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1. Introducción
El género Glandularia Gmel. es originario de América y está representado por cerca de
60 especies (Judd et al., 2002). Sin embargo, debido a su gran similitud con el género
Verbena el estatus taxonómico ha estado en constante controversia por los
especialistas en sistemática vegetal.
El género Glandularia fue descrito por primera vez en el año 1796 por J. F. Gmelin,
quien se basó en G. carolinensis para dar origen al género. Esta especie fue
anteriormente descrita por Linneo como Buchnera canadensis en el año 1767 y que
posteriormente fue integrada al género Verbena por Britton en 1894. En el año 1847,
Schauer consideró a Glandularia como sección del género Verbena y desde entonces
todas las especies fueron incluidas en Verbena L. (Schnack y Covas, 1944).
En el siglo veinte, Perry (1933), incluye a Glandularia como una sección de Verbena,
en 1944 Schnack y Covas le otorgan el rango de género. En 1961 Lewis y Oliver,
vuelven a clasificar a Glandularia como un subgénero de Verbena. A pesar de las
discrepancias y las variadas discusiones, hay consenso en que Glandularia y Verbena
son taxa totalmente distintos a pesar de la jerarquía asignada por los antiguos
investigadores (Umber, 1979).
Los cromosomas de los vegetales proporcionan caracteres de gran importancia
taxonómica y ayudan a esclarecer problemas sistemáticos como los señalados
anteriormente. La serie de cromosomas tal como se observa al microscopio óptico se
le denomina cariotipo o tipo nuclear y está definida por el número de cromosomas y
por otras características visibles como son; el tamaño cromosómico y la posición del
centrómero entre otros. El estudio microscópico de los cromosomas y el análisis de
sus propiedades genéticas surgió en los años 1930s como una disciplina que combina
la citología con la genética y se denomina citogenética (Griffiths et al., 2000).
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La caracterización del cariotipo es importante para evaluar el grado de diversidad
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genómica de grupos de especies, también para futuros análisis genéticos
poblacionales. Los datos citogenéticos son útiles para calificar relaciones intra e
interespecíficas en los géneros (Jara y Zúñiga, 2004).
Una propiedad importante de los cromosomas es que habitualmente el número es
constante en las células, a nivel de individuo y entre todos los individuos de la misma
especie. Propiedad sumamente útil en estudios filogenéticos y en la solución de
problemas sistemáticos (Spotorno, 1985).
Schnack y Covas (1944,1946) estudiaron el cariotipo de un gran grupo de ecotipos
seleccionados de Glandularia y Verbena, estableciendo para Glandularia un número
básico de cromosomas de x=5 y Verbena un número básico de cromosomas de x=7,
estudios que hasta la fecha hace reconocer a Glandularia como un género distinto a
Verbena.
Glandularia spp es una hierba perenne que posee una gran variedad de colores en
sus flores y un hábito de crecimiento rastrero. Características que llaman la atención y
que poseen un enorme potencial paisajístico. En Argentina esta especie ha estado en
constante estudio para desarrollar nuevas variedades ornamentales (Facciuto y
Escandón, 2003). Actualmente en la Facultad de Agronomía de la Universidad
Católica de Valparaíso se lleva a cabo un proyecto de mejoramiento genético de la
especie. Este proyecto consiste en duplicar el material genético mediante colchicina.
Sin embargo, es fundamental conocer con anterioridad el cariotipo o el nivel ploidal,
para ello existen métodos directos e indirectos para determinar el número de
cromosomas y consecuentemente el nivel de ploidía de una especie vegetal. Por
ejemplo; el conteo de cromosomas en células meristemáticas, es un análisis
inequívoco para la determinación del número de cromosomas y nivel de ploidía de una
especie (Singsit y Ozias-Akins, 1992).
Salto de página
En Chile los estudios botánicos del género sólo se basan en la distribución geográfica
y en características morfológicas de las especies, el primer reporte fue efectuado por
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Reiche en 1910, quien clasificó a todas las especies de Glandularia dentro de una
sección de Verbena.
Navas (1973) describe 11 especies y seis variedades presentes en la cuenca de
Santiago, considerando a una de ellas endémica. Sin embargo, la clasificación del
género en Chile no ha estado exenta de dudas, en 1985 Marticorena y Quezada tras
un amplio estudio de las especies silvestres reconocen a Glandularia como un género
distinto a Verbena, pero debido a la falta de un estudio más detallado manifiestan la
necesidad de profundizar las investigaciones en el género.
Debido a la importancia y a la variabilidad de caracteres de las especies del género
Glandularia presentes en Chile, se ha determinado evaluar el número de cromosomas
en algunas poblaciones, como una forma de incrementar la información de apoyo a la
taxonomía, además de contribuir como base a futuros programas de mejoramiento
genéticos. Por lo tanto, el presente trabajo tiene como objetivos:
•
Realizar una caracterización cariológica de especies de Glandularia que
crecen en Chile.
•
Evaluar el número cromosómico de líneas potencialmente poliploides de
Glandualria spp. obtenidas mediante exposición a colchicina.
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2. Revisión Bibliográfica.
2.1 Descripción general y clasificación taxonómica del género Glandularia:
El género Glandularia perteneciente a la familia Verbenaceae fue fundado por J. F.
