metabolómica e integración multiómica en
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Universidad San Pablo-CEU Facultad de Farmacia Departamento de Química y Bioquímica Centro de Metabolómica y Bioanálisis METABOLÓMICA E INTEGRACIÓN MULTIÓMICA EN ORGANISMOS UNICELULARES HACIA LA COMPRESIÓN DE SISTEMAS BIOLÓGICOS Tesis Doctoral David Rojo Blanco Madrid 2014 A mis padres David y Aurora A mi abuela Aurora Y, especialmente, a mi abuelo Vicente iii iv Agradecimientos Es preceptivo, y además hacerlo en primer lugar, dar las gracias a mi directora de tesis Coral Barbas, quien, en 2010, me dio la oportunidad de continuar mis estudios al aceptar mi solicitud para realizar una tesis doctoral en su grupo de investigación. Con ello se abrió una nueva etapa en mi vida, la cual precisamente con estas líneas está comenzando a cerrarse. Sin embargo, a este respecto, sería injusto solo mostrar mi gratitud hacia ella en el campo científico o profesional pues lo que me ha permitido es mucho más. Por todo ello, ¡muchas gracias! En segundo lugar quisiera mencionar a Manuel Ferrer, con quien no solamente he tenido el placer de participar en diversos proyectos sino con el que además he mantenido la mejor de las relaciones. Casualidades de la vida, gracias a estas colaboraciones puede aunar uno de mis intereses infantiles, el mundo de los microbios, con mis primeros pasos en la investigación profesional. ¡Gracias! Seguidamente he de destacar el soporte y apoyo de todos los miembros del personal docente adscrito al CEMBIO: Javier Rupérez, Antonia García, María Paz Martínez, María Paz Lorenzo, María Ángeles López, Fernanda Rey-Stolle y Santiago Angulo. Su labor ha sido fundamental y sin ella esta tesis no hubiera sido posible. Por otro lado, sería inexcusable la omisión en estas líneas de una mención a mis compañeros del CEMBIO, tanto de los presentes como de los pasados, así como de todas las personas que han colaborado de un modo u otro en las diversas publicaciones en las cuales he sido coautor. Además, y de un modo especial, quiero dar las gracias a mis amigos: Joanna y Michał, quienes me comenzaron a mostrar la belleza de Polonia y con quienes di mis primeros pasos en la metabolómica; Emily, an original English rose; Vanesa, de la que siempre apreciaré su sinceridad, y Laura y Maria, le mie care amiche italiane con quienes he compartido momentos fantásticos que nunca voy a olvidar. Asimismo, no puedo dejar de lado a los paulinos Ángel, Joaquín y Allan con los que he vivido, en conjunto, los sabores y sin sabores de casi diez años de mi vida, a Ursicino, quien me ayudó en la fase v final de la maquetación del texto, ni tampoco a D. Leopoldo, a quien agradezco de corazón su afecto y cercanía. Y por supuesto a Beata. Asimismo, es de justicia dedicar unas líneas a las dos instituciones de las que he formado parte desde mi llegada a Madrid. Primero a la Universidad San Pablo-CEU, donde cursé mi licenciatura en Farmacia y a la que he seguido vinculado hasta el día de hoy, y, de manera especialmente sentida, al Colegio Mayor de San Pablo, mi casa en Madrid, donde tan feliz he sido durante nueve años. Y, por último, pues tal y como se recoge en el Evangelio los últimos serán los primeros (Mt 19, 30; Mt 20, 16; Mc 10, 31 y Lc 13, 30), gracias de corazón a mi familia, a mis padres, David y Aurora, y a mis abuelos, quienes me lo han dado todo en esta vida. vi Índice Índice Índice página Dedicatoria iii Agradecimientos v I - Introducción 5 I.1 - La vida, su origen y evolución 7 I.2 - Taxonomía, breve historia y situación actual 8 I.3 - La célula: procariotas y eucariotas 10 I.4 - Metabolómica: aspectos generales y metodología experimental 13 I.4.a - Diseño experimental 16 I.4.b - Selección y almacenamiento de la muestra. Extracción de los metabolitos I.5 - Herramientas analíticas en metabolómica 16 18 I.5.a - Técnicas analíticas 18 I.5.b - Tratamiento de datos 20 II - Objetivo y estructura de la tesis 25 III - La vida microbiana en la fosa Medee, un caso de análisis dirigido 29 III.1 - Introducción 31 III.2 - Materiales y Métodos 33 III.2.a - Betaína 34 III.2.b - Acetato 36 III.3 - Resultados 37 III.4 - Discusión 41 III.5 - Conclusiones 43 IV - Microbiota intestinal y tratamiento antibiótico, una aproximación multiómica 45 IV.1 - Introducción 47 IV.2 - Materiales y Métodos 48 IV.3 - Resultados 51 3 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos IV.4 - Discusión 54 IV.5 - Conclusiones 57 V - Efecto y resistencia de los fármacos antimoniales sobre Leishmania infantum, un enfoque multiplataforma 59 V.1 - Introducción 61 V.2 - Materiales y Métodos 65 V.3 - Resultados 70 V.4 - Discusión 73 V.5 - Conclusiones 75 VI - Contaminación, biodegradación y actividad microbiana en el Mediterráneo y el mar Rojo, hacia la integración multiómica 77 VI.1 - Introducción 79 VI.2 - Materiales y Métodos 83 VI.3 - Resultados 85 VI.4 - Discusión 89 VI.5 - Conclusiones 93 VII - Conclusiones 95 VIII - Bibliografía 99 IX - Anexo 121 X - Índice de figuras y tablas 129 X.1 - Figuras 131 X.2 - Tablas 135 XI - Índice de abreviaturas 137 4 I Introducción Introducción I - Introducción I.1 - La vida, su origen y evolución Mucho se ha escrito y reflexionado sobre el origen de la vida. Actualmente, la hipótesis más aceptada fija la antigüedad de nuestro planeta en unos 4600 millones de años, datándose los primeros fósiles de células procariotas -los estromatolitos- en hace unos 3800-3500 millones de años. Fue Alexander Oparin quien en 1924 propuso el modelo más atrayente para explicar el origen de la vida. Según este, la alta temperatura de la Tierra primitiva junto con la acción de los rayos ultravioleta y las descargas eléctricas habrían provocado las reacciones químicas entre los átomos de carbono, hidrógeno y oxígeno necesarias para dar origen a distintos compuestos orgánicos simples. De este modo habrían surgido los primeros aminoácidos que, por efecto del calor, se combinarían mediante enlaces peptídicos produciendo así las primeras proteínas. Disueltas en agua formarían los primeros coloides y de ellos se originarían los protobiontes, glóbulos estables compuestos de proteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos. La formación de proteínas con actividad catalítica junto con la envoltura de estas gotículas en membranas de naturaleza lipoproteica fueron los últimos pasos necesarios para la aparición de las primeras formas de vida rudimentarias. En base a estas concepciones fue John B. S. Haldane quien acuñó la conocida expresión de “sopa prebiótica” para hacer referencia al estado de los primitivos océanos de la Tierra, ricos en principios inmediatos. En 1953 Stanley L. Miller demostró experimentalmente la viabilidad de esta hipótesis 1; pero, sea cual fuere su origen, lo que parece concluyente es que la vida procariota surgió poco después del enfriamiento terrestre y muy probablemente su metabolismo era anaerobio2. Las cianobacterias y la fotosíntesis productora de oxígeno habrían aparecido bastante más tarde, hace unos 3000-2500 millones de años. Asimismo parece probable que las células eucariotas se originasen a partir de las procariotas hace unos 1400 millones de años pero no se sabe con exactitud cómo tuvo lugar este proceso; para su explicación se han propuesto dos hipótesis. La primera especula con la posibilidad de que núcleos, mitocondrias y cloroplastos se hubieran 7 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos originado a partir de invaginaciones de la membrana plasmática, apareciendo así estructuras internas con doble membrana y material genético capaces de sufrir un desarrollo y una especialización funcional. Por otro lado está la hipótesis endosimbiótica de Lynn Margulis3, más popular que la anterior. De acuerdo con esta, el primer acontecimiento que tuvo lugar habría sido la formación de un núcleo en la célula proeucariota, muy probablemente por fusión de antiguas bacterias y arqueas. Posiblemente una célula huésped bacteriana Gran negativa, que había perdido su pared celular, incorporó en su interior una arquea formando así una asociación endosimbiótica (de ahí el nombre de la hipótesis). Posteriormente la arquea habría perdido su pared y membrana plasmática mientras la bacteria huésped desarrollaba pliegues interiores en su propia membrana. Con el tiempo el genoma del huésped se habría transferido a la arquea original, formándose así el núcleo y el retículo endoplasmático. Este sería el eucariota ancestral con metabolismo fermentador que habría establecido nuevas asociaciones simbióticas con bacterias fotosintéticas, apareciendo de este modo los cloroplastos. Por su parte, las mitocondrias habrían surgido de otra relación endosimbiótica entre la eucariota primitiva y bacterias con respiración aerobia. El principal apoyo de la hipótesis endosimbiótica está precisamente en el descubrimiento de este tipo de relaciones tras encontrarse una cianobacteria que habita en el protista biflagelado Cyanophora paradoxa. Con todo, la secuencia exacta de los acontecimientos sigue sin conocerse. I.2 - Taxonomía, breve historia y situación actual Uno de los aspectos más desconcertantes y a la vez más fascinantes del mundo microbiano es su gran diversidad, de ahí la dificultad para su clasificación sistemática. De ello se ocupa la taxonomía (del gr. taxis, ordenación y nomos, ley), cuya actividad se dirige tanto a la identificación de los organismo como a su nomenclatura y clasificación en taxones -según su grado de semejanza-. La especie constituye el grupo taxonómico básico. Para los organismos microbianos esta puede ser definida como una colección de cepas que comparten numerosas propiedades estables y que difieren de forma significativa de otros grupos. Es 8 Introducción evidente la gran subjetividad a la que esto da cabida y por tanto la siguiente definición propuesta consideraría miembros de una misma especie a aquellos individuos que comparten al menos un 70 % de similitud en G+C en base a experimentos de hibridación de DNA, lo que objetivaría la clasificación. Por encima de la especie y en este orden se situarían los siguientes taxones: género, familia, orden, clase, phylum y reino. Clásicamente se ha tendido a considerar como canónico el sistema de cinco reinos propuesto por Robert Whittaker 4 en 1969, distinguiéndose entre: Monera, Protista, Fungi, Animalia y Plantae. Posteriormente, los trabajos5 de Carl Woese y sus colaboradores sobre las secuencias de rRNA de células procariotas les han llevado a proponer un árbol filogenético dividido en tres ramas (figura 1): Bacteria (diacil diésteres de glicerol como lípidos de membrana y rRNA bacteriano), Archaea (diéter de diglicerol o tetraéter de diglicerol como lípidos de membrana y rRNA arqueano) y Eucarya (acil diésteres de glicerol como lípidos de membrana y rRNA eucariótico). Estos tres grupos se denominan dominios y se ubicarían por encima del concepto tradicional de reino. Figura 1. Árbol filogenético universal propuesto por Olsen y Woese basado en la secuenciación de rRNA 16S6. 