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Espectrometría de masas
Por que se considera una técnica
confirmatoria?
Espectrometría de masas
Técnicas de ionización
Ionización electrónica
Ionización química
Bombardeo de átomos y espectrometría de masas
iónica
Ionización a presión atmosférica
Electroespray
Desorción de matriz asistida por láser
Analizador de masas
Cuadrupolo
Sector magnético
Tiempo de vuelo
Trampa de iones
Sector eléctrico (c/doble foco)
Que hace un espectrómetro de
masas?
Método instrumental destructivo
Método analítico altamente sensible (pg/mL
fg/mL)
Es una balanza a nivel nanomolecular
Ioniza, separa y detecta los iones producidos
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Ionización electrónica
Útil para moléculas en fase gaseosa
Produce espectros reproducibles comparables
incluso con librerías de espectros
Los espectros entregan información estructural,
para interpretación de espectros desconocidos.
En algunas ocasiones el ion molecular es de muy
baja abundancia.
Se produce una doble proceso: ionización y
fragmentación
La nube de electrones generadas es acelerada
por un campo eléctrico. El impacto del analito con
esta nube remueve un electrón de la capa mas
externa del analito produciendo el catión radical
(M+.)
Ionización electrónica
La energía aplicada (70eV)
es lo suficientemente alta
para producir la ionización y
fragmentación.
Solo se necesitan 10 eV
para la ionización y 3 eV por
cada enlace químico.
Sistema que funciona a un
alto vacío (10-3-10-6 torr)
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Ionización química
Técnica de ionización suave, produce iones con poco
exceso de energía, por lo tanto con poca fragmentación.
Es una técnica complementaria a la IE, utilizada
principalmente para verificar la masa molecular de un
compuesto desconocido.
Se utiliza un gas de reacción de bajo peso moleclar
para generar la ionización del analito
(metano,
isobutano, amoníaco) el cual previamente es ionizado
por una nube de electrones (200 eV).
El gas de reacción ionizado donara un protón al
analito y generara un ion MH+.
Se pueden producir moléculas con carga + ó –
dependiendo del gas utilizado.
Ionización química
•
IE del gas de reacción para formar iones:
CH4+. + 2eCH4 + e•
reacción de los iones del gas para formas aductos:
CH4+. + CH4
CH3. + CH5+
Ó
CH3+ + H.
CH4+.
CH3+ + CH4
C2H5+ + H2
•
reacción de los iones del gas con moléculas del analito
CH4 + MH+
CH5+ + M
C2H5+ + M
C2H4 + MH+
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Bombardeo atómico y espectrometría de
masa iónica
Ambas utilizan átomos de alta energía para
bombardear e ionizar la muestra en un único paso (Cs+).
Es útil para muestras liquidas o sólidas de alta peso
molecular (analitos termolábiles con peso molecular
hasta 4000-5000 Da) .
El analito que se encuentra en una matriz líquida o
sólida es introducida a la fuente mediante una sonda y
bombardeada
(glicerol,
alcohol
nitrobenzilico,
trietanolamina, polietilenglicoles) .
Bombardeo atómico y espectrometría de
masa iónica
Electroespray
Se utiliza en analitos de alto peso molecular y termo lábiles
y/o no volátiles (péptidos, proteínas y polímeros), moléculas de
hasta 230 kDa.
También es útil en analitos de bajo PM (MS/MS)
La mas utilizada fuente de iones en la CL/EM
La muestra en forma iónica es convertida en un aerosol y
sometida a un alto voltaje dentro de una cámara a Patm
Al introducir un líquido a un sistema de baja presión este
tiende a congelarse, por lo cual disminuiría la sensibilidad de la
técnica.
Para evaporar el solvente acuoso se utiliza un gas (N 2) .
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Electroespray
La ionización se produce por una aplicación de un
gran potencial entre la salida de la aguja y el paso hacia
el analizador .
La teoría mas aceptada en la actualidad para explicar
este proceso es que el liquido al salir de la aguja entra
en un campo eléctrico, que induce la formación de
cargas en la gota. Al evaporarse el solvente la gota se
contrae y la densidad de carga en la superficie aumenta.