Gmelin en el año 1791 y la descripción original deriva de la apariencia glandular del
área estigmática, en preferencia a los tricomas glandulares del cáliz, bráctea floral o de
los apéndices glandulares de la antera, como hoy en día se supone (Umber, 1979).
En la actualidad el género Glandularia es reconocido como tal y segregado de
Verbena fundamentalmente en modalidades de variación, como son: la variabilidad
genética, número básico de cromosomas, nivel de ploidía, tipo reproductivo,
aislamiento reproductivo y la distribución geográfica de ámbos géneros. Además
existen diferencias morfológicas concretas como apéndices glandulares conectivales,
anatomía del tallo, zigomorfía, longitud del estilo, pigmentos florales y morfología de la
semilla (Schnack, 1964; Umber, 1979).
Schnack (1964) sostiene que Glandularia es originaria de Sudamérica y Verbena de
Norteamérica. Este autor basó sus conclusiones mediante la especiación vegetal, la
cual establece que todo vegetal poliploide proviene de un organismo ancestral
diploide, el cual representa el número básico cromosomal de la especie (Grant, 1989).
La gran mayoría de las especies de Glandularia encontradas en Sudamérica son
diploides a diferencia de Norteamérica, donde la gran mayoría de las especies
encontradas son poliploides. En Verbena las especies poliploides y apomícticas son
encontradas primordialmente en Sudamérica, mientras que las especies diploides son
encontradas en Norteamérica, lo que da a entender que Verbena es originaria de
Norteamérica (Umber, 1979).
Schnack y Covas (1944,1946) determinaron para Glandularia spp. un número básico
de cromosomas de x=5 con poliploides en 4n=20, 6n=30, y 8n=40. Lewis y Oliver
(1961) sostienen que las especies sudamericanas son principalmente diploides con
2n=10, encontrando sólo dos tetraploides en 20 especies investigadas, mientras que
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las especies norteamericanas son, en su mayoría, hexaploides con x=15, 2n=30
donde solo cuatro tetraploides han sido encontradas en 15 especies investigadas.
Glandularia en Norteamérica se encuentra en el sur de Dakota, Virginia, Florida y
Arizona,
en
Centroamérica
se
distribuye
hasta
Guatemala.
Las
especies
sudamericanas son encontradas en el sur de Brasil, Paraguay, Uruguay, Argentina,
Bolivia, Perú y Chile (Umber, 1979). Es común en lugares abiertos, praderas, bordes
de caminos, laderas de cerros, margen de la selva o de bosques, llegando hasta los
2000 m.s.n.m (Botta, 1993).
2.1.1
Descripción botánica de Glandularia en Chile:
En Chile Glandularia se encuentra distribuida entre la II y IX región, desde las zonas
costeras hasta el interior del país, son de crecimiento rápido y son excelentes cubre
suelos. Es una herbácea perenne que crece a pleno sol, sus tallos son pilosos de
verde ceniciento a verde oscuro y alcanzan hasta 50 cm de longitud, posee hojas
opuestas y partidas y al igual que los tallos se encuentran cubiertas de abundantes
tricomas (Riedemann y Aldunate, 2004).
Florecen desde septiembre a diciembre en forma abundante y prolongada, las flores
son hermafroditas, zigomorfas y tubulares. Posee un cáliz tubuloso, penta dentado y
penta costato; la corola es hipocrateriforme, con un
tubo cilíndrico y de
limbo
subbilabiado. Poseen cuatro estambres dídimos, insertos en el tubo de la corola. Las
anteras superiores presentan apéndices glandulares. El ginéceo es súpero, con un
ovario bicarpelar con un óvulo en cada lóculo. El estilo es varias veces más largo que
el ovario y el estigma es bilobulado, con un lóbulo anterior ancho y papiloso, el lóbulo
posterior es agudo y glabro. Las flores se encuentran organizadas en cabezuelas
apretadas de 2 a 4 cm. de diámetro. Presentan corolas blancas, rosadas, violáceas,
azules, púrpuras o amarillas. El fruto es seco, protegido por el cáliz. La nuez es muy
pequeña y madura durante el verano disgregándose en cuatro nuececitas
monospermas (Navas, 1973).
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La especie Glandularia sulphurea (D.Don) Schnack et. Covas (Figura 1) habita en
zonas costeras entre la II y la IX región (Riedemann y Aldunate, 2004). Crece de 20 a
60 cm de longitud; los tallos son tendidos o erectos, presenta hojas opuestas;
pinnatipartidas o subpinnatipartidas entre 1.5 a 3 cm de longitud con pubescencia
recostada. Las hojas cubren casi todo el tallo excepto el ápice. Posee corola amarilla
con variedades blancas y púrpura. La inflorescencia se organiza en un principio en
una espiga globosa para posteriormente desarrollarse en forma cilíndrica, de 1.5 a 2.5
cm de diámetro, con cinco pétalos lobulados de 8 a 9 mm de diámetro y brácteas
lanceoladas agudas, de 3 a 4 mm de longitud. El cáliz es pubescente, de 6 a 8 mm de
longitud; con tubo casi el doble que el cáliz. Presenta cuatro estambres, los superiores
con apéndices glandulares exertos, color violáceos oscuros (Navas, 1973)
Navas (1973) describe dos variedades de G. sulphurea. La primera, G. sulphurea var.
pedunculata, ubicada en la región metropolitana, se caracteriza por sus largos
pedúnculos de 10 a 14 cm de longitud y con hojas de 3 a 4,5 cm de longitud. El
segundo grupo corresponde a G sulphurea var. intermedia, la cual presenta
pedúnculos más cortos, de 1 a 3 cm de longitud, tiene hojas pequeñas de 1 a 1,5 cm
de longitud. Riedemann y Aldunate (2004), describen una variedad nueva de G.
sulphurea la cual se distribuye en áreas específicas de la II a la IX región, presentando
un llamativo color rojo en su corola, denominándola G. sulphurea var. fuscorubra.