9 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Toda esta información se articula según el sistema binomial propuesto ya en el s. XVIII por el botánico sueco Carl von Linné en su obra Systema Naturae. Tras múltiples revisiones y un gran esfuerzo compilador se publicaron en 1980 en el International Journal of Systematic Bacteriology las listas aprobadas de nombres bacterianos, en donde asimismo aparecen periódicamente los nuevos nombres válidos. Además el Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology contiene las descripciones de las especies procariotas actualmente identificadas. I.3 - La célula: procariotas y eucariotas Tal y como hemos podido ya apuntar, existen dos grandes clases de células: las procariotas (del gr. pro, ante y karyon, nuez o núcleo) y las eucariotas (del gr. eu, verdadero y karyon, nuez o núcleo). A continuación desarrollaremos un breve resumen de sus principales características. Bajo el término procariota se engloba a los dominios de Bacteria y Archaea. Morfológicamente la mayoría se presentan en forma de cocos o bacilos. Los primeros son células casi esféricas que pueden existir tanto de forma individual como agrupados. Los diplococos se forman cuando los cocos se dividen y permanecen juntos para constituir pares; si se dividen repetidamente en un mismo plano formando largas cadenas se denominan estreptococos y, si por el contrario lo hacen aleatoriamente generando racimos irregulares, estos se llaman estafilococos. Finalmente cabe la posibilidad de que constituyan paquetes cuadrados: las tétradas. Por su parte, los bacilos presentan forma de bastoncillo, pudiendo variar considerablemente sus proporciones en longitud y diámetro. Un caso particular lo constituyen los vibrios, de forma curvada y con aspecto de coma. Menos comunes que las anteriores son las organizaciones en hifas, que pueden ramificarse para formar una red llamada micelio. Las formas helicoidales pueden ser espirilos, si son rígidos, o espiroquetas, si son flexibles. Además están los pedúnculos. Finalmente hay algunas procariotas pleomórficas, que, como su nombre indica, presentan una forma variable. En lo que respecta al tamaño la variabilidad entre las especies es 10 Introducción inmensa, desde los escasos 0.3 µm del género Mycoplasma a los generosos 600 µm de la Epulopiscium fishelsoni. A nivel organizativo este tipo de célula contiene numerosas estructuras, a saber: membrana plasmática, vacuolas, ribosomas, cuerpos de inclusión, nucleoide, espacio periplásmico, pared celular, cápsula, fimbriae y flagelos. Además cuando las condiciones ambientales son adversas pueden formar esporas. Casi siempre las procariotas presentan una pared celular separada de la membrana plasmática por el espacio periplásmico y en ningún caso sus orgánulos internos están rodeados por una membrana, lo que implica que el material genético se localiza en una región discreta llamada nucleoide. Tal y como se expondrá en el correspondiente cuadro comparativo, en general, la célula procariota es mucho más sencilla que la eucariota. En el dominio Eucarya son organismos unicelulares las algas, los hongos y los protozoos. Su diferencia más obvia con el tipo celular anterior radica en la presencia de membranas internas así como la mayor complejidad y grado de especialización funcional de algunos de sus orgánulos (en particular en lo que atañe a la respiración celular y la fotosíntesis). Orgánulos eucariotas son: la membrana plasmática, los microtúbulos, el retículo endoplasmático, los ribosomas, el aparato de Golgi, los lisosomas, las mitocondrias, los cloroplastos, la pared celular, los cilios, los flagelos, las vacuolas y, por supuesto, el núcleo. No consideramos de mayor interés para esta introducción una descripción detallada de cada uno de los orgánulos celulares así como de su función. Sin embargo, antes de concluir este epígrafe se impone un cuadro resumen (tabla 1) en el que se comparen con rigor las diferencias entre los dos tipos de células. 11 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Tabla 1. Comparación entre células procariotas y eucariotas2. Propiedad Organización del material genético Núcleo verdadero rodeado por membrana Complejos de DNA con histonas Número de cromosomas Intrones en los genes Nucleolo Desarrollo de mitosis Recombinación genética Mitocondrias Cloroplastos Membrana plasmática con esteroles Flagelos Retículo endoplasmático Aparato de Golgi Pared celular Diferencias en orgánulos más sencillos Ribosomas Lisosomas y peroxisomas Microtúbulos Citoesqueleto Diferenciación Procariotas Eucariotas Ausente Presente No Sí Uno Raro Ausente No Parcial, transferencia unidireccional del DNA Ausentes Ausentes Normalmente, no* Más de uno Común Presente Sí Meiosis y fusión de gametos De tamaño submicroscópico, compuestos de una fibra De tamaño microscópico, rodeados de membrana, normalmente con 20 microtúbulos dispuestos según el modelo 9 + 2 Presente Presente Químicamente más sencilla y carece de peptidoglicano Ausente Ausente Normalmente, compuesta químicamente por peptidoglicano** 70S Presentes Presentes Sí Ausentes 80S, excepto en mitocondrias y cloroplastos Presentes Ausentes o raros Ausente Rudimentaria Presentes Presente Tejidos y órganos *Sólo los micoplasmas y los metanotrofos contienen esteroles, no pudiendo sintetizarlos los primeros por lo que han de adquirir sus precursores del medio. Además muchos procariotas contienen hopanoides. **Los micoplasmas y las Archaea no contienen peptidoglicano. 12 Introducción Para la presente tesis doctoral se han abordado distintos trabajos realizados todos ellos con microrganismos unicelulares, tanto procariotas como eucariotas, abarcándose en conjunto los tres dominios taxonómicos. En los correspondientes capítulos se ampliará la información concerniente a cada uno de los seres que han sido objeto de estudio. I.4 - Metabolómica: aspectos generales y metodología experimental La metabol[n]ómica, disciplina ómica encargada del estudio del metaboloma, fue definida por Jeremy K. Nicholson como “the quantitative measurement of the dynamic multiparametric metabolic response of living systems to pathophysiological stimuli or genetic modification”7, si bien el primero en usar dicho concepto fue Stephen G. Oliver8. Desde estos trabajos iniciales publicados a finales de la década de los noventa hasta la actualidad, la metabolómica ha vivido una franca expansión (figuras 2 y 3). La aplicación de este enfoque holístico a un cada vez mayor número de campos ha implicado que para el análisis metabolómico se desarrollen diferentes estrategias según cual sea el caso de estudio. Siguiendo la opinión de Alberto Valdés9 y Warwick B. Dunn10 distinguiríamos cuatro situaciones: Análisis dirigido: aquel en el que se analiza uno o un grupo muy reducido de compuestos preseleccionados en el diseño del estudio. Análisis del perfil metabólico: aquel que analiza un grupo de compuestos con propiedades fisicoquímicas similares o que participan en una determinada ruta metabólica. Análisis de la huella metabólica (del ingl. metabolic fingerprinting): consiste en la obtención global de las señales correspondientes a los metabolitos presentes en la muestra, pudiéndose establecer diferencias y/o similitudes entre los individuos a través de un análisis conjunto y multivariante de estas señales11. Análisis metabonómico: propiamente fue el definido por Nicholson7, este trata de medir la respuesta metabólica dinámica de sistemas biológicos vivos ante estímulos fisiológicos o modificaciones genéticas. 13 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Aunque inicialmente la metabolómica y la metabonómica representaron distintos enfoques para el estudio de los metabolitos, hoy en día no existe una distinción clara entre ambas. De hecho, la Sociedad Metabolómica establece que el término metabolómica engloba al de metabonómica, así como a las definiciones anteriores. En esta línea de simplificación conceptual se ha optado por mantener para esta tesis solo la distinción básica entre análisis dirigido (englobando los dos primeros casos) y fingerprintring (agrupando a los dos últimos). Figura 2. Número de artículos por año en los que se citan las palabras clave metabolomics (azul) o metabonomics (rojo) en su título, según el buscador Web of Knowledge a fecha de 5 de mayo de 2014. Figura 3. Crecimiento de la importancia relativa de la metabol[n]ómica frente a otras disciplinas ómicas durante la pasada década según el buscador Web of Knowledge. En verde, porcentaje de artículos que contienen en su título las palabras clave metabolomics o metabonomics; en gris aquellos en los que figuran los términos genomics, transcriptomics o proteomics. 14 Introducción Por otro lado, ha de destacarse que las dificultades del análisis metabolómico son reseñables, siendo principalmente debidas a la gran complejidad del metaboloma. Este abarca una amplísima colección de metabolitos, los cuales varían tanto en propiedades fisicoquímicas como en abundancias y rangos de concentración12. Por todo ello, para la obtención de información biológica relevante -y así llevar a cabo con éxito un estudio metabolómico (figura 4)-, se impone una adecuada metodología experimental, debiendo incluir: un buen diseño experimental; una adecuada selección y almacenamiento de la muestra; una correcta extracción de los metabolitos; una técnica analítica acertada y un correcto tratamiento de datos. A continuación nos ocuparemos de los tres primeros puntos, reservando los dos últimos para el siguiente epígrafe. Figura 4. Esquema resumen del flujo de trabajo seguido en un estudio metabolómico. 15 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos I.4.a - Diseño experimental En primer lugar resulta prioritario disponer de un correcto modelo experimental, adecuado para responder a las cuestiones que plantee el tema en estudio. Algunos de los puntos a tener en cuenta son: el tipo de muestra, la existencia de controles, el número de réplicas por grupo… Todo ello debe estar convenientemente descrito. Además, son fundamentales una correcta recogida y almacenamiento de la muestra junto con una metodología que asegure su óptimo estado hasta su llegada al laboratorio. Asimismo, según se focalice el trabajo en una lista concreta de metabolitos o en una búsqueda de los mismos tan amplia como sea posible -es decir, según se opte por una aproximación dirigida o una fingerprinting- así habrá de ser la elección de la técnica de extracción, la metodología de análisis y el sistema de detección. Todo ello debe complementarse con el ineludible punto de una búsqueda bibliográfica previa. I.4.b - Selección y almacenamiento de la muestra. Extracción de los metabolitos Las muestras biológicas más habituales en los estudios metabolómicos son la sangre (suero o plasma), la orina, los tejidos y las células. Este último ha sido el caso que ha ocupado a los trabajos desarrollados en la presente tesis doctoral. En general, el tratamiento de la muestra está directamente relacionado con las características de la matriz, el tipo de analito que se desea extraer y la técnica de determinación que se pretende aplicar. Si se trata de un análisis dirigido, se buscará concentrar los metabolitos preseleccionados, optándose en este caso por etapas de extracción muy selectivas. Si por el contrario el estudio es global, se buscará maximizar la capacidad de detección de los metabolitos, tratando de obtenerse la fracción más representativa del metaboloma. Para el análisis del metabolismo celular es particularmente importante su interrupción mediante la inhibición de las enzimas endógenas. Esta etapa debe llevarse a cabo sin inducir variaciones en la concentración de los metabolitos. Las estrategias más habituales se basan en cambios bruscos de pH13 16 14, el empleo de metanol, la mezcla de Introducción disolventes en frío15 16 17 o el cambio de temperatura inducido con nitrógeno líquido (-196 °C). Un posible inconveniente a señalar sería el potencial daño que se le infringiría a la membrana celular, dando lugar a una pérdida de metabolitos, posibilidad que no se puede obviar cuando se opta por el metanol o el nitrógeno líquido. A continuación sería necesaria la realización de un procedimiento que permita romper la célula para así liberar su metaboloma. Esto se suele realizar mediante métodos mecánicos, como las sondas de ultrasonidos o la agitación de la muestra en presencia de pequeños gránulos, o mediante ciclos de congelación/descongelación que favorezcan la lisis. Seguidamente pueden ser interesantes etapas de centrifugación o evaporación, con el fin de purificar o concentrar la muestra, además de para así poder elegir la fase líquida más adecuada para la técnica de análisis. Asimismo, en algún momento del protocolo, ha de realizarse la desproteinización, las opciones más empleadas para la desnaturalización de las proteínas son los cambios bruscos de pH o el uso de disolventes orgánicos como el metanol o el acetonitrilo18. Por otro lado, en el caso de que la técnica analítica de elección fuera cromatografía de gases ha de tenerse en cuenta que los analitos han de ser volátiles y térmicamente estables. Para favorecer la primera propiedad se puede llevar a cabo una sililación. De esta manera, los grupos funcionales con hidrógenos activos (por ejemplo: -OH, -NH, -COOH o SH) reaccionan con N-metil-N-trimetilsilitrifluoroacetamida (MSTFA) o con N,O-bistrimetilsilitrifluoroacetamida (BSTFA) produciendo derivados trimetilsilados. Gracias a esto, aminoácidos, azúcares, ácidos grasos, ácidos orgánicos o esteroles son susceptibles de ser analizados por cromatografía de gases. Una etapa previa de metoximación protegería los grupos funcionales cetona al evitar la tautomería ceto-enólica. En general, y salvo que el protocolo manejado indicase lo contrario, las muestras deben ser almacenadas a -80 °C y mantenidas a bajas temperaturas (aproximadamente 4 °C) durante su proceso de preparación a fin de evitar cualquier alteración en los metabolitos. 