Capítulo 7 - Elfos Scientiae

COSMIX-PLEXING: MODO
NOVEDOSO DE GENERAR Y UTILIZAR BIBLIO TECAS
APÍTULO
C
7
COMBINATORIAS DE PÉPTIDOS PRESENTADOS EN LA SUPERFICIE DE FAGOS
105
COSMIX-PLEXING: MODO NOVEDOSO
DE GENERAR Y UTILIZAR BIBLIOTECAS
COMBINATORIAS DE PÉPTIDOS
PRESENTADOS EN LA SUPERFICIE
DE FAGOS
NATHALIE HORN,1 NELSON SANTIAGO VISPO,2 MICHAEL SZARDENINGS,3 JOHN COLLINS 1,3
1
Dept. Applied Genetics, GBF, Mascheroder Weg 1, Braunschweig, D-38124 Germany.
Centro de Ingienería Genética y Biotecnología. Ave. 31 e/ 158 y 190, Playa. AP 6162,
CP 10600, Ciudad de La Habana, Cuba.
3
Cosmix Molecular Biologicals. GmbH, Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, D-38124,
Germany.
2
INTRODUCCIÓN
La tecnología de presentación de péptidos en la superficie de un fago, fue descrita por primera vez por George P Smith en 1985 [1] como una vía para presentar, en la superficie del virus, un producto génico que está siempre asociado
al gen que lo codifica, y este gen, a su vez, es empaquetado dentro de la misma
partícula viral. Desde entonces un número creciente de laboratorios trabaja con
esta técnica de una amplia gama de aplicaciones [2]. A partir de 1991 se
empezaron a utilizar con éxito bibliotecas grandes de proteínas y péptidos
presentados en fagos, para aislar clones en los cuales la variante seleccionada
tuviera propiedades de unión definidas. Kay BK, et al. [3] hicieron una revisión
de los adelantos recientes en la búsqueda de ligandos peptídicos, y Holliger P y
Hoogenboom H [4] describieron el empleo de anticuerpos obtenidos por este
método, en particular la aplicación exitosa de éstos productos en la clínica.
El tamaño de la biblioteca es un factor que limita el éxito en la tecnología de
presentación de péptidos y proteínas en fagos. Para incrementar al máximo las
interacciones entre el ligando seleccionado y el blanco al cual se une, sería
conveniente presentar péptidos ligados relativamente grandes. El número mínimo de clones requeridos en una biblioteca (que contenga todas las secuencias
posibles) aumenta exponencialmente en la medida que aumenta el número de
residuos de aminoácidos de los péptidos. Una biblioteca que presenta péptidos
106
CAPÍTULO 7
de 9 aminoácidos en su superficie, requeriría una población de al menos 1,5 x
1012 variantes (2,4 x 1017 para péptidos de 13 aminoácidos). No obstante, las
peptidotecas combinatorias más grandes que se han construido contienen alrededor de 1011 variantes, por lo que sólo una fracción de todas las variantes
posibles están representadas en la biblioteca. El desarrollo de una técnica novedosa,
el Cosmix-Plexing® [1], elimina esta limitación [5].
La diversidad potencial de la biblioteca ya no estará representada únicamente por
el número de variantes presentes en la biblioteca inicial sino que las utilizadas en
esta técnica contienen un sitio único de recombinación dentro del dominio
hipervariable. Generalmente, la recombinación se lleva a cabo con una población
preseleccionada, por ejemplo, 104 variantes, por lo que se generan 108
recombinantes que contienen esencialmente todas las combinaciones posibles de
secuencias a cada lado del sitio de recombinación [6]. En la Figura 7.1 se muestra
la ventaja de esta técnica en el sentido del aumento de residuos que se logra a
partir de la diversidad de una población preseleccionada.
Mediante la técnica del Cosmix-Plexing se puede inducir la recombinación de
las secciones izquierda y derecha del dominio variable del anticuerpo con el uso
de enzimas de restricción de tipo II. La característica de estas enzimas es que
se unen a una secuencia definida, pero cortan en un sitio que se encuentra
alejado a una distancia fija; es decir, en una región que no requiere especificidad de secuencia. Por esta razón, se puede generar una población con secuencias “optimizadas” para un número mayor de residuos aminoacídicos.
La generación de recombinación dentro de una región particular es un concepto importante, por ejemplo, el método de recombinación aleatoria de ADN
según lo aplicó el grupo de Stemmer WPC [7-9], demostró claramente las
ventajas de esta idea. Sin embargo no se puede aplicar a todos los casos pués
sólo funciona con familias o variantes de genes que tengan una gran homología
entre sí. La técnica de Cosmix-Plexing no está limitada por la homología
entre pares de recombinación, y muestra una mayor eficiencia de
recombinación dentro de regiones cortas.
Aunque la principal ventaja de la recombinación inducida por Cosmix-Plexing
se obtiene a través del aumento de la diversidad durante la selección, también
se puede utilizar para la simple generación de bibliotecas de un gran número de
clones (por ejemplo, >109 variantes). Además, facilita la producción de bibliotecas grandes mediante la introducción de casetes específicos en bibliotecas ya
generadas (Figura 7.2). Estos casetes son de particular interés si se conoce un
“motivo central” (por ejemplo, el motivo Pro Pro Xxx Pro de los dominios 3 de
homología con Src (SH3) o 1 de homología con Ena-VASP (EVH1), que tienen
preferencia por los ligandos ricos en prolina).
COSMIX-PLEXING: MODO NOVEDOSO DE GENERAR Y UTILIZAR BIBLIO TECAS
COMBINATORIAS DE PÉPTIDOS PRESENTADOS EN LA SUPERFICIE DE FAGOS
107
Figura 7.1. Esquema del principio de la recombinación inducida por Cosmix-Plexing durante el
tamizaje. Una biblioteca combinatoria de talla media (sección superior) se somete a
un procedimiento de selección por afinidad que conduce al aislamiento de varios
miles de variantes que cumplen, al menos en parte, los requerimientos de la selección. En este caso, seis aminoácidos como promedio pudieran ser “óptimos” (sección intermedia). Las secciones izquierda y derecha del dominio hipervariable se
recombinan de modo que se producen los posibles recombinantes. Una nueva selección conduce al aislamiento de variantes “óptimas” que contienen ocho o nueve
residuos optimizados (sección inferior).
108
CAPÍTULO 7
Figura 7.2. Esquema de la aplicación del Cosmix-Plexing. La sección superior muestra la selección de un ligando primario óptimo (principio ilustrado en la Figura 7.1). El motivo
consenso puede ser insertado más como estrategia evolutiva, para tomar ventaja.
COSMIX-PLEXING: MODO NOVEDOSO DE GENERAR Y UTILIZAR BIBLIO TECAS
COMBINATORIAS DE PÉPTIDOS PRESENTADOS EN LA SUPERFICIE DE FAGOS
109
El casete que contiene el motivo Pro Pro Xxx Pro se utilizó en este trabajo para
aislar y caracterizar ligandos que se unen con afinidad elevada a los dominios
SH3 y EVH1 y se tomará como ejemplo para ilustrar la aplicación de la técnica
de Cosmix-Plexing.
En primer lugar se describirá la forma de construir una biblioteca resaltando las
propiedades del sistema Coxmix Plexing, y a continuación se explicará detalladamente la recombinación durante la selección.
