¿ytú de quién eres?:uso de microsatélites para el análisis de

¿Y TÚ DE QUIÉN ERES?: USO DE
ANDREA GARCÍA MARTÍNEZ
MICROSATÉLITES PARA EL ANÁLISIS DE
PARENTESCO EN SOLEA SENEGALENSIS
Tesis de Licenciatura , Julio 2014
ÍNDICE
I. Introducción
3
1.1. Cultivo Integral de Solea senegalensis
3
1.2. Situación actual de Solea senegalensis en el mercado
5
1.3. Reproducción de Solea senegalensis
6
1.4. Problemática del cultivo
7
1.5. Herramientas moleculares
9
1.5.1. Aplicaciones de los microsatélites
10
1.5.1.1. Aplicaciones en mejora genética
10
1.5.1.2. Estudios de biodiversidad
10
1.5.1.3. Filogenia
11
1.5.2. Ventajas y desventajas
12
1.5.2.1. Ventajas
12
1.5.2.2. Desventajas
12
1.5.3. ¿Qué aportan los microsatélites?
13
II. Material y métodos
15
2.1. Material biológico
15
2.2. Extracción de ADN
16
2.3. Amplificación por PCR de los loci seleccionados
18
2.4. Genotipado de las muestras
20
2.5. Análisis de datos de genotipado
22
III. Resultados y discusión
24
3.1. Amplificación y genotipado
24
3.2. Estimas de la diversidad genética
24
3.3. Análisis de parentesco
27
3.3.1. Análisis de parentesco con el programa Vitassign
27
3.3.2. Análisis de parentesco con el programa Cervus
30
3.4. Diseño de la herramienta de asignación
34
3.5. Entonces, ¿Quiénes son los padres?
35
IV. Conclusiones
36
V. Bibliografía
37
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Distribución geográfica de Solea senegalensis
3
Figura 2. ADN total de Solea senegalensis
18
Figura 3. PCR del microsatélite Gata 38
20
Figura 4. GeneScan 500 Liz Standard
21
Figura 5. Genotipado de Sol 9A, Sol 13D, Gata 38 y CA13
22
Figura 6. Asignaciones de parentesco con el programa Cervus (I)
32
Figura 7. Asignaciones de parentesco con el programa Cervus (II)
33
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Origen y sexo de los reproductores
16
Tabla 2. Secuencia y condiciones de amplificación de los microsatélites 19
Tabla 3. Estimas de diversidad genética con Cervus
25
Tabla 4. Resultados de análisis de parentesco con Vitassign (I)
28
Tabla 5. Resultados de análisis de parentesco con Vitassign (II)
29
Tabla 6. Porcentajes de exclusión con Cervus
31
1
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo no podía haberse realizado sin la ayuda de mi directora de Tesis de
Licenciatura, Montse Pérez a quien quiero agradecerle el haberme dado la
oportunidad de hacer este proyecto y haberme apoyado y guiado tan bien
durante su elaboración. También quiero agradecer a mis compañeros Manuel
Nande y Angie Santafé por echarme una mano cuando lo necesitaba.
Personalmente, dar las gracias por el apoyo, cariño y comprensión incondicional
de mis padres, Juan y Lourdes, mi hermana Sara y mis tías Maricarmen y Ana,
que siempre confiaron en mí y sin ellos nunca habría llegado a donde estoy. Por
último, quiero darles las gracias a Jairo, Aida, Loli y Pablo por escuchar
interminables historias sobre genética y estar siempre ahí.
2
INTRODUCCIÓN
La especie objeto de nuestro estudio es Solea senegalensis Kaup, o lenguado
senegalés. Se encuentra en el mar Mediterráneo y en las costas atlánticas desde
el golfo de Vizcaya hasta Senegal (Figura 1). Esta especie se ha sometido a cría
intensiva en acuicultura debido a su alto valor comercial y al rápido desarrollo de
los huevos. A pesar de estas características favorables, todavía hay problemas
para su cultivo, fundamentalmente por causas inherentes a la especie como las
dificultades que presenta su reproducción en cautividad.
Figura 1. Distribución geográfica de S. senegalensis (color púrpura) según Porta et al.
(2006).
1.1.
Cultivo integral de Solea senegalensis
La especie más cultivada en la región atlántica y norte de Europa es el lenguado
común, Solea solea, mientras que en el sur de Europa, principalmente España y
3
Portugal, la especie con un mayor potencial en el campo de la acuicultura es el
lenguado senegalés, Solea senegalensis
(Dinis et al., 1999). Esto se debe
principalmente a características como: que las hembras de S. senegalensis llegan
a la madurez cerca de su tercer año de edad, un año antes que S. solea, además,
de las dos especies, S. senegalensis presenta tasas de crecimiento mayores. Los
primeros estudios en el campo de la reproducción de esta especie se realizaron
en España (Rodríguez, 1984) y Portugal (Dinis, 1986; 1992), donde se ha
cultivado siguiendo el método extensivo (Drake et al., 1984). Actualmente, esta
especie se considera idónea para diversificar la acuicultura en países
mediterráneos.
La complejidad técnica para el cultivo del lenguado, el control de la reproducción
en cautividad o la incidencia de enfermedades es superior a otras especies cuyo
cultivo está ampliamente implantado. Además, se ha comprobado una acusada
reducción de la variabilidad genética debida a endogamia por la constitución de
stocks de reproductores con individuos de la misma familia o descendientes de
éstas (Cañavate, 2005).
Esta especie posee un gran potencial genético y los stocks salvajes de lenguado
mantenidos constituyen modelos ideales sobre los que realizar programas de
selección genética que permitan conseguir ejemplares más adaptados a las
necesidades de la cría intensiva. La aplicación de técnicas de genómica y
proteómica es de vital importancia como medio para maximizar la eficiencia en
la cría del lenguado (Cañavate, 2005). Sin embargo, aún no han sido
desarrollados métodos para controlar la puesta en cautividad, lo cual resulta
esencial para el desarrollo del su cultivo. Se han conseguido puestas mediante la
manipulación del termo período (Anguis y Cañavate, 2005), pero este método no
está optimizado.
4
1.2.
Situación actual de Solea senegalensis en el mercado
Gran parte de los proyectos en acuicultura en Europa están enfocados a la
optimización del cultivo de lenguado senegalés con objeto de que ésta sea la
próxima especie sometida a cultivo intensivo. Si las previsiones de producción se
cumplen, el próximo año será clave para comprobar el comportamiento de los
mercados ante el aumento de oferta de esta especie.