17 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos I.5 - Herramientas analíticas en metabolómica I.5.a - Técnicas analíticas Hoy en día resulta evidente que no existe una herramienta analítica perfecta en todas sus prestaciones para satisfacer las múltiples necesidades generadas en el campo de la metabolómica, máxime en lo que atañe al análisis de la función celular en su nivel molecular19. En este sentido, la espectrometría de masas (mass spectrometry, MS) es la técnica analítica más difundida dada su rapidez, sensibilidad y selectividad, tanto a nivel cualitativo como cuantitativo10. Esta se basa en la formación y detección de iones, previamente separados en función de su relación masa/carga (m/z). Dada la gran complejidad de las muestras que son objeto de estudio, generalmente se tiende a su acoplamiento con una técnica de separación como la cromatografía de gases (gas chromatography, GC), de líquidos (liquid chromatography, LC) o la electroforesis capilar (capilar electrophoresis, CE). GC-MS: ideal para metabolitos volátiles y térmicamente estables, su gran inconveniente suele ser la necesidad de tediosas etapas de derivatización. El análisis requiere de pequeños volúmenes (típicamente alrededor de 1 µL), pudiéndose optar entre una inyección split o splitless. Las columnas capilares puede ser de varios tipos: de paredes impregnadas (usada en la presente tesis), de soporte impregnado, de capa porosa, rellenas o de sílice fundida. Las fases estacionarias más comunes son la DB-5 o la DB-5010 (respectivamente, polisiloxano con un 5 % de fenilos / 95 % de metilos y polisiloxano con un 50 % de cada uno de ellos). Dado que no se obtiene una perfecta separación analítica, la complejidad del cromatograma es notoria y por tanto se requieren programas informáticos para su deconvolución. La identificación de los metabolitos es posible gracias a la gran reproducibilidad que ofrece la técnica tanto en tiempos de retención (retention time, RT) como en perfiles de fragmentación, lo que permite su comparación con bibliotecas ya existentes (por ejemplo las creadas por O. Fiehn o 18 Introducción el National Institute of Standards and Technology: NIST). Las fuentes de ionización más comunes son el impacto electrónico (fuerte) y la ionización química (suave). LC-MS: típicamente usa para su acoplamiento una fuente de ionización por electrospray (que permite un análisis tanto en polaridad positiva como en negativa) o, en menor medida, una ionización química a presión atmosférica 20. Son factores limitantes para el electrospray la concentración salina de la fase móvil así como los pH extremos, aspecto que también puede afectar a la integridad de la fase estacionaria de la columna. Aquí la preparación de la muestra es más simple que en GC-MS, sin embargo no es posible la identificación de los metabolitos por comparación directa con una biblioteca comercial. En este caso ésta se realiza en base a la masa exacta o mediante el análisis de los espectros de fragmentación de MS/MS. La prestación de masa exacta no es una característica común de todos los analizadores, en los casos que nos ocuparán esta ha sido obtenida mediante el uso de un analizador de tiempo de vuelo (time of flight, TOF). Asimismo, análogamente a lo que ocurre en GC-MS, aquí las columnas analíticas tampoco consiguen una separación perfecta de los analitos, lo implica el uso de programas informáticos de deconvolución. En lo que respecta a sus fases estacionarias, la más usada es la fase inversa C8 o C1810, aunque, para una cobertura metabólica completa, se requerirían fases estacionarias tipo HILIC21. CE-MS: en este caso los compuestos se separan atendiendo a su relación m/z y no en base a su interacción con una fase estacionaria. Ideal para metabólitos iónicos y polares, típicamente usa el electrospray como fuente de ionización. Son características de la CE la elevada velocidad de separación -cuando se emplean altos voltajes y capilares cortos-, la alta eficacia, el pequeño volumen de inyección, el consumo mínimo de reactivos y la gran versatilidad en cuanto a modos de operación. Su gran desventaja sería la poca reproducibilidad en cuanto a tiempos de migración (migration time, MT). Al igual que en las anteriores, aquí también es necesaria la deconvolución. 19 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Aunque la presente tesis se focalice en MS no podemos despreciar otras herramientas como la resonancia magnética nuclear (RMN) o la detección ultravioleta (UV). Esta última podría ser suficiente en el caso de un análisis dirigido en el que solo se precisase cuantificar ciertos metabolitos de interés. Los mejores detectores UV son los diode array, estos proporcionan un espectro de todas las longitudes de onda, lo que permite seleccionar más fácilmente aquella en la que el o los analitos de interés sean más visibles, evitándose así el inconveniente de repetir el análisis. La descripción detallada de cada uno de los métodos de análisis así como de los equipos empleados se hará en el correspondiente apartado de materiales y métodos de cada uno de los capítulos. I.5.b - Tratamiento de datos El volumen de datos generado una vez completado el análisis y hecha la deconvolución (y el alineado, si procede) es ingente. Estos se expresan en forma de matriz, constituida esta por dos vectores: columnas -cada uno de los casos de estudio: las muestras- y filas -las entidades-. Sin embargo, el manejo de esta información cruda no es ni eficaz ni posible y por ende se estima pertinente apuntar que tres son los pasos a dar en esta materia. Primeramente se requiere de una depuración, eliminándose ruido y señales indeseadas, esto es el filtrado. Seguidamente se aplicarán los test estadísticos pertinentes. Finalmente se procederá a la identificación de los biomarcadores. Filtrado: el primer punto a garantizar es la reproducibilidad instrumental. En todo acoplamiento cromatografía/electroforesis-MS las muestras inyectadas interaccionan tanto con la parte separativa como con la espectrométrica pudiendo ocasionar una variación, bien en la intensidad, bien en el tiempo de detección de cada señal. Precisamente por esta razón se requiere del análisis periódico de controles de calidad (quality control, QC) a lo largo de toda la secuencia de análisis22. Idealmente, estos se prepararían a partir de la mezcla de una misma parte alícuota tomada de cada una de las muestras. 20 Introducción Definimos una entidad metabólica como el pico al cual se le asocian un índice de retención (retention index, RI) y un espectro de masas -GC- o un RT/MT y un espectro de masas -LC y CE-. Cualquier entidad que no cumpla los criterios de filtrado descritos a continuación deberá ser descartada22. Los motivos exactos por los que preparar QCs son tres22: para equilibrar el sistema separativo antes de la inyección de las muestras “reales”, para calcular la precisión instrumental -entendida como criterio de filtrado- y para la corrección de la señal -solo si las muestras se hubieran analizado en secuencias diferentes-. En el caso de los biomarcadores el criterio de filtrado de la Food and Drug Administration (FDA)23 es el de descartar toda entidad cuyo coeficiente de variación (CV) en los QCs supere el 30 %. Asimismo, es recomendable ignorar todas aquellas entidades que no estén presentes en al menos el 50 % de los QCs, siempre y cuando estos se hayan preparado a partir de un pool de las muestras a analizar. Estadística: inicialmente han de considerarse dos problemas24: el tratamiento de los missing values y la detección de outliers. Los primeros pueden definirse como celdas vacías de la matriz en las cuales, por el motivo que fuere, las respectivas entidades no han sido detectadas. La solución más estricta sería la de descartar la fila entera, sin embargo esto redundaría en la pérdida de información potencialmente interesante. Se plantean pues algunas alternativas tales como reemplazar los missing values por la media de toda la fila o bien por la media de sus vecinos más próximos. En cuanto al segundo punto, definimos outlier como aquella muestra cuyos valores no son concordantes con los de la inmensa mayoría de los de su clase. Además de la re-inspección visual del correspondiente electroferograma o cromatograma una buena manera para su detección es la de comparar su ratio media/mediana con el de las otras muestras. El último paso previo en la preparación de los datos sería el de su potencial transformación o normalización24. Las opciones más comunes son: Z-score (desviación de cada punto respecto de la media dividida por la desviación 21 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos estándar), división por la media o mediana y transformación logarítmica (recomendada si se desea una distribución gaussiana, condición requerida por multitud de test). Hechas estas consideraciones previas ha de exponerse que, según se considere a cada una de las variables individualmente o en relación con las demás, se distinguen dos grandes grupos de test: los univariantes y los multivariantes. El test estadístico univariante por excelencia es el t-test. Un t-test de dos colas se usa típicamente para contrastar una hipótesis mediante la diferencia significativa de medias, asumiendo una misma distribución de varianzas en ambos grupos. Se considera que una variable es significativa -y por tanto responsable de la separación de los grupos- cuando su p valor es igual o inferior a 0.05. Este mismo procedimiento puede usarse para comparar más de dos clases, en cuyo caso el test aplicado será un one-way analysis of variance (ANOVA). Este se basa en la construcción de un nuevo conjunto de variables mediante combinación lineal de las originales de tal modo que maximicen la diferencia de la media respecto de la varianza. Una idea similar es la usada por el two-ways ANOVA, si bien aquí se incluye el contraste simultáneo de dos hipótesis. En esta línea, el test más sofisticado sería aquel que no solo contrasta varios grupos simultáneamente sino también más de dos hipótesis, este es el multivariate analysis of variance (MANOVA). Análogo al t-test pero para distribuciones no normales de datos o cuando el número de observaciones es demasiado pequeño para asegurarlo es el test de Mann-Whitney U. Sin embargo, dado el amplio número de variables a considerar en el experimento metabolómico se recomienda su estudio como un todo, pues cada una de ellas no tendría mayor sentido de manera aislada. Esto implicaría métodos estadísticos multivariantes, los cuales pueden dividirse en dos grandes conjuntos 25: métodos de análisis de factores (factor analysis methods) y métodos de clasificación (classification methods). 