G. laciniata (L). Schnack et Covas (Figura 2) se encuentra entre la IV y VIII región.
Crece hasta 60 cm de altura. Presenta tallos pubescentes verde cenicientos, tendidos
y erectos en la parte superior (Riedemann y Aldunate, 2004). Las hojas son opuestas,
pinnatífidas, en algunos casos las superiores tripartidas, de 1 a 4 cm de longitud,
segmentos oblongos o lanceolados, ápices agudos y entrenudos menores o mayores
que las hojas. Inflorescencia organizada en espiga corta de 2 a 3 cm de diámetro,
pétalos de 4 a 5 mm de diámetro y con brácteas lanceoladas agudas, de 4 a 5 mm de
longitud. El cáliz es pubescente de aproximadamente 8 mm de longitud, con cinco
dientes desiguales. La corola es rosada y viólacea; tubo ligeramente pubescente al
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exterior, tres veces más largo que el cáliz. Tiene cuatro estambres dídimos, de los
cuales los dos superiores tiene apéndices glandulares inclusos (Navas, 1973).
G. porrigens (Phil.) Watson et Hoffman, se encuentra desde la costa hasta la
precordillera de la IV y V región. Crece a pleno sol y presenta corola blanca
(Riedemann y Aldunate, 2004). Navas (1973), describe a G. lipozygioides (Walp.)
Navas, con flores blancas y tubo glabro aproximadamente el doble del cáliz. Con los
estambres superiores con apéndices glandulares inclusos, tallos de 50 cm de longitud,
con hojas opuestas pinnatífidas de hasta 1 cm de longitud. Inflorescencia organizada
en espiga corta que posteriormente se elonga de 2 a 3 cm de diámetro, brácteas
mayores que la mitad del cáliz o casi del largo de éste, 4 a 5,5 mm de longitud. Cáliz
con cinco dientes desiguales, pubescente y glanduloso de 5 a 6 mm de longitud.
(Navas, 1973).
G. berterii (Meins.) Muñoz Pizarro. (Figura 3). Esta especie se encuentra distribuida
entre Coquimbo y Valdivia. Presenta tallos entre 20 a 40 cm de longitud, tendidos y
erectos en la parte superior. Las hojas son opuestas divididas, trífidas o pinnatífidas de
1 a 3 cm de longitud, los entrenudos son mayores que las hojas. La inflorescencia es
una espiga corta de aproximadamente 3 cm de diámetro, posee brácteas lanceoladas,
agudas de 2 a 3 mm de longitud. Cáliz cilíndrico con cinco dientes desiguales de 6 a 8
mm de longitud; limbo penta lobulado de 7 a 8 mm de diámetro, la corola es rosada
pálida o blanca, con tubo pubescente exterior e interiormente. Con cuatro estambres,
los dos superiores con apéndices glandulares inclusos en el tubo (Navas, 1973).
G. reichei (Acebedo) Navas (Figura 4). Navas (1973), la describe como especie nativa
de Chile, se la encuentra preferentemente en la Región Metropolitana. Hierba perenne
pubescente, con tallos de 25 a 40 cm de longitud, tendidos y erectos en la parte
superior. Hojas opuestas, pinnatífidas, división central mayor, tridentada de 1 a 2,5 cm
de longitud con un ancho de 0.6 a 1,5 cm, ápices obtusos, segmentos oblongos,
entrenudos mayores que las hojas. La inflorescencia es una espiga corta con un
diámetro aproximado de 2 cm, posee brácteas lanceoladas, agudas de 3 a 4,5 mm de
longitud. Cáliz pubescente cilíndrico, con cinco dientes desiguales de 7 a 10 mm de
8
longitud. Corola rosada a violácea con tubo glabro o ligeramente pubescente al
exterior, limbo de 7 a 8 mm de longitud, estambres superiores con apéndices
glandulares exertos (Navas, 1973).
Figura 1. Glandularia sulphurea
Figura 2. Glandularia laciniata.
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Figura 3. Glandularia berterii .
Figura 4. Glandularia reichei.
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2.2 Cariotipo:
EL cariotipo está definido por el número de cromosomas y por otros marcadores
visibles como son; el tamaño cromosómico y la posición del centrómero. Los
cromosomas se pueden observar en el microscopio, en metafase, ya que el huso
acromático es visible y los cromosomas alcanzan su máximo grado de condensación,
siendo posible diferenciarlos y clasificarlos morfológicamente (Elliott, 1964; Gasser y
Laemmli, 1987).