PREPARACIÓN DE BIBLIOTECAS PEPTÍDICAS
EN UN FAGÓMIDO
PREPARACIÓN DEL VECTOR LINEAL DE ADN
El fagómido pROCOS4/7stuffer1 que se utilizó en este trabajo, es un vector de
expresión en el cual las variantes peptídicas pueden ser fusionados al extremo
amino de la proteína pIII. Los fagómidos poseen origen de replicación tanto
plasmídico como de bacteriófago. Sin embargo, con excepción del gen al que
se fusionará la secuencia codificante del péptido o la proteína que se presentará, estos vectores no poseen ninguno de los genes del fago. Los fagómidos se
mantienen como plásmidos hasta que una superinfección con un fago auxiliador (M13KO7) active sus orígenes fágicos de replicación y empaquetamiento.
El fago auxiliador proporciona todas las funciones del bacteriófago necesarias
para la síntesis del ADN circular de simple cadena, y para el ensamblaje de las
partículas fagoides que presentan las proteínas híbridas.
En el sistema pROCOS4/7stuffer1, la síntesis de la proteína fusionada a pIII
está bajo el control del promotor P L del bacteriófago λ. El promotor P L es reprimido por la proteína cI producida en cepas de Escherichia coli que contienen
una copia integrada del genoma del fago λ (lisógenos). Con el empleo de este
promotor se encontró empíricamente que en las partículas producidas después
de la superinfección, la proporción adecuada de pIII híbrida en relación con la
pIII normal se logró fundamentalmente para presentaciones monovalentes; o
sea, una molécula de pIII híbrida por partícula viral. El plásmido pROCOS4/
7stuffer1 tiene un gen de resistencia a ampicillina, que permitió la selección de
las células que contienen los fagómidos. La secuencia stuffer es un fragmento
de ADN de 950 pares de bases (pb) del vector pBR322.
Se realizó una digestión completa con dos enzimas de restricción diferentes de
modo tal que se generaron dos extremos cohesivos diferentes en el fragmento
más grande, correspondiente al vector. Este fragmento no puede
110
CAPÍTULO 7
autoligarse en ausencia de un casete de inserción. El sitio en el que se
insertará el casete oligonucleotídico hipervariable se preparó mediante digestión con las enzimas de restricción KpnI y SacI. La región hipervariable
se insertó luego entre una secuencia señal y el gen M13gpIII en el vector
de presentación, de modo que el péptido se exponga en la superficie de la
partícula viral como una prolongación aminoterminal. La biblioteca
resultante presentó una variante peptídica de 8 aminoácidos en la superficie
del fago.
El segundo paso consistió en introducir el casete específico dentro del péptido
de 8 aminoácidos ya insertado en el vector. Entonces se presentaron las siguientes variantes:
(Xxx)5 Pro Pro Xxx Pro (Xxx) 4
Estos dos pasos de la construcción de biblioteca final se ilustran de forma esquemática en las Figuras 7.3 y 7.4, respectivamente.
Figura 7.3. Secuencias nucleotídicas y peptídicas de los insertos. En la secuencia de ADN se
indican los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción: SacI y KpnI son
responsables de la clonación de los insertos dentro de los vectores. BpmI permite la
inserción de los casetes dentro de la región hipervariable. Se describe el sitio de
corte. Se presentan las secuencias de ADN de los cebadores biotinilados, así como
sus secuencias complementarias con los insertos (n n n n n n , l l l l l l
indican las secuencias complementarias para los cebadores 1 o 2, respectivamente). ZZ representa AM (AA, AC), CT, GG, TS (TC, TG), y Yxx, cualquier
aminoácido diferente de cisteína.
COSMIX-PLEXING: MODO NOVEDOSO DE GENERAR Y UTILIZAR BIBLIO TECAS
COMBINATORIAS DE PÉPTIDOS PRESENTADOS EN LA SUPERFICIE DE FAGOS
111
Figura 7.4. Esquema de la construcción de la biblioteca primaria. Los oligonucleótidos del
inserto son amplificados por RCP, con la utilización de cebadores biotinilados, de
lo cual se obtiene un producto que porta biotina en sus extremidades. El producto
de RCP se corta con SacI y KpnI, y los fragmentos de restricción se remueven
mediante perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Los insertos se ligan
entre sí para producir concatámeros que se resuelven como dímeros por restricción con SacI (sección superior izquierda). El sitio de clonaje del vector se abre
por digestión con SacI y KpnI (sección superior derecha). Los vectores y los dímeros
se ligan entre sí. Una digestión con KnpI deja disponible el sitio KpnI del inserto,
que queda libre para ligarse con la segunda extremidad del vector. El vector con la
fusión a la proteína pIII puede ser electroporado para proporcionar una biblioteca
de alta diversidad (sección inferior). l representa la biotina, unida a los cebadores
y a los productos de RCP.
112
CAPÍTULO 7
La recombinación por Cosmix-Plexing se puede llevar a cabo en esta biblioteca
extendida mediante escisión en el sitio de restricción de tipo II (BpmI), lo que
permitirá la optimización de la región completa (se muestra más adelante).
El vector se linealizó según los métodos convencionales.
PROCEDIMIENTO
1. Cortar el vector en uno de los sitios de restricción (KpnI) mediante digestión
a 37 ºC durante 3 h. Comprobar la digestión en un gel de agarosa 1 %.
2. Purificar el vector según el algoritmo de purificación del juego de reactivos
GFXTM (GFX).
3. Incubar el vector con la segunda enzima (SacI) a 37 ºC durante 3 h. Comprobar la digestión en un gel de agarosa 1 %. Las dos bandas correspondientes
al vector y al fragmento stuffer se distinguen claramente.
4. Extraer el fragmento lineal grande del gel con el juego de reactivos GFX.
5. Determinar la concentración de ADN a partir de su densidad óptica a 260 nm
(DO260 ).
Así queda listo el vector para ligarse con el inserto.
PREPARACIÓN DEL INSERT O DE ADN DE DOBLE CADENA A PARTIR
DE OLIGONUCLEÓTIDOS DEGENERADOS
El codón representativo que se utilizó para generar secuencias mezcladas de
aminoácidos fue NNB, donde N significa A, C, G o T, y B representa C, G o T.
Este esquema permitió reducir la frecuencia de aparición de codones de terminación (que conducirían a clones improductivos), puesto que sólo uno de los
tres codones de terminación (TAG) puede ser codificado, mientras los codones
de los 20 aminoácidos aún están representados.
Se prepararon cuatro juegos de insertos, los cuales difieren sólo en el dinucleótido
correspondiente a los extremos cohesivos que serán generados después del corte con la enzima de restricción de tipo II BpmI (en la posición ZZ, señalada en
negritas en la secuencia de ADN que se muestra en la Figura 7.5). La enzima
BpmI se unió a una secuencia definida dentro de la secuencia invariable adyacente a los insertos, pero corta en un punto situado a una distancia fija del sitio
de unión —en el centro del dominio hipervariable—, de modo que generó un
extremo cohesivo de 2 pb. ZZ significa AM (AA y AC), CT, GG y TS (TC y
TG). Es importante que no se produzcan uniones entre extremos homólogos
cuando se religuen las secuencias cortadas, lo cual se logró mediante el juego
COSMIX-PLEXING: MODO NOVEDOSO DE GENERAR Y UTILIZAR BIBLIO TECAS
COMBINATORIAS DE PÉPTIDOS PRESENTADOS EN LA SUPERFICIE DE FAGOS
113
de pares de bases utilizados en la posición ZZ. Además, cuando se mezclaron
los cuatro insertos, esta secuencia NZZ permitió la representación de todos los
aminoácidos, excepto la cisteína. El sitio de restricción BpmI fue necesario
para la inserción del casete y para la recombinación mediante Cosmix-Plexing,
mientras que los sitios de restricción SacI y KpnI se utilizaron para generar el
inserto original.