22 Introducción El análisis de componentes principales (principal components analysis, PCA) es un caso particular de análisis de factores basado en el cálculo de una “nueva” “variable de variables” (en otros textos directamente denominada componente principal) a partir de una matriz de correlaciones, típicamente en metabolómica una matriz de covarianzas, de tal manera que dicha nueva variable explique la máxima dispersión existente entre los individuos. Otro método de análisis de factores es el análisis discriminante (discriminant analysis, DA) cuyo propósito es descubrir las variables responsables de la diferencia entre grupos. En este punto se impone la introducción de dos nuevos conceptos: los de análisis supervisado y no supervisado. El primero asume, con independencia del test utilizado, la introducción de clases que agrupen a las muestras, cosa que se ignoraría en el segundo. En este sentido el método partial least squares (PLS) se basa en un análisis doble de componentes principales al buscar qué variables maximizan la separación de covarianzas entre los grupos previamente definidos. Por su parte, los métodos de clasificación son aquellos que consideran solo uno de los vectores de la matriz -filas o columnas- y no ambos a la vez, como hacen los anteriores. Este conjunto de métodos agrupa a los vectores elegidos en función de un criterio de “distancia” permitiendo así la matematización de su diferencia. Nuevamente aquí encontramos métodos supervisados y no supervisados, respectivamente K-means methods e hierarchical methods (también conocidos como hierarchical component analysis: HCA). Los primeros clasificarán los vectores en función del número predefinido de clases mientras que los segundos comenzarán agrupando a los dos más próximos y continuando así hasta completar todo el dendrograma. Obviamente, el conjunto de test estadísticos finalmente aplicados dependerán del caso de estudio en cuestión pero, fueran cuales fuesen ambos, nunca ha de olvidarse que, tal y como expresó Jean Paul Benzécri 26, un modelo debe derivarse de los datos, [y] no al contrario. 23 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Identificación de biomarcadores: tal y como ya hemos apuntado, la potencial asignación de un nombre a cada una de las entidades se realiza mediante procedimientos distintos según se trate de GC o de LC / CE. En la medida en la que el metaboloma de todos los organismos aún no haya sido completamente caracterizado la información que nos ofrecen las bibliotecas no siempre resulta satisfactoria, aspecto que se acentúa en el mundo microbiano. Esta es una de las grandes limitaciones a la hora de estudiar nuevos organismos o rutas metabólicas que aún no han sido descritas, caso que ha lugar en alguno de los capítulos de esta tesis. El resultado final de todo ello habrá de ser una interpretación coherente de los resultados, ubicando cada metabolito en su correspondiente ruta bioquímica. Los distintos test estadísticos que hayan sido aplicados garantizarán la veracidad de las conclusiones, las cuales siempre deberían servir para dar respuesta a la pregunta inicial que incoó el análisis… amén de poder suscitar otras nuevas. NOTA: Dada la amplitud de los temas tratados y, hasta cierto punto, la disparidad de los mismos se ha decidido que en la presente tesis la revisión bibliográfica específica se realizará en la introducción correspondiente a cada uno de los capítulos. 24 II Objetivo y estructura de la tesis Objetivo y estructura de la tesis II - Objetivo y estructura de la tesis El objetivo de la presente tesis doctoral ha sido la exploración, desde distintas aproximaciones, de las diversas posibilidades de la metabolómica al servicio del estudio de varios organismos unicelulares. En el primer capítulo se ha abordado un caso de análisis dirigido en el cual se ha buscado la detección y estimación del contenido tanto de betaína como de acetato, todo ello dentro del marco planteado para el estudio de la vida microbiana de la fosa marina Medee. El capítulo dos es un trabajo enfocado desde la óptica del fingerprinting. En él nos ocuparemos del estudio del efecto del tratamiento antibiótico sobre la microbiota intestinal. En los capítulos tres y cuatro se mostrarán dos ejemplos del potencial de la combinación de ambas perspectivas cuando, tras un análisis por fingerprinting, se realice una búsqueda dirigida de ciertos biomarcadores. En esta línea, en el capítulo tres, se ha ahondado en las causas de la resistencia de Leishmania spp. al tratamiento con antimoniales así como en su mecanismo de acción para, a continuación, monitorizar el flujo de 13C y así contrastar la hipótesis planteada sobre su origen metabólico. Finalmente, en el capítulo cuatro, se han estudiado las diferencias en el metabolismo microbiano de distintas zonas contaminadas del mar Mediterráneo y del mar Rojo para, en un segundo paso, cuantificar relativamente los compuestos implicados en dicho proceso. 27 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos 28 III La vida microbiana en la fosa Medee, un caso de análisis dirigido La vida microbiana en la fosa Medee, un caso de análisis dirigido III - La vida microbiana en la fosa Medee, un caso de análisis dirigido III.1 - Introducción Hoy en día los ambientes hipersalinos son todavía relativamente comunes en nuestro planeta, si bien lo fueron aún más en el remoto pasado geológico cuando, por ejemplo, todo el norte de Europa estaba cubierto por una gran extensión de agua salada satura -el mar de Zechstein27-, cuya retirada parece haber estado implicada en la extinción masiva del Pérmico-Triásico28 29, acontecida hace 252 millones de años. El último gran episodio de crisis salina de nuestra Historia Geológica tuvo lugar en el Messiniense (subdivisión del Mioceno comprendida entre los 7.2 y los 5.3 millones de años), momento en el cual el Mediterráneo quedó aislado del océano Atlántico. Como consecuencia de la ruptura del balance hídrico entre ambos se produjo la progresiva desecación del Mediterráneo30, apareciendo en su fondo enormes depósitos residuales de agua hipersalina. La estabilidad actual de estas formaciones viene marcada por un compromiso entre la topografía de la zona, su conveniente protección frente a las corrientes marinas y una permanente reposición de sal aportada por la disolución de los depósitos circundantes31. Algunos ejemplos de estos ambientes son las fosas Bannock, Tyro, Discovery, L’Atalante y Urania32 33 31. Las tres últimas se ubican en la llamada “región de las fosas anóxicas”, área vecina a la dorsal mediterránea en la cual todavía se espera encontrar más de estas formaciones34. Confirmando esta idea han aparecido recientemente Thetis y Medee35 36 37 38 (figura 5). 31 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Figura 5. Mapa de la “región de las fosas anóxicas”. En rojo, las fosas hipersalinas mencionadas. Como consecuencia de la mayor densidad de este agua saturada en sal estas fosas están separadas del resto de la masa marina por una fina pero muy estable capa que dificulta los intercambios químicos entre las dos zonas, particularmente de oxígeno 34. Este relativo aislamiento convierte a estos ambientes en los lugares ideales para el estudio de los ciclos biogeoquímicos que pudieron tener lugar durante los primeros momentos de la vida, cuando convivieron las primitivas comunidades de organismos quimiolitótrofos con los ya por entonces veteranos heterótrofos. La energía para el mantenimiento de esta biomasa procede del juego de reacciones de oxidorreducción que tienen lugar en el límite superior de la capa de agua hipersalina, donde la oxidación aeróbica de metales, grupos HS- y grupos sulfurados (que difundirían en estado reducido desde el fondo) constituye un proceso marcadamente exergónico39 40 41 42 43. Según la relativa capacidad de los quimiolitótrofos para usar el oxígeno u otros aceptores de electrones distinguimos dos grandes grupos: las AlphaEpsilonproteobacteria y las Gamma-Epsilonproteobacteria, que respectivamente fijan el CO2 vía ciclo de Calvin-Benson-Bassham o mediante la reducción de ácidos tricarboxílicos. 32 La vida microbiana en la fosa Medee, un caso de análisis dirigido Precisamente por ello estos organismos son uno de los principales productores de materia orgánica de novo de las oscuras profundidades marinas43, sustentando así al resto de la comunidad microbiana formada por multitud de organismo halófitos, la mayoría de ellos solo encontrados en estas fosas mediterráneas. Con todo, el análisis de cómo ha lugar la metanogénesis en estos ambientes está todavía dando sus primeros pasos44. El propósito de este capítulo, inserto en el contexto de un trabajo mucho mayor, ha sido el de contribuir mediante un análisis dirigido de betaína y acetato a la exploración de las condiciones medioambientales de la citada fosa Medee. En esta línea, se ha estudiado la abundancia, importancia ecológica e interacción trófica de los principales procariotas de la solución salina saturada a fin de poder relacionar la síntesis de novo de materia orgánica con el resto de su actividad metabólica. III.2 - Materiales y Métodos Las muestras de la fosa Medee se recogieron a bordo del RV Urania a lo largo de cinco campañas oceanográficas realizadas entre los años 2008 y 2012. El muestreo se llevó a cabo con botellas Niskin de 12 litros fijadas a una escarapela provista de sensores SBE911 y CTD (Sea-Bird Electronics, Belleve, WA, USA). Las profundidades de toma de muestra fueron aproximadamente de los 2800 m a los 3100 m, recolectándose tanto agua hipersalina como sedimentos, ambos almacenados a -80 °C. El tratamiento de las primeras comenzó al mezclarse 50 mL de estas con 150 mL de metanol frío (-80 °C, calidad LC), manteniéndose este preparado en frío durante 60 minutos a fin de precipitar las sales. Posteriormente se centrifugaron a 19.3 x 10 3 g y 4 °C durante 10 minutos. Una vez retirado el sobrenadante este se almacenó a -80 °C. Tanto la toma de muestra como la extracción metabólica fue planificada y llevada a cabo por el equipo del Dr. Michail M. Yakimov, miembro del Institute for Coastal Marine Environment (Messina, Italia). 33 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos III.2.a - Betaína El análisis mediante LC-MS comenzó con la preparación de la muestra. Para ello 300 µL del extracto metanólico anteriormente citado fueron centrifugados a 16 x 10 3 g y 4 °C durante 15 minutos a fin de precipitar cualquier impureza sólida. Acto seguido los sobrenadantes se transfirieron a los viales quedando de este modo listos para su análisis. El perfil metabólico fue obtenido mediante un cromatógrafo de líquidos formado por un desgasificador en línea, una bomba binaria y un autoinyector (1290 infinity, Agilent). Las muestras se mantuvieron a 4 °C durante todo el análisis, el volumen de inyección fue de 0.5 µL y la columna elegida fue una de fase inversa (Zorbax Extend C18 50 x 2.1 mm, 3 μm; Agilent) cuya temperatura de trabajo ascendió a 60 °C. Por su parte el flujo empleado fue de 0.6 mL/min, siendo la fase móvil agua con 0.1 % de ácido fórmico (A) y acetonitrilo con 0.1 % de ácido fórmico (B). El gradiente comenzó con un 5 % de B (01 minutos), luego elevándose hasta un 80 % (1-7 min) y seguidamente hasta el 100 % (711.5 minutos). Tras retornar a las condiciones iniciales de 5 % de B (11.5-12 minutos) estas se mantuvieron durante 3 minutos a fin de re-equilibrar la columna. La duración total de cada análisis fue de 15 minutos. Los espectros de masas se midieron en inyecciones independientes para la polaridad positiva y negativa usando un equipo cuya fuente de ionización es el electrospray y cuyo analizar es un QTOF (Agilent 6550 iFunnel). En polaridad positiva se realizó un barrido de 50 a 1000 m/z y el voltaje del capilar se fijó en 3000 V, tomándose un espectro de masas por segundo. La temperatura del gas fue de 250 °C, el flujo del gas de secado de 12 L/min y la presión del nebulizador de 52 psi. Por su parte, los parámetros del espectrómetro de masas fueron: diferencia de potencial del fragmentador 175 V, del skimmer 65 V y del octopolo 750 V. En modo negativo el rango de medida fue de 50 a 1100 m/z y la diferencia de potencial del fragmentador 250 V; el resto de parámetros se mantuvieron en los mismos valores. A fin de permitir una constante corrección de la m/z detectada por el equipo se han inyectado dos masas de referencia. En modo positivo estas fueron: 121.0509 34 La vida microbiana en la fosa Medee, un caso de análisis dirigido ([C5H4N4+H]+) y 922.0098 ([C18H18O6N3P3F24+H]+) y en modo negativo: 112.9855 ([C2O2F3H]-) y 1033.9881 ([C18H18O6N3P3F24+TFA-H]-). El análisis dirigido comenzó con la búsqueda de betaína, la cual se llevó a cabo reutilizando los datos obtenidos mediante este método general de LC-MS que, sin ser la técnica de elección para este compuesto, sí es una herramienta adecuada para un enfoque de fingerprinting, que era la aproximación inicial. A tenor de su estructura molecular (figura 6) se calculó su masa monoisotópica (118.0863) (MS Fragmentor software, 12.01, ACD/Labs), encontrándose la m/z 118.0866 (error 2.5 ppm) en las muestras correspondientes a las profundidades de 2932 m, 2941 m y 2963 m. En aras de realizar una estimación de su posible concentración se prepararon dos estándares (concentraciones 10 μM y 1 μM), analizándose dos réplicas de cada uno bajo las mismas condiciones que las muestras. Calculando la correspondiente recta de regresión (r=0.999) (figura 7) e interpolando las áreas obtenidas se determinó la concentración del analito. H3C CH3 O + N OH H3C Figura 6. Estructura molecular de la betaína. Abundancia (U.A.) 1.E+07 -5 8.E+06 6.E+06 4.E+06 2.E+06 y = 722320x + 164874 R² = 0.9997 0.E+00 0 5 10 -2.E+06 Concentración del patrón de betaína (µM) 15 Figura 7. Recta de regresión calculada a partir de los estándares de betaína. 