizar durante una hora antes de aplicarles los distintos agentes. Las pérdidas de
tensión durante este tiempo de estabilización se corrigen de forma inmediata hasta alcanzar
de nuevo y de forma estable los 10 mN.
Diseños experimentales
Registro de la actividad miógena espontánea
El registro de la actividad miógena espontánea se realizó siempre tras una hora de
estabilización de la preparación intestinal y una vez comprobado que la preparación no
pierde tensión. Una vez estabilizado el sistema, y durante el tiempo de registro de la
actividad miógena espontánea, prefijado en 5 min, el medio del baño no se renueva.
Los cambios de fuerza en la preparación se miden utilizando transductores isométricos
(LCM systems, Ltd.) y a través de un amplificador (Cibertec) se registran y visualizan
mediante un PC utilizando el software de adquisición de datos (ADQ2C, Micronec). La
actividad miógena espontánea se evaluó midiendo la amplitud y la frecuencia de las
contracciones espontáneas. La amplitud de las contracciones se expresa en mN y la
frecuencia se expresa en ciclos por minuto
Estimulación de la contracción intestinal con acetilcolina
Se utilizó un intervalo de concentraciones finales de acetilcolina (ACh, Sigma) entre 1 nM
y 10 mM, preparadas a partir de una solución madre de ACh 100 mM en agua destilada.
Transcurrida la hora de estabilización se añade 1 ml de la concentración correspondiente
de acetilcolina (en orden creciente) a las cámaras conteniendo 9 ml de medio, y se
registró la actividad contráctil durante 5 min.
Tras finalizar cada registro, se renovó el medio de las cámaras 3 veces y se permite que el
segmento intestinal se reestabilice durante 15 min antes de añadir la siguiente
concentración de acetilcolina. Las contracciones inducidas por la ACh se expresan en mN.
Efecto de la melatonina en la respuesta contráctil inducida por acetilcolina
La MEL (Sigma) se disolvió en etanol y se diluyó en agua destilada hasta obtener una
solución madre de 1 mM (conteniendo menos del 0.5% de etanol), a partir de la cual se
prepararon las sucesivas diluciones hasta conseguir un intervalo de concentraciones
finales de MEL entre 10 pM y 100 μM. Transcurrida la hora de estabilización, el intestino
se estimuló añadiendo 1 ml de ACh 10 μM a 9 ml de medio.
A los 20 s de alcanzar la contracción máxima se añade 1 ml de la concentración
correspondiente de MEL (en orden creciente). Al finalizar cada registro, el medio de las
cámaras se renovó 3 veces y se permite que el tejido se reestabilice durante 15 min antes
de añadir la siguiente concentración de MEL.
Efecto del luzindol en la relajación inducida por melatonina
El luzindol (Tocris) se disolvió en etanol y se diluyó en agua destilada hasta obtener una
solución madre de 1 mM (conteniendo menos del 0.5% de etanol), a partir de la cual se
prepararon las sucesivas diluciones hasta conseguir un intervalo de concentraciones
finales del antagonista entre 10 pM y 100 μM.
Los segmentos intestinales se preincubaron durante 10 min en presencia de las distintas
concentraciones de luzindol, tras lo cual se estimula la respuesta contráctil con 1 ml de
IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura
251
ACh (10 µM), y a los 20 s de alcanzar la contracción máxima se añadió 1 ml de MEL
(1 nM). Se estableció un tiempo de registro de 5 min, y una vez finalizado se renovó el
medio de las cámaras 3 veces, permitiendo que el tejido se reestabilice durante 15 min
antes de ensayar la siguiente concentración de luzindol.
Resultados
Los registros de la actividad miógena espontánea de segmentos intestinales de X. laevis (A)
y de C. auratus (B) tras 1 hora de estabilización se presentan en la Figura 1. En primer
lugar hay que indicar que la preparación intestinal del carpín muestra durante el periodo de
estabilización previo una pérdida de tono muscular más prolongada que la de Xenopus,
alargando su tiempo de estabilización. Esta diferencia puede deberse a la distinta densidad
de tejido muscular, sensiblemente inferior en el carpín.
