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Rev. Salud Anim. Vol. 34 No. 1 (2012): 46-52
VIABILIDAD DE OVOCITOS PORCINOS INMADUROS Y MADURADOS
in vitro VITRIFICADOS CON ETILÉN GLICOL Y TREHALOSA
F. Fernández Reyes*, J.E. Hernández Pichardo*, Gabriela Castellanos García**
*Laboratorio de Manejo de la Reproducción Animal. Universidad Autónoma MetropolitanaXochimilco (UAM-X). Calzada del Hueso 1100, Colonia Villaquietud, Delegación Coyoacán,
CP. 04960, México, D.F. **Clínica Privada.
RESUMEN: Con el objetivo de evaluar la viabilidad de ovocitos porcinos inmaduros (VG) y madurados
in vitro (MII) después de la vitrificación usando etilén glicol y trehalosa, se colectaron 503 ovarios
de los cuales se obtuvieron 731 ovocitos por aspiración de folículos de 3 a 5 mm. Estos se dividieron
en 3 grupos: Grupo 1) control (52 ovocitos), Grupo 2) vitrificación de ovocitos en estado de VG (326
ovocitos) y maduración después del calentamiento y Grupo 3) vitrificación de ovocitos madurados in
vitro (353 ovocitos). En el grupo 1, después de ser cultivados in vitro por 44 horas se evaluó la
maduración mediante la tinción con orceína al 1% en ácido acético al 45%. Los grupos 2 y 3 fueron
vitrificados utilizando el protocolo de dos pasos (equilibrio y vitrificación), la viabilidad fue evaluada
al momento del calentamiento (desvitrificación), mediante la tinción con azul de tiazolil (MTT). Los
resultados obtenidos de maduración en el Grupo 1, fue con presencia de VG 44%, en estado de MI
(cromatina condensada o metafase I) 23% y MII 33%. La viabilidad en el Grupo 2, en fresco fue
100%, al momento del calentamiento 76% y a 44 horas de cultivo in vitro después del calentamiento
13%. Los ovocitos del Grupo 3, antes de la vitrificación presentaron una viabilidad de 94.8% y después
del calentamiento 50%. Se concluye que aunque la viabilidad es mayor al momento del calentamiento
en los ovocitos inmaduros que en los maduros, éstos últimos pueden presentar una mayor ventaja
para el desarrollo posterior en la reproducción asistida, ya que en los inmaduros reduce mucho la
viabilidad al cultivarlos por 44 horas para su maduración in vitro.
(Palabras clave: porcino; ovocito; vitrificación; maduración in vitro; fertilización in vitro)
VIABILITY OF in vitro IMMATURE AND MATURED PIG OOCYTES VITRIFIED WITH
ETHYLEN GLYCOL AND TREHALOSE
ABSTRACT: In order to assess the viability of immature oocytes (GV), matured in vitro (MII) after
vitrification using glycol ethylene and trehalose, 503 ovaries were collected, from which 731 oocytes
were obtained by aspiration of follicles from 3 to 5 mm. They were divided into 3 groups: Group 1)
control (52 oocytes), Group 2) vitrification of oocytes under GV condition (326 oocytes) and maturing
after heating and Group 3) vitrification of in vitro matured oocytes (353 oocytes). In group 1, after
being cultured in vitro for 44 hours, maturation was assessed by staining with 1% orcein in 45%
acetic acid. Groups 2 and 3 were vitrified using the two-step protocol (equilibrated and vitrification),
viability was assessed at heating time (devitrification), by staining with thiazolyl blue (MTT). The
results of maturation in group 1, was with the presence of GV 44%, in state of MI (condensed
chromatin or metaphase I), 23% and 33% MII. Viability in group 2 was 100% fresh, at heating
time 76% and at 44 h of culture in vitro after heating 13%. Group 3 oocytes before vitrification
had a viability of 94.8% and 50% after heating. It is concluded that although viability is higher at
heating time in immature oocytes than in those mature, the latter may have a major advantage for
further development in assisted reproduction, since in those immature, viability is much more
reduced when cultured 44 hours for in vitro maturation.