Empresas como Cupimar poseen plantas de engorde de lenguado en varios
puntos de España, a su vez, la empresa Stolt Sea Farm ha abierto una planta de
lenguados en Islandia recientemente, que se espera llegue a producir 2000
toneladas anuales de esta especie. Se calcula que esta planta alcanzará su mayor
nivel de producción en 2016, lo que se verá apoyado por la reciente adquisición
del criadero Alrogal en Galicia. Este criadero pertenece a la empresa del grupo
Acuidoro que gestiona el centro de reproducción de peces planos, una hatchery
de la que salen tanto rodaballos como lenguados. Las instalaciones de Alrogal
proporcionarán todos los juveniles de lenguado necesarios para la expansión.
Aunque estas son las producciones más importantes, también se suman otras a
menor escala como Sea8 en Portugal, con capacidad de producción de 450
toneladas, o Futuna Blue España, que puede llegar a producir cerca de 60
toneladas.
5
1.3.
Reproducción de Solea senegalensis
El cultivo del lenguado se basa, al igual que en el resto de especies, en la
estabulación de peces salvajes obtenidos del medio marino para la formación de
lotes de reproductores, que se reproducen generando larvas de la generación F1.
La reproducción del lenguado senegalés en cautividad se comenzó a estudiar en
la década de los 80 y continúa hoy en día (Rodriguez et al., 1982). En el caso del
lenguado senegalés, los peces F1 suelen presentar problemas reproductivos en
edad adulta, mientras que las hembras F1 son capaces de producir huevos
fertilizados con puestas espontáneas siempre y cuando estén acompañadas por
machos salvajes (Mañanós, 2011). Además, se ha demostrado que los machos F1
no tienen un comportamiento de cortejo normal (Carazo et al., 2009). Lo que se
sabe hasta el momento es que en lenguados existe una gran influencia de las
pautas de cortejo sexual y la acción de feromonas sobre el proceso de
fecundación en el tanque (Agulleiro, 2008). También se ha detectado una
influencia de la alimentación, obteniéndose mejores resultados de puesta en
reproductores alimentados con comida natural que los que se alimentan con
pienso comercial (Norambuena, 2009). Se ha descrito la fisiología reproductiva
en cautividad
y se han ajustado protocolos específicos de manipulación
ambiental (fotoperiodo y temperatura), así como tratamientos hormonales, con
resultados positivos en cuanto a la estimulación de la ovulación y espermiación,
e incluso al incremento de la producción de huevos, pero que resultan ser
inviables. Hasta la fecha no se han obtenido larvas F2, excepto utilizando técnicas
de fertilización artificial con esperma criopreservado (Rasines et al., 2012).
6
La causa de este comportamiento anómalo continua siendo un enigma y por esta
razón, la investigación sobre este tema es de suma importancia para solucionar
este cuello de botella en el cultivo de S. senegalensis.
Estas dificultades afectan negativamente a su viabilidad y a la rentabilidad
económica como cultivo a escala industrial, pues impiden la producción de
huevos y larvas de manera controlada y que se pueda considerar realmente
cerrado el ciclo vital de la especie en cautividad.
En la actualidad, los alevines de lenguado senegalés presentan un crecimiento
optimizado, pero el factor limitante sigue siendo la ausencia de métodos para el
control de la reproducción bajo condiciones de estabulación.
En algunas zonas del sur de España y Portugal se han conseguido puestas viables
procedentes de los reproductores salvajes estabulados a lo largo de varios años,
aunque se producen de manera poco predecible (Dinis et al., 1999; Anguis y
Cañavate, 2005).
1.4.
Problemática del cultivo
Los problemas en el desarrollo de alevines surgen mayoritariamente como
consecuencia de la consanguinidad. La consanguinidad aumenta cuando se
aparean individuos emparentados entre sí. El grado de consanguinidad puede
controlarse estableciendo las relaciones de parentesco ente los individuos y con
cruzamientos dirigidos. En general, todos los animales de una misma raza se
encuentran emparentados, pero el término consanguinidad se utiliza cuando se
produce el apareamiento de animales con mayor grado de parentesco que el
7
promedio de la población (Molina et al., 1995; Bijma et al., 2001; Parland et al.,
2007).
Hay elementos en la gestión de animales en criaderos que provocan el aumento
del grado de consanguinidad, como que éstos se encuentren confinados en un
mismo espacio reducido. Sus consecuencias son muy negativas en cultivo, una de
ellas es la disminución del rendimiento medio de ciertos caracteres productivos
(Burrow, 1993; Falcao et al., 2001; Ruíz-Flores et al., 2006).
A consecuencia de la endogamia aumenta la frecuencia de genes deletéreos,
cuyo aumento en la población provoca una disminución de la eficacia biológica, e
incluso pueden llegar a ser letales tras varias generaciones de endogamia. Su
capacidad de supervivencia y de reproducción es menor. Por ello, los individuos
son menos fértiles y constituyen líneas de difícil mantenimiento.
Estas premisas son de elevado interés para los criadores, ya que deben conocer
la estructura y constitución genética de sus stocks de reproductores, así como los
posibles efectos adversos de la consanguinidad en el comportamiento y, cuando
sea necesario, redefinir los criterios de selección y apareamiento en los
individuos.
Para caracterizar los stocks de reproductores, se realiza una evaluación de la
variabilidad genética y su distribución entre stocks, además de la detección de
alelos raros que indiquen la presencia de variantes genéticas únicas (GonzálezCandelas y Montolio, 2000).
Para resolver otro de los problemas que afecta a la cría de Solea senegalensis,
que es la acusada reducción de la viabilidad de ejemplares juveniles, debido a
procesos endogámicos, es necesario conocer más su estructura poblacional y su
8
pedigree. Para ello, es imprescindible el uso de herramientas moleculares que
permitan hacer correctamente la asignación de parentales y conocer su
genealogía.
1.5.
Herramientas moleculares
Los microsatélites son un tipo de marcadores genéticos formados por
repeticiones de dos a seis pares de bases (González, 2003; Cruz et al., 2005).