Figura 1
Perfiles tipo de la actividad miógena espontánea de segmentos intestinales
longitudinales de Carassius auratus (a) y de Xenopus laevis (b). Aparece representada
la escala temporal (en min) y cada contracción espontánea se mide en términos de
fuerza (se representan 4 mN).
a)
b)
En la Tabla I se indica la longitud total del intestino en ambas especies, que es
notablemente superior (aproximadamente 5 veces) en el carpín respecto del Xenopus y se
resumen los parámetros que caracterizan la actividad miógena espontánea para ambas
especies. Como puede observarse (Fig. 1, Tabla I) el ritmo de actividad espontánea en el
carpín muestra una frecuencia significativamente superior y una amplitud significativamente
inferior que en el Xenopus.
Tabla I
Caracterización de la actividad miógena espontánea de segmentos
intestinales de C. auratus y X. laevis.
Longitud total
intestino (cm)
Frecuencia
(ciclos/min)
Amplitud (mM)
C. auratus
27.4 ± 3.2
5.44 ± 0.12**
2.78 ± 0.32**
X. laevis
5.7 ± 1.2
1.56 ± 0.13
9.35 ± 0.49
** p<0.001.
La adición de ACh al baño de órganos induce una contracción intestinal inmediata y
pronunciada, con una amplitud directamente proporcional a la dosis de ACh aplicada. En la
Figura 2 representamos dicha respuesta contráctil expresada en porcentaje respecto a la
contracción máxima alcanzada en cada una de las dos especies estudiadas.
IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura
252
Figura 2
Curvas concentración-respuesta del efecto contráctil producido por
la acetilcolina en segmentos intestinales de Carassius auratus y
Xenopus laevis en baño de órganos.
Contracción (%)
100
80
60
40
C. auratus
20
X. laevis
0
10 -9
10-8
10-7
10-6
10-5
10-4
10-3
10-2
Acetilcolina (M)
Se considera 100% a la contracción máxima obtenida para cada especie (véase la
Tabla II). El resto de los valores se representa en porcentajes respecto a dicha
contracción máxima. Los datos se expresan como media ± SEM.
Se puede observar que el intestino de Xenopus responde a concentraciones ligeramente
inferiores de ACh (10-9 frente a 10-8 M), alcanzando su contracción máxima a dosis más
bajas (10-4 frente a 10-2 M). Los valores absolutos de las contracciones máximas
alcanzadas (Tabla II) son similares en ambas especies.
Tabla II
Contracciones máximas inducidas por acetilcolina en
segmentos intestinales de C. auratus y X. laevis.
Acetilcolina
10
-9
Contracción máxima (mM)
C. auratus
X. laevis
-
1.01 ± 0.18
10-8
1.49 ± 0.37
4.78 ± 0.62
10
-7
2.94 ± 0.60
12.75 ± 1.28
10
-6
7.65 ± 0.64
16.09 ± 0.92
10
-5
26.82± 1.96
23.04 ± 2.02
10
-4
26.68 ± 0.75
27.97 ± 2.05
10
-3
32.18 ± 0.34
27.54 ± 1.45
10
-2
29.67 ± 2.11
-
En la Figura 3a se muestra un registro tipo de la respuesta a la adición de MEL mostrada
por un segmento intestinal de carpín previamente contraído con ACh. Puede observarse un
efecto relajante inmediato tras la adición de la indolamina. Los resultados obtenidos con las
distintas concentraciones de MEL empleadas (10 pM-100 μM) se pueden observar en la
Figura 3b, en la que se ha representado el porcentaje de relajación producido por la MEL
respecto a la contracción inducida por una concentración predeterminada de ACh (10-5 M).
IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura
253
La relajación es observable a partir de una concentración de MEL de 10-12 M, e incrementa
de forma progresiva hasta 10-10 M, a partir de la cual el efecto relajante no aumenta y se
mantiene en torno al 16%.
Figura 3
a) Perfil tipo del efecto de la adición de MEL (10 µM) a una preparación intestinal de Carassius auratus
previamente contraído con ACh (10 µM), en el que se observa la relajación inmediata producida por la
indolamina. b) Curva concentración-respuesta del efecto de la MEL sobre segmentos intestinales de
Carassius auratus en baño de órganos previamente contraídos con ACh (10 µM).