El huso acromático consiste en una serie de fibras proteináceas paralelas que apuntan
hacia los polos celulares. Los cromosomas se mueven hacia el plano ecuatorial de la
célula, donde uno de los centrómeros hermanos se une a las fibras del huso que
provienen de uno de los polos; el otro centrómero hermano se une a las fibras que
provienen del otro polo. Son los marcadores visibles de estos cromosomas
condensados los que se observan al microscopio (Darnell et al., 1986).
Uno de los marcadores visible es la región centromérica, la cual se observa como un
estrechamiento en una posición específica del cromosoma dividiéndolo en dos brazos.
Al brazo más corto se le llama p y al más largo q. La posición del centrómero define la
relación entre las longitudes de los brazos cromosómicos, siendo una característica
muy útil para identificar a cada cromosoma. Cuándo el centrómero de un cromosoma
se encuentra en un extremo se clasifica como cromosoma telocéntrico; acrocéntrico
cuando se encuentra cerca del extremo; y es llamado metacéntrico cuando el
centrómero se encuentra en el centro del cromosoma (Griffiths et al., 2000).
El cariotipo proporciona la siguiente información: el tamaño total de cada brazo
cromosómico y de cada cromosoma, la posición del centrómero, el número total de
cromosomas o número diploide (2n) y el número total de brazos cromosómicos.
Además podría revelar la posición de constricciones secundarias (Spotorno, 1985).
11
2.2.1 Poliploidía
En las células somáticas se encuentran dos juegos de cromosomas homólogos, cada
uno de los cuales proviene de uno de sus progenitores (masculino y femenino)
respectivamente, denominándose a esta condición como diploide. El término
poliploidía se refiere a una relación aritmética especial entre los números
cromosómicos de organismos emparentados que poseen diferentes números, es decir;
el organismo poliploide tiene varias series de cromosomas y no sólo dos series
homologables (Grant, 1989; Eguiarte, 1999).
Los organismos diploides tienen un número básico multiplicado por dos; es por eso
que se indican como 2n. Los tetraploides presentan el mismo número básico
multiplicado por cuatro; se expresan abreviadamente como 4n. Por lo tanto, los
poliploides
pueden
representarse
como
3n
(triploide),
4n
(tetraploide),
5n
(pentaploide), 6n (hexaploide) y así sucesivamente (Valdés, 2004).
La poliploidía es una importante forma de evolución y tiene una significación especial
en el fitomejoramiento, ya que se ha hecho uso importante de este fenómeno al
descubrirse que induciendo poliploidía se obtiene mayor altura de plantas que los
respectivos diploides (Elliott, 1964). Esto se explica debido a que se incrementa el
número cromosomal y el volumen de las células, expresándose en muchos casos en
un aumento de las porciones vegetativas de las plantas (Hermsen, 1971).
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2.3 Técnica citológica para observación y recuento de cromosomas:
El estudio de cromosomas de células somáticas comienza con la preparación de la
muestra, la cual se puede obtener de ápices de raíces de aproximadamente dos
centímetros de longitud, pueden obtenerse mediante la germinación de semillas en
placas Petri bajo condiciones asépticas o mediante enraizamiento de esquejes (D’
Ambrogio, 1986).
Posteriormente se realiza una prefijación o un pretratamiento con compuestos
químicos, para inhibir la síntesis de proteínas impidiendo la formación del huso
acromático, determinando la detención de los cromosomas en metafase (Dyer, 1963).
Algunos compuestos químicos utilizados son; Colchicina, 8-hidroxiquinolina, 1bromonaftaleno, en algunos casos también se utilizan bajas temperaturas sobre cero
(Valladolid et al., 2004).
El huso acromático está constituido por una serie de polímeros de tubulina, su
estructura básica corresponde a microtúbulos de dímeros de a y b tubulina que
comienzan a crecer desde la profase. En metafase unos cuantos microtúbulos se unen
a los cinetocoros del centrómero de los cromosomas, guiando la ubicación de las
cromatidas hacia los polos de la célula. Cuándo se adiciona colchicina u 8hidoxiquinolina se bloquea la adición de las subunidades de tubulina a los extremos
de los microtúbulos existente, causando una depolimeración de la estructura,
impidiendo que el huso acromático se forme (Darnell et al., 1986).
Una vez concluida la prefijación prosigue la etapa más importante para la observación
del cariotipo bajo el microscopio óptico - la fijación. En esta etapa se inmovilizan los
componentes de la célula en un estado muy próximo al que se encontraban en la
célula viva (Fukui y Nakayama, 1996). Se realiza con una solución de etanol y ácido
acético glacial en diferentes proporciones (3:1, 2:1, 1:1) durante un tiempo variable
según el grosor de los ápices,1 a 2 h como mínimo, hasta por 24 h si el grosor de los
ápices lo amerita (D’ Ambrogio, 1986).
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El etanol fija el citoplasma y el fluido nuclear, mientras que el ácido acético estabiliza
las nucleoproteínas. Esta mezcla no distorsiona ni disuelve la estructura celular,
puesto que si la muestra se dejara al aire libre, perdería agua por evaporación y sé
plasmolizaría. Además, sería atacada por hongos y bacterias, también mantiene
inactivas las enzimas autocatalíticas y modifica el tejido permitiendo que resista los
tratamientos subsecuentes (Valladolid et al., 2004).
