Alvarez, Lucía Paula. 2010 "Efecto del ácido salicílico sobre la

Efecto del ácido salicílico sobre la virulencia de
Staphylococcus aureus y su interacción con el
huésped
Alvarez, Lucía Paula
2010
Tesis Doctoral
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
www.digital.bl.fcen.uba.ar
Contacto: [email protected]
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales de la Biblioteca Central Dr. Luis
Federico Leloir. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la
fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir.
It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source.
Fuente / source:
Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Efecto del ácido salicílico sobre la
virulencia de Staphylococcus aureus y su interacción
con el huésped
Tesis presentada para optar al título de
Doctor de la Universidad de Buenos Aires
en el área Ciencias Biológicas
Lic. Lucía Paula Álvarez
Director de Tesis: Dra. Fernanda Buzzola
Consejero de Estudios: Dr. Norberto Iusem
Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología
Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires.
Buenos Aires, 2010
1
Efe ct o de l á cido sa licílico sobr e la vir u le n cia de
St a ph ylococcu s a u r e u s y su in t e r a cción con e l h u é spe d
S. aureus es una bact eria oport unist a capaz de generar
infecciones severas en hum anos. Ent re los fact ores de virulencia
m ás im port ant es de S. aureus se encuent ran el polisacárido
capsular ( PC) y la adhesina Eap, cuya expresión est á cont rolada por
los reguladores globales sae y m grA. La expresión de eap es
act ivada por sae, m ient ras que el PC es act ivado por m grA e
inhibido por sae. El ácido salicílico ( SAL) alt era la expresión de
diversas m oléculas en células procariot as y eucariot as. Est e t rabaj o
se propuso est udiar el efect o del SAL sobre la expresión de los
fact ores de virulencia de S. aureus y cóm o est o afect a la int eracción
de la bact eria con el huésped. Al respect o, el SAL provocó un
aum ent o en la capacidad de int ernalización de la cepa Newm an en
células epit eliales. Est o correlacionó con una expresión dism inuida
del PC5 y un aum ent o de Eap, debido al efect o posit ivo del SAL
sobre sae y negat ivo sobre m grA. Por ot ra part e, el t rat am ient o de
las células endot eliales con SAL, así com o t am bién sobre los
rat ones generó una m enor adherencia de S. aureus. Adem ás, se
det erm inó que Eap es esencial para la int ernalización y colonización
de
S.
aureus t ant o
in
vit ro
com o
in
vivo.
Est os hallazgos
dem uest ran que el SAL alt era la expresión de m oléculas de S.
aureus direct am ent e involucradas en la int eracción con el huésped
y por lo t ant o la progresión de la infección podría verse afect ada.
Palabras
clave:
St aphylococcus
aureus,
virulencia,
ácido
salicílico, adhesinas, polisacárido capsular
2
Effe ct of sa licylic a cid on St a ph ylococcu s a u r e u s vir u le n ce
a n d it s in t e r a ct ion w it h t h e h ost
S. aureus is an opport unist ic bact erium capable of generat ing
severe infect ion in hum ans. Am ong t he m ost im port ant virulence
fact ors of S. aureus are t he capsular polysaccharide ( CP) and Eap
adhesin, whose expression is m odulat ed by sae and m grA global
regulat ors. Expression of eap is act ivat ed by sae, while CP is
act ivat ed by m grA and inhibit ed by sae. Salicylic acid ( SAL) alt ers
t he expression of various m olecules in prokaryot ic and eukaryot ic
cells. This work proposed t o charact erize t he effect of SAL on host bact eria int eract ion. I n t his regard, SAL caused an increased
int ernalizat ion
of
st rain
Newm an
int o
epit helial
cells.
This
observat ion correlat ed wit h a decreased expression of CP and an
increased expression of Eap, which would be caused by a posit ive
effect of SAL on sae and a negat ive effect on m grA. Moreover, t he
act ion of SAL on endot helial cells and m ice generat ed a lower
adherence of S. aureus. Moreover, it was det erm ined t hat Eap is
essent ial for int ernalizat ion and colonizat ion of S. aureus bot h in
vit ro and in vivo. These findings dem onst rat e t hat SAL is able t o
alt er t he expression of m olecules direct ly involved in of host - S.
aureus int eract ion, and t herefore t he progression of infect ion would
be affect ed.
Keywords: St aphylococcus aureus, virulence, salicylic acid,
adhesins, capsular polysaccharide
3
Agr a de cim ie n t os
A la Dra. Fernanda Buzzola, por haberm e enseñado a m anej arm e
en el laborat orio de Microbiología y por acom pañarm e en m i carrera
durant e t odos est os años, est ando siem pre dispuest a al diálogo.
Al Dr. Daniel Sordelli, por darm e la oport unidad de realizar est a
Tesis de Doct orado en el laborat orio a su cargo, por confiar en m í,
porque siem pre pude recurrir a él, por su gran sent ido de la
responsabilidad, por com part ir su experiencia y anécdot as.
A m is com pañeros de laborat orio, por brindarm e su am ist ad y su
ayuda en t odo m om ent o. Por los viaj es com part idos, por las salidas
ext ra- lab, por las charlas, el int ercam bio de prot ocolos, los m ails
generales... A Sol, Angie, Sebas, Rit a, Euge, Moni, Sant i, Jorge,
Mariana, Mario, Maribel, Paola, Const anza, Vicky, Marisa, Tania,
Paula, Sole, Kari, Nancy, Federico. Y a Agus y Lore que aunque ya
no est én en el lab, siem pre puedo cont ar con ellas.
A Lorena Medina, por su excelent e asist encia t écnica, por su
paciencia, bondad y cariño! Por su am ist ad, por su ej em plo de gran
sacrificio y de “ no quej a” ! ! !
A la Dra. Crist ina Cerquet t i, Dra. Mariana Cat alano y Dra. Daniela
Cent rón, por su desint eresada colaboración cuando recurrí a ellas y
por la sonrisa que m e regalan cada día.
Al Dr. Gerardo Mirkin por su colaboración en el uso del m icroscopio
de fluorescencia.
Al personal de Biot erio, por su paciencia y su buena predisposición,
especialm ent e a Sabri!
4
Al personal de lim pieza, porque con su labor hacen m ás fácil la
t area de t odos.
A la Lic. Elisa Malaver y a la Dra. Mirt a Schat t ner de la Academ ia
Nacional de Medicina por su colaboración con el cult ivo de células
endot eliales y con el uso del cit óm et ro de fluj o.
Al Dr. Cheung por acept arm e en su laborat orio de la Universidad de
Dart m out h, Hanover, New Ham pshire, USA. A Guido Mem m i y a
María Pilar Trot onda por hacer m ás fácil m i est adía en USA y por su
am ist ad a pesar de la dist ancia y del t iem po.
A la Dra. Rut h Massey por acept arm e en su laborat orio de la
Universidad de Bat h, UK. A Araxi Urrut ia, Andrew Edwards, Laura
Lopez Pascua, Just ine Rudkin y Ore Francis por su com pañía y
ayuda durant e m i est adía en Bat h.
A m i papá, por su cont ribución a la obt ención de m i doct orado,
porque en los últ im os m eses que com part im os pude disfrut ar de su
com pañía com o nunca ant es lo había hecho, por brindarm e su
ej em plo de perseverancia y esfuerzo, porque sé que est á en algún
lugar orgulloso de m í y porque aunque no llegó a est e m om ent o,
est uvo apoyándom e en t odo el recorrido que es t an o m ás
im port ant e que la llegada. Gracias papá, t e am o!
A m i m am á, por est ar siem pre dispuest a a dialogar, porque sé que
puedo cont ar con ella siem pre, para t odo, porque es un ej em plo de
lucha, de dignidad, de int egridad. Por sus sabios consej os. Por los
valores y la filosofía de vida que m e t ransm it ió, por est ar aquí y
ahora a m i lado, de fierro, com o siem pre.
5
A m is herm anos, por ser los m ás herm osos del m undo! A I ván, por
ser m i herm ano durant e t oda m i vida, gracias por el esfuerzo en
afianzar nuest ra relación; a Cam i, por ser m i herm ana- am iga; a
Nico, por ser el herm anit o m enor m ás dulce que exist e ( aguant e el
t aladro! ) ; a Let i, por su m adurez a pesar de su edad; a Lucas por
ser el herm ano m ás delirant e!
A m is sobrinos, Agust ín y Candela por ser t an dulces y por
brindarm e t ant o am or.
A m i cuñada Mariadelia, por cuidar a m i herm ano y a m is sobrinos y
por ofrecer siem pre una m ano para ayudarm e.
A Mart ha, por haber acom pañado a m i papá en sus últ im os años de
vida, por darm e siem pre la bienvenida a su casa, por cocinar t an
rico y por haberm e dem ost rado siem pre su cariño. A Juana, por ser
una abuela post iza m aravillosa!
A m is abuelas, t íos, t ías, prim os, prim a por est ar siem pre cerca y
porque gracias a t odos ellos es im posible no sent irm e acom pañada.
A Fede, por haberm e elegido, por escucharm e, por est ar a m i lado
incondicionalm ent e, por ayudarm e a pulir m i vida y a com plet ar m i
felicidad.
A m i nueva fam ilia: m i suegra Norm a, m is cuñadas Maru y Marce,
m i sobrina Guada, por est ar siem pre dispuest as a ayudarm e y por
la buena onda.
A m is am igas, Luciana, Sol, Cari, I ngrid, Gi, Nat y, Pep, Enid por ser
personas m aravillosas, por est ar siem pre que las necesit é, por las
risas y las lágrim as com part idas.
6
A t odos m is com pañeros de la Soka Gakkai de Argent ina, de
Est ados Unidos, de Brasil y de I nglat erra, por hacerm e sent ir que
siem pre, en cualquier lugar del m undo podré cont ar con su
com pañía y apoyo.
A m i m aest ro de la vida, Daisaku I keda, porque gracias a él hoy
puedo pract icar en Argent ina el budism o de Nichiren Daishonin, por
ser m i guía espirit ual cuando no puedo encont rarm e, por t ener las
palabras j ust as para alent arm e a seguir, siem pre hacia adelant e.
7
“Entre los días de fecunda productividad
se insertan jornadas de incertidumbre
en que nada parece salir bien, y en que hasta
la materia misma responde con hostilidad;
es entonces cuando uno mismo
debe resistir al desaliento.”
Marie Curie.
A m is pa dr e s
8
Los result ados del present e t rabaj o de t esis fueron parcialm ent e
publicados en:
Tuchscherr, L. P. N., Buzzola, F. R., Alva r e z, L. P., Lee, J. C. y
Sordelli
D.
O.
St aphylococcus
Dim inished
aureus
Clearance
from
t he
of
Non
Mam m ary
–
Capsulat ed
Gland
Aft er
Experim ent al Challenge. 2005. I nfect ion and I m m unit y. 73( 12) :
7932- 7937.
Alva r e z LP, Barbagelat a M.S., Gordiola M., Cheung A.L., Sordelli
D.O. and Buzzola F.R. Salicylic Acid Dim inishes St aphylococcus
aureus Capsular Polysaccharide t ype 5 Expression. 2010. I nfect ion
and I m m unit y. 78( 3) : en prensa.
Alva r e z LP, Cheung AL, Sordelli DO and Buzzola FR. Effect s of
salicylic acid on Ext racellular Adherence Prot ein of St aphylococcus
aureus. Enviado a I nfect ion and I m m unit y.
Alva r e z L, Sordelli D, Buzzola F. Efect o del ácido salicílico en la
infección persist ent e por St aphylococcus aureus. XVI I I Congreso
Lat inoam ericano de Microbiología. Pucón, Chile. 23 al 26 de oct ubre
de 2006.
Alva r e z L, Barbagelat a M, Cheung A, Lee J, Sordelli D y Buzzola F.
Efect o del ácido salicílico sobre la virulencia de St aphylococcus
aureus.
XI
Congreso
Argent ino
de
Microbiología.
Córdoba,
Argent ina. 10 al 13 de oct ubre de 2007.
Alva r e z L, Barbagelat a M, Cheung A, Quiroga C, Sordelli D y
Buzzola F. Regulat ion of virulence fact ors in St aphylococcus aureus
is affect ed by salicylic acid. XLI I I Reunión Anual de la Sociedad
9
Argent ina de I nvest igación en Bioquím ica y Biología Molecular. Mar
del Plat a, Buenos Aires, Argent ina.17 al 20 de noviem bre de 2007.
L. P. Alva r e z, M. S. Barbagelat a, A. L. Cheung, D. O. Sordelli and
F. R. Buzzola.. Salicylic Acid Dim inishes St aphylococcus aureus
Capsular Polysaccharide Type 5 Expression. Present ación en post er.
108 General Meet ing of Am erican Societ y for Microbiology. Bost on,
Est ados Unidos, 1 al 5 de j unio de 2008.
L. P. Alva r e z, M. S. Barbagelat a, A. L. Cheung, D. O. Sordelli and
F. R. Buzzola. Expression of eap in St aphylococcus aureus is
Affect ed by Salicylic Acid. XI I I nt ernat ional Congress of Bact eriology
and Applied Microbiology. Est am bul, Turquía. 5 al 9 de agost o de
2008.
Alva r e z LP, Barbagelat a MS, Cheung AL, Cerquet t i MC, Sordelli DO
and
Buzzola
St aphylococcus
F.
I nfluence
aureus
of
Salicylat e
Ext racellular
on
Adherence
Expression
Prot ein.
of
XLI V
Reunión Anual de la Sociedad Argent ina de I nvest igación en
Bioquím ica y Biología Molecular. Carlos Paz, Córdoba, Argent ina.8 al
11 de noviem bre de 2008.
10
El present e t rabaj o de t esis cont ó con el apoyo económ ico de las
siguient es inst it uciones:
Consej o
Nacional
de
I nvest igaciones
Cient íficas
y
Técnicas
( CONI CET)
Agencia Nacional de Prom oción Cient ífica y Tecnológica ( ANPCyT)
Universidad de Buenos Aires ( UBA)
11
Í n dice
Resum en
i
Abst ract
ii
Agradecim ient os
iii
Dedicat oria
vii
Publicaciones
viii
Financiam ient o
x
Í ndice
xi
Abreviat uras
xiii
I nt roducción
1. St aphylococcus aureus
1.1. Generalidades
1.2. Pat ogénesis
1.3. Reguladores
1.3.1. sae
1.3.2. m grA
1.4. Fact ores de virulencia
1.4.1. Polisacárido capsular
1.4.2. Adhesinas
1.4.2.1. Eap
1.5. I nt eracción de S. aureus con
células eucariot as
2. Ácido salicílico
1
1
1
2
3
4
6
7
7
8
9
Hipót esis y Obj et ivos
15
Mat eriales y Mét odos
1. Cepas bact erianas
2. Anim ales
3. Cult ivo celular
3.1. Células epit eliales
3.2. Células endot eliales
4. Ensayo de invasión
5. ELI SA para det ect ar TNF- α
6. Det ección de I CAM- 1 por cit om et ría de fluj o
7. Microscopía de fluorescencia
8. Ext racción de ADN plasm ídico
9. Preparación de células com pet ent es
17
17
11
12
17
17
17
18
18
19
20
21
21
22
12
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
Elect roporación de cepas bact erianas
Transducción de cepas bact erianas
Est udios de fusión t ranscripcional
Ext racción de ARN
qRT- PCR
RT- PCR
Preparación de ext ract os de ant ígenos
capsulares
Expresión de PC por inm unoprecipit ación
Ext racción de prot eínas de pared con lisost afin
Preparación de exoprot eínas
Solubilización de prot eínas de superficie
Elect roforesis en gel de poliacrilam ida con
duodecil sulfat o de sodio ( SDS- PAGE)
Modelo m urino de colonización nasal
Análisis est adíst ico
22
Result ados
1. Efect o del SAL sobre la capacidad de
int ernalización de S. aureus
2. Rol de la cápsula en la int ernalización
3. Efect o del SAL sobre la expresión del
polisacárido capsular serot ipo 5
4. Efect o del SAL sobre la expresión de prot eínas
5. Efect o del SAL sobre la prot eína Eap
6. Efect o del SAL sobre reguladores de
los fact ores de virulencia
6.1. Sist em a regulador sae
6.2. Regulador m grA
7. Acción regulat oria de m grA sobre Eap
8. I nt ernalización de S. aureus en células
endot eliales t rat adas con SAL
9. Expresión de I CAM- 1 en células endot eliales
t rat adas con SAL e infect adas con S. aureus
10. Producción de TNF- α en respuest a a la
infección con S. aureus y al t rat am ient o con SAL
11. Efect o del SAL sobre la colonización
int ranasal de S. aureus in vivo
23
23
23
24
24
25
25
26
26
27
27
28
28
29
29
30
31
35
36
41
41
46
50
53
55
56
57
Discusión
59
Conclusiones
71
Referencias
74
13
Abr e via t u r a s
AD N c: ADN copia
ClfA: Fact or de unión A
ClfB: Fact or de unión B
Cm : cloram fenicol
Coa : coagulasa
COX- 1 : ciclooxigenasa const it ut iva
COX- 2 : ciclooxigenasa inducible
CT : ciclo um bral
CYGP: Casam inoácidos Levaduras GliceroFosfat o.
CYGP w : m edio CYGP sin glucosa
D API : 4',6- diam idino- 2- fenilindol
D M EM : Dulbeco´ s Modified Eagle´ s Medium
Ea p: Prot eína de adhesión ext racelular
Efb: Prot eína de unión al fibrinógeno ext racelular
ELI SA: enzim oinm unoensayo
Em : Erit rom icina
Em p: Prot eína de unión a la m at riz ext racelular
Fg: fibrinógeno
Fn: fibronect ina
Fn BP- A: Prot eína de unión a la fibronect ina A
Fn BP- B: Prot eína de unión a la fibronect ina B
gfp: Prot eína verde fluorescent e
h: horas
H la : α- hem olisina
H la : β- hem olisina
in a : vía int ranasal
ip: int raperit oneal
KD a : Kilo Dalt ons
LB: m edio Luria Bert ani
m in: m inut os
m oi: m ult iplicidad de infección.
M SCRAM M s: com ponent es m icrobianos de superficie
reconocen m oléculas adhesivas de la m at riz
N u c: t erm onucleasa
PBM C: Células m ononucleares de sangre periférica
PBS: buffer salino de fosfat o
PC: polisacárido capsular
PCR: Reacción en cadena de la polim erasa
PM SF: fenilm et ilsulfonil fluorado
r pm : revoluciones por m inut o
qRTPCR: PCR en t iem po real
RTPCR: PCR de t ranscripción inversa
s: segundos
que
14
SAL: ácido salicílico
SD S: duodecil sulfat o
SERAM s: repert orio expandido de m oléculas adhesivas secret ables
SFB: suero fet al bovino
SpA: Prot eína A
SspA: serin prot easa A
TBE: Tris- Borat o EDTA
TCRS: sist em as regulat orios de dos com ponent es
TEM ED : Tet ram et ilet ilendiam ina
TM B: 3,3',5,5'- t et ram et ilbenzidina
TSA: Agar Tript icasa de Soj a
TSB: Caldo Tript icasa de Soj a
UFC: Unidades form adoras de colonias
15
1 . St a ph ylococcu s a u r e u s
1 .1 . Ge n e r a lida de s
St aphylococcus
aureus
Micrococcaceae. Est a
racim os
( Fig.
1) .
es
m iem bro
de
la
fam ilia
bact eria coco Gram posit ivo se agrupa en
Desde
el
punt o
de
vist a
bioquím ico,
los
est afilococos son cat alasa posit ivos, coagulasa posit ivos, oxidasa
negat ivos y ferm ent an el m anit ol ( 34) .
Figur a 1 . St a ph ylococcu s a u r e u s. Micrografía t om ada
elect rónica de barrido de colonias de S. aureus ( 114) .
por
m icroscopía
S. aureus es un m icroorganism o com ensal que se aloj a
principalm ent e en las narinas ant eriores. Aproxim adam ent e el 20%
de los individuos sanos son colonizados persist ent em ent e con S.
aureus
y
el
30%
son
colonizados
int erm it ent em ent e.
La
colonización increm ent a claram ent e los riesgos de infección ( 67) .
Por ot ra part e, S. aureus es una bact eria oport unist a capaz de
causar infecciones t ant o a individuos de la com unidad com o a
pacient es hospit alizados. Puede generar infecciones de piel y t ej idos
16
blandos e infecciones severas com o ost eom ielit is, endocardit is y
bact eriem ia ( 89) .
Para est ablecer la infección, S. aureus cuent a con una gran
variedad de fact ores de virulencia cuya expresión est á m odulada
por im port ant es reguladores globales.
1 .2 . Pa t ogé n e sis
La pat ogénesis de S. aureus es un proceso com plej o que
involucra diferent es com binaciones de com ponent es de superficie y
ext racelulares, los cuales son expresados coordinadam ent e durant e
los diferent es est adios del proceso infeccioso. S. aureus expresa
num erosas prot eínas de superficie que m edian la adhesión al t ej ido
del
huésped
para
iniciar
la
infección.
Est as adhesinas unen
m oléculas t ales com o colágeno, fibronect ina ( Fn) , fibrinógeno ( Fg) y
j uegan un rol clave en el inicio de infecciones endovasculares,
ost eoart iculares e infecciones asociadas a prót esis. Al respect o,
cepas
diferent es
de
S.
aureus
pueden
t ener
una
expresión
diferencial de adhesinas, y por lo t ant o podrían causar ciert os t ipos
de infecciones caract eríst icos ( 32, 86, 100) .
Una vez que S. aureus se adhiere al t ej ido o a la prót esis, es
capaz de crecer y persist ir ut ilizando diferent es est rat egias. S.
aureus puede producir biopelículas, que le perm it en evadir la
respuest a inm une y la acción de los ant ibiót icos ( 25) . Adem ás es
capaz de invadir y sobrevivir dent ro de células epit eliales y
endot eliales, lo cual t am bién le perm it iría a la bact eria escapar de
las defensas del huésped ( 3) . Ot ra est rat egia que ut iliza S. aureus
es la de form ar “ variant es de colonia pequeña” ( VCP) , las cuales
cont ribuirían a las infecciones recurrent es y persist ent es. Las VCP
pueden in vit ro evadir el sist em a inm une sin causar daño al
huésped, y pueden luego revert ir a una form a m ás virulent a ( 110,
17
111) . La principal defensa de S. aureus frent e a los fagocit os es la
producción de m icrocápsula ant ifagocít ica ( 95) . Por ot ro lado, la
prot eína A ( SpA) se une a la porción Fc de las inm unoglobulinas y
com o result ado, puede prevenir la opsonización ( 31) . Adem ás, S.
aureus secret a prot eínas inhibidoras de la quim iot axis ( CHI PS) y la
prot eína de adhesión ext racelular ( Eap) , las cuales int erfieren con la
ext ravasación de los neut rófilos al sit io de infección ( 17) .
Durant e el proceso infeccioso, S. aureus produce num erosas
enzim as, com o prot easas, lipasas y elast asas, que le perm it en
invadir y dest ruir el t ej ido del huésped y m igrar hacia ot ros sit ios.
Est a bact eria t am bién t iene la capacidad de inducir shock sépt ico, a
t ravés de la int eracción del pept idoglicano, ácido lipot eicoico y α-
hem olisina ( Hla) con el sist em a inm une ( 77) . Adem ás, m uchas
cepas producen la t oxina TSST- 1 que act úa com o superant ígeno y
provoca el síndrom e del shock t óxico ( 84) . Ot ras cepas sint et izan
t oxinas exfoliat ivas capaces de causar el síndrom e de la piel
escaldada o im pét igo ( 104) .
La regulación coordinada de los fact ores de virulencia de S.
aureus j uega un rol cent ral en la pat ogénesis. La expresión de
adhesinas
generalm ent e
crecim ient o,
t oxinas,
son
ocurre
en
la
fase
logarít m ica
de
m ient ras que las prot eínas secret adas com o las
producidas
durant e
la
fase
est acionaria.
En
el
t ranscurso de la infección la expresión t em prana de las adhesinas
perm it e la colonización inicial de t ej idos, m ient ras que la producción
t ardía de t oxinas facilit a la disem inación de la bact eria ( 9) .
1 .3 . Re gu la dor e s
La expresión coordinada de los fact ores de virulencia de S.
aureus est á direct a o indirect am ent e influida por la acción de
diversos reguladores globales. Exist en dos grupos principales de
18
reguladores globales en S. aureus: los sist em as regulat orios de dos
com ponent es y la fam ilia de prot eínas hom ólogas SarA ( 19, 83,
92) .