La gota alcanza un punto en que la repulsión de
cargas es mayor a la tensión superficial y la gota explota
produciendo iones con diferente carga (explosión
“Coulombica”).
Electroespray
La información que entrega es acerca de su
PM, solo se obtienen datos cuando se acopla a un
sistema MS/MS.
Desventajas:
efecto matriz: puede provocar ionizaciones no
deseadas, afectando la abundancia relativa de los iones.
Formación de aductos con componentes de la fase
móvil (Na+, K+, NH4+) aumenta los m/z de los fragmentos
producidos.
Una pequeña energía adicional es impartida a los
iones en la fuente ESI y por lo tanto la fragmentación
que se produce es mínima
Electroespray
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Ionización química a presión atmosférica
Similar a la técnica de electrospray , pero con menor rango
de masas (50-1000 Da).
Se crea un plasma en una aguja de descarga, en este plasma
se transfiere un H+ al analito y se fragmenta.
Tiene menos efecto de matriz que la ESI.
Ionización química a presión atmosférica
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Desorción de matriz asistida por láser
Se utiliza principalmente para grandes moléculas
(polímeros, péptidos , proteínas, etc.) hasta 200 kDa.
Esta técnica ioniza y vaporiza el analito directamente
desde una fase condensada.
Un único pulso de láser (N2 λ=337 nm) produce la
desorción del analito desde la matriz y posterior
ionización.
La matriz debe ser capaz de absorber el láser a la
longitud de onda a la cual este se emite.
El analito junto a la matriz escogida de colocan en la
punta de una sonda y se introducen en un sistema al
vacío, para ser bombardeada por un láser.
Desorción de matriz asistida por láser
Analizadores de masas
Resolución: capacidad de separación de 2 iones,
donde R=∆m/m.
Rango de masas: es el valor de m/z mas alto
transmitido por el espectrómetro.
Velocidad de barrido: es la velocidad con que se barre
un espectro de masas . Debe ser en teoría mas rápido
que la elución de los analitos desde la columna.
Eficiencia de la transmisión: cuantos de los iones
producidos en la fuente llegan al detector.
Limite de detección: capacidad de detectar la menor
cantidad de analito con precisión y exactitud.
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Cuadrupolo
Es el mas utilizado, de tamaño compacto, rápida
velocidad de barrido, alta eficiencia de transmisión,
poco requerimiento de vacío 10-3 a 10-5 torr)
Resolución de una unidad m/z .
Rango de masas: 1000 m/z
El analizador consta de 4 barras o electrodos que
filtran los iones de acuerdo a su relación m/z. El valor
filtrado es determinado por la RF y el voltaje de la
corriente directa aplicado a los electrodos.
Cuadrupolo
El movimiento de iones dependerá de la aplicación de los
campos electromagnéticos y eléctricos aplicados
a = 8zU / mr2ω2
q = 4zV / mr2ω2
a/q = 2U/V= cte
m/z = 8U/ar2ω2
m/z = 4V / qr2ω2
m/z = kU o k´V
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Sector magnético
Son los de mayor resolución (0.0001 m/z)
Amplio rango de masas (5000 m/z – 30000 m/z)
Velocidad de barrido menor que un cuadrupolo
Necesitan un alto vacío para trabajar
Los instrumentos de sector magnético separan los
iones dentro de un sector magnético por su momentum
y carga iónica.
Los iones son acelerados al igual que otros
analizadores por campos eléctricos, pero en este caso
de mucho mayor intensidad (1 -10 kV).
El campo magnético es capaz de curvar la trayectoria
de la nube de iones dependiendo del momentum del ion
(µ).
Sector magnético
Cada valor de m/z tendrá su respectivo r, que será
único para el campo magnético y el voltaje de
aceleración dado
(r = µ/ C × B)
C = z×e y µ = m×v
r = (m/z × v)/(B × e)
m/z = (r2B2e)/2V
Para detectar iones a diferentes radios los equipos
actuales utilizan arreglos de diodos de multicanal para
detectar simultáneamente iones en un amplio rango de
valores m/z.