Cada microsatélite se define por el tipo de unidad repetida (di- , tri- y
tetranucleotídicos). Aunque poseen altas tasas de mutación, sus regiones
flanqueantes están muy conservadas, por lo que se utilizan para la amplificación
del locus en cuestión (Morgante y Olivieri, 1993). Estas regiones pueden
utilizarse para la amplificación de microsatélites homólogos en especies muy
relacionadas utilizando los mismos cebadores (amplificación cruzada), lo que
resulta muy útil para la obtención de marcadores altamente polimórficos para
realizar análisis de parentesco. Son de herencia codominante (se distinguen
todos los homocigotos entre sí y estos de los heterocigotos). Poseen una alta
variabilidad en la longitud de la secuencia, lo cual se hereda de manera estable
de forma mendeliana y suelen ser selectivamente neutros. Son muy útiles como
marcadores genéticos debido a que están repartidos de forma azarosa en el
genoma, presentan una alta abundancia, son muy polimórficos y permiten
trabajar con reducidas cantidades de ADN (Cruz et al., 2005; Pérez et al., 2005).
9
1.5.1. APLICACIONES DE LOS MICROSATÉLITES
1.5.1.1.
Aplicaciones en mejora genética
Para llevar a cabo planes de mejora genética se necesita una herramienta
molecular que tenga como características principales: permitir la total
diferenciación de los progenitores y que sea transmitido de forma estable a la
descendencia (Paterson et al., 1991) además de proporcionar abundante
información.
La base molecular de estas herramientas es la diversidad en el número de veces
que se repite una unidad básica por la que está formada y en la variabilidad
intrasecuencial de ésta. Los microsatélites se amplifican por PCR, utilizando como
cebadores las secuencias flanqueantes, al encontrarse más conservadas
(Morgante y Olivieri, 1993).
1.5.1.2.
Estudios de biodiversidad
El uso de los microsatélites en estudios de biodiversidad ha ido aumentando
considerablemente en los últimos años, debido principalmente a su elevado
polimorfismo y a la posibilidad de trabajar con pequeñas cantidades de ADN, que
pueden ser obtenidas sin necesidad del sacrificio del individuo. Son de elevada
utilidad para dilucidar aspectos como la detección de cuellos de botella en
determinadas poblaciones (Hauser et al., 2002,) en conservación (González,
2003), para la medición del flujo génico entre poblaciones (Pita et al., 2011),
asignación de parentales (Pardo et al., 2006), determinación de la población de
origen de individuos (Pita et al., 2010), etc.
10
El uso de estos marcadores de forma generalizada comenzó tras las primeras
publicaciones de su aislamiento y caracterización (Litt y Lutty, 1989; Tautz, 1989;
Weber y May, 1989). En particular, en peces desde 1993 con el aislamiento de
microsatélites y su aplicación en Salmo trutta (Estoup et al., 1993).
1.5.1.3.
Filogenia
Aunque su tasa de mutación es elevada, sus regiones flanqueantes se mantienen
conservadas y son la base para realizar hipótesis filogenéticas entre especies
cercanas. De este modo se han utilizado para resolver filogenias en familias de
cíclidos (Zardoya et al., 1996) y salmónidos (Koskinen et al., 2002) entre otros. A
pesar de estar ampliamente estudiados y caracterizados, aún se desconocen
aspectos como su función, debido a que se encuentran tanto en regiones
codificantes y en mayor grado en no codificantes (Pérez et al., 2005; Cruz et al.,
2005). No hay consenso sobre los patrones de variación de tamaño de alelos
entre generaciones o qué factores concretos determinan la tasa de mutación
(Hancock, 1999; Li et al., 2002; Sibly et al., 2003).
El proceso de evolución de los microsatélites se ha intentado explicar mediante
tres modelos: El modelo del K-alelo (Crow y Kimura, 1970), el modelo de alelos
infinitos (Kimura y Crow, 1964) y el del salto mutacional (Kimura y Otha, 1978).
Este último es el más aceptado y postula que las mutaciones son el resultado de
la ganancia o pérdida de una única unidad de repetición en los alelos ya
existentes en la población, conservando memoria acerca del anterior estado
alélico (Goldstein et al., 1995; Balloux y Goudet, 2002).
11
1.5.2. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS MICROSATÉLITES
1.5.2.1.
Ventajas
Su tamaño permite trabajar con tejido de poca calidad o ADN en proceso de
degradación, lo que resulta muy útil en el estudio poblacional de especies en
peligro de extinción, ya que se puede amplificar a partir de muestras de heces,
hueso o pelo (Hoss y Paabo, 1993), plumas (Ellegren, 1993), que no implican el
sacrificio del ejemplar.
Aplicados a poblaciones son útiles para estudiar los movimientos, el área de
distribución y la estructura de poblaciones sin necesidad de contacto directo con
los individuos (Sloane et al., 2000).
Hay ocasiones en las que se pueden utilizar los cebadores de una especie en
taxones cercanos (amplificación cruzada). Existen ejemplos en mamíferos
(Moore et al., 1991), tortugas (FitzSimmons et al., 1995), aves (Primmer y
Ellegren, 1998) y peces (Zardoya et al., 1996) en los que se ha amplificado en
especies separadas entre 100 y 400 millones de años.
1.5.2.2.
Desventajas
Para utilizar los microsatélites es necesario aislar marcadores específicos de la
especie que se quiere estudiar, lo que conlleva un gasto económico y de tiempo.
Esto puede resultar más complicado trabajando con organismos en los que el
aislamiento sea más difícil o porque los microsatélites aislados para un grupo
taxonómico no se puedan utilizar con grupos próximos (Primmer y Merila, 2002).
12
El uso de cebadores para amplificar microsatélites mediante PCR en especies
próximas puede ser un inconveniente por la presencia de alelos nulos, pues
pueden presentar mutaciones, inserciones y/o deleciones en los sitios de unión
de los cebadores. Esto puede dar lugar a la identificación errónea de individuos
heterocigotos como homocigotos y provocar la acumulación de errores
analíticos.
1.5.3. ¿QUÉ APORTAN LOS MICROSATÉLITES A NUESTRO ESTUDIO?
Por todas las características descritas, los microsatélites son idóneos para este
estudio, ya que reúnen las características necesarias para ser una herramienta
fiable de análisis de parentesco y pedigree.
Anteriormente han sido descritos y evaluados una serie de microsatélites en
peces planos y, en concreto, en Solea senegalensis (Castro et al., 2006; Porta et
al., 2006). Dichos microsatélites fueron probados con una serie de individuos y
presentan buenas tasas de amplificación. Con estos marcadores se desarrollaron
dos herramientas moleculares para asignación de individuos nacidos en
cautiverio a sus parentales. Estos datos poseen un alto valor para el mejor
mantenimiento y gestión de los stocks.
Sin embargo, el análisis con los sets de marcadores publicados anteriormente
(Castro et al., 2006; Porta et al., 2006) no permitió hacer una adquisición
correcta de los individuos. Por ello, se decidió seleccionar los marcadores que se
describen en este trabajo para diseñar una herramienta más fiable.