Para lograr ver los cromosomas bajo el microscopio óptico es muy importante que las
células se encuentren dispersas formando una sola capa, evitando así la
superposición. Para lograr dicho objetivo se deben destruir las paredes celulares y las
pectinas de las uniones intercelulares. Dicha hidrólisis se logra con tratamientos
enzimáticos (celulasas y pectinasas) o agentes químicos como el ácido clorhídrico, los
que provocan la precipitación de las proteínas y la destrucción del ARN (Valladolid et
al., 2004). Se puede realizar con diferentes concentraciones de ácido clorhídrico (1N,
5N, 5,5N). Puede realizarse en un baño a 60ºC. El tiempo de hidrólisis es variable,
pero se han observado los mejores resultados entre 5 a 8 min (D’ Ambrogio, 1986).
Esta técnica de recuento de cromosomas es conocida como Squash, ya que una vez
cortado el ápice de la raíz se adiciona una gota de colorante o tinción a utilizar y se
inicia un aplastado con varios golpecitos realizados con una aguja histológica desde el
centro hacia los bordes, sobre un cubreobjeto limpio y desengrasado. Posteriormente
se flamea; luego el portaobjetos con su respectivo cubreobjeto es presionado
firmemente con papel secante para que el material quede lo más esparcido posible y
se quite el exceso de tinción (D’ Ambrogio, 1986).
Para obtener una muestra definitiva se debe congelar el aplastado mediante inmersión
en nitrógeno líquido aproximadamente 10 seg. Posteriormente se separa el
cubreobjetos con la punta de un bisturí, se deja secar a temperatura ambiente se
aplica glicerol en el área de la muestra se cubre con un cubreobjeto nuevo y se deja
aplastando 24 h. También se puede montar en bálsamo de Canadá o Depex y dejar
secar en estufa a 35-38º C durante 4 a 5 días (D’ Ambrogio, 1986).
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Las tinciones más utilizadas para observar cromosomas son: la orceína y la
hematoxilina
la
primera
se
extrae
de
líquenes
de
los
géneros
Lecanora y Rocella y la hematoxilina del leño Hematoxylum campechianum (D’
Ambrogio, 1986; Michelangeli et al., 2002).
Cuando la hidrólisis se realiza con HCl 5N el contraste producido con la hematoxilina
es muy profundo, debido a que se obtiene un citoplasma muy transparente. Esto
resulta en una técnica muy útil y recomendada en citogenética, debido a su simplicidad
y a la reproducibilidad alta de resultados. También se recomienda para muestras
previamente teñidas, como para materiales con problemas de fijación (Guerra, 1999).
Según Guerra (1999) la hematoxilina por si misma, no es un tinte, pues necesita estar
oxidado, ya sea por algún mineral o utilizando un mordiente. La hematoxilina
combinada con hierro ha sido una de las soluciones para teñir cromosomas y la
técnica más utilizada por citogenetistas. Los iones férricos aparentemente forman una
cubierta protectora en los cromosomas impidiendo su deterioro y genera un contraste
evidente, óptimo y
Nuñez, 1968).
requerido para una buena microfotografía
(Wittmann, 1962;
15
2.4 Índices de asimetría del cariotipo:
La asimetría o simetría del cariotipo es una manera efectiva de expresar su
composición. Un cariotipo simétrico es aquel que presenta en su totalidad
cromosomas del mismo tamaño o los centrómeros de la mayoría de ellos se ubican
en la región media. En contraste, un cariotipo asimétrico está constituido por
cromosomas de diferentes tamaños o predominan aquellos con los centrómeros
ubicados en las regiones submedial, subterminal o terminal (Valdés, 2004).
Los índices de asimetría cromosómica permiten clasificar los cariotipos y compararlos
fácilmente entre especies. La asimetría del cariotipo en una serie de cromosomas está
determinada por la variación de la longitud de los cromosomas y en la variación de la
posición de los centrómeros (Paszko, 2006).
En la literatura existen al menos siete índices propuestos por distintos autores. Sin
embargo, Paszko (2006) tras un detallado análisis concluyó que para medir el grado
de asimetría es fundamental considerar la asimetría intercromosómica, es decir, la que
depende de las diferencias entre los cromosomas del cariotipo, combinada con la
asimetría intracromosómica, la cual expresa diferencias morfológicas de los
cromosomas, derivadas de la proporción de sus brazos. El mismo autor considera
válidos sólo aquellos índices que desarrollan una desviación estándar y un coeficiente
de variación de los largos de los cromosomas y de los índices centroméricos.
Pasko (2006) considera válido el índice de asimetría intercromosomal A2, propuesto
por Romero Zarco (1986), ya que representa la proporción entre la desviación
estándar y la longitud media de los cromosomas del complemento (cariotipo). Desde el
punto de vista estadístico es un parámetro sensible, ya que evalúa adecuadamente la
variación relativa en las longitudes de los cromosomas en un complemento o serie.
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También establece el índice de asimetría (AI), con los parámetros coeficiente de
variación del índice centromérico (CVCI) y el coeficiente de variación del largo del
cromosoma
(CVcl) los cuales entregan
una medida de la heterogeneidad de la
posición del centrómero y la longitud del cromosoma en un cariotipo, pues tienen el
potencial para medir, aún variaciones mínimas del cariotipo. Así, estos dos índices
conjuntamente aumentan la precisión de resultados comparado con otros métodos
existentes.