Los sist em as regulat orios de dos com ponent es en procariot as
son sensibles a señales am bient ales y est án const it uidos por una
hist idin
quinasa
de
m em brana
sensora
y
una
prot eína
cit oplasm át ica reguladora de la respuest a, que una vez act ivada por
fosforilación se une a una secuencia específica del gen blanco ( 82) .
Los sist em as de est e t ipo caract erizados hast a ahora en S. aureus
incluyen agrCA, sa e RS, lyt RS, arlRS, SrrAB, YycFG y VraRS ( 19,
82) .
La fam ilia de prot eínas SarA y el fact or sigB son fact ores
t ranscripcionales que se unen direct am ent e a la región prom ot ora
de los genes blanco. La fam ilia SarA se divide en t res subfam ilias:
a) est ruct uras de dom inio único ( SarA, SarR, SarT, SarV y SarX) ;
b) est ruct uras de doble dom inio ( SarS, SarU y SarY) ;
y c)
est ruct uras de dom inio único alt am ent e hom ólogas a la fam ilia
MarR ( SarZ, M gr A/ Ra t ) ( 19) .
1 .3 .1 . sa e
El sist em a de dos com ponent es sae act iva la expresión de una
am plia variedad de fact ores de virulencia t ales com o serin prot easa
A ( SspA) , t erm onucleasa ( Nuc) , coagulasa ( Coa) , Hla, β- hem olisina
( Hlb) , SpA, Eap, prot eína de unión a la m at riz ext racelular ( Em p) , y
prot eína de unión a la fibronect ina–A ( FnBP- A) probablem ent e a
t ravés de su int eracción direct a con est os genes ( 9, 37- 40) . Por el
cont rario, la expresión del operón cap, que codifica para la
expresión
de
las
prot eínas
involucradas
en
la
sínt esis
del
polisacárido capsular ( PC) , es reprim ida por sae ( 121) .
19
El locus sae est á com puest o por cuat ro m arcos de lect ura
abiert os, dos de los cuales codifican para un regulador saeR y un
sensor saeS ( 38) . Los ot ros dos m arcos de lect ura abiert os ( saeP y
saeQ) se localizan río arriba de saeRS y codifican para prot eínas
que serían im port ant es para el funcionam ient o del operon ( 94,
121) . El gen saeP codifica para una lipoprot eína y saeQ para una
prot eína de m em brana ( 82) . Para el locus sae se ident ificaron
cuat ro t ranscript os, A, B, C y D y dos prom ot ores PA y PC ( Fig. 2) . El
t ranscript o A ( 2,1 Kb) se inicia en el prom ot or PA y cubre saeR y
saeS. Est e t ranscript o est á present e desde el inicio del crecim ient o
bact eriano y
dism inuye su int ensidad durant e la fase m edia
exponencial. Los t ranscript os B ( 2,4 Kb) , C ( 3,1 Kb) y D ( 0,5 Kb) ,
se inician desde el prom ot or PC y aparecen en la fase m edia
exponencial. El t ranscript o C cubre el locus com plet o y quizás sea
procesado para generar B, que cubre saeQ, saeR y saeS. El
t ranscript o D, que cubre sólo saeP, quizás sea un product o del
procesam ient o de C o un t ranscript o de novo ( 1) .
saeP
saeQ
PA
saeR
saeS
A
C
PC
D
B
Figur a 2 . Esqu e m a de l locu s sa e . El locus sae est á com puest o por cuat ro
genes y se t ranscribe desde dos prom ot ores, PA y PC, generando cuat ro
t ranscript os ( A, B, C y D) .
El prom ot or PC es aut oinducido por saeR y saeS, m ient ras que
PA es reprim ido por saeRS. Así, est os t ranscript os se expresan
prim ero desde el prom ot or PA y luego desde el prom ot or PC ( 1) . La
act ivación del prom ot or PC en la fase m edia exponencial represent a
una t ransición regulat oria clave dent ro del locus sae y depende de
ot ros det erm inant es regulat orios t ales com o agr, sarA y sae m ism o.
20
Adem ás, el prom ot or Pc es afect ado por est ím ulos am bient ales t ales
com o
pH,
cloruro
de
sodio
y
glucosa
o
concent raciones
subinhibit orias de ant ibiót icos ( 94) . Cabe dest acar que la cepa
Newm an de S. aureus present a una sust it ución de un am inoácido
en saeS, la cual es parcialm ent e responsable de su fenot ipo, que
incluye la act ivación const it ut iva de PC y la hiperproducción de Coa
y Eap ( 1, 35, 82) .
1 .3 .2 . m gr A
Ot ro regulador global clave en S. aureus es m grA ( m ult iple
gene regulat or A) , hom ólogo a la fam ilia de prot eínas de resist encia
m últ iple a ant ibiót icos MarR de E. coli ( 2) . MgrA cont rola la
expresión de 350 genes, incluyendo los genes que codifican para
varios fact ores de virulencia ( PC, Nuc, Hla, Coa, SspA y SpA) , genes
involucrados en la aut olisis ( lyt RS) y ot ros genes reguladores
globales ( agrCA, arlRS, sarS y sarV)
( 19, 55, 56, 78, 81) .
Asim ism o, MgrA regula negat ivam ent e las bom bas de efluj o NorA,
NorB y Tet 38, las cuales confieren resist encia a ciert os ant ibiót icos
com o la ciprofloxacina ( 112, 125) . Por ot ra part e, m grA reprim e la
form ación
de
biopelícula
y
m odula
la
expresión
de
genes
involucrados en la sínt esis de pared celular y en el est rés osm ót ico
( 78, 124) . MgrA act iva la expresión de los genes cap, hla y nuc,
m ient ras que reprim e la expresión de spa, coa y genes aut olít icos
( 55, 78, 81) . Ot ra caract eríst ica a dest acar en cuant o a est e
regulador es que act iva la expresión de exoprot eínas, m ient ras que
reprim e la expresión de prot eínas de superficie. Est e m odo de
acción es sim ilar a la regulación ej ercida por agr, ot ro im port ant e
regulador global de S. aureus ( 92) . El m ecanism o por el cual agr
regula t ranscripcionalm ent e sus genes blanco es aún desconocido.
Luong et al. ( 78) especularon, basados en el paralelism o ent re agr
y m grA, que m grA quizás int eract úe con agr en la regulación de las
21
exoprot eínas y prot eínas de superficie, ya que m ut aciones en m grA
reprim en a RNAI I I , la m olécula efect ora del sist em a agr.
1 .4 . Fa ct or e s de vir u le n cia
1 .4 .1 . Polisa cá r ido ca psu la r
El 90% de los aislam ient os de S. aureus producen PC. A pesar
de que se han descript o m ás de 11 serot ipos capsulares, el 80% de
los aislam ient os provenient es de hum anos expresan los serot ipos 5
( PC5) y 8 ( PC8) ( Fig. 3) .
Figur a 3 . M icr ogr a fía s de t r a nsm isión e le ct r ón ica de cé lu la s de S. a ur e u s
e n fa se e st a cion a r ia . Previo a la fij ación, las bact erias fueron incubadas con
ant icuerpos específicos ant i- PC5 para est abilizar y visualizar la cápsula. Cepa
Reynolds product ora de PC5 ( izq.) ; m ut ant e acapsular de S. aureus ( der.) ( 118) .
El operón cap5 cont iene 16 genes, desde cap5A hast a cap5P
que se t ranscriben en la m ism a orient ación ( 95) . Los genes t ipo
específicos est án localizados en la región cent ral del locus e
incluyen los genes cap5H, cap5I , cap5J y cap5K ( Fig. 4) .
Región común
A
B
C
D
Región PC5-específica
E
F
G
H
I
J
K
Región común
L
M N
O
P
Figur a 4 . Or ga n iza ción de l clu st e r ge n é t ico ca p5 de S. a u r e us. Se
m uest ran los genes de la región com ún a los clust ers 5 y 8 y la región PC5
específica.
22
El locus cap5 de S. aureus est á baj o el cont rol de una
com plej a red regulat oria. La expresión de PC es est im ulada por el
sist em a agr ( 21) , m grA ( 81) , el sist em a arlRS vía m grA ( 79) , el
fact or σB ( sigB) ( 6) y sarA ( 126) . Por el cont rario, el sist em a sae es
el único regulador descript o que inhibe la expresión de la cápsula
( 82, 121) . Para la expresión t ot al de PC se requiere una región
repet ida invert ida de 10 pb localizada “ río arriba” del prom ot or
principal del operón cap, sugiriendo que un regulador que se une al
ADN est aría involucrado ( 96) .
La expresión de PC5 y PC8 in vit ro es m uy sensible a las
señales
am bient ales.
Las
condiciones
del
m edio
de
cult ivo
m ost raron influir dram át icam ent e en la producción de PC. El
crecim ient o de S. aureus en un m edio de cult ivo sólido y baj o
condiciones lim it ant es de hierro produce un aum ent o en la sínt esis
de PC8 ( 102, 103) . Adem ás, la producción de cápsula in vit ro es
inhibida por ext ract o de levadura, m edio alcalino y anaerobiosis,
pero se ve aum ent ada cuando las bact erias son cult ivadas en un
m edio suplem ent ado con cloruro de sodio al 5% ( 95) .
El PC cum ple un rol esencial para la pat ogénesis de S. aureus,
ya que im pide su opsonización con ant icuerpos y con prot eínas del
com plem ent o y por lo t ant o, inhibe la fagocit osis por part e de los
leucocit os polim orfonucleares hum anos ( 95) . En cuant o a su rol en
la virulencia,
se sabe que la pérdida de cápsula facilit a la
int ernalización en células endot eliales ( 101) .
1 .4 .2 . Adh e sin a s
Para iniciar la infección, S. aureus debe adherirse a la m at riz
ext racelular y a las células eucariot as a t ravés de diferent es
prot eínas de superficie llam adas “ adhesinas” . Muchas de est as
prot eínas que se anclan a la pared de S. aureus fueron agrupadas
23
baj o
la
sigla
MSCRAMMs
por
“ com ponent es
m icrobianos
de
superficie que reconocen m oléculas adhesivas de la m at riz” . Ent re
ellas se encuent ran las prot eínas FnBP- A, FNBP- B, SpA, fact or de
agrupam ient o A y B ( ClfA y ClfB) , ent re ot ras ( 59) .
Ot ro grupo de adhesinas son las designadas SERAMs por
“ repert orio expandido de m oléculas adhesivas secret ables” . Est as
prot eínas poseen la capacidad de ser secret adas al m edio y luego
volver a unirse a la superficie bact eriana. A est e grupo pert enecen
Em p, Coa, prot eína de unión al fibrinógeno ext arcelular ( Efb) y Eap
( 91) .
1 .4 .2 .1 . Ea p
Eap es una adhesina m ult im érica secret ada de 62 KDa que
j uega un rol clave en el est ablecim ient o de la bact eria para causar
la enferm edad. Est a prot eína se com pone de 3 dom inios diferent es
que se unen form ando t et rám eros ( 47) . Hast a el m om ent o, se han
descript o 3 análogos de Eap ( 50, 65 y 72 KDa) en las cepas Mu50,
FDA574 y Wood 46, respect ivam ent e ( 36, 57, 61) . El 98% de los
aislam ient os de S. aureus secret an alguna form a de est a prot eína
( 11) . Eap est á regulada principalm ent e por sae, ya que se ha
dem ost rado que una m ut ant e sae no expresa niveles det ect ables de
est a adhesina ( 49) .
La im port ancia de Eap en la adherencia de S. aureus a células
eucariot as
ha
sido
dem ost rada
por
una
dism inución
en
la
adherencia de una m ut ant e eap a fibroblast os y células epit eliales.
Asim ism o, los ant icuerpos ant i- Eap reducen la int ernalización de S.
aureus ( 45, 53, 69) . Eap t iene un am plio rango de unión a
prot eínas plasm át icas incluyendo Fn, Fg y prot rom bina ( 132) .
Debido a su afinidad dual por prot eínas plasm át icas y por la
superficie bact eriana, cuando Eap es agregada exógenam ent e se
24
produce un aum ent o significat ivo de la adherencia de S. aureus a
fibroblast os y células epit eliales ( 53, 54, 98) . Por ot ro lado, Eap
posee la habilidad de generar aglut inación de las bact erias, ya que
est a prot eína t iene una fuert e t endencia a form ar agregados
m ult im éricos ( 54) .
Las funciones de Eap cobran aún m ás im port ancia si las
FnBPs est án ausent es, com o en el caso de la cepa Newm an de S.
aureus, que present a un codón de t erm inación prem at uro en los
genes que
codifican
para
FnBP- A y
B,
generando
prot eínas
t runcadas ( 43) . Adem ás, la prot eína Eap es expresada en alt os
niveles
en
la
cepa
Newm an
respect o
a
lo
observado
para
aislam ient os clínicos y ot ras cepas de S. aureus com o la RN6390
( 62) .
Por
lo
t ant o,
en
la
cepa
Newm an,
Eap
com pensaría
parcialm ent e la pérdida de unión a Fn.
Por ot ro lado, se han dem ost rado los pot enciales efect os de la
int eracción de Eap con el huésped, que incluyen m odulación de
células T e inhibición de la ext ravasación de leucocit os ( 16, 74) . La
m olécula de adhesión int racelular 1 ( I CAM- 1 o CD54) es expresada
por células endot eliales y act úa com o recept or para int egrinas,
int erviniendo en la adhesión firm e de los leucocit os al endot elio
( 13) . Eap int eract úa con I CAM- 1 sobre las células endot eliales y de
est a m anera est aría inhibiendo el reclut am ient o de neut rófilos a la
zona inflam ada ( 16) . Es por ello que se ha sugerido que Eap podría
act uar com o un fact or ant iinflam at orio. Sin em bargo, ot ros est udios
revelan que Eap t am bién podría t ener un rol proinflam at orio, ya que
su int eracción con I CAM- 1 induciría la sínt esis de I L- 6 y TNF- α
( 116) .
25
1 .5 . I n t e r a cción de S. a u r e u s con cé lu la s e u ca r iot a s
La adherencia de S. aureus a las células del huésped es el
prim er paso de la infección, m ient ras que su habilidad para
sobrevivir en el am bient e int racelular es clave para la persist encia
de est e pat ógeno. Varios t rabaj os han dem ost rado la capacidad de
S. aureus para int ernalizarse y sobrevivir en células fagocít icas no
profesionales
( 4,
58,
87,
133) .
Más
aún,
recient em ent e
se
est ableció que S. aureus perm anece viable dent ro del m acrófago
por 4 días, para luego escapar de las vacuolas int racelulares hacia
el cit oplasm a y provocar la m uert e celular. Los aut ores post ularon
que
est a
est rat egia
podría
ser
una
pot encial
nueva
vía
de
disem inación de est a bact eria pat ógena ( 70) .
Las FnBPs son requeridas para el proceso de int ernalización
en células eucariot as ( 119) . Se propuso que la afinidad de la FnBP
por la Fn unida a β1- int egrinas result aría en la act ivación de vías de
señalización int racelular en el huésped, lo cual llevaría a la
fagocit osis m ediada por act ina de la bact eria adherida ( 50) . Sin
em bargo, a pesar de que las FnBPs j uegan un rol crucial en el
proceso de int ernalización, no son indispensables, ya que S. aureus
es capaz de ser int ernalizado aún en ausencia de est as prot eínas
( 10) . Más aún, no se encont ró correlación ent re el grado de
int ernalización y la cant idad de FnBPs producidas por algunas cepas
de S. aureus ( 52) . Por ot ra part e, la unión de Eap a I CAM- 1
facilit aría la adherencia de S. aureus a células endot eliales ( 16) .
Est o indica que el proceso de int ernalización de S. aureus es
com plej o
y
depende
t am bién
de
la
presencia
de
prot eínas
secret adas com o Eap, adem ás de las prot eínas covalent em ent e
unidas a la pared ( 45, 48, 53) .
26
2 . Ácido sa licílico
Las drogas ant iinflam at orias no est eroideas son ut ilizadas
am pliam ent e
com o
agent es
analgésicos,
ant ipirét icos
y
ant iinflam at orios en el t rat am ient o de diferent es pat ologías. Com o
ej em plo de est os com puest os se pueden cit ar a los salicilat os, com o
la aspirina; profenos, com o el ibuprofeno; ácidos arilalcanoicos,
com o el diclofenac; ent re ot ros.
En
part icular,
la
aspirina
es ingerida
regularm ent e
por
m illones de individuos en t odo el m undo debido a sus conocidas
propiedades analgésicas y t am bién es prescript a con propósit os
definidos, incluyendo la prevención de infart os y el t rat am ient o del
cáncer ( 66, 127) . El com puest o act ivo de la aspirina, el ácido
acet ilsalicílico
ciclooxigenasas
( ASA) ,
1
y
inhibe
2
la
( COX- 1
act ividad
y
2) ,
que
cat alít ica
son
las
de
las
enzim as
responsables de la sínt esis de m oléculas proinflam at orias com o las
prost aglandinas a part ir del ácido araquidónico ( 85) . La COX- 1 se
expresa const it ut ivam ent e en t odos los t ej idos, pero especialm ent e
en el riñón y en el t ract o gast roint est inal. Su act ividad radica en la
prot ección del epit elio gást rico, de la función renal y de la
agregación plaquet aria. La COX- 2, por el cont rario, es inducible por
det erm inados est ím ulos com o algunos m ediadores quím icos de la
inflam ación, por lo t ant o m ant iene los m ecanism os inflam at orios y
am plifica las señales dolorosas que surgen en las áreas inflam adas.
El ASA inhibe m ás fuert em ent e la acción de COX- 1 que la de COX- 2
( 85, 88) .
La aspirina t iene una vida m edia relat ivam ent e cort a en el
plasm a hum ano ( 20 m in) , ya que es rápidam ent e desacet ilada y
convert ida a ácido salicílico ( SAL) . Por lo t ant o, el SAL sería el
responsable de las acciones ant iinflam at orias, ant icancerígenas y
ant ineurodegenerat ivas
de
la
aspirina.
El
SAL
no
inhibe
direct am ent e a COX- 1 y COX- 2, ya que no cuent a con el grupo
27
acet ilo requerido para est a acción. Sin em bargo, inhibiría por algún
ot ro m ecanism o aún desconocido la sínt esis de prost aglandinas
( 134) . Est udios recient es han dem ost rado que el SAL t iene diversas
act ividades celulares y m oleculares incluyendo el cont rol de la
expresión génica. Al respect o, el SAL inhibe la act ivación del fact or
de t ranscripción nuclear κB ( NFκB) y de c- Jun ( reguladores de la
expresión de genes proinflam at orios y de genes involucrados en
ot ros
procesos
celulares
com o
crecim ient o,
diferenciación
y
apopt osis) a concent raciones suprafarm acológicas ( 0,01 – 5 m M) ,
m ient ras que a concent raciones farm acológicas ( m ayor a 5 m M)
suprim e la t ranscripción de COX- 2 inducible ( 24, 68) . Por ot ro lado,
la expresión
recept ores
de I CAM- 1
celulares
por
es inducida por
part e
de
la est im ulación
m ediadores
de
inflam at orios,
incluyendo lipopolisacárido y cit oquinas y es regulada por NF- κB
( 14, 120) . Al respect o, células endot eliales de vena de cordón
um bilical hum ano ( HUVEC) est im uladas con LPS y t rat adas con
salicilat o de sodio a dist int as concent raciones ( ent re 2 y 20 m M)
present aron una expresión dism inuida de NF- κB y de I CAM- 1 ( 136) .
El SAL, adem ás de afect ar a las células eucariot as, t am bién es
capaz de ej ercer su acción sobre bact erias. En cuant o al rol de est e
com puest o en la virulencia bact eriana, se dem ost ró que el SAL
afect ó la fisiología de Pseudom onas aeruginosa y
at enuó su
virulencia m odificando la expresión de 331 genes ( 109) . Por ot ro
lado, la conform ación en biopelícula de la cepa 8325 de S. aureus y
su adherencia a la raíz de Arabidopsis t haliana fue dism inuida por
baj as
concent raciones
de
SAL
( 108) .
Asim ism o,
un
est udio
realizado ut ilizando un m odelo de endocardit is en conej o dem ost ró
que el t rat am ient o con SAL dism inuyó la expresión de Hla y FnBP
en S. aureus ( 72, 73) . Riordan et al. ( 112) observaron un fenot ipo
m enos adherent e luego del t rat am ient o de S. aureus con SAL
result ando en la at enuación de la virulencia. Adem ás, el crecim ient o
en presencia de SAL de Klebsiella pneum oniae produj o una sínt esis
28
dism inuida de su gruesa cápsula ( 22, 23) . Tam bién se dem ost ró
que los efect os del SAL incluyen la act ivación del operon sigB, el
cual posee un rol im port ant e en la m odulación de la expresión de
reguladores
globales
crecim ient o
de
S.
de
S.
aureus
aureus
en
( 72,
presencia
97) .
de
Asim ism o,
SAL
reduj o
el
la
suscept ibilidad a m últ iples ant ibiót icos ( 44, 105- 107) .
El conj unt o de observaciones respect o del com ponent e act ivo
de la aspirina y las m odificaciones que ést e provoca en la virulencia
bact eriana
abre
nuevos
int errogant es
sobre
est e
fárm aco
am pliam ent e ut ilizado y conocido desde hace m ás de 100 años.
29
H ipót e sis
S. aureus coloniza asint om át icam ent e las narinas de hum anos
pero t am bién es capaz de causar sim ples infecciones en la piel a
severas infecciones que pueden llevar a la m uert e. Para generar
est as enferm edades S. aureus debe adapt arse a los diferent es
am bient es del huésped. Es por ello que est e pat ógeno expresa
diferencialm ent e sus fact ores de virulencia de acuerdo a la acción de
los sist em as que los regulan. Por ciert o, la producción de los fact ores
de virulencia secret ados, adhesinas y PC puede ser m odificada por
diversos est ím ulos am bient ales que act úan com o señales de los
sist em as regulat orios de
S.
aureus.
En
part icular,
el
SAL es
am pliam ent e ut ilizado en el m undo baj o la form a de aspirina. Est e
com puest o m odifica la expresión de diversas m oléculas en las células
eucariot as, así com o t am bién en algunos pat ógenos bact erianos.
Por lo t ant o, est e t rabaj o post ula que el SAL al act uar com o
una señal am bient al podría ej ercer su efect o sobre la expresión de
los
fact ores
de
virulencia
necesarios
para
la
colonización
e
int ernalización celular de S. aureus, así com o t am bién sobre los
sist em as regulat orios que los cont rolan. Adem ás, el SAL induciría
cam bios en el huésped que afect arían su int eracción con est e
pat ógeno. De est e m odo el curso de la infección podría verse
alt erado en aquellos pacient es infect ados con S. aureus que
ingieren aspirina regularm ent e.
Obj e t ivo ge n e r a l
El
obj et ivo
del
present e
t rabaj o
de
invest igación
fue
caract erizar el efect o del SAL sobre la int ernalización celular y
colonización de S. aureus, así com o t am bién est udiar los cam bios
30
inducidos por el SAL en el huésped y en est e pat ógeno que
m odifican la int eracción ent re am bos.
Obj e t ivos e spe cíficos
I ) I nvest igar el efect o del SAL sobre la capacidad de int ernalización
de S. aureus en células epit eliales.
I I ) Evaluar el im pact o del SAL sobre la expresión t ranscripcional y
fenot ípica de PC5 e invest igar su efect o biológico.
I I I ) Est udiar si el SAL afect a la expresión de prot eínas en S. aureus.
I V) Det erm inar los cam bios inducidos por el SAL sobre la expresión
de Eap a nivel t ranscripcional y fenot ípico e invest igar su efect o
biológico.
V) Evaluar la acción del SAL sobre los reguladores globales sae y
m grA.
VI ) I nvest igar si m grA t iene alguna acción regulat oria sobre Eap.
VI I ) Est udiar los efect os del SAL sobre las células endot eliales
det erm inando la capacidad de int ernalización bact eriana, así com o
t am bién la expresión de TNF- α y de I CAM- 1.
VI I I ) Est ablecer la acción del SAL en la colonización de S. aureus in
vivo.