Este trabajo se ha desarrollado en el marco de un proyecto JACUMAR de la
Comunidad Autónoma de Galicia titulado “Estudio del comportamiento
13
reproductor del lenguado senegalés (Solea senegalensis) en individuos salvajes y
nacidos en cautividad (F1)”. En este proyecto participaron el Centro
Oceanográfico de Vigo del Instituto Español de Oceanografía, el Instituto Galego
de Formación en Acuicultura (IGAFA) y el Centro de Investigaciones Mariñas
(CIMA) ambos de la Xunta de Galicia.
En 2010 se constituyeron dos tanques de reproductores, uno de ellos con
hembras salvajes y machos F1 y salvajes y el otro con hembras F1 y machos F1 y
salvajes. Solamente se obtuvieron puestas viables en el tanque con hembras F1.
Por tanto el objetivo general del presente trabajo fue asignar la descendencia a
los parentales de lenguado. Los objetivos específicos fueron:
ü Poner a punto una batería de marcadores útil, con el mínimo número de
microsatélites que permitan la asignación inequívoca a los parentales.
ü Determinar si el macho responsable de la puesta con la que trabajamos
era salvaje o pertenecía a la F1.
Los resultados podrán extrapolarse a todas las instalaciones en las que se lleve a
cabo la cría del Solea senegalensis, estandarizar el uso de la batería de
microsatélites propuesta y sus condiciones y diseñar las familias siguiendo el
esquema propuesto. De este modo, se reducirá la endogamia y se minimizarán
los efectos de la reducción de la variabilidad genética a causa de la depresión
consanguínea.
14
MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. Material biológico
Se utilizaron muestras de 67 ejemplares de S. senegalensis, de los cuales 17
pertenecían al stock de reproductores y 50 a la descendencia. Los individuos del
stock de reproductores utilizados en el presente trabajo estaban estabulados
desde 2006 en el Centro Oceanográfico de Vigo del Instituto Español de
Oceanografía. Además se utilizaron 50 individuos criados en cautividad y nacidos
en 2011.
El diseño experimental previo consistió en la constitución de dos tanques de
reproductores en 2010:
- Tanque 6, en adelante T6, en el que se mantuvieron 14 hembras F1, 5
machos salvajes y 3 machos F1.
- Tanque 7, en adelante T7, en donde se mantuvieron 12 hembras
salvajes, 8 machos F1 y 4 machos salvajes.
En 2011, se obtuvieron puestas espontáneas en ambos tanques, pero
únicamente una de las puestas del T6 resultó ser apta para el cultivo. Cuando los
ejemplares presentaban un tamaño adecuado, se realizó un muestreo de aleta
caudal de 50 individuos F1 que se conservó en alcohol hasta la extracción de
ADN posterior.
15
Código
Ind 1
Ind 2
Ind 3
Ind 4
Ind 5
Ind 6
Ind 7
Ind 8
Ind 9
Ind 10
Ind 11
Ind 12
Ind 13
Ind 14
Ind 16
Ind 19
Ind 21
Sexo
♂
♂
♂
♂
♂
♀
♀
♀
♀
♀
♀
♀
♀
♂
♂
♂
♀
Origen
F1
F1
Salvaje
Salvaje
F1
F1
F1
F1
F1
F1
F1
F1
F1
Salvaje
Salvaje
Salvaje
F1
Tabla 1. Origen y sexo de los reproductores analizados.
2.2. Extracción del ADN
El ADN se extrajo de muestras de aleta caudal de los ejemplares de lenguado. A
partir de éstas se hizo una extracción con Chelex 10 % (Walsh et al., 1991). Este
método es rápido y sencillo y se basa en el uso de una resina quelante inhibidora
de las nucleasas y ligasas que no interfiere en la reacción de PCR.
Se utilizó en solución, que se añadió sobre la muestra y se incubó a 56ºC durante
30 minutos. Esto permitió el lisado de las células, la eliminación de proteínas,
contaminantes e inhibidores. Después, las muestras se calentaron a 100ºC
durante 8 minutos, provocando que el ADN se desnaturalice y la destrucción de
16
las proteínas celulares. Para finalizar, los tubos se centrifugaron durante 5
minutos a 8000 r.p.m. Se recogió el sobrenadante, que contenía el ADN y se
guardó en nevera a 4ºC hasta su posterior amplificación.
En aquellas muestras en las que no se obtuvo amplificación de alguno de los
marcadores se realizó una segunda extracción con el método FENOSALT (Pérez y
Presa, 2011), que permite extraer ADN más puro. El protocolo consistió en
añadir a la muestra 500 µL de buffer de lisis (0.1M Tris; 0.01 M EDTA; 0.1 NaCl;
1% SDS; pH=8). Posteriormente, se añadieron 5 µl de proteinasa K (20 mg/ml).
Tras este paso, se mezcló en vórtex y se incubó 55ºC, 1 hora a 300 rpm. Cuando
el tejido estuvo disuelto, se centrifugó a 8000 rpm durante 3 minutos. Al
finalizar, el sobrenadante se transfirió a un tubo limpio y se mezcló por inversión
20 veces con 1 volumen de fenol: cloroformo: isoamil alcohol (25:24:1). Después
se centrifugó a 8000 rpm 5 minutos. Se transfirió el sobrenadante a un tubo
limpio y se mezcló 20 veces con 1 volumen de cloroformo: isoamil alcohol (24:1).
Se centrifugó de nuevo a 8000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se
transfirió a un tubo limpio y se mezcla mezcló por inversión con 2 volúmenes de
etanol puro. Se realizó una centrifugación a 4ºC, 12000 rpm durante 20 minutos.
Tras la centrifugación, se lavó el pellet en alcohol al 70%. Se centrifugó una
última vez a 13000 rpm, a 4ºC. Por último, se eliminó el alcohol y se secó el pellet
en speed vacuum durante 5 minutos a 45ºC. El producto resultante se
resuspendió en 100 ml de agua o TE.
La calidad y la cantidad de ADN extraído se comprobaron mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1% en TAE (Tris Acetato EDTA) de 5 µl de cada
muestra junto a un marcador molecular de 100 pb (Hyper Ladder IV de Bioline).
La tinción se efectuó con bromuro de etidio (Figura 1).
17
El gel migró 30 minutos y se visualizó con luz ultravioleta en un transiluminador.