(Keywords: pig; oocyte; vitrification; in vitro maturation; in vitro fertilization)
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INTRODUCCIÓN
La posibilidad de criopreservar material genético
mediante la vitrificación de gametos, brinda una alternativa de perpetuar las especies (1). La ausencia de tecnologías eficaces para la criopreservación de ovocitos
puede dar lugar a una pérdida de diversidad genética en
el porcino, además de obstaculizar el uso de las tecnolo gía s re pro duc tiva s (2). Una alternati va de
criopreservación es la vitrificación, la cual se define como
la transición de las soluciones acuosas de un estado
líquido a un estado vítreo sólido sin la formación de cristales, aunque su estructura molecular sea la de un líquido extremadamente viscoso (estado vítreo) (3,4).
Los factores que mejo ran el impacto de la
vitrificación sobre los ovocitos o embriones, son los
siguientes: El volumen de solución de vitrificación en
el cual queden contenidos y la alta concentración de
crioprotectores utilizados en la vitrificación. En cuanto
al volumen se ha observado que al vitrificar ovocitos en
estado de meiosis II (MII), en el contenedor Cryotop
(<0.1 µl) presentaron después del calentamiento mejor recuperación y desarrollo que los vitrificados en la
pajilla abierta estirada (OPS) (1-1.5 µl) (5), la disminución del volumen ha permitido obtener mejores resultados debido al paso más rápido por la zona de temperatura peligrosa (+15 a -5ºC), lo cual produce menores
daños por enfriamiento (6). La alta concentración de
crioprotectores utilizados en la vitrificación evita la formación de hielo y disminuye el daño causado por enfriamiento, puesto que disminuye la temperatura a velocidades muy rápidas (2,5000C/min) (3,4), aunque
pueden incrementar las probabilidades de lesionar a
las células debido al choque osmótico y a la toxicidad
de los mismos (3). La técnica de vitrificación es un
proceso rápido y fácil de realizar por lo que se convertirá en un método indispensable en criobiología (7).
Por las similitudes fisiológicas con los humanos,
los cerdos pueden ser utilizados como modelos en
investigaciones biomédicas y para crear animales
gené ticamente modi ficado s como potenci ales
donadores de tejidos y órganos para genotrasplantes,
estas biotecnologías requieren de la producción in vitro
de ovocitos madurados y cigotos de buena calidad (8).
In vivo la capacidad para la fertilización y el desarrollo
se adquiere por los ovocitos después de un largo periodo de crecimiento y desarrollo, este proceso involucra
tanto la síntesis de componentes citoplasmáticos como
la reordenación y reducción de los cromosomas (9).
La competencia meiótica, es decir, la capacidad de
los ovocitos para reiniciar y completar la meiosis, se
adquiere progresivamente durante el crecimiento del
folículo y ovocito (3).
En condiciones de cultivo in vitro la maduración en
algunos casos es deficiente por causas hasta ahora
no identificadas (9), se considera que el tamaño del
ovocito y la comunicación intercelular entre el ovocito
y las células del cúmulo son importantes para su maduración (10), aunque durante muchos años se ha trabajado buscando reproducir artificialmente los eventos
de la maduración, fertilización y el desarrollo embrionario temprano, los procedimientos aún no están completamente estandarizados(11), los estados de maduración meiótica de los ovocitos pueden influir en su
capacidad para sobrevivir a la criopreservación, así se
tiene que la vitrificación de ovocitos en estado de vesícula germinal (VG) podrían tener ventajas ya que los
microtúbulos aún no están organizados en forma de
huso y el material genético está dentro del núcleo protegido por la membrana nuclear, sin embargo los índices de supervivencia de ovocitos vitrificados en estado
de VG, son todavía muy bajos en el bovino y porcino
(3). En un estudio realizado por Wu et al. (12), usando
como crioprotectores etilén glicol (EG) y sacarosa, con
un protocolo de dos pasos y como contenedor la pajilla
OPS, obtuvieron mayor viabilidad de ovocitos porcinos
vitrificados en estado de VG que los vitrificados en estado de MII, los porcentajes fueron 56.8% y 41.9%
respectivamente, se dice que los ovocitos porcinos en
estado de MII son muy sensibles a la vitrificación con
alteración localizada en los microtúbulos y organización mitocondrial (13), por otra parte Nagashima et al.
