INFORME FINAL PROYECTO FONDECYT REGULAR

4*
INFORME FINAL
GOBIERNO DE CHILE
PROYECTO FONDECYT REGULAR
FONDECVT
105963912005
3
2007
NÚMERO PROYECTO
DURACIÓN
AÑO DE EJECUCIÓN
JUAN KRLIZE VIRTONICH
RUT
INVESTIGADOR(A) RESPONSABLE
INSTITUTO DE MICROBIOLOGÍA, FACULTAD DE CIENCIAS,
UNIVERSIDAD AUSTRAL DF. CHILE, CASILLA 167, VALDIVIA
DIRECCION
(63) 221296
(63) 221675
-
FONO
jkruze(i?uach.cI
E-mail
1
PERÍODO QUE INFORMA
1510312008
16/03/2007
HASTA
DESDE
CONTENIDO
(MARQUE CON UNA X EL CASILLERO QUE CORRESPONDA)
NO INCLUYE
INCLUYE
Formulario de Informe Final
X
Publicaciones
X
Resumen de Tesis Título/Grado
X
Información acerca de inventos y patentes
X
Otros (especificar)
X
Informe Incentivo Coop. Internacional (Si corresponde)
Firma Coinvestigadores(as)
Ángara Zambrano A. X
Firma Investigador(a) Responsable
rs
Juan Kruze V.
Fecha:
1410312008
CONTENIDO DEL INFORME FINAL
I. CUMPLIMIENTO DE LOS OB)ETIVOS PLANTEADOS EN EL PROYECTO.
Marque con una X el casillero correspondiente.
CunTpiiniento
No
L Parcial
Objetivos
Map
1. Crear un patrón proteico para
necesario para evaluar
relevancia
antígenos
de
diagnóstica.
X
2. Ensayar las proteínas obtenidas
con sueros de animales infectados
y animales libre de infección para
la identificación de las proteínas
directamente relacionadas con la
especificidad
sensibilidad
y
diagnóstica.
X
3. Producir un preparado proteico
semi-purificado para ser usado
como antígeno-Map de fase sólida
y, si es necesario, antígenos para
la absorción de reacciones
cruzadas.
x
4. Emplear estas proteínas en una
prueba de ELISA y validar su
comportamiento usando un panel de 1000 sueros bovinos con
estatus conocido de infección bien
conocido.
x
S. Evaluar la nueva prueba de
ELISA con muestras de leche en
un rebaño con estatus conocido
de infección.
L
Fundamentar
el cumplimiento
parcial oincumplimiento
Se alcanzó a preparar las placas
de ELISA con los antígenos de
Map, los conjugados marcados, y
las soluciones correspondientes.
Se estaban ensayando los sueros
controles positivos y negativos
cuando ocurrió el incendio que
material
todo
el
destruyó
-biológico.
Se alcanzó a recolectar las
muestras de suero y leche de 650
animales de un rebaño infectado y
se estaban ensayando las
muestras con la nueva prueba de
ELISA cuando se produjo el
incendio que afectó a nuestro
laboratorio, perdiéndose todo el
material biológico y los resultados
jparciales (Tesista:S.Gallardo).
Otro(s) aspecto(s) que Ud. considere importante(s) en la evaluación del cumplimiento de los objetivos
planteados en la propuesta original o en las modificaciones autorizadas por los Consejos.
El proyecto se encontraba en su etapa final de tvb6n con un 95% de avance cuando ocurrió el
siniestro la madrugada del 3 de diciembre 2007 que destruyó completamente el edificio principal
de la Facultad de Ciencias donde funcionaba el Instituto de Microbiología, Unidad Ejecutora del
Proyecto. Como consecuencia del incendio se perdió, además del equipamiento e insumos, la
totalidad del material biológico obtenido en las etapas previas de ejecución y gran parte de la
información almacenada en los diferentes equipos computacionales del grupo de trabajo. Como
consecuencia, no fue posible cumplir todos los objetivos del proyecto y, dado el estado de avance,
se decidió poner término al proyecto con los re.stdos obtenidos hasta la fecha.
Este siniestro afectó, además, a los tesistas participantes en el proyecto. Uno de ellos (Sergio
Gallardo), se encontraba en plena actividad relacionada con el último objetivo del proyecto y
perdió todo el material y resultados parciales por lo cual se debió anular la tesis. Otros dos
tesistas, Mónica Pradenas (Doctorado) y Nancy Hernández (Bioquímico) habían finalizado la parte
experimental de sus tesis y estaban comprometidas a entregar sus manuscritos para ser
sometidos a evaluación y rendir examen de grado antes del 31 de diciembre 2007. Sin embargo, la
pérdida de información retrasó esta actividad y no alcanzaron a graduarse/titularse aunque
terminaron de reconstruir sus manuscritos que se encuentran en etapa de evaluación.
II. RESULTADOS OBTENIDOS
Describa brevemente los resultados obtenidos en el proyecto en un máximo de cinco páginas, tamaño
carta, espacio seguido. Para cada uno de los objetivos específicos, describa o resuma los resultados.
Relacione las publicaciones y/o manuscritos enviados a publicación con los objetivos específicos. Incluya en
anexos, la información de apoyo que estime pertinente y necesaria para la evaluación.