Figura 7.5. Secuencias nucleotídicas y peptídicas de los casetes. En la secuencia de ADN se
indican los sitios de reconocimiento y corte de las enzimas de restricción: BseMI y
BpmI permiten la inserción de los casetes dentro de la región hipervariable de la
biblioteca primaria. Se presentan las secuencias de ADN de los cebadores
biotinilados, así como sus secuencias complementarias con los casetes (n n n n
n n,= indican las secuencias complementarias para los cebadores 1 o 3, respectivamente). ZZ representa AM (AA, AC), CT, GG, TS (TC, TG), y Yxx, cualquier
aminoácido diferente de cisteína. B’, N’ and Z’ representan las bases complementarias a B, N y Z, respectivamente.
Aunque la estrategia seleccionada para preparar los oligonucleótidos tiene muchos
pasos, garantizó la pureza de los productos (Figura 7.3). Es importante señalar
que la calidad de los insertos digeridos influyó notablemente en la calidad de la
ligazón con el vector y, por ende, en la eficiencia de la introducción del ADN
ligado en las bacterias mediante electroporación.
114
CAPÍTULO 7
Los oligonucleótidos que van a ser insertados se conviertieron a ADN de doble
cadena y se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (RCP),
a través del uso de cebadores biotinilados (con el propósito de eliminar fácilmente los fragmentos de restricción en una etapa posterior).
PROCEDIMIENTO
1. Preparar la mezcla de RCP de la siguiente forma:
Inserto: 1 µL (10 pmol)
Cebador 1: 2 µL (200 pmol)
Cebador 2: 2 µL (200 pmol)
tampón de RCP (10x): 10 µL
MgCl2 (25 mM): 10 µL
dNTP (2 mM cada uno): 10 µL
Taq ADN polimerasa: 0,4 µL (2 U)
H2 O: completar hasta 100 µL
Utilizar un termociclador con el siguiente programa:
94 ºC: 1 min, 10 ciclos
60 ºC: 1 min, 10 ciclos
72 ºC: 1 min, 10 ciclos
2. Comprobar la calidad, tamaño y grado de pureza, del ADN de doble cadena
en un gel de agarosa al 4,5 %.
3. Purificar el ADN de doble cadena por extracción fenólica y precipitación
con cloroformo (los insertos son muy pequeños para ser purificados en la
columna del sistema de purificación GFX de Amersham Pharmacia biotech).
Después de cada paso de escisión o ligazón, compobar la integridad del ADN
en geles de agarosa al 4,5 % antes de purificarlo por el método de extracción
con fenol/cloroformo.
4. Digerir los insertos con la enzima de restricción KpnI.
5. Purificar los insertos según el método de fenol/cloroformo.
6. Digerir los insertos con la enzima de restricción SacI.
7. Capturar y eliminar el ADN biotinilado mediante el uso de perlas de
poliestireno superparamagnéticas con estreptavidina unida covalentemente
COSMIX-PLEXING: MODO NOVEDOSO DE GENERAR Y UTILIZAR BIBLIO TECAS
COMBINATORIAS DE PÉPTIDOS PRESENTADOS EN LA SUPERFICIE DE FAGOS
115
a su superficie (Dynabeads M-280 Streptavidin de Dynal). Utilizar un
imán (Dynal MPC) para inmovilizar las perlas.
8. Purificar los insertos según el método de fenol/cloroformo.
9. Ligar los insertos entre sí para generar una cadena larga de monómeros
(concatámero). Inactivar la ligasa con calor.
10. Purificar según el método de fenol/cloroformo.
11. Cortar el fragmento de ADN con SacI para obtener un inserto dimérico con
un sitio KpnI en el centro y extremos cohesivos SacI.
12. Purificar el inserto según el método de fenol/cloroformo.
De esta forma el inserto queda listo para la ligazón con el vector que se preparó
en el primer paso (Figura 7.3).
LIGAZÓN DEL VECTOR Y EL INSERT O DE ADN
Para obtener una biblioteca extensa es importante determinar la proporción
óptima de inserto y vector. Esto se realiza mediante una serie de ligazones de
prueba con diferentes proporciones de inserto y vector (por ejemplo, proporciones molares de 2:1, 1:1, 1:2). La proporción que rinde el mayor número de
recombinantes se utiliza para hacer una ligazón a escala preparativa (por ejemplo, 10 µg).
Entre todos los pasos de ligazón y restricción se comprueba la integridad del
ADN en un gel de agarosa al 1 % y se purifica mediante el sistema GFX
(Amersham Pharmacia Biotech, Suecia).
PROCEDIMIENTO
1. Ligar el vector (digerido con SacI y KpnI) y los insertos (digeridos con SacI).
De esta forma, el vector no puede religar debido a que i) sus extremos son
diferentes y ii) los insertos sólo pueden ligarse con un extremo del vector, el
que fue digerido con SacI. Inactivar las ligasas con calor.
2. Digerir el ADN con KpnI.
3. Ligar el vector unido a uno de los extremos del inserto para cerrar la molécula de ADN. Realizar esta ligazón a una concentración baja de ADN para
promover la religazón y desfavorecer la reinserción de los productos pequeños de la digestión. De forma opcional, los fragmentos pequeños pueden ser
eliminados también mediante purificación en gel.
116
CAPÍTULO 7
El híbrido formado de este modo (vector con inserto) es finalmente introducido
por electroporación en la cepa de E. coli WK6lmutS (selección con ampicillina
300 mg/mL). Se seleccionaron clones al azar y se secuenció su ADN para verificar la presencia del inserto y la integridad del banco, muy pocos clones deben
tener cambios en el marco de lectura, la frecuencia de codones de terminación
debe ser muy baja, y, finalmente, se determinó la frecuencia de codones de
cada aminoácido y se comparó con la frecuencia esperada para una biblioteca
aleatoria NNB. Después de confirmar que el banco es íntegro, se indujo el
empaquetamiento del material genético mediante superinfección de estas células con el fago auxiliador M13KO7.
INTRODUCCIÓN DEL ADN LIGADO EN LAS BACTERIAS
MEDIANTE ELECTROPORACIÓN
A través de la electroporación se logró una eficiencia elevada de transformación cuando se somete la mezcla de células y ADN a un breve pero intenso
campo eléctrico de caída exponencial. Por la intensidad del campo eléctrico, la
mezcla no debe contener sales para evitar que se genere una corriente demasiado alta durante la electroporación. Un cultivo de E. coli se hace
electrocompetente con una serie de lavados. En este trabajo se utilizó la cepa
WK6lmutS que permitió una eficiencia de hasta 1010 transformantes/mg con el
plásmido pBR322 nativo (ADN control superenrollado). El rendimiento del
vector ligado fue de más de 107 (hasta 108 ) transformantes/mg de ADN.
PROCEDIMIENTO
PREPARACIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES [10]
1. Inocular 2 L de medio Luria Bertani (LB) con tetraciclina 20 mg/mL (4
recipientes x 500 mL) con 20 mL de un cultivo fresco que creció durante
toda la noche de la cepa WK6lmutS, e incubar a 37 ºC con agitación hasta
alcanzar una densidad óptica a 600 nm (DO600 ) de 0,6.