(2) al utilizar EG 40% y 1 M de sacarosa en la
vitrificación de ovocitos porcinos inmaduros obtuvieron
una viabilidad de 56.3%, la cual evaluaron mediante el
mantenimiento y apariencia intacta del citoplasma del
ovocito, otros autores mencionan que el gran contenido de gotas de lípidos, característicos de los ovocitos
de esta especie dificulta su vitrificación (14,15).
Los hallazgos mencionados indican que el proceso
de vitrificación hace que disminuya la viabilidad de los
ovocitos para su posterior desarrollo, por lo que es
importante conocer la viabilidad al momento del calentamiento (desvitrificación) para poder establecer protocolos de investigación que mejoren los resultados del
desarrollo posterior a la vitrificación en ovocitos
porcinos. Zhou y Li (15), mencionan que la combinación de crioprotectores permeables y no permeables
pueden incrementar el porcentaje de supervivencia de
los ovocitos porcinos vitrificados. En ovocitos de ovino
el uso de EG y trehalosa ha permitido obtener una
maduración del 88% después de la vitrificación (16),
de modo que la combinación de EG y trehalosa puede
favorecer el proceso de vitrificación, pues el EG actúa
como crioprotector de penetración rápida reduciendo
el cambio de volumen y el tiempo de exposición para
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completar el equilibrio osmótico de los ovocitos, pero
debe considerarse que en alta concentración o prolongada exposición produce un daño excesivo de la membrana y reduce potencialmente el desarrollo posterior
(17). Por su parte la trehalosa tiene características más
favorables que otros azúcares para la estabilización
de las proteínas y de la doble capa de fosfolípidos de
las membranas biológicas (18), puesto que tiene una
acción protectora relacionada con el efecto osmótico
y participa en interacciones específicas con los
fosfolípidos de la membrana (19), estabiliza la bicapa
de lípidos de la membrana y ejerce una función protectora contra el frío (20).
Debido a lo anterior el objetivo del presente trabajo
fue evaluar la viabilidad al momento del calentamiento
después de la vitrificación de ovocitos porcinos
inmaduros (VG) y madurados in vitro (MII), usando
como crioprotector permeable el etilén glicol y no
permeable la trehalosa y como contenedor la pajilla
estirada extrafina (SOPS).
MATERIALES Y MÉTODOS
Los ovarios de cerda provenientes del rastro se depositaron en un termo con 500 ml de solución de NaCl
al 0.9 %, esta fue preservada con 0.5% de una solución de antibiótico antimicótico que contenía Penicilina, Estreptomicina y Anfotericina B. Los ovarios fueron transportados al laboratorio a una temperatura entre 25 y 30ºC en un tiempo no superior a dos horas,
una vez en el laboratorio se lavaron 3 veces con la
misma solución a temperatura ambiente.
Los complejos ovocitos células del cumulus (COCs)
se aspiraron de folículos de 3 a 5 mm con una jeringa
de 10 ml y aguja hipodérmica de 1 ½ calibre 1.20 mm
x 38 mm, el contenido de las jeringas se vertió en
tubos cónicos de 50 ml estériles para la extracción del
sobrenadante, se dejó sedimentar media hora y posteriormente se hicieron lavados del sedimento con el
mismo medio (TL-HEPES-PVA) a intervalos de 15 minutos, se obtuvo del fondo del tubo el paquete celular
el cual se depositó en una caja Petri donde se procedió a buscar y seleccionar los ovocitos con citoplasma
uniforme y rodeados de una masa compacta de células del cúmulo, de acuerdo a lo propuesto por (21,22).
En el diseño experimental se consideró clasificar a
los COCs en tres grupos: Grupo 1) Control. Grupo 2)
Vitrificación de ovocitos en estado de VG. Grupo 3)
Vitrificación de ovocitos madurados in vitro; se realizaron siete ensayos por grupo.
