Diagnostico de Parásitos Sanguineos. Protozoarios y Filarias

PRACTICA #16
DIAGNOSTICO DE PARASITOS SANGUINEOS
Protozoarios y filarias
OBJETIVO DE LA PRACTICA
Conocer los protozoarios y helmintos que pueden detectarse en especimenes
de sangre, aprender a preparar frotes sanguíneos delgados y gruesos para
estudios parasitológicos,
INTRODUCCCION
La prueba confirmativa para diagnóstico de parásitos sanguíneos es efectuada
mediante el examen de preparaciones de frotis sanguíneos. para buscar su
presencia. Sin embargo, debe considerarse que la observación de los frotis
consume mucho tiempo, ya que los parásitos pueden estar presentes en la
sangre periférica en número muy pequeño. La presencia de un solo parásito en
un frotis es significativo y debe identificarse la especie, enseguida. Se requiere
un examen muy cuidadoso de los frotis sanguíneos antes de reportar el estudio
como negativo para parásitos. Por tal motivo es necesario adquirir experiencia
para un examen acertado de frotis sanguíneos, en el diagnóstico de parásitos.
Con frecuencia las plaquetas sobre los eritrocitos pueden ser confundidas
erróneamente como parásitos, por lo que cualquier cosa sospechosa debe
confirmarse.
Los protozoarios parásitos sanguíneos posibles de observar en frotis sanguineos
son Plasmodium y Trypanosoma. Las especies de aschelmintos sanguíneas son
las Filarias, como Onchocerca volvulus.
Trypanosoma se puede diagnosticar por cultivo en sangre y pruebas serológicas.
MATERIALES Y METODOS.
Diagnóstico de Trypanosoma cruzi, Plasmodium y
Onchocercavolvulus.
I. Diferentes tipos de frotes sanguineos.
1. Observación de sangre en fresco.
Aunque el examen microscópico de sangre fresca no es una técnica rutinaria, es
muy útil en la detección de Plasmodium, Trypanosoma y microfilarias, los cuales
pueden ser reconocidos por sus características de movilidad en sangre fresca.
Se coloca una pequeña gota de sangre en un portaobjetos cubierto con un
cubreobjetos. Enseguida se observa al microscopio a baja amplificación,
pudiendo observarse un movimiento como circular de las microfilarias, y uno
ondulatorio de los trypanosomas.
2. Frote Sanguíneo Delgado.
Los frotes delgados de sangre se desarrollan en la misma forma que los frotes
hechos para estudios de hematología. Este tipo de preparaciones son utilizadas
para la identificación de Plasmodium, Trypanosoma y microfilarias. Es
esencial que la película de sangre que quede en el portaobjetos, sea
verdaderamente delgada. La ventaja del frote delgado es que preserva la
estructura del parasito con un mínimo de distorsión.
3. Frote sanguíneo grueso
El frote grueso es preferido con respecto al delgado, para el diagnóstico de
Plasmodium, ya que revela al parásito mas rápidamente, debido a que permite
examinar de 10 a 50 veces mayor cantidad de sangre, que en un frotis
delgado. Este tipo de frotis es más efectivo en los casos de infecciones nuevas o
crónicas por Plasmodium, cuando los parásitos no son abundantes.
3.1. Coloque una gota grande de sangre conteniendo Plasmodium, a un cm de
la orilla del portaobjetos limpio y desengrasado. Use la esquina de otro
portaobjetos y con un movimiento circular extienda la sangre en una gran gota
durante cerca de 20 min, con el fin de desfibrinarla.
3.2. Pueden quedar una o mas gotas en el mismo portaobjetos. Se deja secar a
temperatura ambiente y posteriormente se colorea. Las muestras de sangre
deben tomarse a intervalos de 6 a 18 horas durante tres dias sucesivos.
4. Tinción de los frotes:
Generalmente se usan dos tipos de tinción:
a. Tinción de Wright : contiene una combinación de fijador y colorante.
b. Tinción de Giemsa: contiene por separado el fijador y el colorante.