31
1 . Ce pa s ba ct e r ia n a s
Las cepas bact erianas usadas en est e t rabaj o se list an en la
t abla 1. Todas las cepas se conservaron a - 20º C en caldo t ript eína
de soj a ( TSB) ( Difco) con 20% de glicerol. S. aureus se cult ivó a
37°C, 200 rpm por 18 h en caldo CYGP ( casam inoácido s 10 g/ lit ro,
ext ract o de levadura 10 g/ lit ro, glucosa 5 g/ lit ro, NaCl 5.9 g/ lit ro y
glicerofosfat o 60 m M) sin glucosa ( CYGPw ) ( 93) . Se adicionaron
0.36 m M o 2 m M de SAL al m edio de cult ivo cuando fue necesario.
La cepa AH12pCXEap se cult ivó en LB y luego de 2 h de incubación
se adicionó xilosa a una concent ración final de 0,5% ( v/ v) para
inducir la expresión del plásm ido. Para los experim ent os de invasión
celular, se precipit aron las bact erias por cent rifugación, se lavaron
con solución fisiológica est éril y se suspendieron en m edio de
invasión a una densidad igual a 10 7 UFC/ m l.
2 . Anim a le s
Los experim ent os in vivo se llevaron a cabo ut ilizando rat ones
m achos exocriados de la cepa CF- 1 de 6 a 8 sem anas de edad. Los
anim ales fueron provist os por el biot erio del Depart am ent o de
Microbiología de la Facult ad de Medicina, Universidad de Buenos
Aires. Los rat ones se m ant uvieron durant e los experim ent os en
condiciones est ándar con una diet a de m ant enim ient o ( Alim ent o
Balanceado Cooperación) y agua corrient e acidificada con HCl de
acuerdo a las norm as para el Cuidado y Uso de Anim ales de
Laborat orio. Los anim ales se sacrificaron por asfixia con CO2 .
3 . Cu lt ivo ce lu la r
3 .1 . Cé lu la s e pit e lia le s
Se ut ilizó la línea est ablecida de células epit eliales de glándula
m am aria bovina MAC- T ( gent ilm ent e cedida por Nicolas Léem e,
32
Nexia Biot echnologies I nc.) . El m edio em pleado para su crecim ient o
fue DMEM ( Dulbeco´ s Modified Eagle´ s Medium ) ( GI BCO) con 10%
de suero fet al bovino ( SFB) ( GI BCO) inact ivado por calor, 5 µg/ m l
de insulina, 1 µg/ m l de hidrocort isona ( Sigm a) , 44 m M de NaHCO3 ,
100 U/ m l de gent am icina y 100 µg/ m l de sulfat o de est rept om icina.
Ant es de cada experim ent o, se sem braron 1.5x10 5 células/ pocillo
en placas de cult ivo de 24 o 48 pocillos y se crecieron durant e 24 h
a 37º C con 5% de CO2 ( 12) .
3 .2 . Cé lu la s e n dot e lia le s
Se ut ilizó la línea est ablecida de células endot eliales hum anas
EA.hy926. Est a línea celular es un hibridom a inm ort alizado de
células HUVEC y la línea celular A549 ( 27) . Se cult ivaron en m edio
DMEM con 10%
de SFB inact ivado por calor, 100 U/ m l de
gent am icina, 100 µg/ m l de sulfat o de est rept om icina y 100 U/ m l de
penicilina. Las células se incubaron durant e 48 h en placas de 24
pocillos a 37º C con 5% de CO2 .
4 . En sa yo de in va sión
Las m onocapas de células epit eliales o endot eliales crecidas
en confluencia se incubaron o no con SAL 2 m M ( Sigm a) durant e 2
h previam ent e a la infección. Post eriorm ent e, las células se lavaron
con buffer salino de fosfat o ( PBS) ( GI BCO) y se suspendieron en
m edio DMEM fresco. Luego, las m onocapas celulares se infect aron
con una suspensión de S. aureus ( m oi= 40) que cont enía o no SAL
2m M. Transcurrida 1 h de incubación a 37º C con 5% CO2 , se
realizaron 4 lavados con PBS para descart ar la bact eria ext racelular
no adherida y se agregó a cada pocillo m edio DMEM con 25 µg/ m l
de lisost afin ( Sigm a) cont eniendo o no SAL 2 m M. Luego de la
incubación a 37º C con 5% CO2 , se descart aron a diferent es t iem pos
33
los sobrenadant es de los pocillos o se congelaron a - 70º C y se
lavaron las m onocapas con PBS. Las células se t rat aron con 100 µl
de t ripsina 0.25% - EDTA 0.1% ( GI BCO) durant e 5 m in a 37º C y se
lisaron por el agregado de 900 µl de Trit ón X- 100 0.025% en agua
dest ilada. Los lisados celulares se diluyeron serialm ent e y se
sem braron
en
placas de agar
t ript eina
de soj a
( TSA)
para
cuant ificar la bact eria int racelular viable ( 12) .
5 . ELI SA pa r a de t e ct a r TN F- α
Se ut ilizó el equipo com ercial BD Opt EI A I I ( BD Biosciences) y
se siguieron las inst rucciones del fabricant e. Brevem ent e, se
adicionaron 100 μl de m uest ra o solución est ándar de TNF- α a una
placa de 96 pocillos revest ida con ant icuerpos m onoclonales ant i-
TNF- α hum ano. Se incubaron las placas a t em perat ura am bient e
por 2 h. Se realizaron 5 lavados con la solución correspondient e y
se agregaron 100 μl de la solución de ant icuerpo m onoclonal
biot inilado
ant i- TNF- α hum ano
est rept avidina.
Luego
de
1
h
y
peroxidasa
de
incubación
conj ugada
a
a
t em perat ura
am bient e, se realizaron 7 lavados. Post eriorm ent e, se adicionaron
100 μl de 3,3',5,5'- t et ram et ilbenzidina ( TMB) y las placas se
incubaron a t em perat ura am bient e durant e 30 m in. Luego, se
agregaron 50 μl de la solución com ercial para det ener la reacción y
se leyó la absorbancia a 450 nm en un lect or de ELI SA ( Term o
elect ron, Mult iskan ex) . La concent ración de TNF- α se calculó
com parando los valores de absorbancia obt enidos con la curva
est ándar.
34
Ta bla 1 . Cepas y plásm idos ut ilizados.
Ce pa /
plá sm ido
Ce pa s
Newm an
Newm ansae
RN6390
RN6390sae
JL278
JL801
AH12
AH12pCXEap
ALC2547
ALC4483
ALC4241
ALC1842
ALC5163
ALC6141
ALC3257
R11
R0
R11eap
Plá sm idos
pALC1484
pALC2335
pALC1766
pALC4991
pALC2566
pCXEap
D e scr ipción
Fu e nt e
Aislam ient o clínico ( ATCC 25904) ; PC5+
Mut ant e sae por t ransducción ( saeS: : erm B)
Cepa de laborat orio relacionada a 8325- 4
Mut ant e sae por t ransducción ( saeS: : erm B)
Cepa Reynolds; PC5+
Mut ant e isogénica de Reynolds ( PC5+ ) que no
expresa PC5
Mut ant e eap de la cepa Newm an ( eap: : erm C)
AH12 com plem ent ada con pCXEap
Mut ant e
m grA
de
la
cepa
Newm an
( m grA: : erm C)
Mut ant e sae por deleción de la cepa Newm an
Newm an con pALC2335
Newm an con pALC1766
Newm an con pALC4991
Newm an con pALC2566
Newm an con pALC1484
Newm an con plásm ido cont eniendo FnBP
salvaj e
Newm an con plásm ido cont eniendo FnBP
defect uosa
Mut ant e eap de R11
( 26)
Est e t rabaj o
( 71)
( 121)
( 131)
( 131)
Derivado de pSK236 que cont iene el gen gfp uvr
sin prom ot or precedido por un sit io de unión al
ribosom a de S. aureus
Derivado de pALC1484 que cont iene el
prom ot or del gen eap río arriba del gen gfp uvr
Derivado de pALC1484 que cont iene el
prom ot or principal del gen cap5 río arriba del
gen gfp uvr
Derivado de pALC1484 que cont iene el
prom ot or sae Pc río arriba del gen gfp uvr
Derivado de pALC1484 que cont iene el
prom ot or m grA río arriba del gen gfp uvr
Plásm ido
pCX19
inducible
por
xilosa
cont eniendo el gen eap
( 53)
( 53)
( 55)
( 75)
Est e t rabaj o
( 126)
( 75)
( 55)
( 83)
Dr. Massey
Dr. Massey
Dr. Massey
( 83)
Dr. Cheung
( 126)
( 75)
( 56)
( 53)
6 . D e t e cción de I CAM - 1 por cit om e t r ía de flu j o
Las células EA.Hy926
se incubaron
con
las cepas bact erianas
respect ivas y se t rat aron con SAL 2 m M según lo descript o en el
punt o 4 de Mat eriales y Mét odos. Para el cont rol posit ivo de
est im ulación de la expresión de I CAM- 1 las células se incubaron con 1
μg/ m l de LPS de la cepa de E. coli 0111: B4. La expresión de I CAM- 1
35
se det ect ó a las 6 h post infección. Brevem ent e, las células se
t rat aron con t ripsina 0,25% - EDTA 0,02% y se incubaron a 4º C con
una dilución 1/ 400 del ant icuerpo ant i- CD54 hum ano conj ugado a
peroxidasa
( clon
HA58,
BD
Pharm ingen)
durant e
20
m in
en
oscuridad. A fin de det ect ar la unión no específica, el ant icuerpo ant iCD54 se reem plazó por una concent ración equivalent e de I gG1
inespecífica. Luego, las células se lavaron con PBS, se fij aron con
paraform aldehído 1% durant e 15 m in a 4º C y se analizaron en un
cit óm et ro de fluj o ( cit ofluoróm et ro FACScan, program a FCS Express
V3) . El cit óm et ro se calibró para exam inar 10000 células por
experim ent o. Los um brales para calcular el porcent aj e de células
posit ivas se det erm inó m ediant e el uso de cont roles de isot ipo.
7 . M icr oscopía de flu or e sce n cia
Las células MAC- T se crecieron sobre cubreobj et os. Luego, se
infect aron con la cepa ALC4241 de S. aureus ( m oi: 30) y se
incubaron durant e 1 h a 37º C en at m ósfera con 5% de CO2 . Luego
de la infección, las m onocapas se lavaron con PBS 1X y se t rat aron
con lisost afin 25 μg/ m l durant e 1 h. Los cubreobj et os se lavaron
con PBS 1X y se t iñeron con los colorant es fluorescent es azul de
Evans y 4',6- diam idino- 2- fenilindol ( DAPI ) que t iñen el cit oplasm a
de roj o y el ADN doble cadena de azul, respect ivam ent e ( Merck) .
Los
cubreobj et os
se
visualizaron
baj o
un
m icroscopio
de
fluorescencia ( Nikon, Eclipse 600) .
8 . Ex t r a cción de AD N pla sm ídico
La ext racción de ADN plasm ídico se realizó ut ilizando el
equipo com ercial QI Aprep Miniprep ( QI AGEN) de acuerdo a las
inst rucciones del fabricant e, previo t rat am ient o de la bact eria con
lisozim a ( 10 m g/ m l) ( Sigm a) y lisost afin ( 5 m g/ m l) . Los product os
36
de la ext racción se cuant ificaron por elect roforesis en gel de
agarosa
al
0,8%
en
buffer
TBE 1X ( Tris- Borat o
EDTA)
por
com paración con un m arcador de peso m olecular y concent ración
( Precision Mass) ( Bio- Rad) .
9 . Pr e pa r a ción de cé lu la s com pe t e n t e s
Se realizó un cult ivo en 3 m l de caldo LB a part ir de una
colonia aislada de S. aureus y se incubó durant e 18 h a 37º C y 200
rpm en un incubador orbit al. Luego, se realizó una dilución 1/ 10 del
cult ivo en caldo LB y se incubó a 37º C con agit ación hast a DO650 :
0,5. El cult ivo se colocó en hielo durant e 15 m in para det ener el
crecim ient o bact eriano. Se cosecharon las células por cent rifugación
a 4º C, 12000 rpm , 15 m in y se realizaron 3 lavados con agua
dest ilada est éril y un lavado con glicerol al 10% . El precipit ado así
obt enido se suspendió en 15 m l de glicerol al 10% y se incubó a
t em perat ura am bient e durant e 15 m in. Las células se cent rifugaron,
se suspendieron en glicerol al 10% , se alicuot aron y se conservaron
a - 70º C.
1 0 . Ele ct r opor a ción de ce pa s ba ct e r ia n a s
Las células com pet ent es de la cepa Newm an de S. aureus se
incubó con el plásm ido a incorporar ( pALC2335) ( Tabla 1) durant e
20 m in a t em perat ura am bient e y luego 10 m in en hielo. La
elect roporación
se
realizó
a
2,3
Kv;
100
Ohm s;
25μF
e
inm ediat am ent e se agregaron 900 μl de caldo TSB. Luego de
incubar las bact erias elect roporadas durant e 1 h a 37º C en baño de
agua,
se
sem braron
en
placas
de
TSA
con
10
μg/ m l
de
cloram fenicol ( Cm ) .
37
1 1 . Tr a n sdu cción de ce pa s ba ct e r ia n a s
Se induj o el ciclo lít ico del fago φ- 11 lisógeno de la cepa de S.
aureus
8325- 4
ut ilizando
1
µg/ m l
de
m it om icina
C.
Las
t ransducciones se realizaron en m edio sólido cont eniendo Cl 2 Ca a
una m oi ent re 0,5 y 1. El lisado obt enido a part ir de la cepa
RN6390sae ( Tabla 1) se ut ilizó para infect ar la cepa Newm an de S.
aureus. Las cepas t ransduct ant es así obt enidas se seleccionaron en
m edio TSA con 10 μg/ m l de erit rom icina ( Em ) .
1 2 . Est u dios de fu sión t r a nscr ipcion a l
Se realizaron diluciones 1/ 100 de los cult ivos de S. aureus y
se incubaron a 37º C con agit ación en caldo CYGPw con el agregado
de 50
µg/ m l ( 0,36
m M)
de SAL cuando fue necesario.
Se
t ransfirieron las alícuot as t om adas a cada hora a m icroplacas de 96
pocillos y se m idieron la densidad ópt ica ( DO650 ) y la fluorescencia
( F485/ 516 )
durant e
9
h
en
un
fluoróm et ro
FL600
( BioTek
I nst rum ent s) . La act ividad de los prom ot ores se graficó com o la
m edia de la relación F/ DO para m inim izar las variaciones por
cam bios en la densidad ópt ica ent re experim ent os. Se ut ilizaron los
valores m edios de t res lect uras para realizar la est adíst ica.
1 3 . Ex t r a cción de ARN
El ARN bact eriano se ext raj o ut ilizando Trizol ( Gibco BRL) y
esferas de silica de 0.1 m m de diám et ro en un agit ador de alt a
velocidad ( Biospec) de acuerdo con las inst rucciones del fabricant e
a part ir de cult ivos en DO650 : 1,3. El ácido nucleico ext raído se t rat ó
con
ADNasa
usando
el
equipo
com ercial
TURBO
DNAfreeTM
( Am bion) siguiendo el prot ocolo del fabricant e. La cuant ificación del
ARN ext raído se realizó espect rofot om ét ricam ent e m ediant e lect ura
de la absorbancia a 260 nm .
38
14.
Re a cción
en
ca de n a
de
la
polim e r a sa
de
t r a n scr ipción r e ve r sa e n t ie m po r e a l ( qRT- PCR)
La sínt esis del ADNc se realizó con el equipo com ercial
Transcript or
First
St rand
cDNA
Synt hesis
( Roche)
ut ilizando
cebadores al azar. La PCR en t iem po real se llevó a cabo usando los
equipos Light Cycler Fast St art DNA Mast er SYBR Green I ( Roche) y
los siguient es pares de cebadores: cap5H- f 5´ - CCA GTG AAT TGT
TTG CAA CG- 3´ ; cap5H- r 5´ - CAT TTT CCC AAT AAA TGT TGA AAG3´ ; m grA- f 5'- GGG ATG AAT CTC CTG TAA AC- 3'; m grA- r 5'- GCT
GAA GCG ACT TTG TCA GA- 3'; saeRS- f 5´ - ATG CTA ATA CCG TGA
ATG TCC A- 3´ ; saeRS- r 5´ - TGG CCG TTA AAC CAC ATT AAA- 3´
( am plifican los t ranscript os sae de 3,1; 2,4; y 2,0 Kb) ; gyrB- f 5´ GGT GCT GGG CAA ATA CAA GT- 3´ ; y gyrB- r 5´ - TGG GAT ACC ACG
TCC GTT AT- 3´ . La sínt esis del t ranscript o gyrB se ut ilizó com o
calibrador y com o cont rol int erno para norm alizar los dat os. Las
condiciones de ciclado fueron 95º C por 10 m in seguidos por 45
ciclos de 95º C por 10 s, 55º C por 10 s y 72º C por 15 s, y 1 ciclo de
40º C por 30 s. El núm ero de copias de cada m uest ra se det erm inó
con el program a Light Cycler. Se est ableció el análisis con unidades
arbit rarias t om ando com o 1 al nivel de t ranscript os de la cepa sin
t rat ar norm alizada al t ranscript o gyrB. Adem ás, se realizó el análisis
según Lyvak et al. ( 76) en el cual, el valor - ΔΔCT represent a la
diferencia del ciclo um bral ( CT) ent re el blanco y el cont rol ( gyrB)
t rat ados con SAL m enos la diferencia en CT ent re el gen blanco y
cont rol no t rat ados.
1 5 . RT- PCR
El ADNc se sint et izó com o se describió previam ent e. A part ir
del ADNc se realizó una RT- PCR ut ilizando los siguient es cebadores
específicos: eap- f 5’- TAG AGG TAT CGG GGA ACG TG- 3’; eap- r 5’
TTG GTG TTG ATG TGC CAT TT- 3’; gyrB- f 5´ - GGT GCT GGG CAA
39
ATA CAA GT- 3´ ; y gyrB- r 5´ - TGG GAT ACC ACG TCC GTT AT- 3´ .
Las condiciones de ciclado fueron: 94º C por 5 m in seguido de 20
ciclos de 94º C por 30 s, 58º C por 30 s y 72º C por 30 s, y 1 ciclo de
72º C por 7 m in. Los t ranscript os am plificados se visualizaron a
t ravés de elect roforesis en geles de agarosa t eñidos con BrEt .
1 6 . Pr e pa r a ción de e x t r a ct os de a n t íge n os ca psu la r e s
S. aureus se cult ivó por 24 h a 37º C en agar Colum bia ( Difco)
suplem ent ado con 2% de NaCl para favorecer la producción de PC y
cont eniendo 0.36 o 2m M de SAL cuando fue necesario. Los
cont roles se cult ivaron en el m ism o m edio, pero sin el agregado de
SAL. Se cosecharon t odas las colonias de una placa en 1 m l de PBS
10 m M ( NaCl 0.15 M, pH 7.2) y las suspensiones bact erianas se
aut oclavaron por 1 h a 121º C. Las bact erias se precipit aron por
cent rifugación a 10000 x g y los sobrenadant es se filt raron con
filt ros de 0,45 nm . Los ext ract os capsulares se conservaron a 20º C. Las cepas Reynolds PC5+ y PC- se ut ilizaron com o cont roles
posit ivo y negat ivo de expresión capsular, respect ivam ent e ( 123) .
1 7 . Ex pr e sión de PC por in m u n opr e cipit a ción
Sobre un port aobj et os se preparó un gel delgado de agarosa
al 1% y se realizaron ocho orificios circulares alrededor de un
orificio cent ral. En el orificio cent ral se adicionaron 30 μl de
ant isuero capsular t ipo 5 absorbido y sobre los dem ás orificios se
agregaron 30 μl de diluciones seriadas al m edio de los ext ract os
bact erianos, incluyendo los cont roles posit ivo y negat ivo ( 65) . El
port aobj et os se colocó en una cám ara húm eda a t em perat ura
am bient e
para
perm it ir
la
inm unodifusión
de
los
ant ígenos
capsulares y del ant isuero. Luego de 24 h las líneas de precipit ación
40
se fij aron por sucesivos lavados con NaCl 0,3 y 0,15 M y se
visualizaron m ediant e t inción con azul de Coom assie.
1 8 . Ex t r a cción de pr ot e ín a s de pa r e d con lisost a fin
Un cult ivo de 30 m l de S. aureus incubado durant e 20 h en
CYGPw se cent rifugó 15 m in a 3600 x g. El sobrenadant e
se
reservó
El
para
preparar
las
exoprot eínas
( ver
punt o
19) .
precipit ado se suspendió en 0,6 m l de buffer de digest ión ( sacarosa
30% en 0,05 M Tris pH 7.5 con NaCl 0.145 M) cont eniendo 100 μg
de lisost afin. La solución de sacarosa se ut ilizó com o m edio
hipert ónico para est abilizar
los prot oplast os que se form aron
durant e la digest ión con lisost afin. Se adicionó fenilm et ilsulfonil
fluorado ( PMSF) 1m M para cont rolar la act ividad prot eolít ica de las
enzim as liberadas durant e la lisis celular. La m ezcla celular se
incubó durant e 1 h a 37º C con rot ación a 24 rpm . Los prot oplast os
se rem ovieron por cent rifugación a 8000 x g por 10 m in, y el
sobrenadant e se volvió a cent rifugar en las m ism as condiciones. El
sobrenadant e
cont eniendo
los ant ígenos de
pared
celular
se
alicuot ó y se conservó a - 70°C ( 20) .
1 9 . Pr e pa r a ción de e x opr ot e ín a s
Las
exoprot eínas
cont enidas
en
el
sobrenadant e
por
cent rifugación en el punt o 18, se precipit aron adicionando 3 m l de
ácido t ricloroacét ico al 100% ( Sigm a) . Luego de la incubación
durant e 18 h a 4º C, el precipit ado se cent rifugó 70 m in a 8500 x g
y a 4º C. Finalm ent e se efect uaron t res lavados con et anol helado al
70% . Las prot eínas se secaron al aire durant e 30 m in. Los ext ract os
se disolvieron en 0,5 m l de Tris 0,1 M cont eniendo PMSF 2m M y las
alícuot as se conservaron a - 70º C ( 5) .
41
2 0 . Solu biliza ción de pr ot e ín a s de su pe r ficie
Se cult ivaron las bact erias en CYGPw a 37º C, 200 rpm hast a
DO600 : 1,3 y se cent rifugaron 5 m in a 6000 x g. El precipit ado se
suspendió en 0,5 m l de duodecil sulfat o de sodio ( SDS) 2%
( Sigm a) , se calent ó a 95º C por 5 m in, y se cent rifugó durant e 5
m in a 10000 x g. El sobrenadant e se alicuot ó y se conservó a - 70º C
( 53) .
2 1 . Ele ct r ofor e sis e n ge l de polia cr ila m ida con du ode cil
su lfa t o de sodio ( SD S- PAGE)
Todas las m uest ras prot eicas se separaron en un gel de
poliacrilam ida al 12% . El gel separador al 12% se com puso de 4 m l
de acrilam ida 30% / bisacrilam ida 8% ; 2,5 m l de Tris HCl 1,5 M pH
8,8; 3,3 m l de agua dest ilada; 0,1 m l de SDS 10% ; 0,1 m l de
persulfat o
de
am onio
10% ;
4
μl
de
t et ram et ilet ilendiam ina
( TEMED) . El gel concent rador al 4% se com puso de 1,3 m l de
acrilam ida 30% / bisacrilam ida 8% ; 2,5 m l de Tris HCl 0,5 M pH
6,8; 6,1 m l de agua dest ilada; 0,1 m l de SDS 10% ; 50 μl de
persulfat o de am onio 10% ; 10 μl de TEMED. Las m uest ras se
suspendieron en buffer de Laem m li 5X ( SDS 10% ; glicerol 50% ;
azul de brom ofenol 0,3% ; Tris- HCl 50m M; β- m ercapt oet anol 5% ) ,
se hirvieron durant e 3 m in y se sem braron en los pocillos del gel. El
gel se sum ergió en buffer de corrida 1X y se corrió a 40V durant e
30 m in y a 110V por 2 h. Luego, los geles se t iñieron con azul de
Coom assie 0,25% durant e 15 m in y se decoloraron con 3 cam bios
de solución de dest inción ( m et anol 30% , ácido acét ico 10% y agua
dest ilada 60% ) .