2. Enfriar el cultivo en hielo durante 10 min. Los pasos siguientes del procedimiento se deben realizar a 4 ºC con pipetas, rotores y tubos preenfriados.
Transferir alícuotas del cultivo a tubos de centrífuga y colectar las células
mediante centrifugación a 4 000 xg dutrante 15 min (rotor Sorvall GS3).
Separar cuidadosamente el sobrenadante por decantación. Se debe eliminar
la mayor cantidad posible de líquido.
3. Resuspender las células suavemente en 2 L de Hepes frío 1 mM pH 7. Repetir el paso de centrifugación. Eliminar el sobrenadante.
COSMIX-PLEXING: MODO NOVEDOSO DE GENERAR Y UTILIZAR BIBLIO TECAS
COMBINATORIAS DE PÉPTIDOS PRESENTADOS EN LA SUPERFICIE DE FAGOS
117
4. Resuspender las células suavemente en 1 L de agua destilada estéril y fría.
Repetir el paso de centrifugación. Eliminar el sobrenadante.
5. Resuspender las células suavemente en 40 mL de glicerol al 10 % estéril y
frío. Colectar las células mediante centrifugación a 4000 xg durante 15 min
(rotor Sorvall SS-34). Eliminar el sobrenadante.
6. Resuspender las células suavemente en 4 mL de glicerol 10 % frío. La
concentración final de células debe ser 2-4 x 1010 /mL.
7. Congelar alícuotas de 80 µL (en tubos eppendorf estériles preenfriados) en
nitrógeno líquido y conservarlas a -70 ºC.
ELECTROPORACIÓN CON EL EQUIPO GENE PULSER DE BIO -RAD (EUA)
8. Utilizar una alícuota de 80 µL en cada electroporación y descongelarla en
hielo. Añadir 0,5 mg de ADN (en menos de 10 µL de ddH 2 O). Incubar en
hielo durante 1 min.
9. Transferir la suspensión a una cubeta de electroporación fría (paso de 0,2
cm), y aplicar un voltaje de 2,5 kV, con una capacitancia de 25 mF y una
resistencia de 200 W. Esta combinación genera un pulso de 12,5 kV.cm-1 y
una duración del pulso de 4,5 a 4,7 ms [6].
10. Añadir inmediatamente 1 mL de medio LB a temperatura ambiente, mezclar y transferir la suspensión a un tubo eppendorf.
11. Incubar a 37 ºC durante 1 h con agitación y vertir la suspensión sobre placas
de medio LB/agar que contengan ampicillina 300 mg/mL y tetraciclina 20
mg/mL. Incubar las placas a 37 ºC durante toda la noche.
12. Para determinar la complejidad de la biblioteca —por ejemplo, el número
total de clones generados de forma independiente—, realizar diluciones
seriadas del ADN electroporado y vertirlas sobre placas preparadas según
el paso anterior. Como controles positivo y negativo, se utilizaron células
electroporadas con el vector íntegro y sin ADN, respectivamente.
PREPARACIÓN E INSERCIÓN DEL CASETE ESPECÍFICO
El próximo paso es insertar un casete específico dentro de la secuencia
hipervariable creada en la biblioteca primaria, de modo que se genere una biblioteca secundaria específica. En el diseño de este casete se seleccionaron las
posiciones de aminoácidos invariables, con el propósito de aumentar la probabilidad de interacción entre la biblioteca secundaria y el blanco en particular.
118
CAPÍTULO 7
Figura 7.6. Esquema de la inserción del casete específico. En la sección superior, el casete se
prepara por RCP con cebadores biotinilados, y se digiere en una extremidad con
BpmI. La biblioteca primaria se abre con BpmI y BseRI, y los dos fragmentos
obtenidos (S y L) se purifican por extracción en gel y se mantienen separados.
En la sección inferior, el casete semidigerido se liga con S (S-casete), y se digiere con BseMI. Los fragmentos de restricción se remueven mediante perlas
recubiertas con estreptavidina. La ligación entre L y S-casete produce
concatámeros, que se resuelven finalmente como monómeros por corte con BglI.
COSMIX-PLEXING: MODO NOVEDOSO DE GENERAR Y UTILIZAR BIBLIO TECAS
COMBINATORIAS DE PÉPTIDOS PRESENTADOS EN LA SUPERFICIE DE FAGOS
119
El codón representativo de los codones hipervariables es el mismo que se utilizó
para los insertos iniciales; es decir, NNB (B representa C, G o T).
Se prepararon 16 juegos de casetes que difieren sólo en los dos dinucleótidos
ZZ presentes en los extremos cohesivos generados por el corte de dos enzimas
de restricción de tipo II (BseMI y BpmI) (Figura 7.6). ZZ representa AM (AA
y AC), CT, GG, y TS (TC y TG). Es esencial que los dinucleótidos ZZ presentes
en ambos extremos cohesivos de los casetes difieran entre sí —por ejemplo,
cualquier dinucleótido ZZ presente en el extremo derecho del casete (AM, CT,
GG o TS) tiene la misma probabilidad de presentarse en el lado izquierdo).
Estos extremos distintos promovieron la formación de concatámeros durante el
clonaje del casete en la biblioteca primaria, puesto que un casete no puede ser
clonado en el mismo vector. La formación de concatámeros aumenta la diversidad del banco considerablemente.
Los juegos utilizados en la posición ZZ impidieron la unión entre extremos
homólogos durante la ligazón de las secuencias cortadas con la biblioteca primaria. Además, cuando se mezclaron los 16 casetes, este juego de dinucleótidos
permitió la representación de todos los aminoácidos excepto la cisteína, y redujo la frecuencia de aparición de codones de terminación.
Las enzimas BseMI y BpmI se utilizaron para clonar los casetes en la biblioteca
primaria, lo que los hizo compatibles con los extremos cohesivos (juego de 6)
generados por el corte del inserto hipervariable con BpmI en la biblioteca primaria. En la Figura 7.4 se muestra el algoritmo optimizado para clonar el casete
dentro del inserto de la biblioteca primaria.
Entre los pasos de restricción y ligazón se debe comprobar la integridad del
ADN en geles de agarosa, y luego purificarlo. Durante la preparación del casete
se utilizaron geles de agarosa al 4,5 % y su purificación se realizó según el
método de extracción con fenol/cloroformo. Durante la preparación del vector
y su ligazón con el casete se empleron geles de agarosa al 1 % y el sistema de
purificación GFX de Amersham Pharmacia Biotech (Suecia).
La ligazón a baja concentración genera la religazón del vector que ahora contiene la
región hipervariable complementada por el casete específico, que puede ser electroporado.
________
, n n n n n n, _ representan el ADN del vector, el inserto, y el casete,
respectivamente. representa la biotina, unida a los cebadores. Bp y Bs representan
los sitios de restricción BpmI y BseRI, respectivamente. S y L representan los
fragmentos pequeño y grande del vector, respectivamente. S-casete representa el
producto de ligación entre el casete y el fragmento pequeño del vector. representa el
sitio de restricción BglI.
120
CAPÍTULO 7
PROCEDIMIENTO
PREPARACIÓN DEL CASETE ESPECÍFICO DE DOBLE
CADENA A PARTIR
DE OLIGONUCLEÓTIDOS DEGENERADOS
1. Convertir los oligonucleótidos a doble cadena y amplificar mediante RCP
con el empleo de cebadores biotinilados (para eliminar los fragmentos de
restricción fácilmente mediante el uso de perlas recubiertas con
estreptavidina).