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Grupo 1) Control
Una vez obtenidos los COCs se lavaron tres veces
con medio comercial de maduración TCM-199 con sales de Earle, L-Glutamina y bicarbonato de sodio libre
de proteínas (IN VITRO, México), con el objeto de favorecer la maduración citoplasmática y la maduración
nuclear el medio fue suplementado con D-glucosa,
Piruvato de Sodio, PVA, Cisteína, EGF, FSH y LH,
estas dos últimas hormonas fueron suplementadas
usando 20 µl/ml de Merional (IBSA). Para su cultivo in
vitro los COCs se colocaron en placas de 4 posillos
(Nunc) con 500 µl de medio de maduración, cubierto
con aceite mineral (Sigma), posteriormente se incubaron a 38.5ºC con 5 % de CO2 en aire y humedad a
saturación por 44 horas, de acuerdo a Ducolomb et
al., (22); Abeydeera et al., (23); Wang and Niwa, (24).
Después de la MIV las células del cúmulo fueron
removidas con hialuronidasa al 0.1% en TCM-199, posteriormente se lavaron en medio TL-HEPES-PVA y
después se depositaron los ovocitos con cantidad mínima de medio en un porta objetos (no más de 20 por
porta objeto), para ser cubiertos con un cubre objeto
con parafina sólida en los 4 extremos, una vez montados los ovocitos en el porta objeto se fijaron con ácido
acético etanol (1:3) por 72 horas, transcurrido este
tiempo los ovocitos fueron teñidos con orceína al 1%
en ácido acético al 45% (21).
Los criterios de maduración fueron los siguientes:
- No madurados: Sin cromatina visible o con vesícula
germinal (VG).
- En proceso de maduración: Los que presentaron
cromatina condensada o metafase I (MI).
- Madurados: Los que presentaron metafase II (MII)y
cuerpo polar.
Grupo 2) Vitrificación de ovocitos en estado de VG
Los ovocitos seleccionados se lavaron 3 veces en
TCM-199 que contenía piruvato 0.255 mM, HEPES 25
mM, suero fetal bovino (SFB) 20% (v/v) y antibiótico
10 mL/L, posteriormente fueron transferidos al medio
de equilibrio que contenía TCM-199, etilén glicol (EG)
4% y SFB 20%, en este medio permanecieron 15 minutos, transcurrido este tiempo fueron puestos en solución de vitrificación : TCM-199, EG 30%, SFB 20%
y trehalosa 0.4 M por 20 s, posteriormente se colocaron en una pajilla extrafina (SOPS) (MINITUBE, México) para su vitrificación y se sumergieron directamente en nitrógeno líquido, procedimiento modificado de Al-aghbari et al., (16). El calentamiento
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(desvitrificación) fue una semana después a 37°C, para
lo cual los ovocitos fueron colocados en una placa de
4 posillos (Nunc) con 500 ìl de medio TCM-199 con
10% de SFB y tres concentraciones decrecientes de
trehalosa 0.3 M, 0.2 M, 0.1 M y 0.0 M, durante un
periodo de 3 min en cada pozo, posteriormente fueron
lavados 3 veces en TCM-199 suplementado con 10%
SFB. El cultivo de ovocitos en estado de VG calentados fue similar al grupo control.
Evaluación de viabilidad
Para la evaluación de la viabilidad los ovocitos se
colocaron en caja de Petri y posteriormente se les
agregó azul tiazolil (MTT), transcurridas 2 hrs se procedió a observar la tinción de cada uno de los ovocitos,
los viables presentaron una coloración azul y los no
viables no presentaron coloración. Este procedimiento
fue realizado en tres momentos: 1) En ovocitos frescos (recién colectados). 2) En ovocitos al momento
del calentamiento (desvitrificación). 3) En los ovocitos
calentados después de ser cultivados por 44 horas.
Grupo 3) Vitrificación de ovocitos madurados in
vitro
El proceso de maduración in vitro fue similar al grupo control y la vitrificación fue igual al procedimiento
usado en la vitrificación de ovocitos en estado de VG.
La viabilidad fue evaluada en dos momentos: 1) En
ovocitos frescos (recién colectados). 2) En ovocitos
madurados vitrificados al momento del calentamiento
(desvitrificación).
El análisis estadístico de los resultados fue realizado con la prueba de independencia de Chi-cuadrada
(25,26).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A partir de 503 ovarios colectados en rastro fueron
obtenidos 731 ovocitos y estos fueron divididos en tres
grupos, los resultados obtenidos se describen en las
siguientes tablas:
El porcentaje obtenido después del cultivo por 44
horas no varió en los 3 grupos evaluados (Tabla 1).