Índices de asimetrías propuestos y validados por Paszko (2006):
Asimetría Intercromosomal (A2):
•
A2 = Slc / Xlc
•
Slc: desviación estándar de los largos totales de los cromosomas
•
Xlc: promedio del largo total del cromosoma
Índice de asimetría (AI):
•
AI = (CVlc x CVic) / 100
•
CVlc: Coeficiente de variación del largo del cromosoma
•
CVic: Coeficiente de variación del índice cromosómico
•
CVlc = Slc / Xlc
•
CVic = A2 x 100
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3. Materiales y métodos.
3.1 Material vegetal:
El material vegetal empleado en este estudio corresponde a clones obtenidos de
ecotipos de Glandularia, los cuales fueron colectados directamente de la naturaleza
entre enero y octubre de 2005. Fueron plantados en macetas y posteriormente en
suelo durante enero y febrero de 2006 en la Facultad de Agronomía de la Universidad
Católica de Valparaíso, ubicada en la provincia de Quillota (32º 52’ latitud Sur, 71º 15’
longitud Oeste) (Cuadro 1).
La identificación - CAS-0905-1A - hace referencia al lugar de la colecta (CAS:
Casablanca), mes y año (0905: Septiembre...2005) y número de generación de clones
(1: Planta madre número 1).
Salto de sección (Página siguiente)
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Cuadro 1. Accesiones de Glandularia utilizadas para la medición de los cromosomas.
……………...
Identificación
Longitud
*Especie
Ingreso
Provincia
Localidad
Latitud Sur
CAS-0905-4
G. berterii.
01/09/2005
Valparaíso
Camino Casablanca Algarrobo
33º24’19.2’’
71º31’37.1’’
70
COLL-1005-3
G. berterii.
18/10/2005
Valparaíso
Camino Colliguay
33º10’55.9’’
71º10’23.1’’
463
DOR-0905-1
G. berterii.
03/09/2005
Quillota
Cuesta La Dormida
33°3’38.81’’
71°3’12.59’’
695
BAS-1005-2
G. reichei.
10/10/2005
Elqui
Cuesta Buenos Aires
29º33’3’’
71º14’55.7’’
571
HUE-0905-1
G. reichei.
15/09/2005
Choapa
31º29’12.4’’
71º33’43.3’’
159
MOLL-1005-1
G. laciniata.
10/10/2005
Petorca
Los Molles
32º11’7.9’’
71º31’19.6’’
53
CHO-1005-1
G. laciniata.
10/10/2005
Elqui
Punta de Choros
29º20’11.7’’
71º13’20’’
253
TRA-1005-5
G. sulphurea.
10/102005
Elqui
A 40 Km al sur de Trapiche
29º45’24.6’’
71º19’30.8’’
193
ZAP-0905-13
G. reichei.
08/09/2005
Petorca
Zapallar
32° 33’ 17’’
71°26’51.4’’
163
Accesión
Huentelauquen Costado sur
Ermita P. Hurtado.
* Navas (1973)
Salto de sección (Página siguiente)
Oeste
msnm
19
3.2 Observación de cromosomas mitóticos:
3.2.1 Obtención de meristemas en proliferación:
Los meristemas radiculares en proliferación se obtuvieron a partir de esquejes de cada
accesión. La especie se multiplica fácilmente por esquejes, en condiciones de alta
luminosidad y humedad en la fase inicial del enraizamiento (Riedemann y Aldunate,
2004).
3.2.2
Obtención de placas metafásicas:
3.2.2.1 Prefijación:
Cuando las raicillas alcanzaron un tamaño de 1.0 a 1.5 cm de longitud, se cortaron y
se lavaron cuidadosamente con agua destilada para excluir los restos de sustrato.
Posteriormente se sometieron a un tratamiento con 8 hidroxiquinolina. Dicho
tratamiento bloquea la formación de los microtúbulos del huso acromático a una
concentración de 2mM durante 1 h (Fukui and Nakayama, 1996).
Concluido el tratamiento antimitótico, las raíces fueron lavadas en agua destilada
durante 3 min y posteriormente se fijaron en una solución de etanol absoluto con ácido
acético glacial en proporción 3:1 durante 24 h a 4ºC. Inmediatamente concluida esta
etapa, las muestras fueron almacenadas en etanol 70% a 4ºC (Fukui and Nakayama,
1996).
20
3.2.2.2 Tinción y maceración:
Para obtener placas metafásicas y ver los cromosomas bajo el microscopio óptico, las
raíces se sometieron a una hidrólisis química con ácido clorhídrico 5 N durante 10 min
a temperatura ambiente. Luego fueron lavadas con agua destilada. Posteriormente,
sobre un portaobjeto seco se depositó una raicilla y se disectó la porción
meristemática (aproximadamente 1 mm desde la punta). A continuación, se depositó
una gota de
hierro-hematoxilina acética (45%) sobre el tejido meristemático y se
golpeó de forma circular con una varilla de vidrio para disgregar las células.