Preparar la mezcla de RCP de la forma siguiente:
Inserto: 2 µL (20 pmol)
Cebador 1: 2 µL (200 pmol)
Cebador 2: 2 µL (200 pmol)
tampón RCP (10x): 10 µL
MgCl2 (25 mM): 10 µL
dNTP (2 mM cada uno): 10 µL
Taq ADN polimerasa: 0,4 µL (2U)
H2 O: completar hasta 100 µL
Utilizar un termociclador con el siguiente programa:
94 ºC: 1 min, 10 ciclos
60 ºC: 1 min, 10 ciclos
72 ºC: 1 min, 10 ciclos
2. Comprobar el grado de pureza de los casetes.
3. Purificar el ADN.
4. Digerir los casetes con la enzima BpmI.
Estos casetes están listos para la ligazón con el vector (Figura 7.4).
PREPARACIÓN DEL VECTOR LINEAL DE LA BIBLIOTECA PRIMARIA
Utilizar el vector que contiene el inserto (la biblioteca primaria) como vector de
clonación para crear una biblioteca más extensa.
1. Digerir el vector con BpmI para cortar la región hipervariable en el centro.
2. Digerir con BseRI para dividir el vector en dos partes, un fragmento pequeño
(P) y uno grande (G).
COSMIX-PLEXING: MODO NOVEDOSO DE GENERAR Y UTILIZAR BIBLIO TECAS
COMBINATORIAS DE PÉPTIDOS PRESENTADOS EN LA SUPERFICIE DE FAGOS
121
3. Separar ambos fragmentos mediante electroforesis en agarosa al 1 % y
purifícarlos mediante el sistema de purificación GFX. Mantener los fragmentos separados.
I NSERCIÓN
DEL CASETE ESPECÍFICO EN L A BIBLIOTECA PRIMARIA
1. Ligar los casetes digeridos BpmI con el fragmento pequeño (P) del vector
(producto P-casete) y luego digerir con BseMI. Eliminar los productos no
deseados de la ligación y los extremos pequeños biotinilados del casete mediante el uso de las perlas recubiertas con estreptavidina.
2. Ligar el fragmento grande (G) y el producto P-casete de la reacción anterior.
Utilizar una proporción equimolar y una alta concentración de ADN (> 200
mg/mL). Esta reacción restituye el vector completo y conduce a la formación de concatámeros. Estos contienen unidades monoméricas orientadas en
la misma dirección, debido a que el sitio de restricción BseRI produce extremos cohesivos no compatibles con aquellos producidos en los sitios de corte
de BpmI o BsM. El juego de dinucleótidos ZZ utilizado no permitió la unión
de los fragmentos por sus extremos homólogos. Como los dos extremos de
los casetes no presentan dinucleótidos ZZ idénticos en la mayoría de los
casos, y como éstos no se pueden clonar en el mismo vector, la mayoría de
los productos de la ligazón surgireron a partir de fragmentos provenientes de
clones diferentes de la biblioteca inicial. De esta forma, la ligazón aseguró la
recombinación entre los vectores, lo que condujo a la generación de una
región hipervariable más diversa.
3. Digerir con BglI y ligar a una concentración baja de ADN (<40 mg/mL) para
separar las moléculas individuales de fagómido que conforman los
concatámeros.
4. Compruebar la formación de monómeros mediante secuenciación de clones
seleccionados al azar. El análisis de las secuencias mostró que la biblioteca
más extensa expuso una región hipervariable de 13 aminoácidos, de los cuales 3 son prolinas fijas (inserto + casete), como se muestra:
Secuencia de ADN: (NNB)4 NZZ CCC CCA NNB CCT NZZ (NNB)3
Secuencia peptídica: (Xxx) 4 Xxx Pro Pro Xxx Pro Xxx (Xxx) 3
1. Recombinar los bloques hipervariables 5’ y 3’ siguiendo estos pasos:
a) digerir la biblioteca final con BpmI,
b) ligar para formar concatámeros,
c) separar las unidades monoméricas mediante digestión con BglI,
d) religar a baja concentración de ADN para cerrar la molécula (Figura 7.7).
A este nuevo arreglo se le llama Cosmix-Plexing.
122
CAPÍTULO 7
Figura 7.7. Esquema de la recombinación por Cosmix-Plexing. El material inicial es una preparación de fagemidos obtenida a partir de las colonias resuspendidas e infectadas con
el fago eluído después de la primera ronda de selección. Los vectores se abren con
BpmI, y se religan a alta concentración de ADN para formar concatámeros. Los
concatámeros se resuelven a vectores simples por restricción con BglI, y se ligan a
COSMIX-PLEXING: MODO NOVEDOSO DE GENERAR Y UTILIZAR BIBLIO TECAS
COMBINATORIAS DE PÉPTIDOS PRESENTADOS EN LA SUPERFICIE DE FAGOS
123
Cuando se desarrolla el procedimiento Cosmix-Plexing la enzima de tipo II
divide el dominio hipervariable en dos segmentos: uno representado por 5
residuos aleatorios y otro compuesto por una región hipervariable de 8
aminoácidos de los ciuales 3 son prolinas invariables.
Los péptidos codificados por la secuencia nucleotídica dividida por la enzima
de tipo II, tienen la siguiente estructura:
Gly Trp Arg (Xxx)5 + Pro Pro Xxx Pro (Xxx)4 Asp Pro Gly
Los residuos en negritas corresponden al dominio hipervariable, mientras que
los otros aminoácidos pertenecen a las secuencias flanqueantes fijas.
2. Introducir la construcción en E. coli por electroporación e inducir el
empaquetamiento de la biblioteca secundaria según se describió anteriormente. El ADN preparado de esta forma produjo frecuencias de transformación muy elevadas (alrededor de 108 transformantes/mg de ADN).
PREPARACIÓN DEL FAGO AUXILIADOR M13KO7
Un vector fagómido contiene un origen de replicación de plasmidio y otro de
bacteriófago, pero no posee genes de este último además de la fusión génica
con la proteína o péptido que se desea presentar. La producción de partículas
que portan el fagómido, se logró mediante la superinfección de la cepa transformada con el bacteriófago auxiliador derivado del M13. Este fago auxiliador
proporcionó las funciones necesarias para la síntesis del ADN circular de simple cadena y de la cápsida del bacteriófago.
PROCEDIMIENTO
3. Utilizar una pipeta pasteur estéril desechable para tomar una placa aislada de
M13KO7 de un huésped de la cepa WK6 de E. coli que creció durante toda
la noche en medio LB/agar. Inocular 20 mL of medio LB (2x) con kanamicina
50 mg/mL e incubar todo el día a 37 ºC con agitación.
4. Inocular 1 L de medio LB (2x) complementado con kanamicina 50 mg/mL
con 10 mL del precultivo, e incubar con agitación durante toda la noche a 37 ºC.
5. Centrifugar el cultivo a 11 000 xg y 4 ºC (rotor Sorvall GS3). Transferir el
sobrenadante a tubos limpios y centrifugar nuevamente.
baja concentración de ADN, como monómeros cerrados. Los vectores recombinados
pueden ser electroporados, empaquetados y utilizados para una nueva selección
con el objetivo de aislar ligandos optimizados contra un blanco particular.
representa el sitio de restricción BglI.