42
2 2 . M ode lo m u r in o de colon iza ción n a sa l
Grupos de 10 rat ones m achos se inocularon con 150 μl de
SAL 100 m M o con PBS 1X por vía int raperit oneal. Luego de 30 m in,
am bos grupos de rat ones se inocularon por vía int ranasal ( ina) con
10 μl de una suspensión bact eriana de 1x10 7 UFC en solución
fisiológica. A las 4 h los rat ones se sacrificaron, las narinas se
ext irparon y se realizaron hom ogenat os en 400 μl de TSB. Alícuot as
de las m uest ras así obt enidas se sem braron en placas de TSA para
det erm inar el núm ero de UFC/ m l. Luego de 24 h a 37º C se
cont aron las colonias.
2 3 . Aná lisis e st a díst ico
Los dat os no param ét ricos se analizaron con el t est MannWhit ney ut ilizando el program a GraphPad ( PRI SM, version 4.0) . Se
consideraron significat ivos los valores de P m enores a 0,05. Los
dat os provenient es de los ensayos de ELI SA se analizaron con el
t est Kruskal- Wallis. Los dat os provenient es de las qRT- PCR se
analizaron según lo propuest o por Livak et al ( 76) .
43
1 . Efe ct o de l SAL sobr e la ca pa cida d de in t e r n a liza ción
de S. a u r e u s e n cé lu la s e pit e lia le s
Trabaj os
previos
dem ost raron
una
dism inución
en
la
capacidad de adherencia de S. aureus a células endot eliales cuando
las bact erias fueron expuest as al SAL ( 7, 72) . A fin de det erm inar el
efect o del SAL sobre la int ernalización de S. aureus se ut ilizó la
línea est ablecida de células epit eliales MAC- T. Los ensayos de
invasión se llevaron a cabo ut ilizando dos cepas de laborat orio con
bagaj es genét icos diferent es, la cepa Newm an y la cepa RN6390.
En
base
a
lo
report ado
por
ot ros
aut ores
se
ut ilizó
una
concent ración de SAL ( 0,36 m M) , que represent a los niveles
alcanzados en suero hum ano luego de la ingest ión de aspirina en
baj as
dosis
( 72,
90,
99) .
En
experim ent os
prelim inares
se
det erm inó que la concent ración de SAL ut ilizada no afect ó el
crecim ient o de S. aureus.
S. aureus internalizadas
(UFC/ml)
*
500000
Newman
400000
300000
NewmanSAL
RN6390
*
RN6390SAL
120000
60000
0
Figur a 1 . Efe ct o de l SAL sobr e la in t e r na liza ción de S. a ur e us. Se infect ó
una m onocapa de células MAC- T en confluencia con los inóculos bact erianos
previam ent e t rat ados o no con SAL. Cada barra represent a la m ediana de las
UFC/ m l int ernalizadas de un experim ent o represent at ivo de al m enos 3
experim ent os independient es. Newm an: 8,5x10 4 vs Newm an SAL: 1,1x10 5 UFC/ m l,
* p< 0,01; Newm an vs RN6390, * p< 0,01, Mann- Whit ney t est .
Para realizar los ensayos de invasión las m onocapas celulares
se infect aron con una suspensión de S. aureus previam ent e t rat ada
o no con SAL. Transcurrida 1 h de incubación a 37º C en at m ósfera
44
de 5% de CO2 , se agregó lisost afin para elim inar a las bact erias no
adheridas. Luego de 2 h de incubación, las células se lisaron y se
realizaron los recuent os del núm ero de bact erias int racelulares. En
la figura 1 se observa que el t rat am ient o con SAL produj o un
increm ent o significat ivo en la int ernalización de la cepa Newm an.
Sin em bargo, el t rat am ient o con SAL no afect ó la capacidad de
invasión celular de la cepa RN6390. En concordancia con lo
report ado por Pohlm ann- Diet ze et al. ( 101) en células endot eliales,
la cepa RN6390 se int ernalizó en m ayor m edida que la cepa
Newm an en células MAC- T. Cabe dest acar que la cepa Newm an
expresa PC5, m ient ras que la cepa RN6390 no expresa PC debido a
que posee una m ut ación punt ual en el gen esencial capE5 ( 130) .
Por lo t ant o, el efect o del SAL sobre la capacidad de int ernalización
de S. aureus podría ser dependient e de la cepa.
2 . Rol de la cá psu la e n la in t e r n a liza ción
Ot ros aut ores observaron que la ausencia de cápsula genera
una capacidad de adhesión aum ent ada de S. aureus a las células
endot eliales ( 101) . Al respect o, se est ableció que la cepa Newm an
( PC5+ ) se int ernalizó en m enor m edida que la cepa RN6390 ( PC5- )
( Fig. 1) . La diferencia hallada, sin em bargo, no puede ser at ribuida
sólo a la presencia o no de PC, ya que am bas cepas poseen bagaj es
genét icos diferent es. Adem ás, los result ados obt enidos en la figura
1 sugieren que el SAL podría est ar afect ando la producción de PC y
de est a form a m odificar la capacidad de invasión de S. aureus.
Consecuent em ent e, se realizaron ensayos de invasión ut ilizando la
cepa Reynolds ( PC5+ ) y su m ut ant e isogénica acapsular ( PC5- ) en
presencia o no de SAL, a fin de det erm inar el efect o de est e
com puest o sobre la int ernalización de cepas capsuladas.
Los
result ados dem ost raron que la cepa Reynolds capsulada posee una
m enor capacidad de int ernalización com parada con la m ut ant e PC5-
45
( Fig. 2) . Más aún, la cepa Reynolds PC5+ t rat ada con SAL m ost ró
una capacidad de int ernalización significat ivam ent e m ayor respect o
de la no t rat ada. Cabe dest acar que no se observaron diferencias
significat ivas ent re el grado de invasión de la cepa PC5+ t rat ada
S. aureus internalizadas (%)
con SAL y su m ut ant e acapsular no t rat ada ( Fig. 2) .
100
**
50
*
0
PC5-
PC5+
PC5+
SAL
Figur a 2 . Efe ct o de l SAL sobr e la inva sión de ce pa s Re ynolds de S.
a u r e u s. Monocapas de células MAC- T se infect aron con los inóculos bact erianos
previam ent e t rat ados o no con SAL. Se m uest ra el porcent aj e de int ernalización
de S. aureus relat ivo a la cepa PC5- de un experim ent o represent at ivo de al
m enos 3 experim ent os independient es. Cepas Reynolds, PC5+ : 16,3% vs
PC5+ SAL: 79% , * * p< 0,01; PC5- : 100% vs PC5+ : 16,3% , * p< 0,01; MannWhit ney t est .
Est os result ados indican que las cepas capsuladas de S.
aureus t rat adas con SAL exhiben una capacidad increm ent ada para
invadir
células epit eliales MAC- T,
probablem ent e debido a la
expresión dism inuida del PC.
3 . Efe ct o de l SAL sobr e la e x pr e sión de l polisa cá r ido
ca psu la r se r ot ipo 5
Con el fin de confirm ar un descenso en la producción de PC5
provocado por la acción del SAL, se realizaron ensayos de act ividad
t ranscripcional. Est udios previos m ost raron que la expresión del
operón
cap
est á
m anej ada
principalm ent e
por
el
prom ot or
localizado al principio del operón ( 96, 115) .
46
A.
70000
Newman
60000
NewmanSAL
F/DO
50000
Control
*
40000
ControlSAL
30000
20000
10000
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tiempo (h)
2
B.
Newman
NewmanSAL
DO600
Control
ControlSAL
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tiempo (h)
Figur a 3 . Act ivida d de l pr om ot or ca p ba j o la a cción de l SAL. A. La act ividad
del prom ot or se det erm inó por fusión con gfp y m edición de la fluorescencia en
relación con la densidad ópt ica ( F405/ 516 / DO600 ) en función del t iem po. Se m uest ra
un experim ent o represent at ivo de al m enos 3 experim ent os independient es.
Cont rol: cepa Newm an t ransform ada con plásm ido pALC1484 cont eniendo el gen
gfp sin prom ot or. Tiem po 6h, Newm an: 43887 F/ DO vs Newm an SAL: 18461 F/ DO,
* p< 0,0001; Mann- Whit ney t est . B. Crecim ient o bact eriano ( DO600 ) en función del
t iem po.
Por lo t ant o, la expresión del prom ot or cap5 fue m onit oreada
con la fusión del prom ot or prinicipal cap5 al gen gfp m idiendo la
em isión
de
fluorescencia.
I nicialm ent e,
la
cepa
Newm an
t ransform ada con el plásm ido que cont iene la fusión Pcap- gfp
( Tabla 1) se incubó en presencia o ausencia de SAL. A cada hora se
t om aron alícuot as del cult ivo y se m idieron la F485/ 516 para det ect ar
47
la fluorescencia em it ida por la gfp y la DO600 para m edir el
crecim ient o bact eriano. Los result ados obt enidos se analizaron
graficando F485/ 516 / DO600 a fin de independizarse de las diferencias
en el crecim ient o bact eriano que pudieran present ar las cepas.
Los valores de DO600 dem uest ran que el t rat am ient o de la
cepa Newm an con SAL no afect ó su crecim ient o ( Fig. 3B) . En la
figura 3A se observa que el prom ot or del clust er cap fue influido
negat ivam ent e por el SAL a lo largo del t iem po.
Por ot ro lado, se realizó una qRT- PCR con el fin de det erm inar
los niveles del t ranscript o cap5H alcanzados luego del t rat am ient o
de
la
cepa
Newm an
con
SAL.
Para
ello,
las
suspensiones
bact erianas t rat adas o no con SAL se cult ivaron hast a DO600 : 1,3 y
se procesaron para ext raer el ARN y realizar la qRT- PCR ut ilizando
los cebadores específicos según lo descript o en Mat eriales y
Mét odos. La figura 4 m uest ra una dism inución de los t ranscript os
correspondient es al gen cap5H de la cepa Newm an luego del
t rat am ient o con SAL. Adem ás, los result ados se analizaron según
Livak et al. ( 76) el cual est ablece que un valor de 2 - ΔΔCT m enor a 1
corresponde a una dism inución en la expresión del t ranscript o de
int erés luego del t rat am ient o, m ient ras que un índice m ayor a 1
indica un aum ent o en la expresión. El valor 2 - ΔΔCT para el t ranscript o
cap fue de 0,5.
48
Expresión cap5H/gyrB
(unidades arbitrarias)
1.0
0.5
0.0
Newman
Newman SAL
Figur a 4 . Efe ct o de l SAL sobr e la t r a n scr ipción de l ge n ca p5 H . El est udio
t ranscripcional se llevó a cabo por RT- PCR en t iem po real a part ir de ARN
ext raído de la cepa Newm an previam ent e t rat ada o no con SAL. Cada barra
represent a la expresión del ARNm cap5H norm alizada a la expresión del
t ranscript o gyrB de 3 experim ent os independient es expresada en unidades
arbit rarias ± DS.
Con el obj et ivo de analizar la expresión del PC a nivel
fenot ípico se realizaron ensayos de inm unoprecipit ación doble con
ant isuero ant i- PC5 específico. Para ello, diluciones seriadas al m edio
de los ext ract os capsulares de la cepa Newm an t rat ada o no con
SAL, se deposit aron sobre los orificios de un gel delgado de
agarosa. En el orificio cent ral se colocó la solución de ant isuero
ant i- PC5. Luego de 24 h de incubación en una cám ara húm eda para
perm it ir
la
inm unodifusión,
se
observaron
las
líneas
de
precipit ación. En la figura 5 se observa un t ít ulo de expresión de PC
igual a 4 para la cepa Newm an sin t rat ar. Cuando la cepa Newm an
se t rat ó con SAL a dosis baj as ( 0,36 m M) el t ít ulo de expresión de
PC descendió a 2. Más aún, el aum ent o en la concent ración de SAL
( 2 m M) evidenció est e descenso en la expresión de PC, ya que el
t ít ulo alcanzado fue igual a 1. La concent ración 2 m M de SAL
ut ilizada no afect ó el crecim ient o bact eriano. Est os result ados
dem uest ran que el SAL provocó una dism inución de la expresión de
PC5 a nivel fenot ípico. Adem ás, est e efect o es m ayor cuant o m ayor
es la dosis de SAL ut ilizada.
49
NewmanSAL
(0,36 mM)
Newman
NewmanSAL
(2 mM)
Figur a 5 . Efe ct o de l SAL sobr e la e x pr e sión fe not ípica de PC5 . La expresión
de cápsula se ensayó m ediant e inm unoprecipit ación doble con diluciones seriadas
al m edio de los ext ract os capsulares de la cepa Newm an previam ent e incubada o
no con 0,36 m M o 2 m M de SAL. C+ : Ext ract o capsular de la cepa Reynolds
PC5+ ; C- : Ext ract o capsular de la cepa Reynolds PC5- .
El conj unt o de los result ados obt enidos indican que el SAL
afect ó negat ivam ent e la expresión del PC de S. aureus t ant o a nivel
t ranscripcional com o a nivel fenot ípico. Est e efect o fue dosis
dependient e y sería el responsable del increm ent o de la capacidad
de int ernalización de S. aureus en células epit eliales.
4 . Efe ct o de l SAL sobr e la e x pr e sión de pr ot e ín a s
Paralelam ent e se analizó si el aum ent o en la int ernalización
alcanzado por la cepa Newm an pret rat ada con SAL t am bién podía
deberse a una expresión diferencial de adhesinas. Para ello, se
realizaron
ext racciones
de
las
diferent es
fracciones
prot eicas
( exoprot eínas, prot eínas de pared y de superficie) de la cepa
Newm an t rat ada o no con SAL. Los ext ract os se visualizaron a
t ravés de SDS- PAGEs t eñidos con azul de Coom assie. Según indican
las
flechas
se
observaron
algunos
cam bios
en
el
perfil
de
exoprot eínas ( Fig. 6A) y de prot eínas de pared ( Fig. 6B) de la cepa
Newm an luego del t rat am ient o con SAL.
50
A
M
Newman
-
SAL
B
M
+
Newman
-
C M
+
Newman
-
+
75 KDa
50 KDa
75 KDa
75 KDa
50 KDa
50 KDa
Exoproteínas
Proteínas de pared
Proteínas de superficie
Figur a 6 . Ex pr e sión de pr ot e ína s de S. a u r e u s ba j o la a cción de l SAL.
SDS- PAGEs de exoprot eínas ( A) , prot eínas de pared ( B) y prot eínas de superficie
( C) de la cepa Newm an de S. aureus. Las bandas prot eicas se visualizaron por
t inción con azul de Coom assie. M: Marcador de peso m olecular. Las flechas
indican las bandas con cam bios debido al t rat am ient o con SAL.
Con respect o al perfil de prot eínas de superficie ( Fig. 6C) se
observó una banda m ayorit aria de aproxim adam ent e 60 KDa que se
increm ent ó
cuando
la
cepa
Newm an
fue
t rat ada
con
SAL.
Considerando el peso m olecular y la fracción prot eica de la banda
aum ent ada, se presum ió que est a banda podría corresponder a la
prot eína Eap, la cual posee un peso m olecular de 62 KDa y se
encuent ra adherida a la superficie bact eriana. De est os result ados
se desprende que el SAL afect ó la expresión de prot eínas de S.
aureus.
5 . Efe ct o de l SAL sobr e la pr ot e ín a Ea p
Con el fin de confirm ar si la banda de ~ 60 KDa observada en
la fracción de prot eínas de superficie correspondía a la prot eína
Eap, se llevaron a cabo SDS- PAGEs de la fracción de prot eínas de
51
superficie de la cepa Newm an, de su m ut ant e isogénica eap ( AH12)
y de la cepa AH12 com plem ent ada ( Tabla 1) . En la figura 7 se
observa que la banda de ~ 60 KDa est uvo ausent e en la calle
correspondient e a la m ut ant e AH12, m ient ras que est a banda se
observó en la cepa com plem ent ada. Por lo t ant o, se puede concluir
que el t rat am ient o con SAL provocó un aum ent o en la expresión de
la banda de ~ 60 KDa correspondient e a la prot eína Eap.
M
Newman
NewmanSAL
AH12
AH12pCXEap
75 KDa
Eap
50 KDa
25 KDa
Figur a 7 . Pe r fil de pr ot e ína s de supe r ficie de S. a ur e u s. SDS- PAGE de las
prot eínas de superficie de la cepa Newm an t rat ada o no con SAL, de su m ut ant e
Eap ( AH12) y de la m ut ant e com plem ent ada ( AH12pCXEap) de S. aureus. Las
bandas prot eicas se visualizaron por t inción con azul de Coom assie. M: Marcador
de peso m olecular.
Post eriorm ent e
se
realizaron
experim ent os
de
fusión
t ranscripcional con el fin de evaluar el efect o del SAL sobre la
t ranscripción del gen eap. El t rat am ient o con SAL de la cepa
Newm an
t ransform ada con
el plásm ido Peap- gfp
provocó un
aum ent o en la act ividad del prom ot or eap ( Tabla 1) ( Fig. 8A) .
52
A.
250000
Newman
F/DO
200000
NewmanSAL
*
Control
150000
ControlSAL
100000
50000
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tiempo (h)
B.
2
Newman
NewmanSAL
DO600
Control
ControlSAL
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tiempo (h)
Figur a 8 . Act ivida d de l pr om ot or e a p ba j o la a cción de l SAL. A. La act ividad
del prom ot or se det erm inó por fusión con gfp y m edición de la fluorescencia en
relación con la densidad ópt ica ( F405/ 516 / DO600 ) en función del t iem po. Se m uest ra
un experim ent o represent at ivo de al m enos 3 experim ent os independient es.
Cont rol: cepa Newm an t ransform ada con plásm ido cont eniendo el gen gfp sin
prom ot or. Tiem po 6h, Newm an: 94698 F/ DO vs Newm an SAL: 164723 F/ DO,
* p= 0,01; Mann- Whit ney t est . B. Crecim ient o bact eriano ( DO600 ) en función del
t iem po.
Por ot ro lado, se realizó una qRT- PCR a part ir del ARN de la
cepa Newm an t rat ada o no con SAL ut ilizando cebadores específicos
para el t ranscript o eap. El result ado hallado confirm ó el aum ent o de
los niveles de t ranscript os del gen eap en la cepa Newm an luego del
53
t rat am ient o con SAL ( Fig. 9) . El valor 2 - ΔΔCT para el t ranscript o eap
luego del t rat am ient o con SAL fue igual a 2.
Expresión eap/gyrB
(unidades arbitrarias)
1.5
1.0
0.5
0.0
Newman
Newman SAL
Figur a 9 . Efe ct o de l SAL sobr e la t r a n scr ipción de e a p. El análisis de la
expresión se llevó a cabo por RT- PCR en t iem po real a part ir del ARN ext raído de
la cepa Newm an previam ent e t rat ada o no con SAL. Cada barra represent a la
expresión del ARNm eap norm alizada a la expresión del t ranscript o gyrB
expresada en unidades arbit rarias ± DS.
Con el obj et o de evaluar si el aum ent o en la expresión de Eap
por acción del SAL t enía algún efect o sobre la int ernalización
celular, se realizaron ensayos de invasión con las cepas Newm an y
su m ut ant e AH12 t rat adas o no con SAL. En la figura 10 se observ a
que la m ut ant e AH12 present ó una capacidad significat ivam ent e
m enor de int ernalización com parada con la cepa Newm an. Por lo
t ant o, Eap es im port ant e para el proceso de int ernalización de S.
aureus en las células MAC- T. Por ot ra part e, cuando la cepa AH12
se t rat ó con SAL se observó un aum ent o significat ivo en su
capacidad de invasión, indicando que en ausencia de Eap, el SAL
act uaría
sobre
ot ro/ s
fact or/ es
de
virulencia
que
est arían
involucrados en el proceso de int ernalización celular.
54
S. aureus internalizadas
(UFC/ml)
250000
**
200000
*
150000
100000
*
50000
0
Newman
AH12
AH12SAL
Figur a 1 0 . I n t e r na liza ción de la m u t a n t e e a p de S. a u r e u s y e fe ct os de l
t r a t a m ie n t o con SAL. Se infect aron células MAC- T en m onocapa con inóculos
bact erianos previam ent e t rat ados o no con SAL. Se m uest ra las m edianas de las
UFC/ m l int ernalizadas de un experim ent o represent at ivo de al m enos 3
experim ent os independient es. Newm an: 2x10 5 vs AH12: 4x10 4 UFC/ m l,
* p= 0,001; AH12 vs AH12 SAL: 1,3x10 5 UFC/ m l, * * p< 0,0001, Mann- Whit ney t est .
Con el fin de est ablecer la im port ancia del aum ent o en la
expresión de Eap por acción del SAL para la int ernalización en
células epit eliales, se realizaron ensayos de invasión celular con la
cepa Newm an t ransform ada con el plásm ido Peap- gfp ( Tabla 1)
cult ivada previam ent e o no con SAL. Una vez realizado el ensayo de
invasión sobre las células MAC- T adheridas a cubreobj et os, las
células se incubaron con azul de Evans ( roj o) y DAPI ( azul) , para
visualizar el cit oesquelet o y el núcleo de las células eucariot as,
respect ivam ent e.
Los
cubreobj et os
se
observaron
baj o
el
m icroscopio de fluorescencia a 40X. Luego, para cada condición
ensayada se cont abilizaron las bact erias que present aron act ividad
del prom ot or eap ( verde) en 30 cam pos y se calculó el prom edio de
bact erias adheridas e int ernalizadas. Para la cepa Newm an Peap- gfp
se cont ó un prom edio de 34 bact erias t ot ales, m ient ras que para la
m ism a cepa t rat ada con SAL se cont abilizó una m edia de 70
bact erias en los 30 cam pos est udiados. Los result ados indican que
la cepa Newm an t rat ada con SAL se adhirió a las células MAC- T en
m ayor núm ero que la no t rat ada y est o podría ser consecuencia de
una m ayor expresión de Eap por acción del SAL ( Fig. 11) .
55
B
A
C
Figur a 1 1 . Adh e sión de la ce pa N e w m a n a la s cé lula s e pit e lia le s M AC- T.
A. Células infect adas con Newm an Peap- gfp, 40X; B. Células infect adas con cepa
Newm an Peap- gfp previam ent e t rat ada con SAL, 40X; C. Células infect adas con
Newm an Peap- gfp t rat ada con SAL, 100X. En t odos los casos se m uest ra un
cam po represent at ivo de 30 cam pos observados. Las flechas señalan las
bact erias adheridas que expresan gfp ( verde) . Se observa el cit oplasm a en color
roj o y el ADN eucariot a en color azul.
En conj unt o, los result ados dem uest ran que el SAL provocó
un aum ent o de la t ranscripción del gen eap, así com o t am bién de la
expresión de la prot eína Eap, lo que se t raduj o en un aum ent o en la
int ernalización celular de S. aureus. Adem ás se est ableció la
im port ancia de Eap para la adhesión y post erior int ernalización de
la cepa Newm an de S. aureus en las células MAC- T.
6 . Efe ct o de l SAL sobr e r e gu la dor e s de los fa ct or e s de
vir u le n cia
6 .1 . Sist e m a r e gu la dor sa e
El
locus sae es uno
de los reguladores globales m ás
im port ant es de S. aureus. Est e sist em a de dos com ponent es es el
principal m odulador posit ivo de la t ranscripción de eap, m ient ras
56
que regula negat ivam ent e la t ranscripción
de cap
( 49,
82) .
Teniendo en cuent a que el SAL provocó un aum ent o en la expresión
de eap y una dism inución en la expresión de cap, se invest igó la
acción del SAL sobre el sist em a regulat orio sae m ediant e diferent es
ensayos. En prim er t érm ino, se est udió el efect o del SAL sobre el
nivel de int ernalización de las m ut ant es sae deficient es de las cepas
Newm an y RN6390. Para ello, a part ir de la m ut ant e RN6390sae se
obt uvo la m ut ant e Newm ansae m ediant e t ransducción con el fago
φ- 11 ( Tabla 1) . Luego, se realizaron ensayos de invasión infect ando
m onocapas de células MAC- T con las suspensiones bact erianas
S. aureus internalizadas
(UFC/ml)
previam ent e incubadas o no con SAL.