Como es de esperar se aprecia un mayor porcentaje de viabilidad en los ovocitos frescos recién colectados y en orden decreciente al momento de ser calentados (Tabla 2), así mismo la viabilidad disminuye
significativamente después de la vitrificación (Tabla 3).
La suma total de ovocitos obtenidos en MI (12) y
MII (17), dan como resultado que 29/52 (56%) presentaron rompimiento de vesícula germinal, siendo este
porcentaje mayor al de ovocitos no madurados.
La viabilidad de los ovocitos disminuye con el
proceso de vitrificación y se observa una disminución estadísticamente significativa (P<0.05) cuando son cultivados para su maduración después del
calentamiento.
Al analizar los resultados obtenidos en nuestro ensayo encontramos diferencias atribuibles a factores de
procedimiento. El % de maduración obtenido en el grupo control fue menor al 54.6%, reportado por GonzalesFigueroa y Gonzales-Molfino (10), al utilizar un medio
de cultivo diferente Medio San Marcos (SM) que contenía 22.3 mM piruvato de sodio, suplementado con
Fluido Folicular porcino y gonadotropinas (eCG y hCG),
posiblemente el aporte de los componentes que contiene el fluido folicular entre los que se encuentran pro-
TABLA 1. Resultados de la maduración in vitro de ovocitos porcinos./ Results of in vitro maturation of pig oocytes
Número
de
Ensayos
1
2
3
4
5
6
7
TOTAL
Número de
Ovocitos
Fijados
7
5
10
10
5
5
10
52
Ovocitos no
Madurados (VG)
(%)
5/7 (71)
4/5 (80)
2/10 (20)
4/10 (40)
1/5 (20)
2/5 (40)
5/10 (50)
23/52 (44)a
Ovocitos en proceso de
maduración (MI) (%)
2/7 (29)
0/5 (0)
4/10 (40)
1/10 (10)
1/5 (20)
1/5 (20)
3/10 (30)
12/52 (23)a
Ovocitos
Madurados (MII)
(%)
0 (0)
1/5 (20)
4/10 (40)
5/10 (50)
3/5 (60)
2/5 (40)
2/10 (20)
17/52 (33)a
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TABLA 2. Viabilidad de ovocitos frescos e inmaduros al momento del calentamiento y después del cultivo in vitro por
44 horas./ Fresh egg viability and immature oocytes at heating time and after culture in vitro for 44 hours
ENSAYOS
Frescos recién colectados
(%)
1
38/38 (100)
2
46/46 (100)
3
33/33 (100)
4
45/45 (100)
5
51/51 (100)
6
49/49 (100)
7
64/64 (100)
TOTAL
326/326 (100)ª
Letras diferentes difieren para (P<0.05).
TABLA 3. Viabilidad de ovocitos madurados in vitro
antes y después de la vitrificación./ Viability of in vitro
matured oocytes before and after vitrification
ENSAYOS
VIABILIDAD
ANTES
DESPUÉS
1
39/43 (90%)
9/43 (20%)
2
72/80 (90%)
13/63 (20%)
3
49/49 (100%)
8/40 (20%)
4
46/46 (100%)
35/35 (100%)
5
30/30 (100%)
21/30 (70%)
6
40/40 (100%)
15/30 (50%)
7
58/65 (90%)
47/55 (83%)
TOTAL
335/353 (94.8%)ª
148/296 (50%)b
a difiere de b para (P<0.05)
teínas, carbohidratos, enzimas y hormonas entre otros,
en conjunto brinden mejores condiciones para su maduración. La maduración también fue menor al 60%
mencionado por Casas et al., (21), quienes suplementaron FSH y LH en forma diferente, y los cultivaron
hasta por 72 horas. Varios factores pueden contribuir
en el porcentaje de maduración obtenido entre los que
se tienen la temperatura del transporte de los ovarios
del matadero al laboratorio (10), temperatura y tiempo
de transporte (3), el tamaño del folículo que debe ser
de 3-6 mm (8,14,27,28), cuando son menores puede
afectar su maduración. Por otra parte (Shi et al., (7);
Fujihira et al., (28); Li et al., (29), reportan que el periodo óptimo de cultivo in vitro es de 42 a 44 horas, suficientes para completar los procesos de maduración
nuclear y citoplasmática. Asimismo las condiciones
físicas específicas del ambiente en el que maduran los
ovocitos van a influir en el resultado final, estas deben
ser muy aproximadas a la temperatura corporal de la
cerda que es de 38.5ºC (1,27), quedando dentro de los