124
CAPÍTULO 7
6. Transferir el sobrenadante a tubos de centrífuga limpios y añadir 0,15 volúmenes de disolución polietilenglicol 6 000 (PEG)/NaCl (16,7 %/3,3 M).
Mezclar e incubar en hielo durante 2 h como mínimo.
7. Centrifugar a 13000 xg y 4 ºC durante 90 min (rotor Sorvall GS3). Eliminar
el sobrenadante por decantación y centrifugar nuevamente el sedimento
durante algunos minutos. Eliminar el sobrenadante que queda con una pipeta
y resuspender el fago auxiliador en 10 mL de disolución salina tamponada
con fosfato (PBS).
8. Centrifugar a 17 000 xg y 4 ºC durante 10 min (rotor Sorvall SS-34). Recuperar el sobrenadante y añadir NaN3 a una concentración final de 0,02 %.
Conservar a 4 ºC.
9. Proceder a la titulación de la preparación de fago M13KO7. Inocular 20 mL
de medio LB complementado con tetraciclina 20 mg/mL con 200 mL de un
cultivo de WK6lmutS, e incubar a 37 ºC con agitación hasta alcanzar una
DO600 de 0,5.
10. Durante este período, disponer de diluciones seriadas de la preparación de
M13KO7, 10 µL de fago en un volumen total de 100 µL de ddH 2 O.
11. Añadir 100 µL de las células del paso 9, mezclar e incubar a 37 ºC por 30 min.
12. Vertir alícuotas de 20 µL de las diluciones seriadas en medio LB/agar con
ampicillina 300 mg/mL y tetraciclina 20 mg/mL, LB/agar con kanamicina
50 mg/mL y tetraciclina 20 mg/mL, y LB/agar con tetraciclina 20 mg/mL
como control. Incubar las placas a 37 ºC durante toda la noche.
13. Contar las colonias en cada punto, determinar el título y expresarlo en ufc
(unidades formadoras de colonias)/mL. El título debe estar entre de 1012 y
1013 ufc/mL.
AMPLIFICACIÓN Y EMPAQUETAMIENTO
DE LAS BIBLIOTECAS DE FAGÓMIDOS
1. Resuspender las colonias de las placas donde se amplificaron durante toda la
noche las células electroporadas. Cubra las placas de LB/agar con 15 mL de
medio LB complementado con ampicillina 300 mg/mL y tetraciclina 20 mg/
mL. Balancear las placas durante 20 min a temperatura ambiente y lavar las
células, para ello, tomar y expeler el medio varias veces con una pipeta de 10
mL (el diámetro del orificio de la punta es suficientemente grande para no
dañar las células).
2. Inocular 1 L de medio LB complementado con ampicillina 300 mg/mL y
tetraciclina 20 mg/mL, con 2,5 mL de la resuspensión. Incubar a 37 ºC con
agitación hasta alcanzar una DO600 de 0,5.
COSMIX-PLEXING: MODO NOVEDOSO DE GENERAR Y UTILIZAR BIBLIO TECAS
COMBINATORIAS DE PÉPTIDOS PRESENTADOS EN LA SUPERFICIE DE FAGOS
125
3. Añadir 1012 ufc de fago auxiliador M13KO7 al cultivo. Incubar a 37 ºC durante
1 h con agitación, y después a 30 ºC durante toda la noche con agitación.
4. Colectar el cultivo celular mediante centrifugación a 13000 xg y 4 ºC durante 10 min (rotor Sorvall GS3). Transerir el sobrenadante a un tubo limpio y
centrifugar nuevamente.
5. Transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y añadir 0,15 volúmenes de disolución PEG/NaCl (16,7 %/3,3 M). Mezclar e incubar en hielo
durante 2 h como mínimo.
6. Centrifugar a 13000 xg y 4 ºC durante 90 min (rotor Sorvall GS3) para colectar las partículas de fago. Eliminar el sobrenadante por decantación y
centrifugar el precipitado durante algunos minutos. Eliminar el sobrenadante
que queda con una pipeta.
7. Resuspender el precipitado en 10 mL de PBS y centrifugar durante otros 10
min a 17000 xg (rotor Sorvall SS-34).
8. Recuperar el sobrenadante, añadir NaN3 a una concentración final de 0,02 %
y conservar las partículas de fago a 4 °C.
APLICACIÓN DEL SISTEMA C OSMIX -PLEXING
Aplicación del sistema Cosmix-Plexing a las bibliotecas. La metodología del
sistema Cosmix-Plexing se puede aplicar con el propósito de insertar un casete
específico adicional en el dominio hipervariable de una biblioteca primaria, así
como para amplificar el número de variantes de una biblioteca en particular.
Sin embargo, en la mayoría de los casos este sistema se utiliza para perfeccionarr
la capacidad de unión de los ligandos identificados a un blanco de interés. Como
se explicó anteriormente, el procedimiento Cosmix-Plexing permite que haya
recombinación dentro del dominio hipervariable del banco, inducida por asociación de las secciones izquerda y derecha de la región hipervariable. Esto se
logra mediante el empleo de enzimas de restricción tipo II.
Al inicio del procedimiento se hizo una selección “estándar” contra un blanco
de interés, y después de varios ciclos de selección por afinidad se identificaron
algunas variantes. Estas variantes mostraron propiedades adecuadas para
interaccionar con la molécula blanco. Generalmente, se enriquecieron unos pocos
clones entre los que se presentaron algunas variantes únicas muy relacionadas
con el (los) clon(es) dominante(s) enriquecido(s), de modo que se pudo obtener
una secuencia consenso. Esta secuencia representó la estructura esencial que se
requirió para la unión al blanco. Durante el primer ciclo de selección, los
futuros clones dominantes se encontraban en cantidades pequeñas, al igual
126
CAPÍTULO 7
que muchos otros clones que mostraban poca afinidad por el blanco. En la
medida en que el (los) clon(es) dominante(s)fue (fueron) enriquecido(s) durante los ciclos subsiguientes, mayor es su competencia con los clones de baja
afinidad, los cuales fueron eliminados durante los pasos de lavado. El sistema
Cosmix-Plexing toma ventaja de este hecho.
La población preseleccionada que se recupera después del primer ciclo de selección es el material de trabajo que se sometió a la recombinación. En esta etapa, la
mayoría de los clones presentes mostraron afinidad por el blanco aunque ésta fue
baja. Las regiones hipervariables de los clones de esta población preseleccionada
pueden recombinar entre sí para producir nuevas variantes, de manera que la
unión de dominios inicialmente débiles puede generar clones con nuevas características que quizás correspondan a la estructura “perfecta” de unión al blanco.
Los ciclos de selección subsiguientes con esta biblioteca conducen al aislamiento
de nuevos clones con una afinidad supuestamente óptima por el blanco.
La metodología de Cosmix-Plexing se aplicó a una preparación de fago que se
obtuvo a partir de una alícuota de células resuspendidas y conservadas en glicerol, que fueron infectadas con el fago eluído, después del primer (y finalmente
el segundo) ciclo de selección. La estrategia de este procedimiento se describe
en la Figura 7.7.
Entre los pasos de ligazón y restricción se comprobó la integridad del ADN en
un gel de agarosa al 1 % y se purificó mediante el sistema GFX de Amersham
Pharmacia Biotech (Suecia).
PROCEDIMIENTO
1. Digerir con BpmI el ADN de la población preseleccionada que fue recuperado como plásmido de la preparación. Esta enzima corta la región
hipervarianble en el centro.