Newman
450000
Newmansae
350000
NewmansaeSAL
RN6390
250000
90000
RN6390sae
60000
*
30000
*
**
RN6390saeSAL
0
Figur a 1 2 . Efe ct o de l SAL sobr e la in t e r n a liza ción de S. a ur e u s y sus
m u t a n t e s sa e . Se infect aron células MAC- T en m onocapa con inóculos
bact erianos previam ent e t rat ados o no con SAL. Se m uest ra la m ediana de las
UFC/ m l int ernalizadas de un experim ent o represent at ivo de al m enos 3
experim ent os independient es. Cepa Newm an: 8.5x10 4 vs Newm ansae: 1,5x10 4 ,
* p< 0,01; Newm ansae vs Newm ansae SAL: 3,4x10 4 UFC/ m l, * * p< 0,01, MannWhit ney t est . Cepa RN6390: 5x10 5 vs RN6390sae: 4,7x10 4 , * p< 0,01; MannWhit ney t est . RN6390sae vs RN6390sae SAL: 4,9x10 4 UFC/ m l p> 0,05
En la figura 12 se observa que la inact ivación del locus sae
provocó una dism inución significat iva en la int ernalización de am bas
m ut ant es com parada con las cepas parent ales Newm an y RN6390.
El result ado obt enido perm it e sugerir que los fact ores regulados por
sae est arían involucrados en el proceso de invasión celular. Cabe
dest acar que cuando se t rat ó a las m ut ant es sae con SAL, sólo en el
bagaj e
Newm an
se
observó
un
aum ent o
significat ivo
en
la
57
int ernalización. Por lo t ant o, en est a cepa, ot ros reguladores
dist int os de sae est arían siendo afect ados por el SAL.
Post eriorm ent e, se analizó la act ividad del prom ot or principal
( Pc) del locus sae fusionado al gen report ero gfp en presencia o
ausencia de SAL. En la figura 13A se m uest ra que la act ividad del
prom ot or principal del sist em a sae en presencia de SAL fue sim ilar
a la observada en ausencia de t rat am ient o.
A.
80000
Newman
70000
NewmanSAL
F/DO
60000
Control
50000
ControlSAL
40000
30000
20000
10000
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tiempo (h)
B.
2
Newman
NewmanSAL
DO600
Control
ControlSAL
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tiempo (h)
Figur a 1 3 . Act ivida d de l pr om ot or pr in cipa l sa e ba j o la a cción de l SAL. A.
La act ividad del prom ot or principal sae se det erm inó por fusión con gfp y
m edición de la fluorescencia en relación con la densidad ópt ica ( F/ DO) en función
del t iem po. Se m uest ra un experim ent o represent at ivo de al m enos 3
experim ent os independient es. Cont rol: cepa Newm an t ransform ada con el
plásm ido cont eniendo el gen gfp sin prom ot or. Tiem po 6h, Newm an: 72382 F/ DO
vs Newm an SAL: 70841 F/ DO. B. Crecim ient o bact eriano ( DO600 ) en función del
t iem po.
58
Adem ás, se est udió el efect o del SAL sobre el nivel de
expresión de los t ranscript os sae ut ilizando cebadores específicos
que abarcaron saeR y saeS ( t ranscript os A, B y C) m ediant e qRTPCR. Los result ados dem ost raron que efect ivam ent e el SAL provocó
un aum ent o en la cant idad de t ranscript os sae ( Fig. 14) . El valor de
2 - ΔΔCT fue de 1,6.
Expresión sae/gyrB
(unidades arbitrarias)
1.5
1.0
0.5
0.0
Newman
Newman SAL
Figur a 1 4 . I m pa ct o de l SAL sobr e la e x pr e sión de sa e . El análisis de la
expresión se llevó a cabo por RT- PCR en t iem po real a part ir de ARN ext raído de
la cepa Newm an previam ent e t rat ada o no con SAL. Cada barra represent a la
expresión de sae norm alizada a la expresión de gyrB de 3 experim ent os
independient es expresada en unidades arbit rarias ± DS.
Por
ot ro
inm unoprecipit ación
lado,
doble
se
realizaron
con
ant isuero
experim ent os
específico
para
de
PC5
ut ilizando los ext ract os capsulares de la m ut ant e Newm ansae. En la
figura 15 se observa que el t ít ulo para la m ut ant e sin t rat am ient o
fue de 4, al igual que el obt enido para la cepa Newm an ( ver Fig. 5) .
Sin em bargo, el t ít ulo se increm ent ó al doble ( t ít ulo: 8) cuando la
m ut ant e Newm ansae se t rat ó con alt as dosis de SAL ( Fig. 15) .
Est os result ados sugieren que en ausencia del locus sae, el SAL
podría afect ar a ot ro/ s regulador/ es provocando un aum ent o en la
expresión de PC.
59
Newmansae
NewmansaeSAL
(2 mM)
Figur a 1 5 . Efe ct o de l SAL sobr e la e x pr e sión de PC e n la m u t a nt e sa e . La
expresión de PC5 se det erm inó m ediant e inm unoprecipit ación doble de diluciones
seriadas de los ext ract os capsulares de la cepa Newm ansae previam ent e
incubada o no con 2 m M de SAL. El ant isuero se sem bró en el pocillo cent ral. C+ :
Ext ract o capsular de la cepa Reynolds PC5+ ; C- : Ext ract o capsular de la cepa
Reynolds PC5- .
Con el obj et ivo de evaluar el efect o del SAL sobre la expresión
de la prot eína Eap en la m ut ant e Newm ansae, se realizaron SDSPAGEs de las prot eínas de superficie ext raídas de los cult ivos
bact erianos pret rat ados o no con SAL.
M
SAL
Newman
-
+
Newmansae
-
+
AH12
-
75 KDa
Eap
50 KDa
Figur a 1 6 . Efe ct o de l SAL sobr e la e x pr e sión de Ea p e n la m u t a n t e sa e .
SDS- PAGE de las prot eínas de superficie de la cepa Newm an de S. aureus, su
m ut ant e sae y su m ut ant e eap ( AH12) previam ent e t rat adas o no con SAL. Las
bandas prot eicas se visualizaron por t inción con azul de Coom assie. M: Marcador
de peso m olecular.
60
En la figura 16 se observa la banda correspondient e a la
prot eína Eap en los perfiles de prot eínas de superficie de la cepa
Newm an t rat ada o no con SAL. Cont rariam ent e, en las calles
correspondient es a la m ut ant e sae, no se observó est a banda,
independient em ent e del t rat am ient o con SAL. La ausencia de la
prot eína Eap t am bién se evidenció en la m ut ant e AH12 ( cont rol) .
Por lo t ant o, est os result ados corroboran que el sist em a regulat orio
sae es esencial para la expresión de Eap.
El conj unt o de los result ados obt enidos perm it en concluir que
el aum ent o de Eap y la dism inución de PC podría deberse en part e
a la acción posit iva del SAL sobre el sist em a regulat orio sae.
6 .2 . Re gu la dor m gr A
Ot ro regulador im port ant e que cont rola la expresión de m ás
de 350 genes de S.
aureus es m grA ( 78) .
Est e fact or
de
t ranscripción regula posit ivam ent e la expresión de cap, sin em bargo
se desconoce la acción de MgrA sobre la regulación de eap ( 81) .
Con
el
fin
de
det erm inar
el
efect o
int ernalización de la cepa Newm an y
del
SAL sobre
la
su m ut ant e m grA,
se
realizaron ensayos de invasión en células MAC- T. Los result ados
obt enidos indican que la ausencia del gen m grA provocó un
increm ent o significat ivo en la capacidad de invasión de S. aureus en
células epit eliales ( Fig. 17) . Por lo t ant o, algunos de los fact ores de
virulencia regulados por m grA est arían im plicados en el proceso de
int ernalización de S. aureus. Adem ás, cuando se t rat ó a la m ut ant e
m grA con SAL se observó un aum ent o significat ivo en su grado de
invasión ( Fig. 17) , lo cual sugiere que ot ros reguladores podrían
t am bién ser afect ados por est e com puest o.
61
S. aureus internalizadas
(UFC/ml)
**
*
200000
175000
Newman
NewmanSAL
*
150000
Newmanmgr
125000
NewmanmgrSAL
100000
75000
50000
25000
0
Figur a 1 7 . Efe ct o de l SAL sobr e la in t e r na liza ción de la ce pa N e w m a n de
S. a u r e u s y su m u t a n t e m gr A. Se infect aron células MAC- T en m onocapa con
inóculos bact erianos previam ent e t rat ados o no con SAL. Se m uest ra el
porcent aj e de int ernalización de un experim ent o represent at ivo de al m enos 3
experim ent os independient es. Newm an: 5,4x10 4 vs Newm an SAL: 1,8x10 5 ,
* p< 0,01; Newm an vs Newm anm gr: 1,4x10 5 * p< 0,01; Newm anm gr vs
Newm anm gr SAL: 2x10 5 UFC/ m l, * * p< 0,01, Mann- Whit ney t est .
Con el fin de invest igar la acción del SAL sobre m grA a nivel
t ranscripcional, se llevaron a cabo experim ent os de fluorescencia
con el prom ot or del gen m grA fusionado al gen gfp. Los result ados
dem ost raron que el t rat am ient o con SAL produj o en la cepa
Newm an una dism inución significat iva en la act ividad del prom ot or
m grA
com parado
con
lo
observado
en
la
m ism a
cepa
sin
t rat am ient o ( Fig. 18) .
Mediant e qRT- PCRs se est ableció que la cepa Newm an t rat ada
con SAL expresó una cant idad m enor de t ranscript os de m grA
com parado con los niveles obt enidos para la cepa Newm an no
t rat ada ( Fig. 19) . El valor de 2 - ΔΔCT fue igual a 0,7.
62
A.
35000
Newman
30000
NewmanSAL
F/DO
25000
*
Control
ControlSAL
20000
15000
10000
5000
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tiempo (h)
2
B.
Newman
NewmanSAL
DO600
Control
ControlSAL
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tiempo (h)
Figur a 1 8 . Efe ct o de l SAL sobr e la a ct ivida d de l pr om ot or m gr A. A. La
act ividad del prom ot or m grA se det erm inó por fusión con gfp y m edición de la
fluorescencia en relación con la densidad ópt ica ( F/ DO) en función del t iem po. Se
m uest ra un experim ent o represent at ivo de al m enos 3 experim ent os
independient es. Cont rol: cepa Newm an t ransform ada con el plásm ido
cont eniendo el gen gfp sin prom ot or. Tiem po t h, Newm an: 22378 F/ DO vs
Newm an SAL: 12724 F/ DO, * p= 0,01, Mann- Whit ney t est . B. Crecim ient o
bact eriano ( DO600 ) en función del t iem po.
63
Expresión mgrA/gyrB
(unidades arbitrarias)
1.0
0.5
0.0
Newman
NewmanSAL
Figur a 1 9 . Efe ct o de l SAL sobr e la e x pr e sión de m gr A. El análisis de la
expresión se llevó a cabo por RT- PCR en t iem po real a part ir de ARN ext raído de
la cepa Newm an previam ent e t rat ada o no con SAL. Cada barra represent a la
expresión de m grA norm alizada a la expresión de gyrB de 3 experim ent os
independient es expresada en unidades arbit rarias ± DS.
Adem ás, se realizaron experim ent os de inm unoprecipit ación
con ant isuero específico para PC5 en la m ut ant e Newm anm gr
t rat ada o no con SAL. La figura 20 m uest ra que la ausencia de
m grA afect ó negat ivam ent e la expresión de PC. Est e result ado
dem uest ra que m grA es indispensable para la expresión de cap.
Newmanmgr
NewmanmgrSAL
(2 mM)
Figur a 2 0 . Ex pr e sión de PC e n la m u t a n t e m gr A t r a t a da o no con SAL. La
expresión de PC5 se ensayó m ediant e inm unoprecipit ación de diluciones seriadas
de ext ract os capsulares de la cepa Newm anm gr previam ent e incubada o no con 2
m M de SAL. C+ : Reynolds PC5+ ; C- : Reynolds PC5- .
Por lo t ant o, la dism inución en la expresión de PC5 podría
deberse en part e a la acción negat iva del SAL sobre m grA, uno de
sus reguladores.
64
7 . Acción r e gu la t or ia de m gr A sobr e Ea p
Trabaj os previos han dem ost rado que m grA es capaz de
regular la expresión de prot eínas ext racelulares, t ales com o Hla y
Spa ( 55, 78, 81) . Con el fin de invest igar si m grA cont rola la
expresión de Eap, se realizaron experim ent os para m edir
la
act ividad t ranscripcional del prom ot or eap fusionado a gfp en la
cepa salvaj e Newm an y en su m ut ant e m grA.
En la figura 21 se m uest ra que en la m ut ant e m grA, la
act ividad del prom ot or eap dism inuyó significat ivam ent e com parada
con la cepa salvaj e. Por lo t ant o, m grA podría act uar regulando
posit ivam ent e la expresión de eap a nivel t ranscripcional. Sin
em bargo, cuando la cepa m ut ant e m grA fue t rat ada con SAL, la
act ividad del prom ot or eap aum ent ó, sugiriendo que el SAL est aría
act uando posit ivam ent e sobre ot ro regulador, probablem ent e sae.
Adem ás,
m ediant e
RT- PCR para
el
t ranscript o
eap,
se
corroboró la dism inución de los niveles del t ranscript o eap en la
m ut ant e m grA com parado con el valor det erm inado para la cepa
parent al. Asim ism o, el t rat am ient o con SAL provocó un increm ent o
en la expresión de ARNm de eap en la cepa Newm an. ( Fig. 22) .
Con el fin de invest igar el efect o del SAL sobre la expresión de
la prot eína Eap en la m ut ant e m grA, se realizaron SDS- PAGEs a
part ir de las prot eínas de superficie de la cepa Newm anm gr t rat ada
o no con SAL.
65
F/DO
A. 20000
Newman
18000
16000
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
NewmanSAL
**
*
NewmanmgrA
NewmanmgrASAL
Control
ControlSAL
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tiempo (h)
B.
2
Newman
NewmanSAL
DO600
Newmanmgr A
Newmanmgr ASAL
1
Control
ControlSAL
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tiempo (h)
Figur a 2 1 . Act ivida d de l pr om ot or e a p e n la m u t a n t e m gr A. A. La act ividad
del prom ot or se det erm inó por fusión con gfp y m edición de la fluorescencia en
relación con la densidad ópt ica ( F/ DO) en función del t iem po. Se m uest ra un
experim ent o represent at ivo de al m enos 3 experim ent os independient es. Cont rol:
cepa Newm an t ransform ada con el plásm ido cont eniendo el gen gfp sin prom ot or.
Tiem po 6h, Newm an: 8545 F/ DO vs Newm anm grA: 4611 F/ DO, * p< 0,01;
Newm anm grA vs. Newm anm grASAL: 7617 F/ DO, * p< 0,01. Mann- Whit ney t est . B.
Crecim ient o bact eriano ( DO600 ) en función del t iem po.
66
Expresión de eap (U.A.)
Ne
wm
an
Ne
wm
an
SA
Ne
L
wm
an
m
gr
eap
girB
3
Newman
NewmanSAL
Newmanmgr
2
1
0
Figur a 2 2 . Ex pr e sión de l t r a n scr ipt o e a p e n la m u t a n t e m gr A. Se realizó
una RT- PCR con cebadores específicos para el t ranscript o eap a part ir de ARN
obt enido de la cepa Newm an t rat ada previam ent e con SAL o no y de la cepa
Newm anm gr. Los product os de PCR se corrieron en geles de agarosa t eñidos con
BrEt y se visualizaron baj o luz UV. La fot o del gel se acom paña con la
densit om et ría realizada con el program a Scion I m age para sem icuant ificar el
nivel de t ranscript os.
M
Newman
-
SAL
Newmanmgr
+
-
+
AH12
-
75 KDa
Eap
50 KDa
Figur a 2 3 . Ex pr e sión de Ea p e n la m u t a n t e m gr A. SDS- PAGE de las
prot eínas de superficie de la cepa Newm an de S. aureus, su m ut ant e m grA y su
m ut ant e eap ( AH12) . Las bandas prot eicas se visualizaron por t inción con azul de
Coom assie.
En la figura 23 se m uest ra que la banda correspondient e a la
prot eína Eap no difirió ent re la cepa salvaj e Newm an y su m ut ant e
m grA sin t rat am ient o. En ausencia del gen m grA, el t rat am ient o con
67
SAL provocó un aum ent o en la expresión de la prot eína Eap, lo cual
concuerda con los result ados obt enidos por fusión t ranscripcional.
En conj unt o, los result ados sugieren que m grA act uaría com o
un regulador posit ivo de Eap a nivel t ranscripcional, sin em bargo
est o no se t raduciría en un cam bio a nivel de prot eína. Adem ás, en
ausencia
de
m grA,
el
SAL
afect aría
a
ot ro/ s
regulador/ es
provocando un aum ent o de la prot eína Eap.
8 . I n t e r n a liza ción de S. a u r e u s e n cé lu la s e n dot e lia le s
t r a t a da s con SAL
Est udios previos dem ost raron que el SAL present a diversas
act ividades sobre las células eucariot as incluyendo el cont rol de la
expresión génica ( 14, 24, 68, 136) . Con el obj et ivo de est udiar el
efect o del SAL sobre las células endot eliales y sus consecuencias en
la int eracción de est as células con S. aureus, se realizaron ensayos
de invasión ut ilizando la línea celular EA.Hy926. En ensayos
prelim inares, las células eucariot as se t rat aron con SAL 2m M
durant e 2 h. Luego, las células se infect aron durant e 1 h con la
suspensión bact eriana de la cepa Newm an o de su m ut ant e AH12 y,
t ranscurridas 2, 6 y 24 h post infección se cont abilizaron las UFC/ m l
int ernalizadas y los sobrenadant es se ensayaron para det ect ar TNF-
α m ediant e ELI SA. Sorprendent em ent e, ni la cepa Newm an ni su
m ut ant e eap lograron int ernalizarse en est e t ipo celular. Com o
cont rol se ut ilizó la cepa R0 ( Newm an t ransform ada con un
plásm ido que port a la FnBP- A defect uosa) ( Tabla 1) que com o se
esperaba, present ó niveles de int ernalización t an baj os com o los de
la cepa Newm an ( Fig. 24) . Por lo t ant o, se decidió ut ilizar la cepa
R11 ( Newm an t ransform ada con un plásm ido que port a la FnBP- A
salvaj e) y su m ut ant e R11eap ( Tabla 1) . En los ensayos de invasión
prelim inares ut ilizando dichas cepas se det erm inó que el m ej or
t iem po post infección para det ect ar TNF- α en el sobrenadant e fue
68
de 6 h. Por lo t ant o, t ranscurridas 6 h luego del agregado de
lisost afin se guardaron los sobrenadant es para det ect ar TNF- α y se
S. aureus internalizadas
(UFC/ml)
lisaron las células para cont abilizar las UFC/ m l.
100000
*
R11
R11eap
Newman
R0
*
10000
1000
100
10
1
Figur a 2 4 . I n t e r n a liza ción de S. a u r e u s e n cé lu la s e n dot e lia le s t r a t a da s
con SAL. Monocapas de células EA.Hy926 t rat adas o no con SAL 2 m M se
infect aron con las suspensiones bact erianas. Se m uest ran las m edianas de las
UFC/ m l int ernalizadas de un experim ent o represent at ivo de al m enos 3
experim ent os independient es luego de 6 h post infección. Barras rayadas: células
endot eliales t rat adas con SAL. Barras lisas: células endot eliales no t rat adas. R11,
- SAL: 7,7x10 4 vs + SAL: 1,9x10 4 * p< 0,01; R11 - SAL: 7,7x10 4 vs R11eap - SAL:
2,6x10 4 * p< 0,01; Mann- Whit ney t est .
En la figura 24 se observa que la acción del SAL sobre las
células endot eliales provocó una dism inución en la int ernalización
de la cepa R11 com parada con la invasión de la m ism a cepa en las
células no t rat adas. Por ot ra part e, la m ut ant e R11eap m ost ró una
m enor capacidad de invasión com parada con la cepa salvaj e. La
acción
del
SAL
sobre
las
células
endot eliales
no
afect ó
significat ivam ent e la invasión de la m ut ant e R11eap.
Est os result ados sugieren que Eap es im port ant e para la
int ernalización de S. aureus en células endot eliales y que el SAL
est aría afect ando algún/ os recept or/ es de m em brana de est e t ipo
celular provocando una dism inución significat iva en la invasión de la
bact eria salvaj e. Más aún, Eap podría int eract uar con uno de los
69
recept ores, ya que el t rat am ient o de las células con SAL no provocó
diferencias en la invasión de la m ut ant e eap.
9 . Ex pr e sión de I CAM - 1 e n cé lu la s e n dot e lia le s t r a t a da s
con SAL e in fe ct a da s con S. a u r e u s
Un est udio previo dem ost ró que la prot eína Eap purificada es
capaz de unirse a la prot eína de m em brana I CAM- 1 ( 16) . Por ot ro
lado, se est ableció que el salicilat o de sodio afect ó la expresión de
I CAM- 1 en células HUVEC est im uladas con LPS ( 136) . Con el fin de
est ablecer el efect o del SAL sobre la expresión de I CAM- 1 en las
células endot eliales, se realizaron ensayos de invasión ut ilizando las
células EA.Hy926 t rat adas o no con SAL e infect adas con la cepa
R11 y su m ut ant e R11eap. Luego, m ediant e cit om et ría de fluj o se
det erm inó la cant idad de células posit ivas para I CAM- 1.
% de células positivas
para ICAM-1
80
70
60
50
R11
R11eap
Control Control +
40
30
20
10
0
Figur a 2 5 . Ex pr e sión de I CAM - 1 e n cé lu la s e n dot e lia le s t r a t a da s con SAL
e in fe ct a da s con S. a u r e u s. Las células EA.Hy926 en confluencia t rat adas o no
con SAL 2 m M se infect aron ( m oi: 200) con las suspensiones bact erianas. Se
m uest ran las m edias ± DS del porcent aj e de células posit ivas para I CAM- 1 de un
experim ent o represent at ivo de 2 experim ent os independient es luego de 6 h
post infección. Los ensayos se realizaron por duplicado. Barras rayadas: células
endot eliales t rat adas con SAL. Barras lisas: células endot eliales no t rat adas.
Cont rol - : Células sin infect ar. Cont rol + : Células t rat adas con 1 μg/ m l de LPS.
p> 0,05; Kruskal- Wallis t est .
En la figura 25 se observa un baj o nivel de expresión de
I CAM- 1 en las células endot eliales infect adas t ant o con la cepa R11
70
com o con su m ut ant e R11eap. Por ot ra part e, el t rat am ient o de las
células con SAL no provocó cam bios en la expresión de I CAM- 1 en
ninguno de los casos est udiados.
1 0 . Pr odu cción de TN F- α e n r e spu e st a a la in fe cción con
S. a u r e u s y a l t r a t a m ie n t o con SAL
Los sobrenadant es de cult ivo provenient es de los ensayos de
invasión de las células endot eliales luego de 6 h post infección se
ensayaron m ediant e ELI SA para det ect ar los niveles de TNF- α.
La figura 26 m uest ra que la m ut ant e R11eap produj o un
aum ent o significat ivo de la sínt esis de TNF- α com parado con los
niveles alcanzados por las células infect adas con la cepa salvaj e.
Por ciert o, el t rat am ient o de las células endot eliales con SAL 2 m M
Concentración de TNF-α
(pg/ml)
no produj o diferencias significat ivas en la sínt esis de TNF- α.
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
*
R11
R11eap
Figur a 2 6 . Efe ct o de l SAL sobr e la sín t e sis de TN F- α por pa r t e de cé lu la s
e n dot e lia le s in fe ct a da s con S. a u r e u s. Niveles de TNF- α det ect ados en los
sobrenandant es provenient es de los ensayos de invasión de las células EA.Hy926
t rat adas o no con SAL 2 m M. Se m uest ran las m edias ± DS de la concent ración
de TNF- α en pg/ m l. Barras rayadas: células endot eliales t rat adas con SAL. Barras
lisas: células endot eliales no t rat adas. R11 - SAL: 0,51 pg/ m l vs R11eap - SAL:
32,83 * p< 0,001; Kruskal- Wallis t est .
71
Por lo t ant o, la presencia de la prot eína Eap inhibiría la
sínt esis de TNF- α en células endot eliales hum anas.
1 1 . Efe ct o de l SAL sobr e la colon iz a ción in t r a n a sa l de S.
a u r e u s in vivo
Con el fin de est udiar el efect o del SAL in vivo, se realizaron
experim ent os de colonización nasal ut ilizando las cepas Newm an y
su m ut ant e AH12. Para ello, grupos de rat ones CF- 1 se inyect aron
con SAL 100 m M o con PBS 1X por vía int raperit oneal, al cabo de
30 m in los rat ones se inocularon por vía int ranasal con las
suspensiones bact erianas correspondient es. Luego de 4 h, las
narinas de los anim ales se ext irparon y se procesaron para
cont abilizar las UFC/ m l de los hom ogenat os.