----- - ------ * -----------Objetivo 1. Crear un patrón proteico para Map necesario para evaluar antígenos de relevancia en
inmunodía gnóstico.
De acuerdo a la metodología propuesta, se seleccionaron cepas de Map aisladas de casos clínicos,
las que fueron cultivadas en medio sólido, y posteriormente fueron subcultivadas en medios
líquidos. Se seleccionaron cepas de campo y cepas controles, y se confeccionaron curvas de
crecimiento para así determinar la fase exponenciai en la cual se obtuvieron las proteínas de
secreción para su evaluación (Figura 1).
B
., -.
i:
11
*
:H7
Figura 1. Crecimiento de la cepa Map UACh-C)304 en medio 7H9-OADC (panel A), y medio
Watson Reíd (panel B). Curvas de crecimiento para cada medio en paneles b.
Los cultivos líquidos que se encontraban en fase exponencial fueron cosechados, centrifugados, el
sobrenadante filtrado y concentrado, para el posterior análisis de western blot de las proteínas
contenidas en éste. Es conocido que Map puede ser cultivado en una variedad de medios de
cultivos, los cuales influyen directamente en la expresión génica y con ello en la liberación de
proteínas en éstos. Para determinar qué medio de cultivo era el óptimo para la obtención de
proteínas inmunogénicas se utilizaron dos medios de cultivo para Map, el medio Watson Reid y el
medio Middlebrook 7H9-OADC. Map fue cultivado en ambos medios y se recolectó medio de
cultivo para analizar la liberación de proteínas inmunogénicas durante distintos tiempos de
crecimiento. Se logró exitosamente obtener proteínas secretadas más temprana y eficientemente
en el medio líquido Watson Reid, el cual se utilizó para los ensayos posteriores (Figura 2).
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Sijei
111
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-
14
Figura 2. Análisis de western biot de las proteínas del filtrado celular de la cepa UACh-CM304
usando 3 sueros control positivos a diferentes tiempos de cosecha a partir de los medios 7H9OADC (panel A) y WR (panel B). Carril 1: 4 semanas, carril 2: 6 semanas, carril 3: 8 semanas,
carril 4: 10 semanas.
Los resultados obtenidos para el logro de este objetivo constituyen el cuerpo medular del
manuscrito "Comparison of two liquid culture media to detectect antigenic proteins secreted by
Mycobacerium avium subsp paratuberculosis" (Jara, MC, Pradenas, M, Hernández, N, Zambrano,
A, Collins, MT, Kruze, 3), enviada para su publicación a Ja revista BMC Microbiology
Objetivo 2. Ensayar las proteínas obtenidas con sueros de animales infectados con Map y de
animales libre de infección para la identificación de las proteínas directamente relacionadas con
la sensibilidad y especificidad diagnóstica.
Las proteínas de Map fueron analizadas con un gran número de sueros de animales infectados y
se pudo determinar que las proteínas secretadas al medio Watson Reid poseen una alta
inmunogenicidad comparado con las proteínas celulares de Map. Los patrones inmunogénicos
mostraron, además, una alta variabilidad dependiendo del suero utilizado de los distintos
animales y en relación principalmente al estadio de infección de los animales (Figura 3).
1
II
•-
-
4
L.1
I
-
Figura 3. Análisis de western biot de proteínas secretadas por la cepa UACh-CM304 de Map
cultivada en medio WR. En este caso se muestran los resultados de 14 sueros bovinos de casos
clínicos de paratuberculosis confirmados por cultivo y de los sueros controles. Se observa una
amplia variabilidad en los perfiles inmunoreactivos frente a sueros de animales con diferentes
estados de infección con Map. Carriles 1 a 6: casos clínicos y altos eliminadores, carriles 7 a 10:
suero de eliminadores medios, carriles 11 a 14: sueros de bajos eliminadores, carril 15: animal
control no infectado.
Para determinar la especificidad de las proteínas secretadas por Map y descartar la posibilidad de
reacciones cruzadas con otras micobacterias, se realizaron preadsorciones séricas con 5
micobacterias medioambientales (M. avium, M. phlei, M. terrae, M. scrofulaceum y M. smegmatis).
Los resultados mostraron que la inmunoreactividad de (as proteínas secretadas por Map no varió
después del proceso de preadsorción, sugiriendo que estas proteínas, serían además de
inmunogénicas, específicas y podrían ser semi-purificadas para ser utilizadas como antígenos de
fase sólida en una prueba de ELISA (Figura 4). Es interesante destacar que lo mismo se realizó
utilizando sueros de animales infectados en diferentes estadios de infección, en este caso se
utilizó para la preadsorción M.phlei (Figura 5).
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Figura 4: Análisis de western biot de proteínas secretadas de la cepa Map CM304-UACh
preadsorbida con micobacterias ambientales. Carril 1: suero sin preadsorber, carril 2: suero
preadsorbido con M. avium, carril 3: suero preadsorbido con M. phlei, carril 4: suero preadsorbido
con M. scrofu!aceum, carril 5: suero preadsorbdo ca la M. smegmatis.