2. Ligar los vectores abiertos a una concentración elevada de ADN (>200 µg/
mL) para promover la formación de concatámeros. Esta ligación asegura la
recombinación entre los vectores, lo que incrementa la diversidad de la región hipervariable. Recordar que el dinucleótido ZZ utilizado en la posición
donde se introdujo el corte en el dominio variable, no permite la unión entre
los extremos homólogos de los fragmentos.
3. Separar las unidades monoméricas que conforman los concatámeros mediante digestión con BglI. Ligar a baja concentración de ADN (<40 µg/mL).
4. Comprobar la formación de los monómeros mediante la secuenciación de
clones seleccionados al azar.
COSMIX-PLEXING: MODO NOVEDOSO DE GENERAR Y UTILIZAR BIBLIO TECAS
COMBINATORIAS DE PÉPTIDOS PRESENTADOS EN LA SUPERFICIE DE FAGOS
127
La biblioteca perfeccionada está lista para su introducción en E. coli mediante
electroporación y para su empaquetamiento. El ADN preparado de esta forma
permite obtener frecuencias de transformación extremadamente altas (alrededor de 108 transformantes/µg ADN) .
RESULTADOS
La selección de clones de la biblioteca CPLPPXP contra diferentes blancos, de
las familias de dominios SH3 y EVH1, conduce al diseño de largas secuencias
de consenso, y al aislamiento de ligandos de gran afinidad por estos blancos
específicos. Como validación de la tecnología se abordará un solo ejemplo,
acerca del dominio EVH1 de Vesl.
La proteína Vesl (también llamada Homer) se expresa constitutivamente en el
cerebro y se encuentra a niveles elevados en las sinapsis excitatorias, se une
selectivamente al extremo carboxilo de los receptores metabotrópicos del grupo 1 (mGluR1a y mGluR5) [11]. La región de Vesl que interacciona con
mGluR1a/5 se considera un dominio EVH1 por homología con los dominios
de una familia de proteínas que incluye a Drosophilia Enabled, VASP de mamíferos y la proteína del síndrome de Wiscott-Aldridge (WASP). El dominio
EVH1 de Vesl se une a una secuencia interna rica en prolina que se encuentra aproximadamente a 50 residuos del extremo carboxilo de mGluR1a y mGluR5 [12].
Un motivo de poliprolina, Glu/Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu/Asp, presente en
la proteína ActA del patógeno intracelular Listeria monocytogenes, sirve como
ligando de la familia de proteínas VASP, Mena, y Evl, que comparten un dominio
EVH1 altamente conservado [13]. Otros ligandos naturales de los dominios EVH1
(vinculin y zyxin) también se unen mediante una secuencia similar, con respecto
a las cargas acídicas presentes a ambos lados del núcleo conservado de prolina, y
con respecto a la fenilalanina situada justo antes del motivo de prolina.
Trabajos recientes realizados por Tu y colaboradores [14] demostraron que las
proteínas Shank, moléculas postsinápticas que forman parte del complejo PSD95 asociado al receptor NMDA, se unen a Vesl a través de la secuencia Leu Val
Pro Pro Pro Glu Glu Phe Ala Asn. En este caso, el núcleo de prolina ya no se
encuentra rodeado por residuos ácidos, puesto que éstos sólo se encuentran en
el extremo carboxilo del motivo de prolina. Por otro lado, la Phe ya no se unirá
al núcleo de prolina y, además, está situada hacia la región carboxílica de las
prolinas, contrario a como sucede con las secuencias de los péptidos naturales
que se unen a VASP, Mena y Evl. Estos resultados demostraron que los dominios
EVH1 de VASP, Mena y Evl no se unieron a los mismos ligandos que el dominio EVH1 de Vesl, aunque compartieron algunas características generales. Es
128
CAPÍTULO 7
preciso enfatizar que los resultados expuestos [13, 14] se obtuvieron mediante
el empleo del sistema de dos híbridos de levadura. El trabajo de laboratorio
comenzó con selecciones “normales” por afinidad con Vesl. Después de la tercera ronda, en la cual se obtuvo un enriquecimiento de 200 veces, se secuenciaron
y analizaron clones seleccionados al azar (Tabla 7.1).
Tabla 7.1. Secuencias de 25 clones seleccionados al azar, después de la tercera ronda de selección de la biblioteca CPLPPXP contra el dominio
EVH1 de Vesl (fue imposible leer un clon). Los residuos subrayados están fijos dentro de la biblioteca CPLPPXP. Φ y Ψ representan
residuos aromáticos e hidrofóbicos, respectivamente.
S ecuencias contra el dominio EVH1 de Vesl (tercera ronda de selección)
Secuencia concenso
Xxx (Arg) Φ (Ψ/Φ ) Xxx Pro Pro (Ψ/Φ ) Pro
W/Y Xxx D/F Xxx
El análisis de estos clones mostró que es de gran importancia la presencia de un
residuo de tirosina o triptófano después del motivo rico en prolina, en la posición 10, y parece indicar que hay preferencia por arginina en la posición 2 y
ácido aspártico en la posición 12. La posición 8 entre las prolinas es muy ventajosa para los residuos hidrofóbicos, al igual que las posiciones 3 y 4.
COSMIX-PLEXING: MODO NOVEDOSO DE GENERAR Y UTILIZAR BIBLIO TECAS
COMBINATORIAS DE PÉPTIDOS PRESENTADOS EN LA SUPERFICIE DE FAGOS
129
La población recuperada después de la primera ronda de selección “normal”
fue sometida a Cosmix-Plexing, y tamizada nuevamente contra Vesl. Como la
experiencia de trabajo ha demostrado que después de Cosmix-Plexing los clones
enriquecidos se obtienen de forma eficiente desde la primera ronda de selección, se secuenciaron clones tomados al azar después de esa primera ronda. Las
secuencias se muestran en la Tabla 7.2.
Tabla 7.2. Secuencias de 10 clones seleccionados al azar después de la primera ronda
de selección. La población CPLPPXP recuperada después de la primera
ronda de selección “normal” contra el dominio EVH1 de Vesl, fue sometida
a cosmix-plexing y a tamizaje. Los residuos subrayados se mantienen en
posiciones fijas en la biblioteca CPLPPXP. Φ y Ψ representan residuos
aromáticos e hidrofóbicos, respectivamente.
Secuencias contra el dominio EVH1 de Vesl después del cosmix plexing
(primera ronda)
Ser Arg
Ψ ϕ
Secuencia consenso
(α) Pro Pro F/P Pro W/Y Xxx
Ψ Ψ
En relación con la proteína Vesl, el primer elemento que se observó después del
Cosmix-Plexing es la confirmación del resultado obtenido después de la selección “normal”: el clon dominante es el mismo en ambos casos.
Sin embargo, el enfoque del Cosmix-Plexing permitió obtener una secuencia
consenso más larga (sólo una de las 13 posiciones está aún indeterminada).
Además, se encontraron menos ambigüedades dentro de la secuencia consenso. En la posición 10, después del motivo central de prolinas, se pudo
confirmar la presencia de un residuo de tirosina o triptófano, al igual que la
Arg2. La posición 8 entre las prolinas pareció mostrar preferencia por
fenilalanina o prolina, y no por cualquier residuo hidrofóbico. La cuarta posición estuvo determinada claramente por una tirosina, o, en última instancia,
una fenilalanina (en todo caso un residuo aromático), lo cual no fue obvio
después de la selección “normal”.