Enseguida, se colocó el cubreobjeto y se flameó la preparación en un mechero
durante algunos segundos. Luego se cubrió la preparación con papel absorbente para
remover el exceso de pigmento y se presionó suavemente con el dedo pulgar para
obtener la mayor cantidad de células en un mismo plano (D’ Ambrogio, 1986; Fukui
and Nakayama, 1996; Guerra, 1998).
3.2.2.3 Montaje permanente:
De las preparaciones obtenidas se seleccionaron aquellas que presentaron placas
metafásicas y de las cuales es posible determinar el número de cromosomas y
consecuentemente el nivel de ploidía. Estas muestras fueron congeladas en nitrógeno
líquido, sumergiendo el portaobjeto cuidadosamente con pinzas dentro de un termo
durante algunos segundos. Posteriormente se separaron los cubre objetos, dejando
secar las muestras durante unos minutos. El portaobjeto con la muestra fue montado
con cubreobjetos nuevos y limpios con Glicerol (87% p/p), los cubre objetos retirados
también fueron montados para rescatar muestras que puedan quedar en los cubre
objetos. Las muestras se dejaron aplastadas durante 24 h, cumplido ese tiempo se
sellaron definitivamente los bordes de los cubreobjetos con Entellan (xileno, mezcla de
isómeros, medio de inclusión rápida para microscopía).
Una vez identificadas las mejores placas metafásicas fueron fotografiadas en
microscopio óptico, con un objetivo de 100x.
21
Las fotografías fueron digitalizadas y se realizó la medición de los cromosomas con el
programa Micro Measure versión 3.3 (Reeves, 2001). Posteriormente los cariotipos
fueron confeccionados con el programa Adobe Photoshop 7.0.
Para establecer el número de cromosomas de cada accesión, se contaron los
cromosomas de diez células por individuo. Para medir los cromosomas se utilizaron
sólo las placas metafásicas que presentaban cada uno de los cromosomas con la
posición del centrómero bien definido.
Para determinar el tipo de cromosomas que componen el cariotipo se calculó el índice
centromérico I propuesto por Levan et al (1964) donde I = (brazo corto/ brazo largo) +
brazo corto, además se utilizaron los índices y valores de la posición del centrómero
(Cuadro 3).
Cuadro 3. Índice para la posición del centrómero y nomenclatura cromosómica
xxxxxxxxxx según Levan et al. (1964).
Localización del centrómero
Nombre del cromosoma
Índice
Terminal
(T)
0,01
Terminal
T
0,01 - 0,125
Subterminal
St
0,125 - 0,25
Submedial
Sm
0,25 - 0,375
Medial
M
0,375 - 0,50
Central
(M)
0,50
El nombre del cromosoma se encuentra abreviado, T: telecéntrico, St: sub-telocéntrico,
Sm: sub-metacéntrico, M: metacéntrico.
22
Se realizó un análisis de varianza, comparando los índices de asimetría, mediante un
Diseño Completamente al Azar (DCA), con los datos; largo total del complemento
cromosómico y la razón entre el brazo largo y el brazo corto del cromosoma.
3.3 Conteo de cromosomas en accesiones potencialmente poliploides:
Se evaluó el número de cromosomas - mediante la técnica de conteo de cromosomas
en células meristemáticas - en accesiones de Glandularia spp. que fueron sometidas
a una concentración de 0,01% de colchicina por 24 h, con el objetivo de duplicar el
material genético (Mena, 2007).
23
4. Resultados y discusión.
Se analizaron 130 montajes, de los cuales un 54% presentaron placas metafásicas
contables. Sin embargo, sólo un bajo porcentaje de las placas metafásicas mostraron
cromosomas con los centrómeros bien definidos y visibles para realizar la cariología,
esto significa; de las 70 muestras con placas metafásicas contables, sólo un 21%
fueron aptas para realizar la medición de los cromosomas. Por lo tanto, del total de los
montajes, tan solo un 12% presentó cromosomas medibles.
4.1 Cariotipo de las accesiones estudiadas:
4.1.2 Número cromosómico:
Todas las accesiones estudiadas, correspondientes a las poblaciones colectadas en:
Zapallar, Punta de Choros, Trapiche, Colliguay, Cuesta Buenos Aires, Cuesta La
Dormida, Los Molles, Casablanca y Huentelauquen, presentaron un número
cromosómico diploide de 2n=10 (Figura 5).
24
Figura 5. Cariotipo diploide de Glandularia: 2n=10. a) población Zapallar, b) Punta de
Choros, c) Trapiche, d) Colliguay, e) cuesta Buenos Aires, f) cuesta La
Dormida, g) Los Molles, h) Huentelauquén, i) Casablanca.
4.1.3 Cariogramas de las accesiones estudiadas:
Se obtuvo el cariotipo de las poblaciones; Zapallar, Punta de Choros, Trapiche (Figura
6), cuesta Buenos Aíres, Casablanca, Colliguay y Los Molles (Figura 7). Las siete
accesiones presentaron cinco pares de cromosomas homólogos, con una formula
idiogramática 2m + 3sm; es decir, número diploide con dos pares metacéntricos y tres
pares submetacéntricos.
25
a)
1
2
3
4
5
m
m
m
Sm
Sm
2
3
4
5
Sm
Sm
Sm
4
5
b)
1
m
m
c)
1
2
m
m
3
Sm
Sm
Sm
5 µm
Figura 6. Cariogramas de accesiones de Glandularia: a) Zapallar, b) Punta de Choros
y c) Trapiche.