Figura 2. Gel de agarosa para comprobar la calidad del ADN. Calle 1: marcador de pesos
Hyper Ladder IV. Calles de la 2 a la 8 y de la 9 a la 16: muestras de la extracción de ADN
de reproductores de lenguado.
2.3. Amplificación por PCR de los loci seleccionados
Mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es posible sintetizar
numerosas copias de un fragmento de ADN usando una polimerasa que actúa a
elevadas temperaturas, el número de copias aumenta de forma exponencial.
En nuestro caso, para alcanzar los objetivos propuestos, se testaron (Tabla 2) los
loci microsatélite Sol 13 D y Sol 9A (Porta et al., 2006) y GATA 38, Sol CA13, Smax
02 y F13 (Castro et al., 2006) en los individuos del stock de reproductores. Se
pusieron a punto las condiciones de amplificación para las distintas parejas de
cebadores mediante la variación de ciertas condiciones como la concentración
de MgCl2 o la temperatura de anillamiento. La amplificación por PCR de los
microsatélites se llevó a cabo en un termociclador Agilent Sure Cycler 8800. El
volumen final de la reacción fue de 15 µL, con 100 ng de ADN genómico
18
(aproximadamente 2 µL del extracto), 150 µM de dNTPs, entre 1.5 y 2.0 mM de
Magnesio según el locus amplificado, 10 pmoles de cada cebador (el forward de
cada pareja marcado con el fluoróforo correspondiente (Tabla 2), 0.5U de
polimerasa (NZYTaq DNA polimerase), 1.5 µL de tampón de reacción y agua pura
hasta completar el volumen de 15 µL. Además de los individuos problema, se
amplificó un control negativo. Cada PCR constó de los siguientes ciclos: 1 ciclo de
desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, 58ºC durante 30 segundos y 72ºC
durante 40 segundos y un ciclo final de extensión a 72ºC durante 10 minutos.
Nombre
Sol 13D
Sol 9A
GATA 38
Sol CA13
Primers (5´->3´)
GATCATTAGAGAGGTCACACGAGC
CATGACATCATCGCAGACC
GATCCTCTGTGCCACGACGTTGG
GATCTGGCCGAGAGCAGATGC
ATATCATCAGGCAGTAAAACGGTCGCA
AATG
GCAATCTGCAAACTGACCACTAGATGC
CAGT
ATCCCGAGAAGGCAGATGT
AGTGGAATCAATTTCCTGTGG
Tª
de
annealing (ºC)
MgCl2
(mM)
Marcaje
59
1.5
PET
(GT)12
59
1.5
6-FAM
(GATA)20
62
2.0
HEX
(GAA)10
60
1.5
6-FAM
Unidad
repetida
(GT)12
Smax 02
GGAGGATGTATTGAAAGTGT
AGAGCAGGTCATTATACAGC
(TG)16
58
1.5
NED
F 13
GGCTGCAGAACGATCTTTAC
GCAACCTTGAGCTGTGACC
(TG)8CGC(G
T)4(GA)7
60
1.5
6-FAM
Tabla 2. Secuencia y condiciones de amplificación de los microsatélites empleados.
Los productos obtenidos en la PCR se migraron en un gel de agarosa al 2% con
bromuro de etidio que se visualizó en un transiluminador (Figura 3).
19
Figura 3. Gel de agarosa con los productos resultantes de la PCR del microsatélite GATA
38. Calles 1 y 9: marcador molecular de 100 pb (Hyper Ladder). Calles de 2 a 8 y de 10 a
12: amplicones. Calle 13: control negativo.
2.4. Genotipado de las muestras
Una vez comprobada la correcta amplificación en el gel de agarosa se procedió a
la mezcla de las PCRs de los distintos microsatélites analizados junto a un
estándar marcado y formamida desionizada. En nuestro caso el estándar se llama
GeneScanTM-500 LIZ Size Standard y está marcado con el fluoróforo LIZ, de color
naranja. Este estándar está diseñado para tallar fragmentos entre 35 y 500 pares
de bases y proporciona 16 fragmentos marcados de 35, 50, 75, 100, 139, 150,
160, 200, 250*, 300, 340, 350, 400, 450, 490 y 500 bases (Figura 4).
20
Figura 4. GeneScanTM-500 LIZ Size Standard en naranja.
Los fragmentos se migraron en un ABI Prism 310 DNA Sequencer (Applied
Biosystems) disponible en el Centro de Apoio Científico e Tecnolóxico a
Investigación (CACTI) de la Universidad de Vigo. Este aparato es un secuenciador
automático con capilares que recogen de la placa cada muestra de modo
independiente y la hacen pasar por un haz de luz que excita el fluoróforo y se
talla por comparación con los fragmentos del estándar utilizando, en nuestro
caso, el programa GeneMarker v2.4.0. (Figura 5).
21
Figura 5. Microsatélites Sol 9A, Sol 13D, GATA 38 y Sol CA13 de lenguado migrados en un
ABI Prism 310 DNA Sequencer.
2.5. Análisis de datos
Una vez analizados en el secuenciador se seleccionaron los alelos con el
programa GeneMarker v2.4.0. Este programa permite la visualización de los
picos resultantes del genotipado. Por comparación con el estándar, estima el
tamaño de los alelos de cada individuo. Los datos genotípicos de cada individuo
se registraron en una hoja de cálculo Excel, junto al sexo de los individuos y el
año de nacimiento.
Los análisis de parentesco se realizaron con dos programas que representan los
dos principales métodos para llevar a cabo una asignación:
22
- Vitassign: (Vandeputte et al., 2006) se basa en el principio de exclusión
comprobando la compatibilidad de los genotipos de parentales y descendencia
siguiendo un modo de herencia mendeliana. Por ello, un parental y un individuo
de la descendencia deberán compartir al menos, un alelo de cada locus. Para los
microsatélites, el análisis de parentesco se ha realizado permitiendo de 0 a 3
incongruencias, lo que es típico cuando se trabaja con éstos.
- Cervus: (Marshall et al., 1998; www.fieldgenetics.com) este programa utiliza el
método de máxima probabilidad (likelihood) para estimar las relaciones más
probables entre los parentales candidatos y el grupo de descendientes (Wang,
2012). El método se basa en el cálculo de una puntuación LOD, que nos informa
de la probabilidad que tiene un individuo (o un par de individuos) de ser el padre
(o los parentales) de un determinado descendiente, dividido entre la
probabilidad de que los individuos no estén relacionados. La descendencia es
asignada a los parentales con la mayor puntuación LOD. El análisis realizado con
este programa consta de tres pasos: primero se calculan las frecuencias alélicas,
después se realiza una simulación de parentesco y, por último, con los datos
obtenidos, el análisis de parentesco.