S. aureus recuperadas
de narina (%)
100
Newman
AH12
50
0
Figur a 2 7 . Efe ct o de l SAL sobr e la colon iza ción in t r a na sa l de S. a u r e u s.
Se m uest ran los porcent aj es de las m edianas de un experim ent o represent at ivo
de 3 experim ent os independient es relat ivos a la cepa Newm an sin t rat am ient o
( 100% ) . Barras rayadas: rat ones previam ent e t rat ados con SAL. Barras lisas:
rat ones previam ent e t rat ados con PBS. Newm an, PBS: 100% , SAL: 34% ; AH12,
PBS: 16% , SAL: 8% .
La figura 27 m uest ra que la m ut ant e AH12 posee una
capacidad m enor de colonización que la cepa Newm an. Asim ism o,
el SAL inyect ado por vía int raperit oneal provocó una dism inución de
la colonización int ranasal t ant o de la cepa Newm an com o de su
72
m ut ant e AH12 com parado con los valores de colonización obt enidos
cuando se inyect ó PBS previam ent e a los anim ales.
Los result ados obt enidos sugieren que la prot eína Eap es un
fact or im port ant e para la colonización de S.aureus in vivo y que el
SAL act uaría en el huésped provocando una dism inución en la
colonización nasal de S. aureus.
73
S.
aureus
es
una
bact eria
pat ógena
capaz
de
causar
enferm edades de leves a severas en el huésped infect ado que
pueden causar incluso la m uert e. La capacidad de S. aureus para
generar est as infecciones est á dada por la expresión coordinada de
un arsenal de fact ores de virulencia, los cuales est án m odulados por
im port ant es reguladores globales. El SAL, com ponent e principal de
la aspirina, int erfiere en la expresión de los fact ores de virulencia
de algunos géneros bact erianos.
En est e t rabaj o se dem ost ró, en prim er lugar, que el
t rat am ient o con SAL de la cepa Newm an de S. aureus provocó un
aum ent o significat ivo en la capacidad de int ernalización en las
células epit eliales MAC- T. Los experim ent os del present e t rabaj o se
realizaron en m edio sin glucosa para evit ar la represión de la
producción de fact ores de virulencia, com o por ej em plo PC ( 115) .
Asim ism o,
la
concent ración
de
SAL
ut ilizada
de
0,36
mM
correspondió a la concent ración ant iplaquet aria alcanzada en el
plasm a hum ano ( 30) , m ient ras que la concent ración de SAL de 2
m M est á dent ro del rango t erapéut ico alcanzado en suero hum ano
en pacient es t rat ados para enferm edades crónicas inflam at orias.
Los niveles t erapéut icos en suero de salicilat o en pacient es t rat ados
para enferm edades reum át icas est án ent re 150 y 300 μg/ m l, lo cual
es equivalent e a 1- 2 m M de SAL ( 66) . Recient em ent e, se est ableció
que la cepa 8325- 4 de S. aureus ( no capsulada) cult ivada en
presencia de SAL m ost ró una adherencia reducida a células
endot eliales
um bilicales
hum anas
( 99) .
En
los
experim ent os
realizados en est e t rabaj o con la cepa RN6390 de S. aureus
( derivada de la 8325- 4) , no se pudieron corroborar esos result ados.
Est a discrepancia podría ser explicada por las diferent es líneas
celulares, o quizás sean de m ayor im port ancia las diferencias en el
diseño experim ent al y las condiciones de crecim ient o bact eriano
ut ilizadas.
74
La int ernalización de S. aureus en células de m am ífero
depende del puent e de Fn form ado ent re las FnBPs de la bact eria y
la int egrina α5 β1 del huésped ( 119) . Kupferwasser et al. ( 72)
describieron que el t rat am ient o con SAL de dist int as cepas de S.
aureus provocó una dism inución en la adhesión a prot eínas de la
m at riz ext racelular,
t ales com o
Fn
y
Fg.
En
t al
est udio
la
dism inución de la expresión de prot eínas que se unen a la m at riz
sobre la superficie de la bact eria, se represent ó com o el conj unt o
de dat os derivados de las cepas de S. aureus RN6390, COL,
Newm an e I SP479C, adem ás de varios aislam ient os clínicos de S.
aureus m et icilino resist ent es. Por ot ro lado, los genes fnbA y fnbB
de la cepa Newm an cont ienen una m ut ación punt ual que result a en
un codón st op, lo que genera FnBPs t runcadas al final del dom inio C
( 43) . Consecuent em ent e, est o provoca una adherencia deficient e
de la cepa Newm an com parada con ot ras cepas de S. aureus que
cont ienen FnBPs salvaj es. Los result ados de est a t esis confirm aron
que la cepa Newm an se int ernalizó en m enor grado en las células
MAC- T com parada con la cepa RN6390. Sin em bargo, cuando
am bas
cepas
se
t rat aron
con
SAL,
sólo
la
capacidad
de
int ernalización de la cepa Newm an se vio increm ent ada.
Es im port ant e dest acar que las cepas Newm an y RN6390 de
S. aureus poseen diferencias en lo que respect a a su bagaj e
genét ico. Adem ás de lo m encionado ant eriorm ent e respect o de las
FnBPs, exist en ot ras diferencias relevant es. La cepa Newm an
produce el serot ipo capsular 5, por el cont rario la cepa RN6390
posee una m ut ación punt ual en el gen cap5E que la conviert e en no
capsulada ( 130) . Por ot ra part e, la cepa RN6390 es una m ut ant e
nat ural sigB, m ient ras que la cepa Newm an posee un sigB salvaj e
( 71) . Adem ás, la cepa Newm an posee una m ut ación punt ual en el
locus saeS, que genera una sobreproducción de Coa, FnBP- A y Eap,
m ient ras que no afect a la expresión de Hla, Hlb y PC com parado
con ot ras cepas que poseen un saeS salvaj e ( 1, 35, 82) . Por lo
75
expuest o, los cam bios observados en el grado de invasión de las
cepas Newm an y RN6390 de S. aureus no pueden ser at ribuidos
sólo a la expresión diferencial del PC5. Pholm ann- Diet ze et al. ( 101)
observaron que la presencia de la cápsula podría int erferir con la
adherencia de S. aureus a los t ej idos del huésped. Ciert am ent e,
cuando se t rat ó con SAL a la cepa Reynolds PC5+ de S. aureus se
observó una capacidad aum ent ada en la int ernalización respect o de
est a cepa y de su m ut ant e isogénica acapsular no t rat adas. En vist a
de los result ados obt enidos se sugiere que el PC5 podría est ar
enm ascarando a las m oléculas de adhesión que posee S. aureus en
su superficie. Más aún, el t rat am ient o con SAL est aría afect ando
negat ivam ent e la producción de PC5.
La expresión in vit ro del PC de S. aureus es alt am ent e
sensible a diversas señales am bient ales ( 95) . Al respect o, en est e
t rabaj o se dem ost ró que la act ividad del prom ot or principal del
locus cap5, al igual que el nivel de los t ranscript os cap5H,
dism inuyeron luego de t rat ar a la bact eria con SAL. Por ot ro lado,
Blickwede et
dism inuyó
en
al.
la
( 7)
observaron que la expresión de cap5A
cepa
Newm an
luego
del
t rat am ient o
con
concent raciones subinhibit orias de florfenicol ( ant ibiót ico ut ilizado
en m edicina vet erinaria) , indicando que la expresión de cap puede
ser afect ada por diferent es agent es farm acológicos. Por ciert o,
cuando
se
evaluó
la
expresión
fenot ípica
del
PC5
por
inm unoprecipit ación ut ilizando ant isuero específico para PC5, se
observó
una
reducción
de
la
producción
de
cápsula
dosis
dependient e luego del t rat am ient o con SAL de la cepa Newm an.
Asim ism o,
el
crecim ient o
en
presencia
de
SAL
de
un
m icroorganism o Gram negat ivo y con una cápsula gruesa, com o
Klebsiella pneum oniae, result ó en una sínt esis dism inuida del PC
( 22, 23) . En part icular, el PC fue reducido un 60%
a una
concent ración de SAL de 0,21 m M. En am bos casos, el SAL provocó
est e efect o sobre la producción de cápsula a concent raciones
76
norm alm ent e alcanzadas en plasm a luego de la ingest ión de
aspirina dent ro del rango t erapéut ico.
Ciert am ent e, la int ernalización increm ent ada en las células
epit eliales de la cepa Newm an de S. aureus luego del t rat am ient o
con SAL podría deberse no sólo a la dism inución de la producción
de PC5 sino t am bién a cam bios en la expresión de sus adhesinas.
Trabaj os previos det erm inaron que el SAL int erfirió con la expresión
de varias prot eínas de S. aureus, incluyendo FnBP- A y Hla ( 72, 73) .
En est e t rabaj o, cuando se analizaron los perfiles de prot eínas de la
cepa Newm an se observó que el t rat am ient o con SAL afect ó la
expresión de unas pocas exoprot eínas y prot eínas de pared.
Adem ás, un aum ent o im port ant e de una banda de ~ 60 KDa se
observó en la fracción de prot eínas de superficie cuando se t rat ó a
la bact eria con SAL. La prot eína que se encuent ra en esa fracción
prot eica y que posee un peso m olecular sem ej ant e al de la banda
observada correspondió a la caract erizada por Palm a et al. ( 98)
quienes la denom inaron Eap ( 8) . Su ident ificación fue confirm ada
m ediant e
ensayos
con
la
m ut ant e
Newm aneap
( AH12) .
En
conclusión, el t rat am ient o con SAL provocó un increm ent o en la
expresión de Eap en la cepa de S. aureus Newm an. Est e efect o
t am bién se observó a nivel t ranscripcional. Harraghy et al. ( 49)
est ablecieron que la glucosa al 0,5% reprim e la expresión de eap
probablem ent e por su acción negat iva sobre el sist em a regulador
sae. Por est a razón, los experim ent os realizados se llevaron a cabo
en ausencia de glucosa. Adem ás, la producción de Eap es reprim ida
a alt as concent raciones de hierro ( 60) . Por lo t ant o, la expresión de
Eap es sensible a la acción de diferent es com puest os, a los que se
sum a el SAL.
Por ot ro lado, en el present e t rabaj o se est ableció que la
ausencia de expresión de Eap provocó una dism inución en la
int ernalización de S. aureus t ant o en células epit eliales com o
77
endot eliales. En concordancia con est os result ados, Haggar et al.
( 45) observaron una capacidad dism inuida en la adhesión de la
m ut ant e AH12 a los fibroblast os y querat inocit os com parada con la
cepa Newm an. En est e t rabaj o de t esis, se det erm inó en el m odelo
m urino de port ación nasal una m enor colonización de la m ut ant e
AH12 con respect o a la cepa salvaj e a las 4 hs post infección. Por lo
t ant o, Eap es un fact or im port ant e que cont ribuye a la adhesión de
S. aureus y post erior colonización del vest íbulo nasal. Por el
cont rario, en un m odelo m urino de herida superficial no se
encont raron diferencias en el diám et ro de los abscesos ni en la
cant idad de bact erias de la cepa Newm an y su m ut ant e AH12 ( 16) .
Los m ism os aut ores ut ilizando un m odelo m urino de sepsis t am poco
encont raron diferencias significat ivas en el núm ero de bact erias
encont radas en riñón luego de 5 días. La discrepancia ent re los
result ados obt enidos en est e t rabaj o y los report ados por Chavakis
et al. ( 16) puede explicarse por los diferent es m odelos anim ales,
com o así t am bién por los dist int os t iem pos post infección ut ilizados.
Por lo t ant o, la prot eína Eap en la cepa Newm an que posee sus
FnBPs t runcadas, j uega un rol im port ant e en la int ernalización
celular y adherencia in vivo.
Est udios previos est ablecieron que el locus sae cont rola en
conciert o con ot ros reguladores globales la producción de Eap a
nivel t ranscripcional ( 1, 49, 60, 82, 113, 117) . Se ident ificaron
cuat ro t ranscript os superpuest os del locus sae ( 1, 94, 121) . Los
t ranscript os saeB, C y D son fuert em ent e expresados en la cepa
Newm an com parado con la cepa de S. aureus 8325- 4 ( 41, 82,
121) . Por ot ro lado, el prom ot or principal del locus sae es Pc, el cual
es aut orregulado y t am bién reprim ido por SigB en las cepas de S.
aureus 8325- 4, I SP479R, UAMS- 1 y COL ( 35, 75) . Est e prom ot or es
act ivado
por
H 2 O2
y
concent raciones
subinhibit orias
de
α-
defensinas, pero no responde a alt as concent raciones de sales ( 1,
35) . En el present e t rabaj o, el t rat am ient o con SAL no afect ó la
78
act ividad del prom ot or PC en las condiciones est udiadas. Sin
em bargo, el nivel de los t ranscript os saeA, B y C cont rolados por los
prom ot ores PA y PC ( ver Fig. 2, I nt roducción) se increm ent aron
luego de la exposición al SAL. Por ot ro lado, St einhuber et al. ( 121)
dem ost raron que la m ut ant e sae de la cepa I SP479C de S. aureus
t uvo una t asa de invasión dism inuida en células endot eliales
com parada con la cepa salvaj e, m ient ras que la cepa Newm an y su
m ut ant e sae m ost raron t asas de invasión m uy reducidas. En el
present e t rabaj o se det erm inó que las m ut ant es Newm ansae y
RN6390sae present aron una capacidad dism inuida de invasión en
células epit eliales MAC- T com parada con sus respect ivas cepas
salvaj es. Adem ás, el t rat am ient o con SAL induj o un aum ent o
significat ivo en la capacidad de invasión de la m ut ant e Newm ansae
con respect o a la m ism a cepa no t rat ada. Sin em bargo, el SAL no
provocó cam bios en la int ernalización de la m ut ant e RN6390sae.
Est os result ados podrían sugerir que en ausencia de sae en el
bagaj e Newm an, el SAL ej ercería su acción sobre algún ot ro
regulador que provocaría los cam bios observados.
El locus sae es un im port ant e regulador de m últ iples prot eínas
de S. aureus ( 39, 42, 49) . Al respect o, en est e t rabaj o de t esis se
est ableció que la m ut ant e Newm ansae no expresó prot eínas de
superficie.
Blickwede
et
al.
( 7)
observaron
que
la
m ut ant e
Newm ansae no expresó niveles det ect ables de em p, eap y fnbB.
Adem ás, Harraghy et al. ( 49) dem ost raron que una m ut ant e sae de
la cepa Newm an no expresó Eap. Teniendo en cuent a est a
inform ación, puede concluirse que el sist em a regulat orio sae es
esencial para la expresión de est a adhesina. Recient em ent e, se
dem ost ró que la cepa Newm an posee una fuert e expresión de sae y
de eap debido a la m ut ación que est a cepa present a en saeS ( 82) .
La expresión const it ut iva de sae sugiere que en la cepa Newm an
est e sist em a no podría ser m odulado por com puest os ext ernos ( 1,
35) . Sin em bargo, Schafer et al. ( 117) observaron que la act ividad
79
y las funciones dependient es de sae se increm ent aron por la acción
de un biocida ( Perform ® ) y de SDS, aún sobre sus niveles basales
alt os.
En
concordancia
con
est os
aut ores,
los
result ados
encont rados en est e t rabaj o dem uest ran que el locus sae puede ser
act ivado por SAL en la cepa Newm an y que est a act ivación result ó
en una expresión aum ent ada de Eap.
En S. aureus exist en result ados cont radict orios respect o de la
regulación que ej erce sae sobre el operón cap. Al respect o, el locus
sae reprim iría los genes cap5 ( 82, 121) . Sin em bargo, Rogasch et
al. ( 113) no encont raron ninguna influencia del locus sae sobre la
t ranscripción del operón cap en la cepa Newm an ni en la cepa COL.
El aum ent o de la expresión de PC5 en la m ut ant e Newm ansae
t rat ada con SAL sugiere que est e com puest o podría est ar afect ando
a ot ro regulador. La expresión aum ent ada del PC5 inducida por el
SAL parecería cont radecirse con la m ayor capacidad de adhesión
observada en
la m ut ant e Newm ansae t rat ada con
SAL.
Sin
em bargo, est a discrepancia podría explicarse por el hecho de que
ot ras adhesinas est arían aum ent adas por acción del SAL en la
m ut ant e Newm ansae. Cabe dest acar que, a pesar de que Eap es la
adhesina m ás im port ant e en la cepa Newm an, t ant o las m ut ant es
Newm aneap com o Newm ansae son capaces aún de int ernalizarse,
lo que sugiere que est as cepas est arían ut ilizando ot ras adhesinas
para dicho proceso.
Ot ro regulador im port ant e en S. aureus es m grA. Hast a el
m om ent o, no hay t rabaj os que report en la función de m grA en la
int ernalización de S. aureus en células eucariot as. En est e t rabaj o
se observó que la m ut ant e m grA de la cepa Newm an se int ernalizó
en m ayor grado en las células epit eliales que la cepa salvaj e. Est o
podría deberse a que m grA es un regulador posit ivo de cap5 y
cap8, por lo que, cuando m grA est á ausent e la dism inución de PC
podría desenm ascarar las adhesinas, generando una m ayor t asa de
80
invasión ( 78) . Por ot ra part e, el t rat am ient o con SAL de la m ut ant e
m grA provocó un aum ent o de su int ernalización, lo que sugiere que
ciert as adhesinas podrían est ar aum ent adas. Más aún el efect o
posit ivo del SAL sobre la expresión del locus sae en ausencia de
m grA redundaría en el aum ent o de la adhesina Eap.
No se conocen ant ecedent es que det erm inen la acción de
m grA sobre la expresión de Eap.
La m ut ant e Newm anm grA
present ó una act ividad reducida del prom ot or eap com parada con la
cepa salvaj e. Adem ás, se observó un descenso en el nivel de
t ranscript os de eap por RT- PCR. Sin em bargo, no se observaron
diferencias significat ivas ent re el nivel de expresión de la prot eína
Eap de la cepa Newm an y de su m ut ant e m grA. Est o sugiere que el
aum ent o observado a nivel t ranscripcional no sería suficient e com o
para det ect ar
cam bios a nivel fenot ípico por
la m et odología
ut ilizada. Est o nos perm it e inferir que el aum ent o observado en la
prot eína
Eap
luego
del
t rat am ient o
con
SAL,
se
debería
principalm ent e al increm ent o de sae. Por lo t ant o, la dism inución de
m grA inducida por
el SAL no afect aría significat ivam ent e la
expresión final de la prot eína Eap.
Est udios previos det erm inaron que la regulación del PC en S.
aureus est á afect ada por diversos est ím ulos am bient ales y es
regulada a diferent es niveles ( 18, 51, 80) . Los genes sbcD y sbcC
est án involucrados en la represión de la producción de PC5 a t ravés
de los reguladores arl y m grA baj o condiciones subinhibit orias de
ciprofloxacina o m it om icina C ( 18) . En el present e t rabaj o, el
t rat am ient o con SAL de la cepa Newm an provocó una dism inución
de la act ividad del prom ot or de m grA. En concordancia con est os
hallazgos, el nivel de t ranscript os de m grA t am bién decreció luego
de la exposición
al
SAL.
Al
respect o,
Riordan
et
al.
( 112)
dem ost raron que el salicilat o provocó una dism inución de los
t ranscript os m grA en las cepas de S. aureus Becker y SH1000. Por
81
ot ra part e, cuando el fact or t ranscripcional MgrA est uvo ausent e en
la
cepa
Newm an
no
se
observó
producción
de
PC5
independient em ent e del t rat am ient o con SAL. En conj unt o los
result ados sugieren que en ausencia de MgrA, la dism inución en la
expresión de PC5 desenm ascararía las adhesinas de superficie
cont ribuyendo est o a una capacidad aum ent ada para invadir las
células eucariot as. Ciert am ent e, la dism inución de la expresión de
cap observada luego del t rat am ient o con SAL en la cepa salvaj e,
podría deberse en part e a un efect o negat ivo del SAL sobre m grA.
Cabe dest acar que en ausencia de m grA, la act ividad del
prom ot or eap y la expresión de la prot eína Eap se ven aum ent adas
luego del t rat am ient o con SAL. Est os result ados indicarían que el
SAL, en ausencia de m grA, act uaría sobre ot ro regulador que
provocaría un aum ent o en la expresión de eap. Est e ot ro regulador
podría ser sae. Est os result ados concuerdan con el aum ent o de la
capacidad de invasión observada para la m ut ant e m grA t rat ada con
SAL con respect o a la no t rat ada.
En la cepa Newm an las FnBPs t runcadas no est án ancladas a
la pared celular y son secret adas com plet am ent e al m edio de
cult ivo ( 43) . Por ello, se realizaron los experim ent os de invasión en
células endot eliales con la cepa Newm an que expresa las FnBPs
salvaj es ( R11) j unt o a su m ut ant e isogénica eap deficient e. En est e
caso cuando las células endot eliales se incubaron en m edio con
SAL, se observó una dism inución en la int ernalización de la cepa
R11. Sin em bargo, el m encionado t rat am ient o no afect ó el grado de
invasión de la m ut ant e R11eap. Por lo t ant o, el SAL afect aría la
expresión de algún/ os recept or/ es celular/ es involucrado/ s en la
int eracción con la adhesina Eap. Est udios previos dem ost raron que
la prot eína Eap purificada es capaz de unirse a la m olécula de
superficie I CAM- 1 sobre las células endot eliales ( 16) . St rindhall et
al. ( 122) dem ost raron que aislam ient os clínicos de S. aureus
82
provenient es de infecciones agudas fueron capaces de inducir la
expresión de I CAM- 1 en células HUVEC. En el present e t rabaj o, el
t rat am ient o de las células endot eliales con SAL no induj o cam bios
significat ivos en la expresión de I CAM- 1. Adem ás, la est im ulación
de la expresión de I CAM- 1 por part e de la cepa Newm an R11 y de
su m ut ant e R11eap no fue significat iva. Probablem ent e, los posibles
fact ores est im ulat orios de est a cepa de S. aureus ( pept idoglicano,
ácido araquidónico, Eap) no fueron suficient es com o para inducir la
expresión
de I CAM- 1
en
est e t ipo celular.
Por
el cont rario,
Kat erinaki et al. ( 66) observaron una dism inución en la expresión
de
I CAM- 1
en
concent raciones
células
ent re
1
de
y
m elanom a
5
m M.
t rat adas
Asim ism o,
con
ot ros
SAL
a
aut ores
dem ost raron la dism inución en la expresión de I CAM- 1 por el ácido
acet il salicílico en células HUVEC y ret inales est im uladas con LPS
( 15, 63, 136) . Adem ás, el salicilat o de sodio dem ost ró reducir la
expresión de I CAM- 1 en las células HUVEC est im uladas con LPS
( 0,1 µg/ m l) en el rango de concent raciones de 0,02 a 20 m M ( 136) .
Por lo t ant o, la discrepancia de los result ados obt enidos en el
present e t rabaj o podría deberse a las diferent es condiciones
experim ent ales ut ilizadas respect o a los ot ros est udios.
S. aureus es capaz de generar una respuest a inflam at oria a
t ravés
de
diferent es
fact ores,
t ales
com o
el
pept idoglicano,
hem olisinas y prot eína A ( 33) . Por el cont rario, m uchos ot ros
fact ores de virulencia de est a bact eria ( Efb, CHI PS, ent re ot ros)
poseen una acción ant iinflam at oria lo que le perm it e evadir la
respuest a inm une del huésped ( 17) . En part icular, la prot eína Eap
puede act uar prom oviendo la sínt esis de cit oquinas proinflam at orias
en m onocit os y m acrófagos, m ient ras que posee una acción
ant iinflam at oria al unirse a I CAM- 1 y de est a m anera bloquear la
int eracción de los leucocit os con las células endot eliales ( 16, 116) .
Asim ism o, alt as concent raciones de Eap ( 81 μg/ m l) produj eron un
efect o inhibit orio de la proliferación de PBMCs, m ient ras que a baj as
83
concent raciones ( 9 μg/ m l) Eap est im uló la proliferación de est as
células ( 46) . Recient em ent e, se det erm inó que Eap inhibió el
reclut am ient o de células T en un m odelo de psoriasis en rat ón a
t ravés de su int eracción con I CAM- 1 ( 129) . Asim ism o, Xie et al.