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Figura 5: Análisis comparativo de la inmunoreactividad de las proteínas del filtrado celular antes y
después de la adsorción con M. phlei, usando suero de animales infectados con Map con
diferentes estatus de eliminación fecal de Map. Carril 1 sin pre-adsorción, carril 2: con preadsorción utilizando M. phlei.
Los resultados obtenidos en el logro de este objetivo constituyen la base del manuscrito titulado
"Antibody to secreted proteins of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in sera from
infected ruminants" (Pradenas, M, Jara, MC, Hernández, N, Zambrano, A, Collins, MC, Kruze, 1),
enviada para su publicación a la revista Veterinary Microbiology.
Objetivo 3. Producir un preparado proteico semi-purificado para ser usado como antígeno-Map de
fase sólida y, si es necesario, antígenos para la adsorción de reacciones cruzadas.
Para la semi-purificación de las proteínas de interés, se realizaron análisis bidimensionales, para
así determinar el peso molecular y el punto isoeléctrico (PI), antecedentes que nos permite
determinar la mejor manera de purificarlas. El patrón bidimensional resultante arrojó escasas
variaciones de acuerdo al punto isoeléctrico entre todas las proteínas inmunodetectadas (valores
entre 5 y 6); sin embargo, se pudo determinar que las proteínas de interés poseen pesos
moleculares en el rango de 20 a 50 kDa, por lo cual se determinó seguir trabajando sólo con el
patrón unidimensional para los siguientes ensayos. En consecuencia, después de haber
determinado el rango de inmunoreactividad y su variabilidad en los patrones de unión, se decidió
semi-purificar las proteínas de peso molecular inferior a 55 kDa las cuales fueron obtenidas por
centrifugación utilizando tubos centricon Plus 70 con un poro de corte de 60 kDa. Con esto se
logró un extracto semi-purificado con una concentración proteica de aproximadamente 2,0 ig/pil
(Figura 6). El antígeno fue titulado en placas de ELISA, determinándose 100 ng de antígeno como
cantidad a adherir en cada pocillo. Una vez preparados los pocillos se procedió a titular los sueros
y el conjugado a utilizar en la prueba de ELISA.
12
123
47
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26
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Figura 6: SDS-PAGE de proteínas secretadas por Map cepa UACh-CM304 cultivado en medio
líquido Watson Reid. Panel A, carril 2, proteínas secretadas sin semi-purificar; Panel B, carril 2:
proteínas semi-purificadas; carril 3: proteínas semi-purificadas y reconcentradas (el carril 1 de
ambos paneles muestra el marcador de peso molecular en kDa).
Objetivo 4. Emplear estas proteínas en una prueba de ELISA y validar su comportamiento (con y
sin adsorción sérica con antígenos de reacción cruzada) usando un panel de 1.000 sueros bovinos
con un esta tus de infección bien definido.
Al 3 de diciembre de 2007 (fecha del siniestro) se habían realizado ensayos de titulación con el
diseño en placa de ajedrez, donde se utilizaron 3 diluciones de suero (1:10, 1:20 y 1:50) y 4
diluciones del conjugado IgG anti-bovino conjugado a peroxidasa (1:5.000; 1:10.000; 1:15.000 y
1: 20.000). A la máxima dilución del suero y de( c,ctuado, se logró discriminar claramente entre
animales infectados (muy positivos +++), (positivos, ++) y negativos (no infectados), sugiriendo
que estas proteínas pueden ser buenos antígenos de fase sólida para un nuevo ELISA.
Lamentablemente, este objetivo no se pudo cumplir en su totalidad debido a que, a consecuencia
del incendio, se perdió el banco de sueros con estatus conocido de infección del Laboratorio de
Paratuberculosis del Instituto de Microbiología, junto con los sueros no infectados (provenientes
de toros del Centro de Inseminación Artificial de la UACh) con los que se realizarían los ensayos
estadísticos de validación. Además, también se perdieron más de 500 placas ya sensibilizadas
con el antígeno, y todos los reactivos necesarios para realizar los ELISA5, como son IgG antibovino conjugado a peroxidasa, Proteína G conjugada a peroxidasa, cromógeno (TMB), sales para
prepara bufferes de lavado, solución de detención y el lector automático de ELISA.
Por las razones antes expuesta, no será posible obtener una publicación científica válida con los
resultados parciales obtenidos hasta la fecha en relación a este objetivo.
Objetivo S. Evaluar la nueva prueba de ELISA
conocido de infección.
Cklff
muestras de leche en rebaños con estatus
Al igual que en el objetivo anterior, este objetivo no se pudo cumplir debido a la pérdida del
material biológico (placas de ELISA sensibilizadas y muestras de suero y leche) durante el
incendio. Para este objetivo se contaba con la colaboración de un alumno tesista de pre-grado
(Sergio Gallardo, Medicina Veterinaria), quien alcanzó a recolectar las muestras de suero y leche
de 650 animales de un rebaño infectado y estaban ensayando las muestras con la nueva prueba
de ELISA cuando se produjo el incendio. La pérdida total de los registros con los resultados
parciales tampoco permitirá obtener una publicación.