Además de un análisis de parentesco, con este programa se han efectuado
estimas de diversidad genética como: número de alelos, heterozigosidad
observada y esperada, contenido de información polimórfica (PIC), equilibrio de
Hardy-Weinberg, porcentajes de exclusión y probabilidad de alelos nulos. El
programa analiza conjuntamente los datos de reproductores y de la
descendencia como si fuera una única población, lo que es equivalente a lo que
se observaría en la naturaleza.
23
Además de este programa, para obtener datos de la constitución genética de las
poblaciones se han utilizado la versión web del programa GENEPOP (Rousset,
2008) (http://genepop.curtin.edu.au/). Con este programa testamos las
desviaciones del equilibrio de H-W y se realizaron diversas estimas de diversidad
genética como Fis (Weir y Cockerham, 1984), número esperado y observado de
heterocigotos y homozigotos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Amplificación y genotipado
Es importante destacar que aunque Smax 02 es un microsatélite de Scophtalmus
maximus y el F13 se diseñó en la especie congenérica Solea solea ambos ofrecen
una resolución apropiada. Para el F13 se consiguieron genotipar todos los
individuos, mientras que para Smax 02 se observaron problemas de
amplificación recurrentes que no pudieron solucionarse.
3.2. Estimas de la diversidad genética
Utilizando el programa Cervus, se efectuó el cálculo de estimadores como Fis,
heterocigosis y homocigosis esperada y observada, frecuencia de alelos nulos,
contenido en información polimórfica (PIC).
Para comprobar si la población está en equilibrio HW, con el programa Cervus
(Marshall et al., 1998) se efectuó una Chi 2 de bondad de ajuste, comparando las
frecuencias observadas de los genotipos con las esperadas, calculadas a partir
de las frecuencias alélicas asumiendo equilibrio HW (Tabla 3).
24
Locus
K
N
Ho
He
PIC
HW
F(Null)
Sol 9A
Sol 13D
GATA 38
CA 13
Smax 02
F 13
13
8
8
13
9
12
66
66
67
66
43
65
0.742
0.955
0.881
0.742
0.488
0.815
0.760
0.803
0.705
0.734
0.520
0.795
0.717
0.767
0.653
0.688
0.462
0.763
NS
ND
**
NS
NS
NS
+0.0027
-0.0955
-0.1362
-0.0193
+0.0132
-0.0265
Tabla 3. Estimas de diversidad genética. (A: número de alelos, N: Número de individuos
analizados, Ho: Heterozigosidad observada, He: Heterozigosidad esperada, PIC:
Contenido de Información polimórfica, HW: Equilibrio Hardy -Weinberg, F (Null):
Probabilidad de alelos nulos.
Equilibrio Hardy-Weinberg. El equilibrio de HW postula que los individuos de
una población se encuentran en dicho equilibrio cuando se trata de una
población que se reproduce al azar, lo suficientemente grande y en la que no
influyen procesos de migración o mutación que alteren las frecuencias génicas. El
análisis realizado con Cervus nos indica que todos los microsatélites se ajustan al
equilibrio de HW excepto el GATA 38. El microsatélite Sol 13D es el único para el
que Cervus no realiza el test de HW. Según el programa no se ha podido realizar
el análisis debido a que el tamaño de la muestra no es
suficiente. Está
demostrado que un número reducido de individuos provoca desviaciones en el
equilibrio, pero en este caso no estaría ser esta la una causa por la que el
programa no pueda realizar dicho análisis, pues el número de individuos
genotipados para este microsatélite es similar a los otros. Además, el locus que
menos individuos genotipados posee es el Smax 02, y para éste sí realiza análisis.
25
Heterocigosidad. Los resultados de heterocigosidad observada se ajustan bien a
lo esperado. Para los microsatélites Smax 02 y Sol 9A, la heterocigosidad
esperada es ligeramente mayor que la observada, al contrario que el resto de los
casos, esto está relacionado con la frecuencia de alelos nulos. Estos dos
microsatélites son los únicos que presentan alelos nulos, lo cual era esperable al
observar el exceso de homocigotos con respecto a lo esperado. En nuestro caso,
para todos los microsatélites la frecuencia de alelos nulos es muy baja, con
excepción del locus Sol 9A. Esto coincide con los datos obtenidos por Castro et
al., 2006 en los que el locus Sol 9A presentaba la mayor tasa de alelos nulos
(6%). El locus Smax 02 también presenta una frecuencia de alelos nulos más
elevada que los restantes loci analizados. En el caso de Smax 02 puede la
frecuencia de alelos nulos puede estar sobreestimada pues es el microsatélite
que presenta una menor cantidad de individuos de la descendencia genotipados.
Alelos nulos. Con respecto a los alelos nulos, se considera que son nulos aquellos
alelos que no se detectan en el genotipado normal de los individuos. Son una
causa común de las desviaciones del equilibrio HW en loci microsatélite
(Pemberton et al., 1995). La baja ratio de alelos nulos es muy importante para
obtener una herramienta fiable de asignación en acuicultura, ya que para que
ésta sea correcta, se deben detectar todos los
posibles genotipos de los
individuos. La frecuencia de alelos nulos no debe superar el 5%, ya que esto
comprometería el análisis de parentesco (Marshall et al., 1998). Cuando hay un
alelo nulo en un marcador, individuos que parecen homocigotos son en realidad
heterocigotos siendo uno de los alelos un alelo nulo. Esta explicación puede
aplicarse también a aquellos casos en los que no se consiguió amplificar algún
microsatélite para alguno de los individuos, habiendo amplificado correctamente
todos los demás.
26
Contenido en Información Polimórfica. El valor del PIC (contenido en
información polimórfica) (Botstein et al., 1980), es indicativo de la validez y
fiabilidad de los marcadores para asignación. Depende del número de alelos y de
la distribución de frecuencias. Valores superiores a 0.5 se consideran muy
informativos. Nuestros datos son muy similares a los obtenidos por Porta et al.,
2004 y Castro et al., 2006, lo que indica que el bajo número de individuos
analizado no nos ha impedido observar la mayoría de los alelos de cada locus.
Los valores obtenidos son mayores de 0.5, con excepción del locus Smax 02,
debido a que es el microsatélite del que menos individuos se han conseguido
genotipar. Parece probable que la explicación para este dato en Smax 02 sea que
se trata de un microsatélite descrito para rodaballo (Scophthalmus maximus), lo
que explica no solo su bajo valor de PIC sino la presencia de nulos. Estos valores
de PIC obtenidos muestran que los microsatélites empleados en el estudio son
un buen conjunto de marcadores.