20
Relajación (%)
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
a
10-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4
Melatonina (M)
b
La relajación se expresa en porcentaje respecto a la contracción inducida por la ACh. Los datos se presentan como media ±
SEM (n = 6/concentración de MEL ensayada).
La adición de luzindol al baño de órganos no tiene ningún efecto por si misma sobre la
actividad miógena espontánea de los segmentos intestinales de carpín (datos no
mostrados). Sin embargo, la preincubación con distintas concentraciones del antagonista
produce un bloqueo concentración-dependiente de la relajación inducida por MEL
(Figura 4). Dicha reversión por luzindol del efecto relajante de la MEL llega a alcanzar
valores del 80% de reducción a partir de concentraciones de 10-6 M.
Figura 4
Efecto de distintas concentraciones de luzindol, en porcentaje, sobre
la relajación inducida por MEL, considerando 100% a la relajación
máxima que produce la MEL (1 nM) en ausencia de luzindol.
100
Relajación (%)
80
60
40
20
0
0
10-11 10-10 10-9
10-8
10-7
10-6
10-5
Luzindol (M)
Los datos se presentan como media ± SEM (n=6/concentración de luzindol ensayada).
IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura
254
Discusión
En el presente estudio se pone de manifiesto la viabilidad de un sistema de baño de
órganos para la caracterización de la motilidad intestinal del carpín dorado (Carassius
auratus), en comparación con la mostrada por Xenopus laevis, y su respuesta a
reguladores, como la ACh y la MEL. En primer lugar, nuestros resultados demuestran la
existencia de una actividad miógena espontánea en segmentos intestinales longitudinales
de ambas especies, hecho que no había sido investigado con anterioridad en el carpín.
La actividad espontánea hallada en el intestino del carpín, respecto a la hallada en
Xenopus, muestra alta frecuencia y baja amplitud, confirmando un estudio anterior en esta
misma especie (16). En los peces, el único estudio previo, realizado en la trucha, no pone
de manifiesto dicha actividad miógena espontánea de segmentos intestinales (16). Puesto
que la existencia de un tono miógeno basal parece ser una característica general del
intestino de los vertebrados, consideramos que esta falta de actividad espontánea en la
trucha puede atribuirse a dificultades metodológicas. Las diferencias en frecuencia y
amplitud del ritmo espontáneo entre especies se justifican en base a las bien conocidas
diferencias en las características morfofuncionales del intestino, derivadas principalmente
de su adaptación a distintos patrones de alimentación entre especies (17).
La motilidad intestinal in vivo, que asegura un tránsito y aprovechamiento adecuados del
alimento digerido, es resultado del funcionamiento simultáneo de varios mecanismos
reguladores de la contracción del músculo liso intestinal, incluyendo tanto la inervación
intrínseca y extrínseca, como las acciones de los mediadores endocrinos liberados
localmente (17). En nuestro estudio hemos ensayado la acción de un agonista
parasimpático, la ACh, como agente inductor de contractilidad intestinal, encontrando en
ambas especies, y de acuerdo con lo esperado, un efecto contráctil dependiente de
concentración.
El intestino de Xenopus parece mostrar una sensibilidad a la ACh ligeramente superior a la
del carpín, respondiendo a dosis más bajas del parasimpaticomimético, si bien la
contracción máxima alcanzada por el intestino en este sistema es muy similar en ambas
especies. Por tanto, nuestros resultados nos llevan a proponer a este protocolo de
contracción intestinal inducida por ACh en baño de órganos como modelo válido para
reproducir in vitro el aumento de motilidad intestinal por descarga vagal in vivo, y sobre el
que investigar efectos de otros posibles agentes reguladores de la motilidad.
Precisamente en este sentido, nuestros resultados demuestran, por primera vez en los
peces, que la MEL puede modificar la motilidad intestinal, produciendo relajación inmediata,
pero parcial, de la preparación intestinal estimulada con ACh. En estudios previos
realizados en la rata se ha descrito que la MEL reduce el tono y la amplitud de las
contracciones espontáneas de segmentos aislados de ileon, pero sin obtener efectos
dependientes de la concentración (18), por lo que los autores proponen que puede tratarse
de un efecto inespecífico, posiblemente mediado por receptores de serotonina.