III. PRODUCTOS GENERADOS POR EL PROYECTO
En esta sección debe incluir todo documento o material cuyo contenido corresponda substancialmente a los
objetivos del proyecto que se informa y en los que se indique el M° del proyecto FONDECYT. Aténgase a los
formatos que se incluyen para cada tipo de producto generado. Adjunte copia de los documentos no
enviados previamente a EONDECYT. Utilice las hojas adicionales que sean necesarias.
Si Ud. tiene un proyecto de Incentivo a la Cooperación Internacional, destaque con (*) las
publicaciones generadas como producto del mismo a continuación de las que corresponden al
Reaular
1. Artículos en revistas científicas nacionales o extranjeras con Comité Editorial.
1
Marque con una "X" lo que corresponda. Para trabajos En Prensa/ Aceptados/ Enviados adjunte copia
de carta de aceptación o de envío.
Autor(a)(es/as)
Título (Idioma Original) rnbre Completo de1
Revista.
Jara, M.C.; Pradenas, M.; Hernández, N.; Zambrano, A.; Collins, M.T.;
Kruze, 1.
Comparison of two liquid culture media to detect antigenic proteins
secreted by Mycobacteríum avlum subsp. paratuberculoslS.
ir.1c Microbiology
(se adjunta carta recepción)
O En preparación
J1 Enviada
- Pág.
Año; 2008 Vol.
Ref. bibliográfica
Estado de la publicación a O Publicada
O Aceptada
la fecha.*
¡En Prensa
Otras fuentes de
financiamiento, si las hay_
Autor(a)(es/as)
Título (Idioma Original)
Nombre
Revista.
Ref. bibliográfica
Estado de la publicac
la fecha.*
Otras fuentes de
financiamiento, si las
L1
_____
Pradenas, M.; Jara, M.C.; Hernández, N.; Zambrano, A.; Collins, M.T.;
Kruze,_3.
Antibody to secreted proteins of Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosís (n sera from Infected ruminants.
Veterinary Microbiology
Año; 2008 Vol
a
Publicada
¡En Prensa
J[]
Pág
N°
El Aceptada
(se adjunta carta recepción)
O En preparación
Enviada
Autor(a)(es/as)
Fry, M.P.; Kruze, .J.; Collins, M.T. (*)
Título (Idioma Original)
Evaluation of four commercial enzyme-linked immunosorbent assayi
for the diagnosis of bovine paratuberculosis in ChOcan dairy herds.
Journal of Veterinary Diagnostic Investigation
Nombre Completo de la
Revista.
Año: 2008 Vol. 20 N° 3 Pág. Pp (se adjunta prueba de galera)
Ref. bibliográfica
O En preparación
Estado de la publicación a
O Enviada
flAceptada Publicada ¡En
la fecha . *
1-1
- Prensa
Otras fuentes de
financiamiento, si las hay
Autor(a)(es/as)
Salgado, M.; Kruze, 3.; Collins, M.T.
Título (Idioma Original)
Diagnosis of paratuberculosis by fecal culture and ELISA on milk and
serum samples in two types of Chilean dairy goats herds.
Journal of Veterinary Dlagnostic Investigation
Nibre Completo dé1
Revista.
Pág. 99-102 (se adjunta abstract)
Año: 2007 Vol. 19 N° 1
E En preparación
E Enviada
a
EjAceptada
P
Prensa
Instituto de Microbiología, Facultad de Ciencias, UACh
Ref. bibliográfica
Estado de la publicad
la fecha.*
Otras fuentes de
financiamiento, si las
Autor(a)(es/as)
Título (Idioma Original)
Kruze, 3.; Salgado, M.; Collins, M.T.
nbre Compleo de la
Revista.
Paratuberculosis en rebaños caprinos chilenos,
Archivos de Medicina Veterinaria
Año: 2007 Vol. 39 N° 2 Pág. 147-152 (se adjunta abstract)
Ref. bibliográfica
E En preparación
E Enviada
Estado de la publicación a
LlAceptada
Publicada ¡En
la fecha.
Prensa
Otras fuentes—
de
—
financiamiento, si las hay
ZI
Autor(a)(es/as)
fSaladoM.; Herthnek, D.; Bólske, G.; Leiva, S.; Kruze,).
Título (Idioma Original) 1 First isolation of Mycobacterium paratuberculosis from wild guanacos
(Lama guanicoe) in Tierra del Fuego Island.
-
Nfíbre Completo de la Journal of Wildlife Diseases
Revista.
Año: - Vol. -
Ref. bibliográfica
Estado de la publicación a 9Publicada ¡En la fecha.*
Prensa
Otras fuentes de
financiamiento, si las hay
- Pág. (se adjunta abstract y carta recepción)
E En preparación
X Enviada
flAceptada
T
2. Otras publicaciones/productos.
Autor(a)(es/as)
-
Título (Idioma Original)
Tipo de publicación o
producto
Marque con una 'X' lo que
corresponda
Kruze 1.; Salgado, M.
Pasado, presente luturo de la paratuberculosis en Chile. En:
Efecto de la intensificación de sistemas ganaderos pastoriles.
Aspectos técnicos, Ambientales y Sanitarios. Serie Simposios y
Compendios, SOCFIIPA.