Interpretación de los frotes de Plasmodium:
El frote grueso es usado para detectar la presencia del genero Plasmodium. El
frote delgado es usado para identificar la especie del Plasmodium. Se debe
examinar un mínimo de 100 campos microscópicos antes de que un frote sea
reportado como negativo.
II. Identificación de de T. cruzi a partir de sangre de animales
reservorios, en frote sanguíneo:
1. Se capturan animales silvestres (ej: mapaches, opossums, woodrats,
armadillos, y pequeños roedores) y se anestesian por inyección
intramuscular de xylazina (0.25 mg/kg de peso corporal) mezclado con cloruro
de cetamina (25 mg/kg).
2. Se obtiene sangre del animal por punción cardiaca, o a partir de la vena
femoral, colocando la sangre en un tubo Vacutainer® heparinizado.
3. Para el cultivo, se inocula 1 ml de sangre en 9 ml de medio InfusiónTryptosa-Higado (LIT medio) para permitir el crecimiento de cualquier
trypanosoma presente.
4. Se tiñe un frote delgado de cada animal con Giemsa y se examina al
microscopio para buscar Trypanosoma.
5. El plasma separado de la sangre se guarda a -80° C para pruebas
serológicas.
III. Identificación de de T. cruzi por Inmunodiagnostico:
1. Se prepara antígeno de cultivo de epimastigotes de 11-días de una cepa
Brazil cultivada en medio Infusión- Tryptosa-Higado (LIT). Los Epimastigotes se
lavan tres veces con buffer de fosfatos salino (PBS) y se resuspenden en formol
al 1% en PBS. El antígeno se coloca en los círculos de portaobjetos de prueba
comercial y se secan a 50° C por 30 minutos. Los portaobjetos se almacenan en
un desecador con CaCl2 a -4° C no mas de 1 mes, para pruebas serológicas.
2. Prueba indirecta de anticuerpos inmunofluorescentes (IFAT): El
metodo IFAT y la prueba de ELISA son conocidos como muy
sensibles y especificos para diagnostico de infecciones con T. cruzi
3. Para la prueba de IFAT se utiliza un reactivo comercial a base de un
conjugado de IgG -fluoresceína anti-mapache. Se toman alicuotas de 150 ml y
se congelan a -80° C, diluyendo en solucion de Azul Evans 0.1% antes de
usarse. El azul de Evans tine los epimastigotes de color rojo, que observados
al microscopio de fluorescencia, se ven fluorescentes, usando un iluminador
50W Hg (488 nm excitacion y un filtro 520 nm band-pass filter). Las
concentraciones optimas de suero (1:40) y de conjugado (1:10) se obtienen
por titulación, usando un suero control positivo de mapache y un control
negativo.
4. Otras pruebas inmunodiagnósticas son: Prueba de fijación del complemento,
haemaglutinación indirecta y ELISA inmunoensayo unido a una enzima
IV. Diagnóstico de Plasmodium por frote sanguineo:
1.Se puede utilizar la sangre de ratones silvestres. Para obtener sangre de la
cola, se limpia con solución yodada el extremo de la cola y se hace un corte en
la punta, recogiendo la sangre con un portaobjetos y haga un frote, practicando
el metodo de la gota gruesa.
2. Tiña la preparación con Giemsa y observe al microscopio a 10 X para buscar
eritrocitos parasitados.
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFIA
DPDx Diagnostic procedures for blood specimens. 2001. Malaria Plasmodium
falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax.
Michael J. Yabsley, Gayle Pittman Noblet, and Oscar J. Pung. 1999. Use of the
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Trypanosoma cruzi Infections in Raccoons from Georgia. Department of
Biological Sciences, Clemson University, Clemson, South Carolina 29634-0326
USA (Yabsley and Noblet) and Department of Biology and Institute for
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Georgia 30460-8042 USA (Pung).
http://www.vet.uga.edu/ivcvm/1999/yabsley/yabsley.htm