Estudios posteriores, también en la rata, han sugerido que la MEL, especialmente durante
la noche, puede actuar como un regulador local, disminuyendo el tono muscular y
produciendo cambios de motilidad en músculo liso intestinal (19). Nuestros resultados de
concentración-respuesta a MEL sugieren que estamos ante un efecto que puede ser
fisiológico en los peces (se produce a concentraciones fisiológicas de la indolamina).
Para poder confirmar esta hipótesis se requeriría demostrar la existencia de receptores
específicos para MEL en el intestino. Sin embargo, en la actualidad numerosos estudios
han descrito una amplia distribución de sitios de unión de MEL en el encéfalo de varias
especies de teleósteos (20, 21), pero apenas se ha investigado la posible localización
periférica de receptores de MEL en los peces (22, 23). Por el contrario, varios estudios han
IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura
255
propuesto la existencia de sitios de unión de MEL en el tracto gastrointestinal de diversas
especies de aves y mamíferos (6, 7, 24, 25).
En el carpín, la reversión por luzindol (potente antagonista competitivo de receptores de
MEL) del efecto relajante de la indolamina, apoya la especificidad de este efecto de la MEL,
reforzando la presencia de receptores funcionales de MEL en el intestino.
En estudios realizados con sistemas de baño de órganos similares al utilizado en el
presente trabajo se ha propuesto un papel de la MEL en la contractilidad del músculo liso
vascular. Sin embargo, los resultados respecto al efecto de la MEL sobre la contractilidad
del músculo liso vascular en la rata son muy variados, así se han propuesto efectos
relajantes, contráctiles e incluso potenciadores de la contracción inducida por estimulación
adrenérgica (15, 26).
Posiblemente, como han sugerido Doblen et al. (15), los efectos contráctiles de la MEL en
el músculo liso vascular puedan estar mediados por distinto tipo de receptor. La relajación
parece estar mediada por receptores de tipo MT2, que son los más abundantes en el
intestino de la rata (25) y cuya activación inhibe el incremento de calcio intracelular,
mientras que la potenciación de la vasoconstricción estaría mediada a través de otro
subtipo de receptor (posiblemente MT1) (15).
Situaciones similares, es decir, distintas respuestas dependientes del tipo de receptor, son
frecuentes para otros ligandos endógenos de los organismos. El desarrollo de agonistas y
antagonistas selectivos para los distintos subtipos de receptores de MEL resulta esencial para
dilucidar el papel de estos subtipos de receptores en la modulación del tono muscular por MEL.
Es bien conocido que la contracción de las células del músculo liso requiere un incremento
en la concentración de calcio intracelular (bien por entrada desde el exterior celular a través
de canales de membrana, o bien por liberación de los almacenes intracelulares). En la
trucha se ha descrito que la activación colinérgica del músculo liso intestinal depende
principalmente de la movilización externa de calcio (27).
Teniendo en cuenta que en nuestro estudio estamos observando una acción relajante de la
MEL sobre una contracción colinérgica, resulta atractivo proponer que los efectos de la MEL
en el intestino del carpín pueden estar implicando un bloqueo de canales de calcio
dependientes de voltaje, como se ha sugerido en su acción sobre la pared vascular de la
rata (28) o por inhibición de la calmodulina, como recientemente se ha propuesto para el
músculo esquelético de la rata (29).
No obstante otras posibilidades también pueden ser contempladas, por ejemplo a través de
la activación de receptores de GABA, y posterior reducción del calcio, como se ha
propuesto en varios modelos tisulares (retina, techo óptico) de Xenopus (29). Obviamente,
se requiere realizar estudios adicionales para poder dilucidar estas distintas opciones.
Finalmente, indicar que nuestros resultados sobre el efecto de la MEL en la motilidad
intestinal del carpín, amplían la información disponible sobre las posibles funciones de esta
indolamina en la regulación de la alimentación en los peces. En la inhibición del apetito
producida por MEL en el carpín (11, 12) puede estar implicada una menor motilidad
gastrointestinal (presentes resultados), que si llegan a producir un retraso del vaciamiento
intestinal originarían una señal periférica de saciedad, reforzando de este modo el papel
anorexigénico de esta hormona en este teleósteo.