Seminario ¡Taller ¡Curso
ri Monografía
Informe Técnico
Fl Libro
LI Software
n Capítulo de Libro
El Patente
Mapa
[J Exposición de Arte
Otro. Especificar: Simposio
Editor(es) (Libros o Capítulos D.PinoChet. Sociedad Chilena de Producción Animal A.G. Vol. 13.
de Libros)
pp. 93-104.
Nombre de la Editoriat/ Organización
Sociedad Chilena de Producción Animal (SOCHIPA)
Lugar y Fecha de Publicación País: Chile
Ciudad: Frutillar
Fecha: 14 Diciembre 2007
Iw
2. Presentaciones a Congresos Nacionales e Internacionales. Adjunte copia del resumen o
texto de la ponencia y de la tapa de/libro de Resúmenes, si no la ha enviado previamente.
Autor(a)(es/as)
Pradenas, M.; Jara, M.C.; lambTano, A.; Kruze, 3.; Collins, M.T.
Título (Idioma
Original)
Antigenicity study of secreted proteins of Mycobacterium avíum subsp.
paratuberculosis (Map) isolated from dairy herds in southern Chile.
Nombre del Congreso 9th International Colloquium on Paratuberculosis
Ciudad: Tsukuba
IFecha: 29 oct. - 2 nov.
2007
Lugar y Fecha
País: Japón
Autor(a)(es/as)
Kruze, 3.; Fry, M.P.; Salgado, M.A.; Mella, A.; Collins, M.T.
Título (Idioma
Original)
Evaluation of tour commercial ELISA kits for the diagnosis of bovine
paratuberculosis in dairy llierds of southern Chile.
Nombre del Congreso 1 9ffi
Lugar y Fecha
País: Japón
Colloqulum on Paratuberculosis
Fecha: 29oct. - 2 nov.
TCiudad: Tsukubaj
27
7s)
Título (Idioma
Original)
Nombre del Congreso
Kruze, J.; Salgado, M; &aciulÍa, X.
-
Evaluation of tour commercial bovine-ELISA kits for the diagnosis of
paratubercu(osis in dairy goats.
International Cofloquium oriParatuberculosis --
Ciudad:
Tsukuba
ui
- 1 Fecha: 29oct. - 2 nov.
Lugar y Fecha
Pa: Japón
Autor(a)(es/as)
Salgado, M.; Herthnek, O.; Bólske, G.; Kruze, 3.
Isolation and molecular confirmation of Mycobacterium avium subsp.
paratubercui!osis in guanacos (Lama guanicoe) in Tierra del Fuego, Chile,
bv, fecal culture and Real-Time PCR.
Nombre del Congreso 9 International Colloquium on Paratuberculosis
Título (Idioma
Original)
Ciudad: Tsukuba
Fecha: 29 oct. - 2 nov.
2007
Lugar y Fecha
País: Japón
Autor(a)(es/as)
Salgado, M.; Herthnek, D.; Kruze, 1; Pradenas, M.
Título (Idioma
Original)
Molecular typing of l4ycobacterium avium subsp. paratuberculosis strains
from dífferent Chilean domestic and wildlife animal hosts.
Nombre del Congreso gth InternatonaI CotIoqus
Lugar y Fecha
País: Japón
oi Paratuberculosis
Fecha: 29oct.- 2nov.
ICludad:Tsukuba
2007
Autor(a)(es/as)
[Paredes E.; Pradenas, M.; Kruze, 1; Jara, M.C.; Collins, M.T.
Pathological and bacteriological diagnosis of paratuberculosis in farmed
red deer (Cervus elaphus) ami tallow deer (Dama dama) in Chile.
Título (Idioma
Original)
Nombre del Congreso 9nternationalColloquiUm on Paratuberculosis
Ciudad: Tsukuba
Lugar y Fecha
País: Japón
Autor()(es/as)
SaIgado,M; Kruze, 1; Mella, A. JFecha: 29 oct. - 2 nov.
2007
-
Antecedentes preliminares sobre epidemiología molecular de
Título (Idioma
Mycobacterium paratubercufosis aislados de guanacos (Lama guanicoe)
Original)
-
-
en la Isla de Tierra del Fuego, Chile. Nombre del Congreso VIII Jornada Chilena de Buiatría
1
Lugar y Fecha
País: Chile
Ciudad: Frutillar
UM
Fecha: 14-16 nov. 2007
fo terminadas en el marco del proyecto. Adjunte
copia del resumen no informado anteriormente y certificación de aprobación, si corresponde.
4. Tesis y /0 Memorias en ejecución y
Título de la Tesi s
Obtención de proteínas secretadas de Mycobacteriumavium subspl
paratuberculosis para su posible uso como antígenos en pruebas
diagnósticas.
Nombre y Apellidos
del(deia)/delos(las)
Mónica Viviana Pradenas Ferreira
y Tutor(a)
GradoGrado Doctor en Ciencias Veterinarias
Titulo/
Institución Facultad,
Universidad Austral de Chile,
Departamento
Microbiologa
Lugar
País: Chile
Estado de Tesis
En Ejecución:
Facultad de Ciencias, Instituto de
Ciudad: Valdivia
Terminada:
X
Fecha de Inicio: Abril 2005 Fecha de Término: Diciembre 2007
Titulo de la Tesis
Nombre y Apellidos
del(de la)/de los(las)
Detección de proteínas inmunogénicas de Mycobacterium avium subsp
J paratuberculosis.