35 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos III.2.b - Acetato El otro metabolito interesante para este estudio fue el ácido acético. Consecuentemente se procedió a su determinación mediante un equipo de electroforesis capilar zonal (Beckman P/ACE MDQ Capillary Electrophoresis System) en base a un método previamente desarrollado45. Dicho instrumento consta de un detector UV (fijándose la longitud de onda a 200 nm), un autoinyector y un capilar de poliacrilamida, este último de 37 cm de longitud y 75 µm de diámetro. Durante el análisis las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente, inyectándose durante 5 s por diferencia de presión y aplicándose una diferencia de potencial de 10 kV. El tampón electroforético de elección fue una mezcla de H2O:MeOH (9:1, ácido fosfórico 0.2 M en el agua) cuyo pH se ajustó a 6. Las muestras a inyectar se diluyeron 1:1 con agua miliQ, detectándose una posible presencia de ácido acético sólo en uno de los casos. Para su confirmación se procedió a reanalizar dicha muestra, previa adición del estándar, siendo la concentración final de este 2 mM y 20 mM (figura 8 A). Esta misma idea se utilizó para descartar la presencia de ácido acético en las otras dos muestras (figura 8 B y C). Para la estimación de la concentración del analito se analizaron dos patrones de ácido acético de concentraciones 4 mM y 40 mM cuyos datos de absorbancia fueron utilizados para interpolar. 36 La vida microbiana en la fosa Medee, un caso de análisis dirigido Figura 8. Fragmento de los electroferogramas correspondiente a la determinación de ácido acético. En el eje de abscisas se expresa el tiempo en minutos y en el de ordenadas la absorbancia en U.A. A) muestra con ácido acético. B y C) muestras sin ácido acético. Asimismo se representan los electroferogramas correspondientes a los estándares de ácido acético 4 mM y 40 mM. III.3 - Resultados A lo largo de las cinco campañas oceanográficas anteriormente mencionadas se monitorizaron distintos parámetros a fin de caracterizar el entorno de la fosa en estudio. Aproximadamente a una profundidad de unos 2877 - 2880 m se detectó un ligero salto en la concentración de oxígeno, la salinidad y la temperatura. En este punto la salinidad comenzó a incrementar sus valores (de 38.7 a 39.0 mM), al igual que la temperatura, si bien el oxígeno adoptó una tendencia de disminución (de 212 ± 17 a 133 ± 12 μmol/L). Esto permitió establecer la interfaz entre el agua marina normal y la hipersalina entorno a una profundidad de unos 2910 m (figura 9). A fin de completar esta primera aproximación se añadieron a las citadas mediciones otras en referencia a las concentraciones de varios compuestos inorgánicos (tabla 2). 37 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Figura 9. Relación entre la salinidad, la temperatura y la concentración de oxígeno respecto de la profundidad en la fosa Medee. Las barras indican el error estándar respecto de la media para tres réplicas. Tabla 2. Composición química del agua hipersalina de la fosa Medee medida en muestras previamente concentradas diez veces mediante evaporación. Concentraciones expresadas en mM salvo explícita mención de otra unidad. Parámetros Densidad (kg/L) Temperatura (°C) Salinidad Na+ ClMg2+ K+ Ca2+ SO42HSBrH3BO3 NH4+ Li (µM) 38 2940 1.19 14.45 304 4.022 4.684 603 331 2.4 140.4 0.67 49.0 1.9 2.31 149 Profundidad (m) 2975 3010 1.21 1.22 14.73 15.32 314 325 4.110 4.165 4.833 4.830 630 773 363 462 2.6 3.0 146.0 166.9 0.93 0.97 53.3 62.6 2.0 2.2 2.27 2.45 160 166 3102 1.22 15.44 345 4.178 5.259 788 471 2.8 201.0 1.64 65.3 2.3 2.35 163 La vida microbiana en la fosa Medee, un caso de análisis dirigido En cuanto al número total de células procariotas se observó su aumento significativo en la interfaz (8.6-26.4 x 104 células/mL) respecto de las capas inmediatamente superiores (1.6-1.9 x 104 células/mL) para, acto seguido, comenzar una disminución gradual conforme aumenta la profundidad (figura 10). Figura 10. Relación entre la población microbiana y la profundidad en la fosa Medee. Las barras indican el error estándar respecto de la media para tres réplicas. DAPI: 4’,6diamidino-2-fenilindol, reactivo de tinción fluorescente usado en microscopía para la realización de recuentos celulares. EUB: Eubacteria. ARCH: Archaea. GM1: Grupo Marino 1 de Thaumarchaeota. EURY: Euryarchaeota. El siguiente paso consistió en la determinación de las principales especies microbianas de Medee. Para ello se recurrió a la amplificación mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) y transcripción inversa de rRNA 16S partiendo de varias muestras de RNA recogidas a profundidades determinadas (figura 11), trabajo realizado por el equipo del Dr. Michail M. Yakimov, miembro del Institute for Coastal Marine Environment (Messina, Italia). 39 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Figura 11. Panorámica de la población procariota de la fosa Medee. Su estratificación y abundancia relativa se agrupan por árboles filogenéticos en relación a la profundidad (RAxML program). El primero de los puntos significativos a mencionar aquí es la presencia de los grupos de Alphaproteobacteria y Gammaproteobacteria, dominantes en el área de transición y en la parte superior de la interfaz y típicos de las zonas oceánicas con poca concentración de oxígeno. Con relación a los mismos se ha demostrado su capacidad para fijar CO2 mediante una reacción acoplada a otra de oxidación de compuestos azufrados 46 47. Por otro lado, destacamos la ausencia de Epsilonproteobacteria así como de ATP citrato liasa, enzima clave del reductor ciclo de los ácidos tricarboxílicos que realizan algunos organismos quimiolitótrofos como el anteriormente citado. En cuanto a los microbios del agua hipersalina aquí los grupos mayoritarios son MSBL1 (87 % de las arqueas) (Mediterranean Sea Brine Lakes 1) y KB1 (72 % de las bacterias) (Kebrit Deep Bacteria 1); ambos constituyen potenciales nuevas divisiones de procariotas que, al carecer de un miembro cultivable, se han referido en base al nombre genérico del lugar donde se han identificado. En esta línea, resultan especialmente 40 La vida microbiana en la fosa Medee, un caso de análisis dirigido significativas algunas de las contribuciones realizadas en la dirección de una posible metanogénesis por parte de los organismos del grupo MSBL143 48 49. Puesto que se ha confirmado a partir de los datos de rRNA 16S la presencia de metil coenzima M reductasa en el agua hipersalina de Medee sería posible apuntar a que esta fuese la responsable de tal actividad. Siguiendo la línea de un típico experimento metabolómico de análisis dirigido y dado que los sustratos para la metanogénesis en los ambientes hipersalinos son conocidos, se procedió a monitorizar la presencia de los metabolitos de interés confirmándose la existencia de betaína y acetato (tabla 3). Tabla 3. Concentración estimada de betaína y acetato en las muestras de agua hipersalina analizadas. Betaína (μM) Acetato (mM) Profundidad (m) 2932 2941 0.07 0.19 No detectado No detectado 2963 0.13 0.54 III.4 - Discusión Los factores principales que condicionan que vida microbiana es posible en los ambientes hipersalinos son la energía disponible (generada mediante reacciones de óxidoreducción) y el mantenimiento del equilibrio osmótico del citoplasma48. La osmolaridad puede regularse de un modo relativamente sencillo mediante diversas estrategias como la biosíntesis de determinados compuestos o la acumulación de iones monovalentes48 50. La variable más limitante es la producción energética pues en estos ambientes la ausencia de luz y de oxígeno impide altos rendimientos exergónicos. Por tanto, solo unas pocas especies de anaerobios son capaces de soportar estas duras condiciones 27 48 50, habiéndose demostrado recientemente su interconexión simbiótica al constituir una comunidad capaz de explotar en su conjunto este hostil nicho ecológico51 52. La estabilidad de esta red trófica se basa en la reducción de betaína, compuesto típicamente usado en el mantenimiento de la presión osmótica (tal y como se ha observado en Acetohalobium arabaticum y Methanohalobium evestigatum53). Asimismo 41 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos se ha demostrado la capacidad de A. arabaticum para degradar betaína mediante su reducción, usando el hidrógeno como donador de electrones (reacción de Stickland), cualidad también encontrada en otros miembros del orden Halanaerobiales54. La ausencia de ATP citrato liasa y de Epsilonproteobacteria descarta otras vías reductoras. Son productos de la citada reacción de reducción el acetato y la trimetilamina, posible sustrato para la metanogénesis. La confirmación de la presencia de estos metabolitos indica la existencia de actividad metanogénica en Medee, aun cuando sus concentraciones son notoriamente bajas. Asimismo este hecho se avala por la existencia de metil coenzima M reductasa. En base a las similitudes encontradas entre Medee y otros ambientes de características similares53 se puede plantear la hipótesis de la existencia una degradación reductora de betaína tras la que, aprovechándose uno de sus productos -la trimetilaminase llevaría a cabo la metanogénesis. Esta síntesis de novo de materia orgánica se fundamenta en dos evidencias: la existencia de betaína solo en las capas superiores de Medee frente su casi total ausencia en las más profundas, donde sería totalmente consumida y la acumulación de uno de los productos de esta degradación -el acetato- en la zona más honda, no pudiendo ser otra su procedencia dada la imposibilidad de usar mono o dimetilamina para su síntesis48 53. Por otro lado, el análisis detallado de los miembros de la comunidad microbiana reveló la presencia de al menos seis linajes de procariotas, dominando los ya citados KB1 y MSBL1. La relación del grupo KB1 con los ambientes de degradación de la betaína y la de MSBL1 con la de la metanogénesis daría muestra de la complementación de las distintas ramas filogenéticas, constituyéndose así una red trófica para el aprovechamiento de los recursos (figura 12). 42 La vida microbiana en la fosa Medee, un caso de análisis dirigido Figura 12. Modelo de síntesis de novo de materia orgánica a partir de la reducción de betaína y posterior metanogénesis, muestra de la cooperación trófica entre KB1 y MSBL1. III.5 - Conclusiones Las evidencias anteriormente citadas han servido para plantear un modelo hipotético que explique cómo ha lugar la vida bajo las extremas condiciones existentes en ambientes como el de la fosa mediterránea Medee. Siendo este un ecosistema estratificado por la concentración salina, la mayor parte de su biomasa se concentra en las capas superiores próximas a la interfaz donde la disponibilidad de betaína permite su reducción por las arqueas del grupo KB1, a posteriori suministradoras de trimetilamina para la biosíntesis de metano realizada por las bacterias MSBL1. El análisis dirigido de estos metabolitos ha servido para demostrar el potencial de la metabolómica como herramienta complementaria aplicada al estudio de complejos ecosistemas para cuya completa descripción se requiere de una aproximación holística multidisciplinar. 