( 135) report aron que Eap fue capaz de inhibir la encefalom ielit is en
rat ón a t ravés del m ism o m ecanism o. En el present e t rabaj o, se
dem ost ró que la m ut ant e R11eap generó un aum ent o significat ivo
en la sínt esis de TNF- α en las células endot eliales com parado con la
cepa R11. Est e result ado le at ribuiría un rol ant iinflam at orio a la
prot eína Eap. En conj unt o, se desprende que Eap podría const it uir
un
t rat am ient o
efect ivo
cont ra
enferm edades
inflam at orias
crónicas.
Endres et al. ( 29) dem ost raron que la adm inist ración de
aspirina a personas sanas durant e 14 días no generó cam bios en
los niveles de TNF- α sint et izados por los PBMCs luego de la
est im ulación con LPS. En concordancia con est os result ados, en el
present e t rabaj o, el t rat am ient o de las células endot eliales con SAL
no produj o diferencias significat ivas en la producción de TNF-
α luego de la infección con la cepa Newm an R11. Por ot ro lado, el
salicilat o de sodio a una concent ración de 20 m M provocó una
dism inución
en
los niveles de TNF- α en
m acrófagos m urinos
est im ulados con LPS ( 128) . Est a discrepancia podría ser explicada
por las diferent es líneas celulares, est ím ulos, concent raciones y
diferent es salicilat os ut ilizados.
La port ación nasal de S. aureus en hum anos es un fact or de
riesgo im port ant e para el desarrollo de enferm edades graves ( 67) .
Karabay et al. (64) observaron que los pacient es que ingirieron aspirina
en baj as dosis por un t iem po prolongado t uvieron una baj a
prevalencia de port ación nasal de S. aureus. Por ot ro lado, Eisen et
al. ( 28) dem ost raron que la adm inist ración de aspirina a pacient es
con endocardit is por S. aureus est aba asociada a un riesgo m enor
84
de com plicaciones post - infección ( por ej . cirugía de reem plazo de
válvula) . Con el fin de evaluar el efect o del SAL in vivo se ut ilizó un
m odelo m urino de colonización nasal de S. aureus. Al respect o, se
observó una dism inución del nivel de colonización de S. aureus a
las
4
hs
post - infección
en
el
grupo
de
rat ones
inyect ados
previam ent e con SAL com parado con el grupo cont rol. La aparent e
discrepancia de est os result ados con la m ayor capacidad de
invasión celular de S. aureus inducida por el SAL, puede ser
explicada por el hecho de que el SAL adm inist rado al huésped
desencadenaría una serie de event os que podrían prom over la
elim inación de la bact eria. Por ot ro lado, el t iem po de cont act o
ent re la bact eria y el SAL en est e m odelo in vivo no sería suficient e
para generar la expresión alt erada de PC y Eap en la cepa Newm an
que se observó in vit ro.
La im port ancia de est e est udio radica en el hecho de que
provee inform ación básica acerca de un fárm aco, el SAL, que afect a
la expresión de los sist em as regulat orios de S. aureus lo que podría
causar un im pact o inesperado en el curso y t rat am ient o de la
infección.
Por
ciert o,
la
inform ación
obt enida
m ediant e
est a
invest igación podrá ext enderse en un fut uro al est udio de nuevas
est rat egias t erapéut icas dest inadas al cont rol y prevención de las
infecciones est afilocóccicas en grupos de riesgo.
85
En el present e t rabaj o de t esis se realizaron ensayos para
est ablecer el efect o del SAL sobre la virulencia de S. aureus y su
int eracción con el huésped. Los result ados descript os perm it ieron
concluir:
1.
El t rat am ient o con SAL provocó un aum ent o en la capacidad de
invasión de la cepa Newm an en las células epit eliales.
2.
Las cepas no capsuladas RN6390 y Reynolds PC- m ost raron
una capacidad aum ent ada para invadir las células epit eliales con
respect o a las capsuladas Newm an y Reynolds PC5+ , por lo t ant o la
ausencia de cápsula favoreció la int ernalización de S. aureus.
3.
El SAL induj o una dism inución en la act ividad del prom ot or
cap, com o así t am bién en la expresión de t ranscript os cap y de
PC5.
4.
La expresión de prot eínas de pared, exoprot eínas y prot eínas
de superficie de S. aureus fue afect ada por el t rat am ient o con SAL.
5.
El SAL induj o la act ividad del prom ot or eap, com o así t am bién
la expresión de los t ranscript os eap y de la prot eína Eap.
6.
Eap j uega un rol im port ant e en la int ernalización de la cepa
Newm an en células epit eliales y endot eliales.
86
7.
La act ividad del prom ot or Pc del locus sae no fue afect ada por
el SAL, m ient ras que la cant idad de t ranscript os saeB, C y D
aum ent o luego del t rat am ient o con SAL.
8.
El sist em a regulat orio sae es esencial para la expresión de
Eap.
9.
La act ividad de sae y, por lo t ant o, los fact ores regulados por
est e locus, son im port ant es para la invasión celular de S. aureus.
10. El
t rat am ient o
con
SAL provocó
una dism inución
en
la
act ividad del prom ot or m grA, así com o t am bién en la expresión de
los t ranscript os m grA.
11. El regulador m grA es esencial para la expresión de PC5.
12. m grA induj o la expresión del prom ot or eap, sin em bargo est o
no se reflej ó en un aum ent o de la prot eína Eap.
13. La presencia del gen m grA generó una dism inución en la
capacidad de adhesión de S. aureus.
14. La acción del SAL sobre las células endot eliales produj o una
m enor t asa de invasión por part e de la cepa Newm an R11 de S.
aureus, m ient ras que no m odificó la int ernalización de su m ut ant e
eap.
87
15. La presencia del gen eap inhibió la sínt esis de TNF- α en células
endot eliales.
16. El t rat am ient o de las células endot eliales con SAL no produj o
cam bios significat ivos en la producción de TNF- α inducida por la
infección de S. aureus.
17. La producción de Eap es fundam ent al para la colonización
nasal de S. aureus.
18. La colonización nasal de S. aureus dism inuyó luego del
t rat am ient o del huésped con SAL.
88
1.
Adh ik a r i,
R.
P.,
and
R.
P.
N ovick .
2008.
Regulat ory
organizat ion of t he st aphylococcal sae locus. Microbiology 1 5 4 :949959.
2.
Ale k sh u n , M . N ., a n d S. B. Le vy. 1999. The m ar regulon:
m ult iple resist ance t o ant ibiot ics and ot her t oxic chem icals. Trends
Microbiol 7 :410- 413.
3.
Ar r e cu bie t a ,
C.
L.,
FD .
2006.
St aphylococcus
aureus–
eukaryot ic cell int eract ions., p. 517- 525. I n V. N. Fischet t i, RP.;
Ferret t i, JJ.; Port noy, DA.; Rood, JI . ( ed.) , Gram - posit ive pat hogens.,
2nd ed. ASM Press, Washingt on, DC.
4.
Ba yle s, K. W ., C. A. W e sson, L. E. Liou, L. K. Fox , G. A.
Boh a ch , a n d W . R. Tr u m ble . 1998. I nt racellular St aphylococcus
aureus escapes t he endosom e and induces apopt osis in epit helial
cells. I nfect I m m un 6 6 :336- 342.
5.
Be r n a r do,
Ut e r m oh le n ,
Subinhibit ory
K.,
O.
N.
Kr u t ,
Pa k u la t ,
S.
concent rat ions
S.
M u lle r ,
of
Fle e r ,
and
linezolid
A.
M.
Sch n a it h ,
Kr on k e .
reduce
O.
2004.
St aphylococcus
aureus virulence fact or expression. Ant im icrob Agent s Chem ot her
4 8 :546- 555.
6.
Bisch off, M ., P. D u n m a n , J. Kor m a n e c, D . M a ca pa ga l, E.
M u r ph y, W . M ou n t s, B. Be r ge r - Ba ch i, a n d S. Pr oj a n . 2004.
Microarray- based analysis of t he St aphylococcus aureus sigm aB
regulon. J Bact eriol 1 8 6 :4085- 4099.
7.
Blick w e de , M ., R. Goe t h e , C. W olz, P. Va le n t in - W e iga n d,
and
S.
Sch w a r z.
2005.
Molecular
basis of
florfenicol- induced
increase in adherence of St aphylococcus aureus st rain Newm an. J
Ant im icrob Chem ot her 5 6 :315- 323.
89
8.
Bode n , M . K., a n d J. I . Flock . 1992. Evidence for t hree
different fibrinogen- binding prot eins wit h unique propert ies from
St aphylococcus aureus st rain Newm an. Microb Pat hog 1 2 :289- 298.
9.
Br on n e r , S., H . M on t e il, a n d G. Pr e vost . 2004. Regulat ion of
virulence det erm inant s in St aphylococcus aureus: com plexit y and
applicat ions. FEMS Microbiol Rev 2 8 :183- 200.
10.
G.
Br ouille t t e , E., G. Gr ondin , L. Shk r e t a , P. La ca sse , a nd B.
Ta lbot .
2003.
In
vivo
and
in
vit ro
dem onst rat ion
t hat
St aphylococcus aureus is an int racellular pat hogen in t he presence or
absence of fibronect in- binding prot eins. Microb Pat hog 3 5 :159- 168.
11.
Bu ck lin g, A., J. N e ilson , J. Lin dsa y, R. ffr e n ch - Con st a n t ,
M . Enr ight , N . D a y, a nd R. C. M a sse y. 2005. Clonal dist ribut ion
and phase- variable expression of a m aj or hist ocom pat ibilit y com plex
analogue prot ein in St aphylococcus aureus. J Bact eriol 1 8 7 :29172919.
12.
Buzz ola , F. R., L. P. Alva r e z, L. P. Tuchsche r r , M . S.
Ba r ba ge la t a , S. M . La t t a r , L. Ca lvin h o, a n d D . O. Sor de lli. 2007.
Different ial abilit ies of capsulat ed and noncapsulat ed St aphylococcus
aureus isolat es from diverse agr groups t o invade m am m ary epit helial
cells. I nfect I m m un 7 5 :886- 891.
13.
Ca r los, T. M ., a n d J. M . H a r la n . 1994. Leukocyt e- endot helial
adhesion m olecules. Blood 8 4 :2068- 2101.
14.
Collins, T., M . A. Re a d, A. S. N e ish, M . Z. W hit le y, D .
Th a n os, a n d
T. M a n ia t is.
1995.
endot helial cell adhesion m olecules:
Transcript ional regulat ion
of
NF- kappa B and cyt okine-
inducible enhancers. FASEB J 9 :899- 909.
90
15.
Cost a n zo, A., F. M or e t t i, V. L. Bur gio, C. Br a vi, F. Gu ido,
M . Le vr e r o, a n d P. L. Pu r i. 2003. Endot helial act ivat ion by
angiot ensin I I t hrough NFkappaB and p38 pat hways: I nvolvem ent of
NFkappaB- inducible kinase ( NI K) , free oxygen radicals, and select ive
inhibit ion by aspirin. J Cell Physiol 1 9 5 :402- 410.
16.
Ch a va k is, T., M . H u ssa in , S. M . Ka n se , G. Pe t e r s, R. G.
Br e t ze l, J. I . Flock , M . H e r r m a nn , a nd K. T. Pr e issne r . 2002.
St aphylococcus aureus ext racellular adherence prot ein serves as ant iinflam m at ory fact or by inhibit ing t he recruit m ent of host leukocyt es.
Nat Med 8 :687- 693.
17.
Ch a va k is, T., K. T. Pr e issn e r , a n d M . H e r r m a n n . 2007. The
ant i- inflam m at ory
act ivit ies
of
St aphylococcus
aureus.
Trends
I m m unol 2 8 :408- 418.
18.
Ch e n , Z., T. T. Lu on g, a n d C. Y. Le e . 2007. The sbcDC locus
m ediat es repression of t ype 5 capsule product ion as part of t he SOS
response in St aphylococcus aureus. J Bact eriol 1 8 9 :7343- 7350.
19.
Ch e u n g, A. L., A. S. Ba ye r , G. Zh a n g, H . Gr e sh a m , a n d Y.
Q. Xion g. 2004. Regulat ion of virulence det erm inant s in vit ro and in
vivo in St aphylococcus aureus. FEMS I m m unol Med Microbiol 4 0 :1- 9.
20.
Ch e u n g, A. L., a n d V. A. Fisch e t t i. 1988. Variat ion in t he
expression of cell wall prot eins of St aphylococcus aureus grown on
solid and liquid m edia. I nfect I m m un 5 6 :1061- 1065.
21.
D a ssy, B., T. H oga n , T. J. Fost e r , a n d J. M . Fou r n ie r . 1993.
I nvolvem ent of t he accessory gene regulat or ( agr) in expression of
t ype 5 capsular polysaccharide by St aphylococcus aureus. J Gen
Microbiol 1 3 9 Pt 6 :1301- 1306.
91
22.
D om e n ico, P., D . R. La n dolph i, a n d B. A. Cu n h a . 1991.
Reduct ion
of
capsular
polysaccharide
and
pot ent iat ion
am inoglycoside inhibit ion in gram - negat ive bact eria by
of
bism ut h
subsalicylat e. J Ant im icrob Chem ot her 2 8 :801- 810.
23.
D om e n ico, P., S. Sch w a r t z, a n d
Reduct ion
of
capsular
polysaccharide
B. A. Cu n h a .
product ion
in
1989.
Klebsiella
pneum oniae by sodium salicylat e. I nfect I m m un 5 7 :3778- 3782.
24.
D on g, Z., C. H u a n g, R. E. Br ow n , a n d W . Y. M a . 1997.
I nhibit ion of act ivat or prot ein 1 act ivit y and neoplast ic t ransform at ion
by aspirin. J Biol Chem 2 7 2 :9962- 9970.
25.
D on la n , R. M ., a n d J. W . Cost e r t on . 2002. Biofilm s: survival
m echanism s of clinically relevant m icroorganism s. Clin Microbiol Rev
1 5 :167- 193.
26.
D u t h ie , E. S., a n d
L. L. Lor e n z.
1952.
St aphylococcal
coagulase; m ode of act ion and ant igenicit y. J Gen Microbiol 6 :95- 107.
27.
Edge ll, C. J., C. C. M cD on a ld, a nd J. B. Gr a h a m . 1983.
Perm anent cell line expressing hum an fact or VI I I - relat ed ant igen
est ablished by hybridizat ion. Proc Nat l Acad Sci U S A 8 0 :3734- 3737.
28.
Eise n, D . P., G. R. Cor e y, E. S. M cBr yde , V. G. Fow le r , Jr .,
J. M . M ir o, C. H . Ca be ll, A. C. St r e e t , M . G. Pa iva , A. I ona c, R. S.
Ta n , C. Tr ibouilloy, O. Pa ch ir a t , S. B. Jon e s, N . Ch ipigin a , C.
N a be r , A. Pa n, V. Ra va sio, R. Ga t t r inge r , V . H . Chu , a nd A. S.
Ba ye r . 2009. Reduced valve replacem ent surgery and com plicat ion
rat e in St aphylococcus aureus endocardit is pat ient s receiving acet ylsalicylic acid. J I nfect 5 8 :332- 338.
92
29.
En dr e s, S., R. E. W h it a k e r , R. Ghor ba ni, S. N . M e yda ni,
a n d C. A. D in a r e llo. 1996. Oral aspirin and ibuprofen increase
cyt okine- induced synt hesis of I L- 1 bet a and of t um our necrosis
fact or- alpha ex vivo. I m m unology 8 7 :264- 270.
30.
Fa r t hing, D ., L. Ge hr , H . T. Ka r n e s, D . Sica , T. Ge hr , T.
La r u s, C. Fa r t h in g, a n d L. Xi. 2007. Effect s of salicylic acid on post ischaem ic vent ricular funct ion and purine efflux in isolat ed m ouse
heart s. Biom arkers 1 2 :623- 634.
31.
Fost e r , T. J. 2005. I m m une evasion by st aphylococci. Nat Rev
Microbiol 3 :948- 958.
32.
Fost e r , T. J., a n d M . H ook . 1998. Surface prot ein adhesins of
St aphylococcus aureus. Trends Microbiol 6 :484- 488.
33.
Fou r n ie r , B., a n d D . J. Ph ilpot t . 2005. Recognit ion of
St aphylococcus aureus by t he innat e im m une syst em . Clin Microbiol
Rev 1 8 :521- 540.
34.
Fr a n k lin D ., L. M . D . 1998. St aphylococcus aureus infect ions.
Medical Progress 3 3 9 :520- 532.
35.
2008.
Ge ige r , T., C. Goe r k e , M . M a in ie r o, D . Kr a u s, a n d C. W olz.
The
virulence
regulat or
Sae
of
St aphylococcus
aureus:
prom ot er act ivit ies and response t o phagocyt osis- relat ed signals. J
Bact eriol 1 9 0 :3419- 3428.
36.
Ge isbr e ch t , B. V., B. Y. H a m a ok a , B. Pe r m a n , A. Ze m la ,
a n d D . J. Le a h y. 2005. The cryst al st ruct ures of EAP dom ains from
St aphylococcus aureus reveal an unexpect ed hom ology t o bact erial
superant igens. J Biol Chem 2 8 0 :17243- 17250.
93
37.
Gir a u do, A. T., A. Ca lzola r i, A. A. Ca t a ldi, C. Bogn i, a nd R.
N a ge l. 1999. Corrigendum t o: " The sae locus of st aphylococcus
aureus encodes a t wo- com ponent regulat ory syst em " . FEMS Microbiol
Let t 1 8 0 :117.
38.
Gir a u do, A. T., A. Ca lzola r i, A. A. Ca t a ldi, C. Bogn i, a nd R.
N a ge l. 1999. The sae locus of St aphylococcus aureus encodes a t wocom ponent regulat ory syst em . FEMS Microbiol Let t 1 7 7 :15- 22.
39.
Gir a u do, A. T., A. L. Che u n g, a n d R. N a ge l. 1997. The sae
locus of St aphylococcus aureus cont rols exoprot ein synt hesis at t he
t ranscript ional level. Arch Microbiol 1 6 8 :53- 58.
40.
Gir a u do, A. T., C. M a n silla , A. Ch a n , C. Ra spa n t i, a n d R.
N a ge l. 2003. St udies on t he expression of regulat ory locus sae in
St aphylococcus aureus. Curr Microbiol 4 6 :246- 250.
41.
Goe r k e , C., U. Flu ck ige r , A. St e in h u be r , V. Bisa n zio, M .
Ulr ich , M . Bisch off, J. M . Pa t t i, a n d C. W olz. 2005. Role of
St aphylococcus aureus global regulat ors sae and sigm aB in virulence
gene
expression
during
device- relat ed
infect ion.
I nfect
I m m un
7 3 :3415- 3421.
42.
Goe r k e , C., U. Flu ck ige r , A. St e in h u be r , W . Zim m e r li, a n d
C. W olz. 2001. I m pact of t he regulat ory loci agr, sarA and sae of
St aphylococcus aureus on t he induct ion of alpha- t oxin during devicerelat ed infect ion resolved by direct quant it at ive t ranscript analysis.
Mol Microbiol 4 0 :1439- 1447.
43.
Gr u n dm e ie r , M ., M . H u ssa in , P. Be ck e r , C. H e ilm a n n , G.
Pe t e r s, a n d B. Sin h a . 2004. Truncat ion of fibronect in- binding
prot eins in St aphylococcus aureus st rain Newm an leads t o deficient
94
adherence and host cell invasion due t o loss of t he cell wall anchor
funct ion. I nfect I m m un 7 2 :7155- 7163.
44.
Gu st a fson , J. E., P. V. Ca n de la r ia , S. A. Fish e r , J. P.
Goodr idge , T. M . Lich ocik , T. M . M cW illia m s, C. T. Pr ice , F. G.
O'Br ie n , a n d W . B. Gr u bb. 1999. Growt h in t he presence of
salicylat e increases fluoroquinolone resist ance in St aphylococcus
aureus. Ant im icrob Agent s Chem ot her 4 3 :990- 992.
45.
H a gga r , A., M . H u ssa in , H . Lon n ie s, M . H e r r m a n n , A.
N or r by- Te glu n d, a n d J. I . Flock . 2003. Ext racellular adherence
prot ein from St aphylococcus aureus enhances int ernalizat ion int o
eukaryot ic cells. I nfect I m m un 7 1 :2310- 2317.
46.
H a gga r , A., O. Sh a n n on , A. N or r by- Te glu n d, a n d J. I .
Flock . 2005. Dual effect s of ext racellular adherence prot ein from
St aphylococcus aureus on peripheral blood m ononuclear cells. J I nfect
Dis 1 9 2 :210- 217.
47.
H a m m e l, M ., D . N e m e ce k , J. A. Ke igh t le y, G. J. Th om a s,
Jr ., a n d B. V. Ge isbr e ch t . 2007. The St aphylococcus aureus
ext racellular
adherence prot ein
( Eap)
adopt s an
elongat ed but
st ruct ured conform at ion in solut ion. Prot ein Sci 1 6 :2605- 2617.
48.
H a r r a gh y, N ., M . H u ssa in , A. H a gga r , T. Ch a va k is, B.
Sin h a , M . H e r r m a n n , a n d J. I . Flock . 2003. The adhesive and
im m unom odulat ing propert ies of t he m ult ifunct ional St aphylococcus
aureus prot ein Eap. Microbiology 1 4 9 :2701- 2707.
49.
H a r r a gh y, N ., J. Kor m a n e c, C. W olz, D . H om e r ova , C.
Goe r k e , K. Oh lse n, S. Qa zi, P. H ill, a n d M . H e r r m a n n . 2005. sae
is essent ial for expression of t he st aphylococcal adhesins Eap and
Em p. Microbiology 1 5 1 :1789- 1800.
95
50.
H a u ck , C. R., a n d K. Ohlse n . 2006. St icky connect ions:
ext racellular m at rix prot ein recognit ion and int egrin- m ediat ed cellular
invasion by St aphylococcus aureus. Curr Opin Microbiol 9 :5- 11.
51.
H e r be r t , S., D . W or lit zsch , B. D a ssy, A. Bou t on n ie r , J. M .
Fou r n ie r , G. Be llon , A. D a lh off, a n d G. D or in g. 1997. Regulat ion
of St aphylococcus aureus capsular polysaccharide t ype 5:
CO2
inhibit ion in vit ro and in vivo. J I nfect Dis 1 7 6 :431- 438.
52.
H u ssa in , M ., K. Be ck e r , C. von Eiff, G. Pe t e r s, a n d M .
Herrm ann.
2001.
Analogs of
Eap
prot ein
are conserved
and
prevalent in clinical St aphylococcus aureus isolat es. Clin Diagn Lab
I m m unol 8 :1271- 1276.
53.
H u ssa in , M ., A. H a gga r , C. H e ilm a nn, G. Pe t e r s, J. I .
Flock , a n d M . H e r r m a n n . 2002. I nsert ional inact ivat ion of Eap in
St aphylococcus aureus st rain Newm an confers reduced st aphylococcal
binding t o fibroblast s. I nfect I m m un 7 0 :2933- 2940.
54.
H u ssa in , M ., A. H a gga r , G. Pe t e r s, G. S. Ch h a t w a l, M .
H e r r m a n n , J. I . Flock , a n d B. Sin h a . 2008. More t han one t andem
repeat
dom ain
of
t he
ext racellular
adherence
prot ein
of
St aphylococcus aureus is required for aggregat ion, adherence, and
host cell invasion but not for leukocyt e act ivat ion. I nfect I m m un
7 6 :5615- 5623.
55.
I n ga va le , S., W . va n W a m e l, T. T. Lu on g, C. Y. Le e , a n d A.
L. Ch e u n g. 2005. Rat / MgrA, a regulat or of aut olysis, is a regulat or of
virulence genes in St aphylococcus aureus. I nfect I m m un 7 3 :14231431.
96
56.
I n ga va le , S. S., W . Va n W a m e l, a n d A. L. Ch e u n g. 2003.
Charact erizat ion of RAT, an aut olysis regulat or in St aphylococcus
aureus. Mol Microbiol 4 8 :1451- 1466.
57.
Ja h r e is, A., Y. You sif, J. A. Rum p, R. D r a ge r , A. Vogt , H . H .
Pe t e r , a n d M . Sch le sie r . 1995. Tw o novel cat ionic st aphylococcal
prot eins induce I L- 2 secret ion, proliferat ion and im m unoglobulin
synt hesis in peripheral blood m ononuclear cells ( PBMC) of bot h
healt hy
cont rols
and
pat ient s
wit h
com m on
variable
im m unodeficiency ( CVI D) . Clin Exp I m m unol 1 0 0 :406- 411.