María Clara Jara Wilde
y Tutor(a)
Título! Grado Bioquímico
.
-
.
.
Institución, Facultad,
Universidad
Austral de Chile,
Facultad de Ciencias,
Instituto de
Departamento
Microbiología
Lugar
País: Chile
Estado de Tesis
En Ejecución:
Ciudad: Valdivia
- Terminada: X
Fecha de Inicio: agosto 2005 Fecha de Término: marzo 2007
Título de la Tesis
Nombre y Apellidos
del(de la)/de los(las) proteicos a partir de cepas chilenas de
1 PurificaciÓn de antígenos
subsp paratuberculosis.
Mycobacterlum avlum
Nancy Camila Hernández
Villegas
yTutor(a)
Título! Grado Bioquímico
___________________
.
.
Institución, Facultad,
-le,Austral
Facultad de Ciencias,
Universidad
deInstituto
Chide
Departamento
Microbiolog
Lugar
País: Chile
Estado de Tesis
En Ejecución:
1.
Ciudad: Valdivia
Terminada: X
Fecha de Inicio: agosto 2006 Fecha de Término: diciembre 2007 um
]
Título de la Tesis
Evaluación de cuatro kits comerciales de inmuno-enzimo ensayo
(ELISA) para el diagnóstico de paratuberculosis bovina.
Nombre y Apellidos
del(de la)/de los(las) Alumno(a)(os/as)
yjutor(a)
Título! Grado
Magíster en Ciencias M/Microbiología
Institución, Facultad, Departamento
Universidad Austral de Chile, Facultad de Ciencias, Instituto de
Microbiología
Lugar
País: Chile
Ciudad: Valdivia
Estado de Tesis
En Ejecución:
Terminada: X
María Paulina Fry Bravo
Fecha de Inicio: agosto 2006 Fecha de Término: octubre 2007
Título de la Tesis
__
Nombr e-y- Apellidos
del(de la)/de los(las) TEvaluación de una prueba de enzimo-inmuno ensayo (ELISA-UACh)
para el diagnóstico de paratuberculosis bovina con muestras de suero
yjçh—__
Sergio Eugenio Gallardo Valenzuela
Título! Grado
Medico Veterinario
Institución Facultad
Universidad Austral de Chile, Facultad de Ciencias, Instituto de
Departamento Microbiología -.---.------Ciudad: Valdivia
País: Chile
Lugar
.1.-
Estado de Tesis
__
Ejecución:
Terminada: X (suspendida)
Fecha
' de Inicio: octubre 2007 Fecha de Término: diciembre 2007
__..--.--.----.-..----.------- ---..-----.-.--.---.
IV. DESTAQUE OTROS LOGROS DEL PROYECTO TALES COMO:
•
Estadías de investigación.
• Formación de recursos humanos exceptuando tesistas ya informados.
• Actividades de difusión vio extensión en latemtca del proyecto.
• Cualquier otro logro no contemplado en los ítem anteriores y que Ud. quiera destacar.
1. En noviembre 2007 se dictó una conferencia sobre "Pasado, presente y futuro de (a
Paratuberculosis en Chile" en la Reunión Anual de la Sociedad Chilena de Producción
Animal, realizada en Frutillar en la cual se hizo una reseña de los trabajos realizados por
nuestro grupo de trabajo, particularmente nuestros dos proyectos FONDECYT, y el futuro
trabajo propuesto en el FONDECYT recientemente adjudicado (108506912008). El
objetivo de esta conferencia fue dar a conocer a la comunidad la importancia de la
enfermedad, su diagnóstico y control, y el aporte fundamental a estos logros realizado
por nuestro grupo de trabajo. (ver punto 111.2 Otras publicaciones/productos).
2. En enero 2008 se realizó en nuestro Instituto una reunión con autoridades del Servicio
Agrícola y Ganadero de Santiago y P.Montt para analizar y discutir una propuesta de
Certificación de Rebaños para ser aplicado a nivel nacional con el soporte técnico de
nuestro grupo de trabajo. En esta reunión tuvo vital participación el Dr M.T. Collins,
nuestro colaborador de la Universidad de Wisconsin-Madison, USA. (ver punto VI. Informe
Proyecto de Incentivo a la Cooperación Internacional).
3. El interés despertado en el medio ganadero de la zona por nuestros trabajos financiados
por FONDECYT nos ha impulsado a realizar, aprovechando nuestra infraestructura de
laboratorio, algunas investigaciones relacionadas con el diagnóstico de paratuberculosis
en otras especies animales, especialmente de vida silvestre, lo cual ha generado algunas
publicaciones científicas relacionadas con guanacos, ciervos y caprinos. (ver punto 111.1
Publicaciones/ productos). Para estas publicaciones hemos recibido la invaluable ayuda
del Prof. Dr M.T. Collins de la Universidad de Wisconsin (ver punto VI. Informe de
Proyecto de incentivo a la Cooperación Internacional).
y.