3.3. Análisis de parentesco
3.3.1. Análisis de parentesco con el programa Vitassign
Utilizando la información obtenida para los 6 microsatélites ensayados, el
programa Vitassign (Vandeputte et al., 2006) nos permite realizar una asignación
de parentales con 0, de 1 a 2 o de 2 a 3 incongruencias. En la Tabla 4 se
muestran los resultados obtenidos tras el análisis con este programa.
27
Nº de
incongruencias
Asignación con
incongruencias
Asignación sin
incongruencias
No
asignados
1
68%
32%
32%
De 1 a 2
86%
32%
10%
De 2 a 3
94%
32%
0%
Tabla 4. Resultados del análisis de parentesco con Vitassign.
Porcentaje de asignación con 6 microsatélites. Se observa que incrementando el
número permitido de incongruencias el porcentaje de individuos asignados es
mayor, siendo constante el número de asignaciones perfectas. Hay individuos de
los que no se dispone de información para uno o dos microsatélites,
normalmente F13 y Smax 02, ambos diseñados en otras especies y con algunos
problemas de amplificación. Este hecho es el responsable de la mayoría de las
asignaciones con incongruencias. En general, las causas más comunes de error
han sido fallos en la lectura de genotipos o ausencia de datos en algunos de ellos.
Además de esta fuente de error, han surgido otros problemas como en el caso
del microsatélite Smax 02, ya que su reducido tamaño (80 pb) convirtió las
etapas de amplificación y genotipado en un proceso muy complejo.
En las asignaciones que no son perfectas, el programa asigna varios posibles
padres para cada hijo. Los genotipos correspondientes se han revisado y
asignándose a cada hijo los parentales más probables. Un ejemplo de estas
incongruencias debido a la falta de datos de genotipado es el del individuo 17:
sus parentales son la pareja formada por el macho 1 y la hembra 8, pero el
programa mostraba incongruencias debido a que no se disponía de datos del
28
genotipado de los microsatélites Sol 9A y Sol 13D para ese descendiente.
Posteriormente, se revisaron los genotipos del individuo de la descendencia y se
asignaron los parentales correctamente.
Las asignaciones perfectas y las que fueron revisadas muestran que hay una sola
pareja de parentales, formada por el macho 1 y la hembra 8, ambos parentales
F1.
Porcentaje de asignación con 4 microsatélites. En vista de los resultados
obtenidos, decidimos eliminar del análisis los microsatélites responsables de las
incongruencias (Smax 02 y F13) y efectuar de nuevo el análisis de parentesco con
los 4 restantes (Sol 13D y Sol 9A (Porta et al., 2006) y GATA 38, Sol CA13). En la
tabla 5 se muestran los resultados obtenidos tras realizar el análisis de
parentesco eliminando Smax 02 y F13.
Nº de
Asignación con
Asignación sin
No
incongruencias
incongruencias
incongruencias
asignados
1
82%
42%
14%
De 1 a 2
90%
42%
2%
De 2 a 3
93%
42%
0%
Tabla 5. Resultados del análisis de parentesco con Vitassign de los microsatélites Sol 9A,
Sol 13D, GATA 38 y Sol CA 13.
Los datos obtenidos tras el nuevo análisis indican que éste es más robusto que el
realizado teniendo en cuenta a los microsatélites Smax 02 y F13. El porcentaje de
asignación con una o dos incongruencias aumenta de 86% a 90%, observándose
29
un notable descenso de los individuos no asignados (del 10% al 2%). También se
observa una acusada reducción del número de individuos no asignados en el caso
en el que sólo se le permite al programa realizar el análisis con una
incongruencia: de 32% a 14%. Las asignaciones perfectas aumentaron de 32% a
42%. Estos datos indican que, eliminando las dos principales fuentes de error en
la asignación, el análisis de parentesco es más fiable.
3.3.2. Análisis de parentesco con el programa Cervus
Ligamiento. El análisis con Cervus indica que los loci Sol CA 13, F13, GATA 38, Sol
9A y Smax 02 presentan segregación independiente, es decir, no se encuentran
ligados. Si hubiese ligamiento entre alguno la probabilidad de exclusión podría
estar sobreestimada (Castro et al., 2006). Este resultado contrasta con el
obtenido por Castro et al, 2006 que analizando 4 familias de lenguado senegalés
procedentes de Stolt Sea Farm observaron una desviación significativa de la
asociación al azar entre F13 y Sol9A en todas las familias sugiriendo ligamiento
entre ambos marcadores. En cualquier caso, aunque no hemos detectado indicio
alguno de ligamiento en nuestros datos, si así fuera, no supondría problema
alguno pues a la vista de los resultados obtenidos con el programa Vitassign el
microsatélite F13 será eliminado de la herramienta de asignación.
Porcentajes de exclusión con 6 microsatélites. Los porcentajes de exclusión se
calculan respecto a los genotipos de la descendencia (Tabla 6). El programa
Cervus aporta datos de la probabilidad combinada de exclusión, lo que nos
informa acerca de la fiabilidad del análisis, ya que es la probabilidad de que la
asignación errónea de un progenitor sea detectada en el análisis de parentesco
30
(Jamieson, 1994). Excl1 es la probabilidad de exclusión conociendo a uno de los
parentales y Excl2 es la probabilidad de exclusión conociendo a los dos. En todos
los casos el valor de Excl2 es menor que Excl1 (Tabla 6). La probabilidad de
exclusión para todos los microsatélites en conjunto conociendo a un padre es de
0.06923 y conociendo a ambos padres 0.01044, lo que indica que la probabilidad
de que la pareja asignada como padres no sea correcta es del 1.04%. Estos
valores muestran que la asignación es muy fiable, ya que las probabilidades de
que los parentales sean otros que difieren con los asignados, es muy baja.
Son unos buenos valores para el análisis de parentesco. Se observa que el
microsatélite que presenta un porcentaje de exclusión más elevado es el Smax
02, ya que es del que menos individuos de la descendencia se han conseguido
genotipar, y por ello, se han obtenido menos datos para asignarlos a sus
correspondientes parentales, dando lugar en ocasiones a errores en la
asignación, que, posteriormente fueron revisados.
Locus
Sol 9A
Sol 13D
GATA 38
Sol CA13
Smax 02
F 13
Excl 1
0.638
0.578
0.713
0.663
0.858
0.572
Excl 2
0.461
0.401
0.539
0.489
0.716
0.395
Tabla 6. Porcentajes de exclusión para cada microsatélite obtenidos con el programa
Cervus.