Sector magnético
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Otra forma utilizada para medir los valores m/z es
mantener constante el potencial eléctrico aplicado y el radio
por el cual viajan los iones y variar el rango de B para que
los iones con valores m/z cercanos alcancen el valor
apropiado de r.
En
este
caso
electromultiplicador
el
detector
utilizado
es
un
Manteniendo cte los valores de B y r, y variar el potencial
V aplicado, se tienen problemas con la estabilidad y la
velocidad de escaneo de analizador.
Espectrómetro de masas de doble enfoque /
sector eléctrico
Consiste en dos platos curvos concéntricos, a los
cuales se aplica un voltaje que curva la nube iónica.
El radio de la trayectoria depende de la energía
cinética del ion y del potencial aplicado (r = 2V/E).
El radio es independiente de m/z, por lo cual un
sector eléctrico no es útil como un analizador de
masas independiente.
Se acopla a un sector magnético, mejorando la
resolución del sistema , por la reducción en la
distribución de la energía cinética de los iones.
Espectrómetro de masas de doble enfoque /
sector eléctrico
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Tiempo de vuelo
Es capaz de separar los iones generados en el tiempo
mientras ellos viajen en un tubo de vuelo (2m).
Es un espectrómetro simple que no requiere campos
magnéticos y trabaja a un voltaje fijo.
Tienen una baja resolución menor a 500.
Alta eficiencia en la transmisión
Rápida velocidad de barrido
Alto limite de rango de masas (500 kDa).
Bajos límites de detección
Tiempo de vuelo
Los iones son acelerados por campos eléctricos de
alta intensidad (2-25 kV), aplicados entre el plato de
apoyo y la grilla de aceleración.
Como todos los iones son acelerados en la misma
distancia, por la misma fuerza, todos tendrán la
misma energía cinética.
EC = ½ mv2
por lo cual los iones mas ligeros viajaran mas rápido.
La Ep es determinada por el voltaje aplicado y la
carga del ion
v = √(2V×e)/(m/z)
t= (L/√(2V×e))× √m/z
Tiempo de vuelo
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Trampa de iones
Alta sensibilidad
Bajo costo
Rápida velocidad de escaneo
Alta relación señal-ruido
La trampa de iones consta de un electrodo circular
con forma de rosca y 2 electrodos en los extremos.
Una combinación de RF y voltajes es aplicado a los
electrodos para crear un campo electromagnético
semejante al de un cuadrupolo.
Los iones con cierta energía potencial son atrapados
en el centro de la trampa.
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Triple cuadrupolo
Por que utilizar técnicas MS/MS?
Mayor Selectividad
Paso de aislación
Paso de disociación
Menores límites de detección
Solo permanecen en la trampa los iones que necesito
Mejor calidad de los espectros
Reducción del ruido
Menor limpieza de las muestras
Información estructural complementaria
Pasos en un proceso MS/MS
Ionización del analito (IE o IQ)
Aislación del ion padre
semejante a un SIM
Disociación del ion padre
disociación inducida por colisión (CID)-colisión con átomos de H
el usuario determina experimentalmente la energía de colisión
Análisis masa de los iones hijos
igual proceso que un SCAN
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Colisión inducida por disociación en trampa
iónica
El gas de colisión siempre es el gas transportador (He)
Las ondas aplicadas (resonante o no-resonante) a los
electrodos de los extremos desplazan los iones
almacenados desde el centro de la trampa hacia los
extremos (campo eléctrico).
El oscilamiento de los iones entre los extremos permite
su colisión con los átomos de He.
Cuando las colisiones alcanzan un nivel energético
suficiente la disociación ocurre y se forman los iones
hijos.
DIC modo no resonante
Es una onda cuadrada de 500 Hz que es aplicada a los
electrodos extremos.
La amplitud varia entre 0 y 100 V.
Los iones almacenados se mueven hacia los electrodos
cargados negativamente.
La energía de colisiones con el He es controlada por la
amplitud de la onda.
DIC modo resonante
Es una onda de alta frecuencia (~ 20 KHz) aplicada a los
electrodos extremos.
Se necesitan menores voltajes (< 1.0 V)
Es mas selectiva que la onda no resonante.
Solo el ion padre en resonancia con la onda aplicada es
excitado y disociado.
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