RESUMEN
Describa en forma precisa y breve el tópico general del proyecto, sus metas y objetivos y los resultados
alcanzados. Utilice un lenguaje apropiado para la comprensión del público no especialista en el tema.
Esta información podrá ser difundida. (No debe exceder este espacio en fuente Verdana 9)
La paratuberculosis bovina es una enfermedad de alta prevalencia en los rebaños lecheros en
la mayoría de los países y también en Chile, comprometiendo seriamente a la industria
lechera, debido a que produce una fuerte disminución de la producción, enflaquecimiento
progresivo de los animales infectados, eliminación prematura de vientres y, finalmente,
muerte de los animales afectados. El control de la enfermedad se basa en la detección y
eliminación del rebaño de los animales infectados, lo cual requiere de pruebas diagnósticas
rápidas, efectivas y de bajo costo para ser aplicadas en forma masiva. Dos son los métodos
diagnósticos más utilizados: el cultivo fecal para el aislamiento del agente causal y la
detección de anticuerpos anti-Map mediante pruebas serológicas (ELISA). El cultivo fecal es
de alto costo, laborioso, poco sensible y lento para entregar un resultado (16 semanas). La
prueba de ELISA, por el contrario, es de bajo costo, no requiere equipos sofisticados, es más
sensible que el cultivo fecal y permite obtener un resultado dentro de 24 h. Las actuales
pruebas diagnósticas de ELISA basadas en la detección de anticuerpos poseen baja
sensibilidad debido a que utilizan extractos proteicos crudos de células de Map como
antígenos de fase sólida. Además, es necesario realizar una etapa previa de pre-adsorción de
los sueros problema con extractos crudos de M.phlei con la finalidad de eliminar reacciones
cruzadas con otras micobacterias que producen resultados falsos positivos. Si bien este paso
aumenta la especificidad, hace disminuir la sensibilidad diagnóstica de la prueba.
El objetivo general del proyecto fue desarrollar una prueba de ELISA autóctona más específica
y más sensible que las actualmente existentes en el mercado utilizando antígenos proteicos
semi-purificados secretados por Map en medios líquidos ya que estos antígenos serían más
inmunogénicos y específicos que los utilizados en las pruebas comerciales. Con este propósito
se propusieron los siguientes objetivos específicos: crear un patrón proteico para Map para
evaluar antígenos de relevancia diagnóstica, ensayar estas proteínas con sueros de animales
infectados y animales libres de infección para identificar las proteínas directamente
relacionadas con la sensibilidad y especificidad diagnóstica, producir un preparado proteico
semi-purificado para ser usado como antígeno-Map de fase sólida y para la adsorción de
reacciones cruzadas, usar estas proteínas en una prueba de ELISA y validar su
comportamiento con sueros controles negativos y positivos, y evaluar su utilidad como prueba
diagnóstica utilizando muestras de leche de estanque y de vacas individuales en un rebaño
infectado.
Para el cumplimiento de estos objetivos se seleccionaron cepas de campo aisladas en nuestro
laboratorio y cepas controles, y se cultivaron en dos medios de cultivo líquido (Middlebrock
7H9-OADC y Watson Reid) a partir de los cuales se obtuvieron las proteínas secretadas para
su evaluación. Watson Reid demostró ser el mejor medio obteniéndose una mayor cantidad de
proteínas y en un período de incubación más temprano. Los patrones proteicos fueron
diferentes en ambos medios y de demostró que las proteínas secretadas son, en general, de
bajo peso molecular (<60 kDa). Estos patrones proteicos inmunogéniCcS evidenciaron que las
proteínas más reactivas al ser enfrentadas a sueros de animales controles fueron las que se
encuentran en la fracción entre 20 y 50 kDa. Al ensayar estas proteínas inmunoreactivas con
diferentes sueros de animales infectados se observó una alta variabilidad entre ellas, por lo
que fue necesario utilizar fracciones proteicas, principalmente de aquellas proteínas con un
rango <45 kDa, en lugar de usar una proteína única. Mediante ensayos de westernblot se
demostró que no se presentan diferencias al realizar preadsorción sérica con distintas
micobacterias medioambientales, lo que indicaría que estas proteínas secretadas serían,
además de inmunogénicas, específicas. Finalmente estas proteínas obtenidas de los filtrados
de cultivo fueron semi-purificadas obteniéndose un extracto proteico con todas las proteínas
menores a 45 kDa. Esta fracción fue utilizada como antígeno para ser adherido a placas de
ELISA (100 ng por pocillo). Ensayos preliminares de ELISA sugerían fuertemente que las
proteínas secretadas por Map, principalmente las fracciones <45 kDa, permitirían discriminar
con claridad entre animales infectados y no infectados.
Por razones de fuerza mayor (incendio del laboratorio) no se alcanzó a validar la nueva
prueba de ELISA con sueros controles y su potencial uso con muestras de leche.
nuy beneficiosa para planificar la reconstrucción del laboratorio de Paratuberculosis y analizar
'n forma conjunta las alternativas de colaboración futura para superar la tragedia.