Con el programa Cervus (Marshall et al., 1998) se obtuvo un archivo que
contiene a los posibles padres (Figura 6).
31
Figura 6. Salida del programa Cervus, las asignaciones perfectas en azul y las que deben
ser revisadas en amarillo.
A pesar de que hay algunas incongruencias en algunos alelos, la asignación
muestra una única pareja de parentales que corresponden al macho 1 y a la
hembra 8 (ambos pertenecientes a la generación F1), en el 66% de los casos. En
el 34% restante de los individuos se comprobaron los genotipos y la pareja que
mejor se asocia a éstos son la hembra 8 y el macho 1.
Hay diferentes errores que se pueden cometer cuando se trabaja con
microsatélites: ausencia de amplificación, artefactos en ésta, así como errores
humanos en la lectura de los genotipos (Bonin et al., 2004; Hoffman y Amos,
2005). Los errores de genotipado son mayores en heterocigotos para alelos
adyacentes y éstos son una de las principales causas de falsa exclusión, llegando
incluso al 23% (Hoffman y Amos, 2005). Esta problemas pueden comprometer o
interferir en el análisis de parentesco (Marshall et al., 1998; Glaubitz et al., 2001),
especialmente cuando los padres candidatos son excluidos basándose en una
sola incongruencia (Hoffman y Amos, 2005).
32
Los errores en asignación de parentesco cuando se trabaja con microsatélites
suelen ser del 2% (Castro et al., 2004; Bonin et al., 2004; Hoffman y Amos, 2005),
debido a errores de genotipado o a la presencia de alelos nulos. En nuestro caso,
el error es 1,04% lo cual significa que el conjunto de marcadores seleccionados
es perfecto para identificar a los parentales. Además, los individuos que no se
consiguieron asignar de forma correcta inicialmente, una vez revisados,
mostraron como única pareja de parentales la formada por la hembra 1 y el
macho 8, ambos pertenecientes a la generación F1.
Porcentajes de exclusión con 6 microsatélites. Una vez eliminados los
microsatélites F13 y Smax02 del análisis, el porcentaje de asignaciones
incorrectas desciende de un 34% a un 18%. Este resultado confirma que ambos
eran los causantes de la mayoría de las incongruencias que interferían en el
análisis, cómo ya habíamos observado en el análisis con Vitassign (Tabla 6).
Tabla 6. Salida del programa Cervus, excluyendo los microsatélites Smax 02 y F13. Las
asignaciones perfectas en azul y las que deben ser revisadas en amarillo.
33
3.4. Diseño de la herramienta de asignación
Como ya se indicó con anterioridad las herramientas disponibles hasta el
momento (Castro et al., 2206; Porta et al., 2006) no resultaron adecuadas en
nuestro caso de estudio pues no se obtuvo un porcentaje de asignación
adecuado. Los resultados obtenidos en los diferentes análisis de parentesco
muestran que, el mejor conjunto de microsatélites para crear una herramienta
de análisis fiable es el formado por los marcadores Sol 13D, Sol 9 A, GATA 38 y
Sol CA13.
En el caso de la herramienta propuesta por Castro et al., 2006 formada por los
marcadores Sol CA13, F13, Smax 02 y GATA 38, resulta sorprendente la elevada
probabilidad de asignación que observan pues, dos de los microsatélites
presentes en su herramienta (Smax 02 y F13) han sido finalmente descartados
por nosotros por ser los responsables de la mayoría de las incompatibilidades y o
incongruencias en dicho análisis.
La herramienta de asignación propuesta por Porta et al. (2006) está formada por
5 marcadores a saber, Sol 19A, Sol 13D, Sol 9A, Sol MII y Sol CA13, en las pruebas
efectuadas con puestas reales, la asignación fue del 100%. Además, para validar
la idoneidad y fiabilidad de la herramienta los autores efectúan una serie de
simulaciones y predicciones teóricas con las que obtienen unos valores entre
98% y 90% de asignación. Sin embargo, a pesar de que los autores describen las
condiciones para efectuar la amplificación en multiplex, no conseguimos repetir
sus resultados en el laboratorio y decidimos testar cada microsatélite por
separado.
34
Con nuestra herramienta asignamos los individuos a los parentales con más de
un 98% de fiabilidad y utilizamos un marcador microsatélite menos que Porta et
al. (2006) lo que abarata los costes de asignación.
3.5. Entonces, ¿Quiénes son los padres?
Una vez aplicada la herramienta y según los datos de que disponemos con
respecto a los parentales, los análisis efectuados con los dos programas de
asignación disponibles nos indican que ambos parentales pertenecen a la
generación F1.
La trazabilidad de los individuos es muy importante en este tipo de trabajos pues
cualquier error en la identificación de los mismos podría dar como resultado una
asignación errónea. Las consecuencias de una mala asignación pueden ser
desastrosas si esa información se utiliza para la fundación de nuevos stocks.
En nuestro caso, todos los individuos parentales están marcados con un chip con
un código numérico. Este chip se implantó en los individuos previamente a la
utilización de los mismos en la fundación de los dos tanques que constituyen el
experimento. Asociados a ese código se mantienen actualizados los datos de
origen, sexo y otras características biológicas. En el momento de la toma de
muestras, se extrae un trozo de aleta caudal que se conserva en alcohol y se
guarda con el mismo código del chip del individuo para permitir la trazabilidad.
Por tanto, atendiendo a la información de los códigos de los reproductores, los
datos genéticos obtenidos en el presente trabajo nos indican que ambos
parentales pertenecen a la generación F1. Siendo este el primer caso en el que
de manera espontánea se obtiene una puesta F2 en cautividad.
35
CONCLUSIONES
ü La selección de marcadores es de vital importancia para que la asignación
sea correcta y fiable.
ü Con nuestra herramienta reducimos el número de marcadores con
respecto a Porta et al. (2006) y obtuvimos una herramienta fiable y más
económica.
ü La eliminación de marcadores obtenidos para otras especies disminuye la
probabilidad de error y aumenta la probabilidad de asignación.
ü Se ha podido demostrar que por primera vez se han obtenido larvas F2 de
Solea senegalensis, como resultado de la mezcla en el mismo tanque de
individuos salvajes e individuos pertenecientes a la generación F1.
ü Estos nuevos datos acerca del lenguado senegalés pueden ayudar en la
optimización de su cultivo.
36
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