valores utilizados en este estudio. Mucci et al., (11)
reportan que la utilización de SFB como suplemento
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Al momento del
calentamiento (%)
17/34 (50)
5/11 (50)
12/12 (100)
25/42 (60)
37/50 (75)
33/41 (80)
61/61 (100)
190/250 (76)b
Desvitrificados y
cultivados 44 h (%)
0/34 (0)
0/11 (0)
0/12 (0)
16/42 (37)
0/50 (0)
8/41 (20)
12/61 (20)
33/250 (13)c
proteico en los medios de cultivo pueden aumentar el
porcentaje de maduración, sin embargo la posible presencia de elementos no identificados, determinan que
algunos aspectos de su función aún no son completamente comprendidos. En los ovocitos inmaduros
vitrificados y calentados no maduró ningún ovocito después de la vitrificación a 44 horas de cultivo in vitro,
posiblemente por daño del citoesqueleto y los
microfilamentos durante el proceso de vitrificación como
lo mencionan Dobrinsky et al., (30).
Los resultados de viabilidad en el grupo control fueron similares al 100% reportado por Shi et al., (7) y
superiores al 90.0% citado por Didion et al., (31). La
viabilidad después del calentamiento para ovocitos en
estado de VG fue superior al 57.0% reportado por Didion
et al. (31), quienes los evaluaron por apariencia
morfológica y citan 0% de viabilidad cuando los evaluaron mediante la tinción con azul tripan y diacetato
de fluoresceína. En tanto que el porcentaje obtenido
de viabilidad después del calentamiento y cultivados
por 44 horas fue menor al 60.0% reportado por Didion
et al., (31), quienes los cultivaron por 24 horas. Un
menor porcentaje 56.8% de supervivencia fue reportado por Wu et al. (12), asimismo un porcentaje de 27.7%
reportan Somfai et al. (32). Los resultados obtenidos
de viabilidad durante el proceso de maduración indican
que disminuye ligeramente 94.8%, comparado con la
de los ovocitos frescos que presentaron el 100%. La
viabilidad para ovocitos madurados in vitro vitrificados
y calentados fue similar al 53.8% mencionado por Shi
et al. (7). La diferencia en los porcentajes obtenidos de
viabilidad con los autores antes mencionados, puede
deberse a los componentes de los medios de cultivo
ya que Shi et al. (7), utilizaron suplementos diferentes
en el medio de cultivo (Gonadotropina coriónica equina,
hCG de origen humano y Fluido folicular porcino). Un
menor porcentaje 41.9% de supervivencia reporta Wu
et al. (12), al utilizar un protocolo diferente en el proce-
51
so de vitrificación con EG y sacarosa. La supervivencia de los ovocitos vitrificados depende del daño que
se ocasione durante el proceso, sobretodo por el choque osmótico en la deshidratación y rehidratación (13).
Celestinos y Gatica (33), reportan que en el proceso
de vitrificación es importante el volumen de la muestra,
concentración de crioprotectores, método de adición
de los mismos, temperatura y tiempo de equilibrio, y
tasa de enfriamiento.
CONCLUSIÓN
El presente estudio demostró que el uso de EG y
trehalosa como crioprotectores en el proceso de
vitrificación de ovocitos porcinos permite obtener
ovocitos viables al momento del calentamiento tanto
en estado de VG como en MII al ser vitrificados en
pajillas SOPS. La viabilidad al momento del calentamiento fue mayor en los ovocitos vitrificados en estado
de vesícula germinal que en los vitrificados en estado
de MII. Deberán realizarse estudios posteriores a fin
de valorar si la viabilidad observada en lo ovocitos
vitrificados en estado de MII es favorable para su posterior fertilización o desarrollo.
AGRADECIMIENTOS
Al Rastro Los Arcos de Los Reyes La Paz, estado
de México, por la donación de los ovarios.
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(Recibido 6-12-2010; Aceptado 5-11-2011)