43 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos 44 IV Microbiota intestinal y tratamiento antibiótico, una aproximación multiómica Microbiota intestinal y tratamiento antibiótico, una aproximación multiómica IV - Microbiota intestinal y tratamiento antibiótico, una aproximación multiómica IV.1 - Introducción El intestino grueso es sin duda alguna uno de los lugares más desconocidos en lo que atañe a los procesos de la nutrición humana. A lo largo de su tracto habita una amplísima población microbiana íntimamente involucrada en la fisiología y la nutrición de los individuos, esta es la que conocemos bajo el nombre microbiota. En esta línea, este complejo ecosistema puede asimilarse para su estudio al modelo de un biorreactor anaeróbico en el cual un amplio catálogo de genes bacterianos complementan nuestras capacidades de digestión, detoxificación, producción de compuestos bioactivos o asimilación de determinados nutrientes55 56 57 58 59. Los estudios más recientes parecen demostrar que cada individuo tiene una microbiota única y más o menos estable, dominada en un 90 % por los fila Bacteroidetes y Firmicutes junto con otros menos abundantes como Actinobacteria, Proteobacteria y Verrucomicrobia60. Por otro lado, parece bastante evidente la capacidad perturbadora del tratamiento antibiótico sobre estas poblaciones61 62 63, siendo esta aún más digna de consideración dada la emergencia de resistencias y los importantes problemas de salud pública que esto supone, máxime tras demostrarse que algunas de estas especies pueden sobrevivir en el intestino humano durante años61 64 65 66. Obviamente, ante un tratamiento antibiótico es toda la microbiota la que se ve afectada y no solo el patógeno contra el que va dirigido. En los últimos años se ha comenzado a evaluar el efecto de estas terapias sobre la población microbiana del intestino, primeramente mediante el estudio del rRNA 16S61 64 65 67 68 69 70. Sin embargo, la gran diversidad de estos organismos complica terriblemente la interpretación de los resultados. Asimismo, esta investigación se ve limitada por la elección mayoritaria de un enfoque genómico, que es estático, lo que deja fuera del campo de estudio elementos dinámicos tales como la expresión de proteínas y metabolitos71. En lo que respecta al campo específicamente metabolómico cabe mencionar que ya se ha tratado de monitorizar mediante RMN alguno de los cambios que acontecen en el 47 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos intestino de los ratones frente a antibióticos de amplio espectro72, pero, hasta donde nos consta, nunca se ha aplicado esta metodología a un caso humano. Este capítulo constituye la parte metabolómica del primer trabajo llevado a cabo para el estudio del tratamiento antibiótico y sus repercusiones sobre la microbiota intestinal, abordado este desde una perspectiva holística -esto es: genómica, proteómica y metabolómica-. Gracias a esta aproximación multiómica ha sido posible la construcción de una auténtica instantánea de la estructura de la población microbiana y de su situación en el ecosistema intestinal, así como una mejor intelección de las relaciones de esta con la fisiología humana. IV.2 - Materiales y Métodos Las muestras seleccionadas fueron materia fecal fresca procedente de un individuo que no había estado bajo tratamiento antibiótico durante los últimos tres meses. Dicho paciente (varón de 68 años) ingresó en el Departamento de Medicina Interna del Hospital Universitario de Kiel por la infección de su marcapasos y sin presentar en su cuadro clínico ningún signo de desorden intestinal. El tratamiento antibiótico se inició por vía intravenosa con la administración de ampicilina/sulbactam (2 x 750 mg/dosis) y cefazolin (3 x 2 g/dosis). Tras esto se mantuvo el cefazolin (3 x 2 g/dosis) durante 14 días, momento en el que se le retiró la vía y se dio por finalizada la terapia. Las muestras se recogieron por triplicado en los siguientes momentos: antes del inicio del tratamiento (día 0), en los días 3, 6, 11, y 14 de la administración de antibióticos y en el día 40, es decir, 26 días después del término de la posología. Todas ellas fueron inmediatamente congeladas y almacenadas a -80 °C. A partir de las mismas se procedió a la extracción de DNA y RNA; a la secuenciación de rDNA 16S y rRNA 16S; a la purificación, ampliación y secuenciación de mRNA; al estudio metagenómico y metatranscriptómico; a la extracción, separación e identificación de las proteínas y, finalmente, al estudio metabolómico por fingerprintring. Para este último, de 0.4 a 2 g de cada una de las muestras fueron resuspendidos en una solución de tampón fosfato salino (phosphate buffered saline, PBS, pH 7.4) y 48 Microbiota intestinal y tratamiento antibiótico, una aproximación multiómica centrifugadas a 1000 g y 4 °C durante 2 minutos a fin de separar los restos fecales (infranadante) de la fracción celular. Acto seguido el sobrenadante se centrifugó a 13000 g durante 5 minutos, obteniéndose así los correspondientes pellets de la microbiota intestinal. La extracción de los metabolitos se realizó mediante la adicción de 1.2 mL de metanol frío (-80 °C, calidad LC) a los pellets seguida de su agitación y reposo durante una hora a -80 °C. Concluido este periodo, las muestras fueron nuevamente agitadas y sonicadas durante 30 s en nitrógeno líquido para después volver nuevamente a reposar durante una hora a -80 °C. Este protocolo se repitió cinco veces para, una vez concluido, precipitarse los restos indeseados mediante centrifugación a 16000 rpm y 4 °C durante 10 minutos. El extracto metanólico obtenido fue almacenado a -80 °C hasta su llegada al laboratorio de metabolómica. A fin de precipitar cualquier impureza sólida que se pudiera haber formado durante este tiempo, dicho extracto metanólico se centrifugó nuevamente a 13000 g y 4 °C durante 20 minutos. A partir del sobrenadante generado se prepararon los QCs mediante la mezcla de una parte alícuota tomada de cada una de las muestras, transfiriéndose el resto a los correspondientes viales para su análisis. El perfil metabólico fue obtenido mediante un cromatógrafo de líquidos formado por un desgasificador en línea, dos bombas binarias y un autoinyector (1200 series, Agilent). La columna elegida fue una de fase inversa (Discovery HS C18, 150 x 2.1 mm, 3 µm, Supelco) protegida mediante la correspondiente precolumna (Discovery HS C18, 20 x 2.1 mm, 3 µm, Supelco), ambas mantenidas a 40 °C durante todo el tiempo de análisis. Por su parte, el flujo de trabajo fue de 0.6 mL/min, usándose como fase móvil agua con 0.1 % de ácido fórmico (A) y acetonitrilo con 0.1 % de ácido fórmico (B). El gradiente comenzó con un incremento de B del 25 % al 95 % en 35 minutos, volviendo a las condiciones iniciales durante el siguiente minuto y manteniéndose estas durante 9 más a fin de reequilibrar el sistema. La duración total de cada inyección fue de 45 minutos. Asimismo, ha de mencionarse que las muestras se analizaron según una secuencia aleatoria, colocándose entre medias varios QCs a fin de asegurar la precisión instrumental. El 49 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos volumen de inyección fue de 10 µL, manteniéndose los viales a 4 °C durante todo el análisis. Los espectros de masas se midieron en polaridad positiva usando un equipo cuya fuente de ionización es el electrospray y cuyo analizar es un QTOF (Agilent 6520). El barrido de masas fue de 50 a 1000 m/z y el voltaje del capilar se fijó en 3000 V, tomándose 0.77 espectros de masas por segundo. La temperatura del gas fue de 330 °C, el flujo del gas de secado de 10.5 L/min y la presión del nebulizador de 52 psi. Por su parte, los parámetros del espectrómetro de masas fueron: diferencia de potencial del fragmentador 175 V, del skimmer 65 V y del octopolo 750 V. A fin de permitir una constante corrección de la m/z detectada por el equipo se inyectaron dos masas de referencia, a saber: 121.0509 ([C5H4N4+H]+) y 922.0098 ([C18H18O6N3P3F24+H]+). Los archivos resultantes se procesaron mediante el algoritmo de deconvolución MFE, herramienta incluida en el programa informático Mass Hunter Qualitative Analysis (B.04.00, Agilent). Acto seguido se alinearon todos los cromatogramas (muestras y QCs) mediante el programa informático MassProfiler Professional (B.02.01, Agilent) para así proceder con su análisis multivariante mediante el uso de SIMCAP+ (12.0.1.0, Umetrics). Gracias a este se generó un modelo de PLS-DA, incluyendo en el mismo todas las variables y la predicción para los QCs (figura 13 A). Como consecuencia se descartó la muestra “día 3”. En un segundo paso se realinearon los cromatogramas correspondientes a las muestras “día 0”, “día 6”, “día 11”, “día 14” y “día 40”, filtrándose sus variables a fin de seleccionar aquellas con un mínimo de 100 % de presencia en al menos uno de los cinco grupos. Seguidamente se procedió a la realización de un t-test comparando los pares “día 0” vs “día 6”, “día 6” vs “día 11”, “día 11” vs “día 14” y “día 14” vs “día 40” seleccionándose las variables cuyo p valor fuese menor o igual de 0.01. Con ellas se construyó el correspondiente modelo de PLS-DA (figura 13 B) además de representarse mediante un HCA (figura 14). En último término la lista de m/z generada tras el t-test se contrastó con la base de datos de libre acceso METLIN, identificándose 49 m/z de interés (±1 ppm) luego proyectados mediante un PLS-DA (figura 13 C). 50 Microbiota intestinal y tratamiento antibiótico, una aproximación multiómica IV.3 - Resultados El agrupamiento de los QCs tras su predicción (figura 13 A) así como los altos valores de R2 y Q2 demuestran tanto la fortaleza del modelo como la validez biológica de la separación existente entre los grupos de muestras, la cual mantiene la misma tendencia tras los filtrados (figura 13 B y C). Consecuentemente se distinguen tres conjuntos: “días 0, 11 y 14”; “día 6” y “día 40”. Esta situación se contrastó con un HCA (figura 14) el cual vino a corroborar la proximidad de las situaciones metabólicas de los “días 0, 11 y 14” y su diferencia respecto de “día 6” y “día 40”. Figura 13. Proyecciones PLS-DA. A) Todo el conjunto de datos (8600 entidades) con predicción de los QCs. 7 componentes principales. R2=0.989. Q2=0.670. B) Variables estadísticamente significativas tras el t-test (382 entidades). 4 componentes principales. R2=0.978. Q2=0.928. C) Variables estadísticamente significativas identificadas en METLIN (49 entidades). 4 componentes principales. R2=0.968. Q2=0.915. 51 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Figura 14. HCA de las variables estadísticamente significativas tras el t-test (382 entidades). Las m/z más abundantes se representan en rojo, las menos abundantes en azul. Esta misma tendencia se observó en los datos de metranscriptómica y proteómica (figura 15). Figura 15. A) Metatranscriptómica. Agrupamiento de las muestras en función del tipo y abundancia de los genes expresados, la distancia entre las mismas se calculó mediante la función Bray-Curtis. B) Proteómica. Agrupamiento de las muestras en función del tipo y abundancia de las proteínas expresadas, la distancia entre las mismas se calculó mediante la correlación de Pearson. 