En conclusión, nuestro estudio pone de manifiesto la idoneidad del método empleado para
el análisis de la regulación local de la motilidad gastrointestinal en los peces, y demuestra
por primera vez en este grupo de vertebrados que la MEL produce relajación de la
contracción intestinal a dosis fisiológicas, sugiriendo la existencia de receptores específicos
para dicha indolamina en el intestino del carpín.
IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura
256
Agradecimientos
Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Educación y Ciencia (AGL2004-08137-C0401), E. Velarde es beneficiaria de una beca predoctoral del MEC asociada a dicho proyecto.
Referencias
1. FALCON J. Cellular circadian clocks in the
pineal. Prog. Neurobiol. 1999; 58:21-62
2. RAIKLIN NT, KVETNOY IM, TOLKACHEV VN.
Melatonin may be synthesized in
enterochromaffin cells. Nature 1975;
255:344-5
3. BUBENIK GA, HACKER RR, BROWN GM,
BAROS L. Melatonin concentrations in the
luminal fluid, mucosa and muscularis of
the bovine and porcine gastrointestinal
tract. J. Pineal Res. 1999; 26:56-63
4. MOTILVA V, CABEZA J, ALARCÓN DE LA
LASTRA C. New issues about melatonin
and its effects on the digestive system.
Current Pharmacological Design 2001;
7(10):909-31
5. BUBENIK GA. Gastrointestinal melatonin:
localization,
function
and
clinical
relevance. Dig. Dis. Sci. 2002; 47:2336-48
6. LEE PPN, PANG SF. Melatonin and its
receptors in the gastrointestinal tract. Biol.
Signals. 1993; 12:181-93
7. POON AMS, CHOW PH, MAK ASY, PANG
SF. Autoradiographic localization of
2[125I]iodomelatonin binding sites in the
gastrointestinal tract of mammals including
humans and birds. J. Pineal Res. 1997;
23:5-14
8. MAILLIET F, FERRY G, VELLA F, BERGER S,
COGÉ
F,
CHOMARAT
P
ET
AL.
Characterization of the melatoninergic
MT3 binding site on the NRH: quinone
oxidoreductase 2 enzyme. Biochem.
Pharmacol. 2005; 71:74-88
9. BUBENIK GA, PANG SF. Melatonin levels in
the gastrointestinal tissues of fish,
amphibians, and a reptile. Gen. comp.
Endocrinol. 1997;106:415-9
10. KEZUKA H, IIGO M, FURUKAWA K, AIDA K,
HANYU I.
Effects
of
photoperiod,
pinealectomy and ophthalmectomy on
circulating melatonin rhythms in the
goldfish, Carassius auratus. Zool. Sci.
1992; 9:1047-53
IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura
11. PINILLOS ML, DE PEDRO N, ALONSO-GÓMEZ
AL, ALONSO-BEDATE M, DELGADO MJ. Food
intake inhibition by melatonin in goldfish
(Carassius auratus). Physiol. Behav. 2001;
72:629-34.
12. LÓPEZ-OLMEDA JF, MADRID JA, SÁNCHEZVÁZQUEZ FJ. Melatonin effects on food
intake and activity rhythms in two fish
species with different activity patterns:
Diurnal (goldfish) and nocturnal (tench).
Comp. Biochem. Physiol A 2006;144:180-7
13. MARTÍNEZ-ÁLVAREZ RM, DE PEDRO N,
GUIJARRO A, ALONSO-GÓMEZ AL, ISORNA E,
DELGADO MJ. Efecto de la melatonina sobre
el peso corporal y las reservas metabólicas
del carpín dorado (Carassius auratus). III
Congreso
Iberoamericano
Virtual
de
Acuicultura.
CIVA2004.
2004:746-55.