58.
Je von , M ., C. Gu o, B. M a , N . M or da n , S. P. N a ir , M . H a r r is,
B. H e n de r son , G. Be n t le y, a n d S. M e gh j i. 1999. Mechanism s of
int ernalizat ion
of
St aphylococcus
aureus
by
cult ured
hum an
ost eoblast s. I nfect I m m un 6 7 :2677- 2681.
59.
Joh, D ., E. R. W a nn, B. Kr e ik e m e ye r , P. Spe zia le , a nd M .
H ook . 1999. Role of fibronect in- binding MSCRAMMs in bact erial
adherence and ent ry int o m am m alian cells. Mat rix Biol 1 8 :211- 223.
60.
Joh n son, M ., A. Cock a yn e , a n d J. A. M or r isse y. 2008. I ron-
regulat ed
biofilm
form at ion
in
St aphylococcus
aureus
Newm an
requires ica and t he secret ed prot ein Em p. I nfect I m m un 7 6 :17561765.
61.
M.
Jon sson , K., D . M cD e vit t , M . H . M cGa vin , J. M . Pa t t i, a n d
H ook .
1995.
St aphylococcus
aureus
expresses
a
m aj or
hist ocom pat ibilit y com plex class I I analog. J Biol Chem 2 7 0 :2145721460.
62.
Joost , I ., D . Bla ss, M . Bur ia n, C. Goe r k e , C. W olz, L. von
M u lle r , K. Be ck e r , K. Pr e issn e r , M . H e r r m a n n , a n d M . Bisch off.
2009. Transcript ion analysis of t he ext racellular adherence prot ein
97
from St aphylococcus aureus in aut hent ic hum an infect ion and in vit ro.
J I nfect Dis 1 9 9 :1471- 1478.
63.
Jousse n, A. M ., V. Poula k i, N . M it sia de s, B. Kir ch hof, K.
Koiz u m i, S. D oh m e n , a n d A. P. Ada m is. 2002. Nonst eroidal ant iinflam m at ory drugs prevent early diabet ic ret inopat hy via TNF- alpha
suppression. FASEB J 1 6 :438- 440.
64.
Ka r a ba y, O., H . Ar inc, H . Gu n du z , A. Ta m e r , H . Ozh a n ,
a n d C. Uya n . 2006. A new effect of acet ylsalicylic acid? Significant ly
lower prevalence of nasal carriage of St aphylococcus aureus am ong
pat ient s receiving orally
adm inist ered acet ylsalicylic acid. I nfect
Cont rol Hosp Epidem iol 2 7 :318- 319.
65.
Ka r a k a w a , W . W ., J. M . Four n ie r , W . F. Va nn, R. Ar be it , R.
S. Sch n e e r son , a n d J. B. Robbin s. 1985. Met hod for t he serological
t yping of t he capsular polysaccharides of St aphylococcus aureus. J
Clin Microbiol 2 2 :445- 447.
66.
Ka t e r in a k i, E., J. W . H a ycock , R. La lla , K. E. Ca r lson , Y.
Ya n g, R. P. H ill, P. C. Lor iga n , a nd S. M a cN e il. 2006. Sodium
salicylat e
inhibit s
TNF- alpha- induced
NF- kappaB
act ivat ion,
cell
m igrat ion, invasion and I CAM- 1 expression in hum an m elanom a cells.
Melanom a Res 1 6 :11- 22.
67.
Klu yt m a ns, J., A. va n Be lk u m , a n d H . Ve r br u gh. 1997.
Nasal carriage of St aphylococcus aureus: epidem iology, underlying
m echanism s, and associat ed risks. Clin Microbiol Rev 1 0 :505- 520.
68.
Kopp, E., a n d S. Gh osh . 1994. I nhibit ion of NF- kappa B by
sodium salicylat e and aspirin. Science 2 6 5 :956- 959.
98
69.
Kr e ik e m e ye r , B., D . M cD e vit t , a n d A. Podbie lsk i. 2002. The
role of t he m ap prot ein in St aphylococcus aureus m at rix prot ein and
eukaryot ic cell adherence. I nt J Med Microbiol 2 9 2 :283- 295.
70.
Ku bica , M ., K. Gu zik , J. Kozie l, M . Za r e bsk i, W . Rich t e r , B.
Ga j k ow sk a , A. Golda , A. M a cia g- Gu dow sk a , K. Br ix , L. Sh a w , T.
Fost e r , a n d J. Pot e m pa . 2008. A pot ent ial new pat hway for
St aphylococcus aureus dissem inat ion: t he silent survival of S. aureus
phagocyt osed by hum an m onocyt e- derived m acrophages. PLoS One
3 :e1409.
71.
Ku llik , I ., P. Gia ch in o, a n d T. Fu ch s. 1998. Delet ion of t he
alt ernat ive sigm a fact or sigm aB in St aphylococcus aureus reveals it s
funct ion
as a global regulat or
of
virulence genes.
J Bact eriol
1 8 0 :4814- 4820.
72.
Kupfe r w a sse r ,
L.
I .,
M.
R.
Ye a m a n,
C.
C.
N a st ,
D.
Kupfe r w a sse r , Y. Q. Xion g, M . Pa lm a , A. L. Che ung, a nd A. S.
Ba ye r . 2003. Salicylic acid at t enuat es virulence in endovascular
infect ions by t arget ing global regulat ory pat hways in St aphylococcus
aureus. J Clin I nvest 1 1 2 :222- 233.
73.
Kupfe r w a sse r , L. I ., M . R. Ye a m a n, S. M . Sha pir o, C. C.
N a st , P. M . Sulla m , S. G. Fille r , a nd A. S. Ba ye r . 1999.
Acet ylsalicylic
acid
reduces
veget at ion
bact erial
densit y,
hem at ogenous bact erial dissem inat ion, and frequency of em bolic
event s in experim ent al St aphylococcus aureus endocardit is t hrough
ant iplat elet and ant ibact erial effect s. Circulat ion 9 9 :2791- 2797.
74.
Le e , L. Y., Y. J. M iya m ot o, B. W . M cI nt yr e , M . H ook , K. W .
M cCr e a , D . M cD e vit t , a n d E. L. Br ow n . 2002. The St aphylococcus
aureus Map prot ein is an im m unom odulat or t hat int erferes wit h T
cell- m ediat ed responses. J Clin I nvest 1 1 0 :1461- 1471.
99
75.
Li, D ., a nd A. Ch e u n g. 2008. Repression of hla by rot is
dependent on sae in St aphylococcus aureus. I nfect I m m un 7 6 :10681075.
76.
Liva k , K. J., a nd T. D . Sch m it t ge n. 2001. Analysis of relat ive
gene expression dat a using real- t im e quant it at ive PCR and t he 2( Delt a Delt a C( T) ) Met hod. Met hods 2 5 :402- 408.
77.
Low y, F. D . 1998. St aphylococcus aureus infect ions. N Engl J
Med 3 3 9 :520- 532.
78.
Lu on g, T. T., P. M . D u n m a n , E. M u r ph y, S. J. Pr oj a n , a n d
C. Y. Le e . 2006. Transcript ion Profiling of t he m grA Regulon in
St aphylococcus aureus. J Bact eriol 1 8 8 :1899- 1910.
79.
Luong, T. T., a n d C. Y. Le e . 2006. The arl locus posit ively
regulat es St aphylococcus aureus t ype 5 capsule via an m grAdependent pat hway. Microbiology 1 5 2 :3123- 3131.
80.
Luong, T. T., a nd C. Y. Le e . 2002. Overproduct ion of t ype 8
capsular polysaccharide augm ent s St aphylococcus aureus virulence.
I nfect I m m un 7 0 :3389- 3395.
81.
novel
Luong, T. T., S. W . N e w e ll, a nd C. Y. Le e . 2003. Mgr, a
global
regulat or
in
St aphylococcus
aureus.
J
Bact eriol
1 8 5 :3703- 3710.
82.
and
M a in ie r o, M ., C. Goe r k e , T. Ge ige r , C. Gon se r , S. H e r be r t ,
C.
W olz.
Different ial
t arget
gene
act ivat ion
by
t he
St aphylococcus aureus t wo- com ponent syst em saeRS. J Bact eriol
1 9 2 :613- 623.
100
83.
M a n n a , A., a n d A. L. Ch e u n g. 2001. Charact erizat ion of sarR,
a m odulat or of sar expression in St aphylococcus aureus. I nfect
I m m un 6 9 :885- 896.
84.
M cCor m ick , J. K., J. M . Ya r w ood, a n d P. M . Sch lie ve r t .
2001. Toxic shock syndrom e and bact erial superant igens: an updat e.
Annu Rev Microbiol 5 5 :77- 104.
85.
M e a de , E. A., W . L. Sm it h, a nd D . L. D e W it t . 1993.
Different ial
inhibit ion
of
prost aglandin
endoperoxide
synt hase
( cyclooxygenase) isozym es by aspirin and ot her non- st eroidal ant iinflam m at ory drugs. J Biol Chem 2 6 8 :6610- 6614.
86.
M e n zie s, B. E. 2003. The role of fibronect in binding prot eins in
t he pat hogenesis of St aphylococcus aureus infect ions. Curr Opin
I nfect Dis 1 6 :225- 229.
87.
M e n zie s, B. E., a n d I . Kou r t e va . 1998. I nt ernalizat ion of
St aphylococcus aureus by endot helial cells induces apopt osis. I nfect
I m m un 6 6 :5994- 5998.
88.
M it che ll, J. A., P. Ak a r a se r e e nont , C. Thie m e r m a nn, R. J.
Flow e r ,
and
J.
R.
Va n e .
1993.
Select ivit y
of
nonst eroidal
ant iinflam m at ory drugs as inhibit ors of const it ut ive and inducible
cyclooxygenase. Proc Nat l Acad Sci U S A 9 0 :11693- 11697.
89.
M or e illon ,
P.,
Y.I .
Qu e ,
and
M .P.
Gla u se r .
2005.
St aphylococcus aureus, p. 2321- 2351. I n J. E. B. G. L. Mandell, and
R. Dolin ( ed.) , Principles and pract ice of infect ious disease. ElsevierChurchill Livingst one, Philadelphia.
90.
N e e ds,
C.
J.,
a nd
P.
M.
Br ook s.
1985.
Clinical
pharm acokinet ics of t he salicylat es. Clin Pharm acokinet 1 0 :164- 177.
101
91.
2007.
N it sche - Schm it z, D . P., M . Rohde , a nd G. S. Ch ha t w a l.
I nvasion
m echanism s of
Gram - posit ive pat hogenic cocci.
Throm b Haem ost 9 8 :488- 496.
92.
N ovick , R. P. 2003. Aut oinduct ion and signal t ransduct ion in
t he regulat ion of st aphylococcal virulence. Mol Microbiol 4 8 :14291449.
93.
N ovick , R. P. 1991. Genet ic syst em s in st aphylococci. Met hods
Enzym ol 2 0 4 :587- 636.
94.
N ovick , R. P., a n d D . Jia n g. 2003. The st aphylococcal saeRS
syst em coordinat es environm ent al signals wit h agr quorum sensing.
Microbiology 1 4 9 :2709- 2717.
95.
O'Rior da n , K., a n d J. C. Le e . 2004. St aphylococcus aureus
capsular polysaccharides. Clin Microbiol Rev 1 7 :218- 234.
96.
Ou ya n g, S., S. Sa u , a n d C. Y. Le e . 1999. Prom ot er analysis
of t he cap8 operon, involved in t ype 8 capsular polysaccharide
product ion in St aphylococcus aureus. J Bact eriol 1 8 1 :2492- 2500.
97.
Pa lm a , M ., A. Ba ye r , L. I . Kupfe r w a sse r , T. Josk a , M . R.
Ye a m a n , a n d A. Ch e u n g. 2006. Salicylic acid act ivat es sigm a fact or
B by rsbU- dependent and - independent m echanism s. J Bact eriol
1 8 8 :5896- 5903.
98.
Pa lm a , M ., A. H a gga r , a n d J. I . Flock . 1999. Adherence of
St aphylococcus aureus is enhanced by an endogenous secret ed
prot ein wit h broad binding act ivit y. J Bact eriol 1 8 1 :2840- 2845.
99.
Pa r k , W . B., S. H . Kim , J. H . Cho, J. H . Ba n g, H . B. Kim , N .
J. Kim , M . D . Oh , a n d K. W . Ch oe . 2007. Effect of salicylic acid on
102
invasion of hum an vascular endot helial cells by St aphylococcus
aureus. FEMS I m m unol Med Microbiol 4 9 :56- 61.
100. Pa t t i, J. M ., B. L. Alle n , M . J. M cGa vin , a n d M . H ook . 1994.
MSCRAMM- m ediat ed adherence of m icroorganism s t o host t issues.
Annu Rev Microbiol 4 8 :585- 617.
101. Poh lm a n n - D ie t ze , P., M . Ulr ich , K. B. Kise r , G. D or in g, J.
C. Le e , J. M . Fou r n ie r , K. Bot ze n h a r t , a n d C. W olz. 2000.
Adherence of St aphylococcus aureus t o endot helial cells: influence of
capsular polysaccharide, global regulat or agr, and bact erial growt h
phase. I nfect I m m un 6 8 :4865- 4871.
102. Pou t r e l, B., F. B. Gilbe r t , a n d M . Le br u n . 1995. Effect s of
cult ure condit ions on product ion of t ype 5 capsular polysaccharide by
hum an and bovine St aphylococcus aureus st rains. Clin Diagn Lab
I m m unol 2 :166- 171.
103. Pou t r e l,
B.,
P.
Ra in a r d,
and
P.
Sa r r a din .
1997.
Het erogeneit y of cell- associat ed CP5 expression on St aphylococcus
aureus st rains dem onst rat ed by flow cyt om et ry. Clin Diagn Lab
I m m unol 4 :275- 278.
104. Pr e vost ,
G.,
P.
Cou ppie ,
and
H.
M on t e il.
2003.
St aphylococcal epiderm olysins. Curr Opin I nfect Dis 1 6 :71- 76.
105. Pr ice , C. T., a nd J. E. Gust a fson . 2001. I ncreases in t he
m ut at ion frequency at which fusidic acid- resist ant St aphylococcus
aureus arise wit h salicylat e. J Med Microbiol 5 0 :104- 106.
106. Pr ice , C. T., G. W . Ka a t z, a n d J. E. Gu st a fson . 2002. The
m ult idrug efflux pum p NorA is not required for salicylat e- induced
103
reduct ion in drug accum ulat ion by St aphylococcus aureus. I nt J
Ant im icrob Agent s 2 0 :206- 213.
107. Pr ice , C. T., F. G. O'Br ie n, B. P. She lt on , J. R. W a r m ingt on ,
W . B. Gr u bb, a n d J. E. Gust a fson . 1999. Effect s of salicylat e and
relat ed com pounds on fusidic acid MI Cs in St aphylococcus aureus. J
Ant im icrob Chem ot her 4 4 :57- 64.
108. Pr it hivir a j , B., H . P. Ba is, A. K. Jha , a nd J. M . Viva nco.
2005. St aphylococcus aureus pat hogenicit y on Arabidopsis t haliana is
m ediat ed eit her by a direct effect of salicylic acid on t he pat hogen or
by SA- dependent , NPR1- independent host responses. Plant J 4 2 :417432.
109. Pr it h ivir a j , B., H . P. Ba is, T. W e ir , B. Su r e sh , E. H .
N a j a r r o, B. V. D a ya k a r , H . P. Sch w e ize r , a n d J. M . Viva n co.
2005.
Down
regulat ion
of
virulence
fact ors
of
Pseudom onas
aeruginosa by salicylic acid at t enuat es it s virulence on Arabidopsis
t haliana and Caenorhabdit is elegans. I nfect I m m un 7 3 :5319- 5328.
110. Pr oct or , R. A., B. Ka h l, C. von Eiff, P. E. Va u da u x , D . P.
Le w , a n d G. Pe t e r s. 1998. St aphylococcal sm all colony variant s
have novel m echanism s for ant ibiot ic resist ance. Clin I nfect Dis 2 7
Su ppl 1 :S68- 74.
111. Pr oct or , R. A., a n d G. Pe t e r s. 1998. Sm all colony variant s in
st aphylococcal infect ions: diagnost ic and t herapeut ic im plicat ions.
Clin I nfect Dis 2 7 :419- 422.
112. Rior da n , J. T., A. M u t h a iya n , W . Va n Voor h ie s, C. T. Pr ice ,
J. E. Gr a h a m , B. J. W ilk in son , a n d J. E. Gu st a fson . 2007.
Response of St aphylococcus aureus t o salicylat e challenge. J Bact eriol
1 8 9 :220- 227.
104
113. Roga sch , K., V. Ru h m lin g, J. Pa n e - Fa r r e , D . H ope r , C.
W e in be r g, S. Fu ch s, M . Sch m u dde , B. M . Br ok e r , C. W olz, M .
H e ck e r , a n d S. En ge lm a n n . 2006. I nfluence of t he t wo- com ponent
syst em
SaeRS
on
global
gene
expression
in
t wo
different
St aphylococcus aureus st rains. J Bact eriol 1 8 8 :7742- 7758.
114. Rya n , K., a n d C. Ra y. 2004. Sherris Medical Microbiology, 4t h
ed. ed. McGraw Hill
115. Sa u,
S.,
J.
Su n,
a nd
C.
Y.
Le e .
1997.
Molecular
charact erizat ion and t ranscript ional analysis of t ype 8 capsule genes
in St aphylococcus aureus. J Bact eriol 1 7 9 :1614- 1621.
116. Scr iba , T. J., S. Sie r r o, E. L. Br ow n , R. E. Ph illips, A. K.
Se w e ll, a n d R. C. M a sse y. 2008. The St aphyloccous aureus Eap
prot ein act ivat es expression of proinflam m at ory cyt okines. I nfect
I m m un 7 6 :2164- 2168.
117. Sch a fe r ,
D .,
T.
T.
La m ,
T.
Ge ige r ,
M.
M a in ie r o,
S.
En ge lm a n n , M . H u ssa in , A. Bosse r h off, M . Fr osch , M . Bisch off,
C. W olz, J. Re idl, a n d B. Sin h a . 2009. A point m ut at ion in t he
sensor
hist idine
kinase
SaeS
of
St aphylococcus
aureus
st rain
Newm an alt ers response t o biocide exposure. J Bact eriol.
118. Sch a ffe r , A. C., a nd J. C. Le e . 2008. Vaccinat ion and passive
im m unisat ion against St aphylococcus aureus. I nt J Ant im icrob Agent s
3 2 Su ppl 1 :S71- 78.
119. Sin h a , B., P. P. Fr a n cois, O. N usse , M . Fot i, O. M . H a r t for d,
P. Va uda ux , T. J. Fost e r , D . P. Le w , M . H e r r m a n n, a nd K. H .
Kr a u se . 1999. Fibronect in- binding prot ein act s as St aphylococcus
aureus invasin via fibronect in bridging t o int egrin alpha5bet a1. Cell
Microbiol 1 :101- 117.
105
120. Spr in ge r , T. A. 1990. Adhesion recept ors of t he im m une
syst em . Nat ure 3 4 6 :425- 434.
121. St e in h u be r , A., C. Goe r k e , M . G. Ba ye r , G. D or in g, a n d C.
W olz. 2003. Molecular archit ect ure of t he regulat ory Locus sae of
St aphylococcus aureus and it s im pact on expression of virulence
fact ors. J Bact eriol 1 8 5 :6278- 6286.
122. St r in dh a ll, J., P. E. Lin dgr e n , S. Lofgr e n , a n d E. Kih lst r om .
2002. Variat ions am ong clinical isolat es of St aphylococcus aureus t o
induce expression of E- select in and I CAM- 1 in hum an endot helial
cells. FEMS I m m unol Med Microbiol 3 2 :227- 235.
123. Tolle r sr u d, T., K. Ke n n y, A. J. Re it z, Jr ., a nd J. C. Le e .
2000. Genet ic and serologic evaluat ion of capsule product ion by
bovine m am m ary
isolat es of
St aphylococcus aureus and
ot her
St aphylococcus spp. from Europe and t he Unit ed St at es. J Clin
Microbiol 3 8 :2998- 3003.
124. Tr ot on da , M . P., S. Ta m be r , G. M e m m i, a n d A. L. Ch e u n g.
2008. MgrA represses biofilm form at ion in St aphylococcus aureus.
I nfect I m m un 7 6 :5645- 5654.
125. Tr u on g- Boldu c, Q. C., Y. D in g, a nd D . C. H oope r . 2008.
Post t ranslat ional m odificat ion influences t he effect s of MgrA on norA
expression in St aphylococcus aureus. J Bact eriol 1 9 0 :7375- 7381.
126. va n W a m e l, W ., Y. Q. Xiong, A. S. Ba ye r , M . R. Ye a m a n, C.
C. N a st , a n d A. L. Ch e u n g. 2002. Regulat ion of St aphylococcus
aureus t ype 5 capsular polysaccharides by agr and sarA in vit ro and
in an experim ent al endocardit is m odel. Microb Pat hog 3 3 :73- 79.
106
127. Va n e , J., a n d R. Bot t in g. 1992. The hist ory of aspirin, p. 334. Aspirin and ot her salicylat es. Chapm an and Hall, London.
128. Vit t im be r ga , F. J., Jr ., T. P. M cD a de , R. A. Pe r u gin i, a n d M .
P. Ca lle r y. 1999. Sodium salicylat e inhibit s m acrophage TNF- alpha
product ion and alt ers MAPK act ivat ion. J Surg Res 8 4 :143- 149.
129. W a n g, H ., J. von Roh r sch e idt , J. Roe h r be in , T. Pe t e r s, A.
Sin dr ila r u, D . Ke ss, K. T. Pr e issn e r , a n d K. Sch a r ffe t t e r Koch a n e k . 2009. Ext racellular Adherence Prot ein of St aphylococcus
aureus Suppresses Disease by I nhibit ing T- Cell Recruit m ent in a
Mouse Model of Psoriasis. J I nvest Derm at ol.
130. W a n n , E. R., B. D a ssy, J. M . Fou r n ie r , a n d T. J. Fost e r .
1999. Genet ic analysis of t he cap5 locus of St aphylococcus aureus.
FEMS Microbiol Let t 1 7 0 :97- 103.
131. W a t t s, A., D . Ke , Q. W a n g, A. Pilla y, A. N ich olson - W e lle r ,
a n d J. C. Le e . 2005. St aphylococcus aureus st rains t hat express
serot ype 5 or serot ype 8 capsular polysaccharides differ in virulence.
I nfect I m m un 7 3 :3502- 3511.
132. W e ich h a r t , T., M . H or k y, J. Solln e r , S. Ga n gl, T. H e n ics, E.
N a gy, A. M e in k e , A. von Ga ba in , C. M . Fr a se r , S. R. Gill, M .
H a fn e r , a n d U. von Ah se n . 2003. Funct ional select ion of vaccine
candidat e
pept ides
from
St aphylococcus
aureus
whole- genom e
expression libraries in vit ro. I nfect I m m un 7 1 :4633- 4641.
133. W e sson, C. A., L. E. Liou, K. M . Todd, G. A. Boha ch, W . R.
Tr u m ble , a n d K. W . Ba yle s. 1998. St aphylococcus aureus Agr and
Sar
global regulat ors influence int ernalizat ion
and
induct ion
of
apopt osis. I nfect I m m un 6 6 :5238- 5243.
107
134. W u , K. K. 2000. Aspirin and salicylat e: An old rem edy wit h a
new t wist . Circulat ion 1 0 2 :2022- 2023.
135. Xie , C., P. Alca ide , B. V. Ge isbr e ch t , D . Sch n e ide r , M .
H e r r m a n n , K. T. Pr e issn e r , F. W . Lu scin sk a s, a n d T. Ch a va k is.
2006. Suppression of experim ent al aut oim m une encephalom yelit is by
ext racellular adherence prot ein of St aphylococcus aureus. J Exp Med
2 0 3 :985- 994.
136. Zund, G., A. L. D zus, R. Pr e t r e , U. N ie de r h a u se r , P. Vogt ,
a n d M . Tu r in a . 1998. Endot helial cell inj ury in cardiac surgery:
salicylat e m ay be prot ect ive by reducing expression of endot helial
adhesion m olecules. Eur J Cardiot horac Surg 1 3 :293- 297.
108