52 Microbiota intestinal y tratamiento antibiótico, una aproximación multiómica Centrándonos en los datos de metabolómica, lo primero a reseñar es que de las 382 variables significativas 29 son comunes a todas las muestras. Asimismo, la muestra “día 40” es la que contiene un mayor número de entidades, 280, seguida de “día 6” con 234, “día 14” con 185, “día 11” con 121 y “día 0” con 139. De acuerdo con las identificaciones putativas de METLIN (tabla 4, anexo) se pueden establecer cinco grupos de metabolitos (figura 16). En base a los mismos destaca el aumento de los ácidos orgánicos de cadena larga y de los péptidos los “días 6 y 40”, estos incluyen: dos esfingolípidos, seis ácidos grasos insaturados, dos amidas, un ácido lipofosfatídico y un tripéptido. Por su parte, los glicero(liso)fosfolípidos están aumentados los “días 11 y 14” y disminuidos tras el fin del tratamiento antibiótico. Finalmente, ha de ser mencionado el significativo aumento en el “día 40” de algunos compuestos tales como varios derivados de colesterol, precursores de vitamina D, ácidos biliares, prostaglandinas y esteroles. Figura 16. Representación esquemática de la abundancia de los distintos grupos de metabolitos bacterianos a lo largo de la secuencia de muestreo. Grupo 1: ácidos grasos (18), esfingolípido (1), glicerolípidos (2), glicerofosfolípido-LPA (1), esterol-alcaloide (1). Grupo 2: ácido graso con aldehídos y alcoholes (1), esfingolípido (1), carnitinas (2), ácido graso con etanolamida (1). Grupo 3: ácido graso con etanolamida (1), esteroles-derivados de vitamina D3/ácidos biliares (4), derivados de prostaglandinas (2), ácido graso insaturado (1). Grupo 4: esfingolípido (1), esterol-derivado de vitamina D3/ácido biliar (1). Grupo 5: esterol-corticoide (1). Entre paréntesis se indica el número de metabolitos de cada clase. 53 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos IV.4 - Discusión La evaluación de las repercusiones del tratamiento antibiótico sobre el ambiente del intestino humano requiere inicialmente de la mención de los dos factores principales que modulan los cambios en la microbiota: primeramente, la selección de las especies resistentes y su posterior remisión tras el cese de la presión antibiótica, y en segundo lugar, la velocidad con la que acontecen los fenómenos en el nivel objeto de estudio, factor muy significativo al tratarse de una aproximación multiómica. En el presente capítulo se ha demostrado que el mayor cambio se produce en la transición entre los días 11 y 14, tras alcanzarse un pico de mínima diversidad microbiana el día 11. Todo ello vendría precedido de una reducción de los organismos Gram-negativos (día 6) y una posible colonización de su nicho ecológico por parte de los microbios propios de la parte superior del tracto intestinal, tales como los Bacteroidetes, que naturalmente son resistentes a los betalactámicos (día 11). Tras esto comenzaría a recuperarse el número y tipo de Gram-positivas propias del tramo distal del intestino, cosa que ya se ha apuntado en varios estudios previos basados en rDNA 16S65 68 69. Estas oscilaciones poblacionales muestran su correlato en la biodiversidad y riqueza de los metabolitos y proteínas determinados en cada uno de los tiempos de muestreo. Uno de los primeros elementos a considerar es la disminución de la expresión proteica, si bien particularmente las proteínas implicadas en la glicolisis, la descarboxilación del piruvato, el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, el metabolismo del glutamato, la incorporación de hierro y la hidrólisis del GTP experimentan un sutil aumento tras el inicio de la administración antibiótica (día 6) a fin de permitir a las bacterias mayores posibilidades de supervivencia ante una situación de estrés y de falta de nutrientes. No obstante, hacia el final del tratamiento todas ellas estarían disminuidas significativamente. Por otro lado, en cuanto a la expresión génica, se ha detectado una disminución general de la actividad de los elementos móviles extracromosomales asociados a la regulación de las secuencias palindrómicas espaciadoras, que en conjunto constituyen un primitivo tipo bacteriano de inmunidad adaptativa73, pues dichas secuencias protegen a 54 Microbiota intestinal y tratamiento antibiótico, una aproximación multiómica las células de la invasión de DNA exógeno (vía virus o plásmido)74. Por ende, bajo la presión antibiótica, la microbiota intestinal sería más susceptible de adquirir nuevas secuencias de DNA, incrementándose así la posibilidad de obtener genes por transferencia horizontal, a la postre responsables del desarrollo de resistencias. Desde la perspectiva metabólica el primer hecho que resultó llamativo fue la disminución de varios grupos de compuestos esperados en base a la estructura de la población microbiana. En esencia, esto sugiere una alteración de la relación establecida entre las enzimas pancreático/hepáticas y las microbianas, lo que es congruente con la situación anteriormente citada que ha lugar con las proteínas. En conjunto esto apuntaría hacia una disminución de la actividad de ciertas vías metabólicas claves, lo cual se ha tratado de modelizar esquemáticamente en la figura 17. Aparentemente, la excreción biliar de los antibióticos es la que dispara toda la cascada de acontecimientos bioquímicos. Inicialmente las bacterias responderían al tratamiento aumentado tanto la actividad de sus sistemas de defensa, tales como la expresión de betalactamasas y péptidos transportadores, como la síntesis de glicerofosfolípidos, a fin de luchar contra una situación de falta de nutrientes. En este contexto disminuirían la producción de polisacáridos y lipopolisacáridos. Por otro lado, los genes relacionados con la síntesis de la cubierta celular y la degradación del peptidoglicano aumentarían su expresión, manteniéndose elevada hasta el final del tratamiento. Asimismo, la parte bacteriana del metabolismo de los ácidos biliares, las hormonas y el colesterol, se ve atenuada, lo que posiblemente afecta a la circulación enterohepática y a la síntesis lipídica, si bien, tras el fin del tratamiento, se retornaría a los niveles previos al inicio del mismo. Una situación análoga ocurre con las vitaminas cuya síntesis o asimilación depende de la microbiota (típicamente la B12). Por lo que respecta a las rutas metabólicas directamente implicadas en la nutrición de los procariotas (glicólisis, ciclo de los ácidos tricarboxílicos, metabolismo del glutamato, incorporación de hierro…) estas presentan una inducción hasta un máximo de actividad que ha lugar el día 6, a partir del cual se atenúan paulatinamente. Esto se traduciría en una significativa disminución en la circulación enterohepática de los compuestos en cuyo proceso de asimilación 55 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos intervienen las bacterias tales como el hierro, algunos azúcares o ciertos aminoácidos ramificados. Finalmente, en lo que respecta stricto sensu a la estructura de la población bacteriana se puede constatar una progresiva oscilación que iría desde una predominancia inicial de los Bacteroidaceae hasta una situación final de dominio de los Burkholderiaceae. Figura 17. Esquema interpretativo de las variaciones de la microbiota y la actividad metabólica en el intestino humano frente a un tratamiento antibiótico. Las líneas continuas indican relaciones, las discontinuas aumentos o disminuciones de las sustancias consignadas en los respectivos recuadros. 56 Microbiota intestinal y tratamiento antibiótico, una aproximación multiómica IV.5 - Conclusiones El presente capítulo constituye una evidencia empírica pionera sobre la posibilidad de la integración de distintos datos ómicos aplicados al estudio de una situación biológica concreta: la evolución de la microbiota y de sus relaciones con el individuo hospedador durante un tratamiento antibiótico con betalactámicos. El modelo construido viene a apuntar en la dirección de la producción de profundas alteraciones en ambos factores durante la administración de los fármacos, para, una vez concluida la pauta posológica, retornarse a una situación más o menos similar a la de partida. Con todo, a pesar de lo atrayente de estas conclusiones, estas deben ser matizadas antes de su generalización pues han sido obtenidas a partir de datos procedentes de un único paciente. 57 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos 58 V Efecto y resistencia de los fármacos antimoniales sobre Leishmania infantum, un enfoque multiplataforma Efecto y resistencia de los fármacos antimoniales sobre Leishmania infantum, un enfoque multiplataforma V - Efecto y resistencia de los fármacos antimoniales sobre Leishmania infantum, un enfoque multiplataforma V.1 - Introducción La leishmaniasis es una de las enfermedades parasitarias más ampliamente difundida a nivel mundial, cuya incidencia aumenta en los países en vías de desarrollo. Actualmente se considera que unos 350 millones de personas viven bajo unas condiciones de serio riesgo de contagio, contabilizándose unos 2 millones de casos nuevos por año75. La transmisión del parásito entre los mamíferos -hospedadores vertebrados- se debe a la picadura de las hembras de la subfamilia Phlebotominae -hospedadores invertebrados-, las cuales necesitan la sangre de los primeros para la maduración de su progenie. Esto introduce algunas formas promastigote en el torrente sanguíneo, comenzando de este modo el ciclo de vida de Leishmania spp. (figura 18). Fagocitados por las células del sistema inmune, rápidamente los promastigotes se transforman en amastigotes en el interior de los fagolisosomas, multiplicándose en medio de este ambiente hostil hasta matar al macrófago. Esto liberaría a la circulación sanguínea una importante carga de amastigotes, los cuales serán ingeridos por las Phlebotominae tras una nueva picadura. El ciclo se cerraría con la vuelta a la forma promastigote, cosa que ha lugar en el intestino medio del hospedador invertebrado. 61 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Figura 18. Esquema del ciclo de vida de Leishmania spp. según el Laboratory Identification of Parasites of Public Health Concern del Centers for Disease Control and Prevention 76. Las manifestaciones clínicas de la enfermedad sirven para su clasificación en tres grupos según produzca una lesión exterior localizada (cutánea), afecte a las mucosas (mucocutánea) o dañe los órganos internos (visceral). Hoy en día los principales focos de leishmaniasis visceral se localizan en Sudán e India, mientras que en Afganistán, Siria y Brasil prima la manifestación cutánea77. En esta última se incluyen algunas variantes particulares tales como la mucocutánea, la cutánea difusa, la recidivante y la dérmica post-kala-azar. Ahora bien, si la leishmaniasis cutánea tiende espontáneamente a su curación (aunque pueda evolucionar a alguna de las formas antes mencionadas según la especie de Leishmania que la haya producido y el estado del sistema inmune)78, la visceral es mucho más agresiva y puede causar la muerte si no se recibe tratamiento. Esta última mayoritariamente la produce el complejo Leishmania (L.) donovani - Leishmania (L.) infantum, si bien la malnutrición y la depresión del sistema inmune (fundamentalmente por una coinfección con VIH) también predisponen a su desarrollo75. 