)urante la estadía de Prof. Collins se lograron t%Tmlnar dos manuscritos relacionados con el
'royecto Regular que se enviaron a publicación (ver punto III. Publicaciones) y se preparó y
nvió el siguiente manuscrito no relacionado directamente con el proyecto y que se encuentra
n etapa de evaluación:
algado, M.; Herthnek, D.; Bólske, G.; Leiva, 5.; Kruze, ). First isolation of Mycobacterium
,aratuberculosis from wild guanacos (Lama guanicoe) in Tierra del Fuego Island. Journal of
Wildlife Disease (en arbitraje) (se adjunta abstract y carta de recepción).
demás, el Prof. Collins tuvo importantes reuniones técnicas con nuestro grupo de trabajo y con
l grupo de trabajo de la Dra. Marta Alfaro (INIA, Remehue, Osorno) relacionado con el
Proyecto Regular N° 1070239/ 2007, del cual el Dr Juan Kruze es investigador alterno.
Finalmente, se gestionó una reunión técnica con las autoridades del Servicio Agrícola y
Ganadero, División Protección Pecuaria, de Santiago y Puerto Montt, con la finalizad de revisar y
discutir el documento de trabajo elaborado por el SAG: "Manual de Prodecimientos: Propuesta
de estándares Paratuberculosis bovina (PTBC)". Esta reunión se realizó en Valdivia el martes 22
de Enero con participación de los Drs. Luis Paredes (SAG, Puerto Montt) y Rubén Moreira (SAG,
Santiago), además del Dr M.T. Collins, Dr Miguel Salgado y Dr Juan Kruze. Como resultado de
esta reunión, el SAG deberá elaborar un Programa definitivo de Certificación de Rebaños para
ser aplicado a nivel nacional en Chile, con la asesoría del Dr Collins y nuestro grupo de trabajo.
VII.- ANEXOS
1.
Informe declaración de gastos proyecto regular N°105063912005.
2.
Declaración jurada que certifica la pérdida de documentos de respaldo de los años de
ejecución 2005, 2006, y 2007 (noviembre) a consecuencia del incendio que afectó a la
Facultad de Ciencias.
3.
Informe declaración de gastos Proyecto de Incentivo a la Cooperación Internacional
N07070188/2007.
4.
Portadas y Resúmenes de las siguientes Tesis finalizadas en el período 2007:
a)
Mónica Viviana Pradenas Ferreira (Doctorado en Ciencias Veterinarias): Obtención de
proteínas secretadas de Mycobacterium avium subsp paratuberculosis para su posible uso
como antígenos en pruebas diagnósticas.
b) María Clara Jara Wilde (Bioquímico): Detección de proteínas inmunogénicas de
Mycobacterium avium subsp paratuberculoSiS.
María Paulina Fry Bravo (Magíster en Ciencias MI Microbiología): Evaluación de cuatro kits
comerciales de inmuno-enzimo ensayo (ELISA) para el diagnóstico de paratuberculosis
bovina.
d) Nancy Camita Hernández Villegas (Bioquímico): Purificación de antígenos proteicos a
partir de cepas chilenas de Mycobacteríum avíum subsp para tuberculosis.
c)
S. Documento de la Escuela de Medicina Veterinaria de la UACh que acredita inscripción de Tesis
del estudiante Sergio Gallardo Valenzuela, titulada: "Evaluación de una prueba de enzimoinmuno ensayo (ELISA-UACh) para el diagnóstico de paratuberculosis bovina con muestras de
suero y leche.
6. Abstracts presentados al 9' Internacional Colloqium on Paratuberculosis, Tsukuba, Japón,
oct/nov 2007.
7. Abstract presentado en la VIII Jornada Chilena de Buiatría, Frutillar, Chile, noviembre 2007.
8.
Publicaciones:
a)
Fry, P. et al. Prueba de galera de manuscrito aceptado en el Journal of Veterinary
Diagnostic Investigation, vol. 20 (3), 2008. (Evaluation of four commercial enzyme-linked
immunosorbent assays for the diagnosis of bovine paratuberculosis in Chitean dairy
he rds).
b) Jara, M.C. et al. Abstract y carta de recepción de manuscrito enviado para su publicación a
BMC Microbiology (Comparison of two liquid culture media to detect antigenic proteins
secreted by Mycobacterium avium subsp. para tuberculosis).
c)
Pradenas, M. et al. Abstract y carta de recepción de manuscrito enviado para su
publicación a Veterinary Microbiology (Antibody to secreted proteins of Mycobacterium
avium subsp. paratuberculosis in sera from infected ruminants).
d)
Salgado, M. et al. Abstract publicado en Journal of Veterinary Diagnostic Investigation
19:99-102, 2007. (Diagnosis of paratuberculosis by fecal culture and ELISA on milk and
serum simples in two types of Chilean dairy goats herds).
e)
Kruze, J. et al. Abstract publicado en Archivos de Medicina Veterinaria 39: 147-152, 2007
(Paratuberculosis en rebaños caprinos chilenos).
f)
Salgado, M. et al. Abstract y carta de recepción de manuscrito enviado para publicación en
Journal of Wildlife Diseases (First isolation of Mycobacterium para tuberculosis from wild
guanacos (Lama guanicoe) in Tierra del Fuego Island).