Disponible en URL: http://www.civa2004.org
14. WEEKLY LB. Melatonin-induced relaxation
of rat aorta: interaction with adrenergic
agonist. J. Pineal Res. 1991; 11:28-34
15. DOOLEN S, KRAUSE DN, DUBOCOVICH ML,
DUCKLES SP. Melatonin mediates two
distinct responses in vascular smooth
muscle. Eur. J. Pharmacol. 1998; 345:67-9
16. JOHANSSON A, HOLMGREN S. Ca2+recruitment
in
tachykinin-induced
contractions of gut smooth muscle from
African clawed frog, Xenopus laevis and
rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Gen.
Comp. Endocrinol. 2003; 113:185-91
17. HASLER WL. Small Intestinal Motility. En:
JOHNSON LR, ED. Physiology of the
Gastrointestinal Tract. Vol. 1. 4ª ed.
London: Acad. Press, 2006:935-64
18. BUBENIK GA. The effect of serotonin, Nacetylserotonin
and
melatonin
on
spontaneous contractions of isolated rat
intestine. J. Pineal Res. 1986; 3:41-54
19. MERLE A, DELAGRANGE P, RENARD P, LESIEUR
D, CUBER JC, ROCHE M ET AL. Effect of
melatonin on motility patterns of small
intestine in rats and its inhibition by melatonin
receptor antagonist S 22153. J. Pineal Res.
2000; 29(2):116-24
257
20. IIGO M, KOBAYASHI M, OHTANI-KANEKO R,
HARA M, HATTORI A, SUZUKI T ET al.
Characteristics,
day-night
changes,
subcellular distribution and localization of
melatonin binding sites in the goldfish
brain. Brain Res. 1994; 644:213-20
21. BAYARRI MJ, IIGO M, MUÑOZ-CUETO JA,
ISORNA E, DELGADO MJ, MADRID JA ET AL.
Binding characteristics and daily rhythms
of melatonin receptors are distinct in the
retina and brain areas of the European
sea bass (Dicentrarchus labrax). Brain
Res. 2004; 1029(2):241-50
22. LÓPEZ-PATIÑO MA. Receptores centrales y
periféricos de melatonina en el teleósteo
Tinca tinca. Caracterización, farmacología
y ritmicidad diaria y estacional. Tesis
doctoral. Universidad Complutense de
Madrid. 2004
23. KULCZYKOWSKA E, KALAMARZ H, WARNE
JM, Balment RJ. Day-night specific
binding of 2-[125I]Iodomelatonin and
melatonin content in gill, small intestine
and kidney of three fish species. J. Comp.
Physiol. B 2006;176:277-85
24. PONTOIRE C, BERNARD M, SILVAIN C,
COLLIN JP, VOISIN P. Characterization of
melatonin binding sites in chicken and
human intestines. Eur. J. Pharmacol.
1993; 247(2):11-8
IV Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura
25. SALLINEN P, SAARELA S, ILVES M, VAKKURI
O, LEPPALUOTO J. The expression of MT1
and MT2 melatonin receptor mRNA in
several rat tissues. Life Sci. 2005;
76;1123-34
26. MONROE KK, WATTS SW. The vascular
reactivity of melatonin. Gen. Pharmac.
1998; 30(1):31-5
27. ARONSSON U, HOLMGREN S. Muscarinic
M3-like receptors, cyclic AMP and L-type
calcium channels are involved in the
contractile response to cholinergic agents
in gut smooth muscle of the rainbow trout,
Oncorhynchus mykiss. Fish Physiol.
Biochem. 2000; 23:353-61
28. STAKE N, OE H, SAWADA T, SHIBATA S. The
mode of vasorelaxating action of
melatonin in rabbit aorta. Gen. Pharmacol.
1991; 22 (2):219-21
29.
DE ALMEIDA-PAULA LD, COSTA-LOTUFO LV,
FERREIRA ZS, MONTEIRO AEG, ISOLDI MC,
GODINHO RO ET AL. Melatonin modulates
rat myotube-acetylcholine receptors by
inhibiting calmodulin. Eur. J. Pharmacol.
2005; 525:24-31
30. PRADA C, UDIN SB. Melatonin decreases
calcium levels in retinotectal axons of
Xenopus laevis by indirect activation of
group
III
metabotropic
glutamate
receptors. Brain Res. 2005; 1053:67-76
258