26
d)
1
2
m
3
m
4
Sm
5
Sm
Sm
e)
1
2
3
4
5
m
m
Sm
Sm
Sm
10 µm
f)
g)
1
2
3
4
5
m
Sm
Sm
Sm
Sm
1
m
2
3
4
m
Sm
Sm
5
Sm
5 µm
Figura 7. Cariogramas de accesiones de Glandularia , d) Casablanca, e)..Colliguay, e)
Los Molles, g) cuesta Buenos Aires
27
4.1.4 Asimetría general del cariotipo:
Se evaluaron tres cariotipos por accesión, de los cuales se obtuvo un promedio para
medir los índices propuestos por Paszko (2006). Los resultados se resumen en el
siguiente cuadro:
Cuadro 4. Índices de asimetría (AI), (A2), (CVlc), (CVic) y desviación estándar de los
………… índices de asimetría (dsAI) y (dsA2).
Accesión
Clasificación
Navas (1979)
AI
dsAI
A2
dsA2
CVlc
CVic
Buenos Aires
G. reichei.
0,016
+/- 0,02
0,137
+/- 0,01
0,136
0,214
Casablanca
G. berterii.
0,023
+/- 0,04
0,145
+/- 0,01
0,145
0,168
Punta Choros
G. laciniata.
0,019
+/- 0,04
0,136
+/- 0.01
0,136
0,248
Colliguay
G. berterii.
0,022
+/- 0,01
0,149
+/-0,001
0,149
0,247
Los Molles
G. laciniata
0,041
+/- 0,03
0,200
+/- 0,02
0,200
0,219
Trapiche
G. sulphurea.
0,002
+/- 0.04
0,150
+/- 0,01
0,150
0,238
Zapallar
G. reichei.
0,039
+/- 0.04
0,196
+/- 0,01
0,196
0,225
Los resultados numéricos de los índices de asimetría, indican que, los cariotipos son
simétricos intra e intercromosomal, por otro lado, el análisis estadístico realizado a los
distintos índices de asimetría, muestran que no existen diferencias significativas entre
los diferentes fenotipos estudiados.
La metodología utilizada arrojó resultados sugiriendo que los datos cariológicos
confirman que todas las accesiones analizadas corresponden al mismo género,
confirmando el número básico x=5 establecido por Schnack y Covas en 1944. Sin
embargo, los caracteres cromosómicos no aportan evidencia para la separación entre
las taxa estudiadas. Por otra parte, la alta variabilidad fenotípica observada intra e
interespecífica y la falta de una revisión crítica del género no permiten una clara
relación de los caracteres cromosómicos con especies bien delimitadas.
28
Es relevante mencionar, que el número de repeticiones fue bajo, por lo tanto, es
importante destacar que para futuros análisis se deben considerar una mayor cantidad
de placas metafásicas medibles y otras poblaciones de Glandularia del norte y sur de
Chile.
Cabe señalar que los resultados obtenidos en este estudio, corresponden al primer
reporte sobre el cariotipo y el número cromosómico de las especies de Glandularia
que crecen en Chile.
4.3 Evaluación de líneas potencialmente poliploides:
Mediante la técnica de conteo de cromosomas en células meristemáticas, se concluye
que el tratamiento efectuado por Mena (2007), utilizando una concentración de
colchicina al 0,01% durante 24 h, duplica el número cromosómico, observándose
placas metafásicas tetraploides 4n=20. Sin embargo de las accesiones que recibieron
el tratamiento con colchicina, de un total de 30, sólo en un individuo se observaron
células poliploides (Figura 8).
Figura 8. Cariotipo Tetraploide 4n=20, correspondiente a accesiones de Casablanca
tratadas con colchicina al 0,01% por 24 h.
Salto de página
Es importante efectuar una caracterización morfológica debido a que es posible que
29
existan diferencias concretas en cuanto a tamaño de las hojas y flores. Schnack y
Covas (1945), efectuaron una tetraploidización de G.
peruviana
observando
modificaciones en el diámetro de los estómas y un aumento significativo del tamaño
de las hojas y flores.
Salto de página
5. Conclusiones.
30
Los fenotipos evaluados de nueve poblaciones de Glandularia, colectados en Punta de
Choros, cuesta Buenos Aires, Trapiche, Huentelauquén, Los Molles, Zapallar, cuesta
La Dormida, Colliguay y Casablanca presentaron un número somático diploide 2n=10.
Por lo tanto, se confirma el nivel de ploidía y el número cromosómico básico de las
poblaciones seleccionadas de Glandularia spp. que crecen en Chile, establecido por
Schnack y Covas en 1944.
En siete de las nueve accesiones evaluadas se pudo caracterizar el cariotipo,
obteniendo la fórmula idiogramática o cariotípica 2m + 3sm.
Los índices de asimetría indican que no existen diferencias significativas entre los
diferentes fenotipos estudiados. Por lo tanto, la alta variabilidad fenotípica observada
entre las distintas taxa y la falta de una revisión crítica del género no permiten una
clara relación de los caracteres cromosómicos con especies bien delimitadas.
En una de las líneas potencialmente poliploides se observó la duplicación del material
genético, presentando un número somático 4n=20.
31
6. Literatura citada.
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