130
CAPÍTULO 7
Por otro lado, el procedimiento de Cosmix-Plexing ofreció más información
acerca de los dos extremos de la secuencia consenso. De hecho, en la primera
posición pareció ser importante la serina, y en las dos últimas (12 y 13), los
residuos hidrofóbicos.
Los clones caracterizados después de la selección (Tablas 7.1 y 7.2), se prepararon como fagos individuales y se evaluaron de esa forma mediante ELISA
para determinar su afinidad por la proteína Vesl. Los resultados de este ELISA
confirmaron la preferencia del blanco por el clon dominante, así como la capacidad de los otros clones seleccionados para unirse a la proteína Vesl. El análisis mediante BIAcore no se ha realizado aún.
Estos resultados, obtenidos a partir de una biblioteca de péptidos presentados
por fagos, pudieran compararse, en cierta medida, con los obtenidos por otros
grupos con el sistema de dos híbridos de levadura [13, 14]. Los resultados
señalan fundamentalmente en el papel crucial que desempeñó la presencia de
un residuo aromático inmediatamente después del motivo de prolina, el cual se
encuentra fijo en esta biblioteca. Sin embargo, Trp y Tyr parecen ser más ventajosos que Phe. Además, también hay residuos acídicos a ambos lados de las
prolinas, aunque no se determinó claramente una posición en particular. En
este sentido, la secuencia consenso parece la imagen especular de las secuencias de los ligandos naturales de VASP, Mena y Evl.
Sin embargo, también se pudiera considerar que la secuencia consenso mostró
semejanzas con la secuencia Shank que se une a Vesl, dado que en ambos casos
se encontró el residuo aromático hacia el mismo lado del motivo central de prolina
y separado de éste (o de una parte de éste, en el caso de la biblioteca CPLPPXP)
por dos residuos. También existió una posición hidrofóbica similar hacia el extremo amino del motivo de prolinas, lo que hizo homólogas a la secuencia Shank y
a la secuencia consenso presentada por el fago, según se muestra en la secuencia
Leu/Ile Xxx Xxx Pro Pro Xxx Xxx Arom. No se debe enfatizar que las
interacciones de los péptidos ricos en prolina con los dominios EVH1 se producen a través de la formación de una hélice levógira de poliprolina de tipo II (PPII).
Esta hélice PPII contiene tres residuos por vuelta, con una sección transversal
triangular. Una cara (dos residuos de cada vuelta cuyas cadenas laterales están
hacia el interior) hace contacto con el piso del surco de unión del dominio EVH1,
mientras que los terceros residuos de cada vuelta forman una columna que no
interacciona con el dominio, pero que es esencial para la estabilidad de la hélice
[15]. Si se considera la cantidad de residuos que pueden ser importantes en la
unión, y el espacio entre ellos, la regularidad de la secuencia anterior podría
sugerir la forma de esta hélice: Leu/Ile 1 Xxx2 Xxx3 Pro1 Pro2 Xxx3 Xxx1 Arom2 .
Los residuos 1 y 2 se localizaron en las dos columnas que hacen contacto con
Vesl, mientras que los residuos 3 estabilizaron la estructura.
COSMIX-PLEXING: MODO NOVEDOSO DE GENERAR Y UTILIZAR BIBLIO TECAS
COMBINATORIAS DE PÉPTIDOS PRESENTADOS EN LA SUPERFICIE DE FAGOS
131
CONCLUSIONES
Se alcanzó éxito en la construcción de un banco de alta calidad si se tienen en
cuenta varios factores como son: su diversidad (>108 recombinantes), la frecuencia de aminoácidos encontrados en cada posición, muy similar a la frecuencia esperada para una biblioteca aleatoria NNB, la baja frecuencia de clones
no productivos, muy pocos codones de parada o corrimientos del marco de
lectura, y la ausencia de vectores parentales religados, es decir , que no contendrían ningún inserto.
Esta biblioteca especializada obtenida por la metodología de Cosmix-Plexing
corroboró que es un procedimiento de gran interés. Se logró aislar de forma
eficiente ligandos de gran afinidad para varias moléculas blanco de las familias
SH3 y EVH1, mediante el empleo de la biblioteca inicial rica en prolina. Se
obtuvieron fácilmente secuencias consenso largas. Además, los resultados de
la selección de clones de la biblioteca rica en prolina, recombinada mediante
Cosmix-Plexing, permitió extender las secuencias consenso y reducir sus ambigüedades potenciales.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a Lawrence A. Quilliam y Brian K. Kay, quienes nos proporcionaron los dominios GST-SH3; al Prof. Wehland y al Dr. Uwe D. Carl, por
facilitarnos las proteínas GST-EVH1. Gracias también a Peter Röttgen for las
útiles discusiones y por alentarnos en el trabajo.
REFERENCIAS
1. Smith GP. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens
on the virion surface. Science 1985;228:1315–7.
2. Collins J. Phage display. In: Moos WH, et al., editors. Ann Reports in Combinatorial Chemistry
& Molecular Diversity. Vol. 1, ESCOM. Leiden; 1997. p.210–50.
3. Kay BK, Kurakin AV, Hyde-DeRuyscher R. From peptides to drugs via phage display. DDT
1998;3:370–8.
4. Holliger P, Hoogenboom H. Antibodies come back from the brink. Nat Biotechnol
1998;16:1015–6.
5. Collins J, Röttgen P. Evolutive phage-display –a method as basis for a company. GBF. Scientific
Annual Report 1997;19–28.
132
CAPÍTULO 7
6. Collins J, Röttgen P, inventors. Cosmix-Plexing patent EP 9800533 (pending) based on EP
97101539.1, (priority 6.02.1997).
7. Stemmer WPC. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro
recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:10747–51.
8. Stemmer WPC. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature 1994;370:389–
91.
9. Patten PA, Howard RJ, Stemmer WPC. Applications of DNA shuffling to pharmaceuticals
and vaccines. Curr Opin Biotechnol 1997;8:724–33.
10. Dower WJ, Miller JF, Ragsdale CW. High efficiency transformation of E. coli by high
voltage electroporation. Nucleic Acids Res 1988;16:6127–45.
11. Brackeman PR, Lanahan AA, O’Brien R, Roche K, Barnes CA, Huganir RL, et al. Homer:
a protein that selectively binds metabotropic glutamate receptors. Nature 1997;386:284–8.
12. Tu JC, Xiao B, Yuan J, Lanahan AA, Leoffert K, Li M, et al. Homer binds a novel prolinerich motif and links group 1 metatropic glutamate receptors with IP3 receptors. Neuron
1998;21:717–26.
13. Niebuhr K, Ebel F, Frank R, Reinhard R, Domann E, Carl UD, et al. A novel proline-rich
motif present in ActA of Listeria monocytogenes and cytoskeletal proteins is the ligand for
the EVH1 domain, a protein module present in the Ena/VASP family. EMBO J
1997;16:5433–44.
14. Tu JC, Xiao B, Naisbitt S, Yuan JP, Petralia RS, Brakeman P, et al. Coupling of mGluR/
homer and PSD-95 complexes by the shank family of postsynaptic density proteins. Neuron
1999;23:583–92.
15. Adzhubei AA, Sternberg MJE. Left-handed polyproline II helices commonly cccur on globular proteins. J Mol Biol 1993;229:472–93.