62 Efecto y resistencia de los fármacos antimoniales sobre Leishmania infantum, un enfoque multiplataforma Lamentablemente, los tratamientos actuales están limitados tanto en número como en eficacia. Los primeros en introducirse fueron los antimoniales pentavalentes (Sb (V)), usados ya en Brasil en 1912 contra la leishmaniasis cutánea y mucocutánea y en Italia en 1915 contra la visceral79 80. En las últimas décadas se han desarrollado algunos nuevos fármacos contra la leishmaniasis visceral tales como la anfotericina B o la miltefosina, si bien los antimoniales siguen siendo el tratamiento más frecuente. Tras su uso durante más de sesenta años ha sido en los últimos treinta cuando la aparición de resistencias a Sb (V) ha comenzado a ser un verdadero problema clínico. Esto viene a ilustrarse con el alto porcentaje de fracasos terapéuticos registrado en India en pacientes previamente no tratados, que según los datos más actuales se elevaría hasta un 65 %81. Todo ello apunta hacia un mal uso generalizado de los antimoniales que, en última instancia, sería la razón principal de esta emergencia de resistencias82. Aunque su mecanismo de acción ya ha sido estudiado, los resultados todavía no son concluyentes. Las investigaciones iniciales sugerían que el Sb (V) inhibe la síntesis macromolecular en los amastigostes83, probablemente mediante la alteración del metabolismo energético al perturbar la glicólisis y la β-oxidación de los ácidos grasos84. Trabajos posteriores pusieron de manifiesto la inducción de la apoptosis celular en amastigotes tratados con Sb (III) al detectarse cierta fragmentación de su DNA y la externalización de fosfatidilserina en la superficie de su membrana celular85 86. Finalmente, se ha demostrado que, in vitro, el Sb (III) actúa como inhibidor competitivo de la tripanotiona reductasa87, cosa que apuntaría a que el metabolismo del glutatión y del tripanotión también estaría involucrado en la medida en la que juega un papel central en la regulación del estrés oxidativo. Esta última hipótesis ha ganado popularidad desde que se ha demostrado una relación directa entre el Sb (III) y la perturbación del equilibrio redox del parásito88. Una situación análoga se presenta en lo referente al mecanismo de resistencia, tradicionalmente interpretado como un balance entre la entrada, salida y secuestro de la molécula activa89. En esta línea, en los miembros de la familia Tripanosomatidae no puede obviarse el papel central que juegan el tripanotión y el glutatión, tioles claves en sus 63 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos procesos de detoxificación de metales pesados90. En primer lugar, los niveles de estos se relacionan con los de las enzimas implicadas en la síntesis de glutatión (glutamilcisteina sintasa y gsh 1) y poliaminas (ornitina decarboxilasa), moléculas que a la postre son las precursoras del tripanotión90 91 92 93 94 95. Otra posibilidad a tener en cuenta es la conjugación directa del metal con un tiol, proceso catalizado por la glutatión-Stransferasa96. En este sentido, los niveles de esta última97 así como los de la tripanotión-Stransferasa96 se han visto alterados en los casos de resistencia a antimonio. Por otro lado, la cantidad de este en la célula también puede controlarse actuando sobre su entrada o salida, proceso que, para los metaloides trivalentes, se ha visto mediado por acuagliceroporinas98. Asimismo, la conjugación tiol-Sb es posible gracias a su secuestro en una vacuola intracelular mediante la proteína A, un transportador de la familia ABC 99. Finalmente, la resistencia a Sb también puede relacionarse con el citoesqueleto, estructura fundamentalmente formada por dímeros de α-/β-tubulina. En la medida en la que su síntesis se ve afectada por metaloides100 101 102 103 104 105 como el As y en cuanto a que ya se han registrado casos de resistencia cruzada de este con Sb, no resulta descabellado pensar en una interrelación de ambos a nivel del citoesqueleto. Con todo, para una perfecta compresión de la resistencia también ha de tenerse en cuenta el papel activo que juega el hospedador, factor ampliamente explicado por Haldar et al.78 Siendo esta la situación, la metabolómica, en su enfoque de fingerprinting, constituye una herramienta atractiva para enfrentarse a este problema. En esta línea, para conseguir una cobertura del metaboloma tan completa como sea posible es fundamental la combinación de varias plataformas de análisis106, máxime si la materia a abordar es tan compleja como ciertamente lo es el funcionamiento celular a nivel molecular19. Además, en la medida en la que no se dispone de ningún biomarcador de resistencia a ninguno de los fármacos actualmente en uso contra Leishmania spp. es particularmente urgente su identificación, hasta el punto de constituir una de las prioridades de la Organización Mundial de la Salud107. Consecuentemente, en los últimos años la leishmaniasis ha sido ampliamente estudiada108 109 110 111, incluso en lo referente al mecanismo de acción del Sb78 64 89 112 113. En esta línea, el presente capítulo afronta esta Efecto y resistencia de los fármacos antimoniales sobre Leishmania infantum, un enfoque multiplataforma cuestión mediante el uso de tres plataformas de análisis (LC-MS/MS, CE-MS y GC-MS) a fin de ahondar tanto en el conocimiento del mecanismo de acción como en el de la resistencia a Sb (III) en L. (L.) infantum. El experimento se completa con una estrategia novedosa para el rastreo de 13C, usada a fin de identificar la ruta sintética de los biomarcadores previamente caracterizados. V.2 - Materiales y Métodos Los promastigotes de las cepas de L. (L.) infantum M/CAN/ES/96/BCN150 fueron suministrados por el Dr. F. J. Carrión de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid. Estos se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con un 10 % de suero fetal bovino inactivado por calentamiento a 26 °C. Las cepas resistentes se obtuvieron mediante el cultivo de la parental bajo concentraciones crecientes de tartrato potásico de Sb (III) hasta que los parásitos pudieron soportar 180 µM. El cultivo masivo comenzó con un inóculo de 4.105 promastigotes/mL que, una vez hubo alcanzado la fase exponencial y una concentración de 8.106 promastigotes/mL, fue transferido al mismo volumen de medio fresco e incubado -o no- en presencia de tartrato potásico de Sb (III) 120 µM durante 12 horas (la concentración inhibitoria de éste para esta cepa es de 20.9 µM). Tras su recolección, los parásitos se lavaron con medio Hank a 4 °C e inmediatamente después se congelaron con N2 líquido, manteniéndose a -80 °C hasta su llegada al laboratorio de metabolómica. La preparación del experimento con 13C siguió exactamente los mismos pasos, si bien el cultivo de los parásitos se hizo en medio RPMI1640 cuya arginina había sido sustituida completamente por L-arginina marcada con 13C en todas sus posiciones. De este modo, el diseño experimental contempló la existencia de tres grupos de L. (L.) infantum, a saber: cepas sensibles tratadas (ST), cepas sensibles no tratadas (SNT) y cepas resistentes (R), contando con cuatro réplicas de cada una de ellas. En LC-MS cada pellet de 4.107 promastigotes se resuspendió y lisó mediante la adición de 200 µL de MeOH/H2O (4:1) y posterior agitado con TissueLyser LT (Qiagen, Germany) con 2 bolas de cristal de 2 mm durante 5 minutos a 50 Hz. Seguidamente, las 65 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos impurezas se eliminaron mediante centrifugación (15700 g, 4 °C, 20 minutos) y posterior filtrado del sobrenadante a través de un filtro de nilón de 0.22 µm. De este modo quedó la solución lista para su análisis. En esta plataforma, el perfil metabólico fue obtenido mediante un cromatógrafo de líquidos formado por un desgasificador en línea, dos bombas binarias y un autoinyector (1200 series, Agilent). La columna elegida fue una de fase inversa (Discovery HS C18, 150 x 2.1 mm, 3 µm, Supelco) protegida mediante la correspondiente precolumna (Discovery HS C18, 20 x 2.1 mm, 3 µm, Supelco), ambas mantenidas a 40 °C durante todo el tiempo de análisis. Por su parte, el flujo de trabajo fue de 0.6 mL/min, usándose como fase móvil agua con 0.1 % de ácido fórmico (A) y acetonitrilo con 0.1 % de ácido fórmico (B). El gradiente comenzó con un incremento de B del 25 % al 95 % en 35 minutos, manteniéndose así durante 5 minutos y volviendo a las condiciones iniciales durante el siguiente minuto, mantenidas estas durante 9 más a fin de re-equilibrar el sistema. La duración total de cada inyección fue de 50 minutos. Asimismo, ha de mencionarse que las muestras se analizaron según una secuencia aleatoria, colocándose tanto al inicio como a intervalos regulares varios QCs a fin de asegurar la precisión instrumental. El volumen de inyección fue de 15 µL, manteniéndose los viales a 4 °C durante todo el análisis. Los espectros de masas se midieron en polaridad positiva usando un equipo cuya fuente de ionización es el electrospray y cuyo analizar es un QTOF (Agilent 6520). El barrido de masas fue de 50 a 1000 m/z y el voltaje del capilar se fijó en 3000 V, tomándose 1.95 espectros de masas por segundo. La temperatura del gas fue de 330 °C, el flujo del gas de secado de 10.5 L/min y la presión del nebulizador de 52 psi. Por su parte, los parámetros del espectrómetro de masas fueron: diferencia de potencial del fragmentador 175 V, del skimmer 65 V y del octopolo 750 V. A fin de permitir una constante corrección de la m/z detectada por el equipo se inyectaron dos masas de referencia, a saber: 121.0509 ([C5H4N4+H]+) y 922.0098 ([C18H18O6N3P3F24+H]+). En CE-MS cada pellet de 4.107 promastigotes se resuspendió y lisó mediante la adición de 200 µL de MeOH/H2O (4:1) y posterior agitado con TissueLyser LT (Qiagen, Germany) con 2 bolas de cristal de 2 mm durante 5 minutos a 50 Hz. Seguidamente las 66 Efecto y resistencia de los fármacos antimoniales sobre Leishmania infantum, un enfoque multiplataforma impurezas se eliminaron mediante centrifugación (15700 g, 4 °C, 20 minutos). Posteriormente, 150 µL del sobrenadante se transfirieron y evaporaron a 35 °C en un vial con inserto mediante SpeedVac SPD121P (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Finalmente el precipitado se resuspendió en 150 µL de H2O MilliQ, centrifugándose nuevamente con las condiciones antes descritas y transfiriéndose el sobrenadante a un nuevo vial, quedando así listo para su análisis. En esta plataforma, el perfil metabólico fue obtenido con un equipo de electroforesis capilar (7100 Agilent) acoplado a un espectrómetro de masas TOF (6224 Agilent). La separación se llevó a cabo en polaridad normal en un capilar de sílice fundida de 100 cm de longitud y 50 µm de diámetro. El tampón de separación se preparó a partir de una solución 0.8 M de ácido fórmico en MeOH/H2O (10 %), manteniéndose a 20 °C durante todo el análisis. A lo largo del mismo y antes de cada nueva inyección se procedió a lavar el capilar con el citado tampón durante 5 minutos. Asimismo, el equipo contaba con líquido auxiliar (0.6 µL/min), mezcla de MeOH/H2O (50 %) con 0.1 mM de ácido fórmico y dos masas de referencia, a saber: 121.0509 ([C5H4N4+H]+) y 922.0098 ([C18H18O6N3P3F24+H]+), las cuales permitir una corrección constante de la m/z detectada. Las muestras fueron inyectadas hidrodinámicamente mediante la aplicación de una presión de 50 mBar durante 50 s, seguida de un stacking de tampón introducido mediante la aplicación de 100 mBar durante 10 s. El voltaje de separación fue 30 kV con una presión interna de 25 mBar, siendo el tiempo total de cada análisis 30 minutos. Por su parte, los parámetros del espectrómetro de masas fueron previamente optimizados114 mediante el estudio de la relación señal/ruido para la m/z 175.1179. Estos fueron: fragmentador 100 V, skimmer 65 V, octopolo 750 V, presión del nebulizador 20 psi y, respectivamente, temperatura y flujo del gas de secado 200 °C y 12.0 L/min. El voltaje del capilar se fijó en 3500 V, adquiriéndose los datos en modo positivo en un barrido de masas de 80 a 1000 m/z y midiéndose 1.02 espectros/s. Asimismo, ha de mencionarse que las muestras se analizaron según una secuencia aleatoria, colocándose tanto al inicio como a intervalos regulares entre ellas varios QCs. 67 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos En GC-MS cada pellet de 4.107 promastigotes se resuspendió y lisó mediante la adición de 350 µL de MeOH/Cl3CH/H2O (3:1:1) y posterior agitado con TissueLyser LT (Qiagen, Germany) con 2 bolas de cristal de 2 mm durante 5 minutos a 50 Hz. Seguidamente las impurezas se eliminaron mediante centrifugación (15700 g, 4 °C, 20 minutos). Posteriormente, 200 µL del sobrenadante se transfirieron y evaporaron a 35 °C en un vial con inserto mediante SpeedVac SPD121P (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Para la metoximación se adicionaron 10 µL de hidrocloruro de o-metoximamina en piridina (15 mg/mL), incubándose las muestras durante 16 horas en oscuridad. Después se añadieron otros 10 µL de BSTFA con un 1 % de trimetilclorosiloxano, incubándose las muestras durante 1 hora a 70 °C para su sililación. Finalmente se adicionaron 100 µL de heptano con C18:0 metilester (100 ppm), compuesto usado como patrón interno. Siguiendo exactamente el mismo procedimiento se prepararon dos blancos, analizados estos al inicio y al final de la secuencia. Asimismo, ha de mencionarse que las muestras se analizaron según una secuencia aleatoria, colocándose tanto al inicio como a intervalos regulares entre ellas varios QCs. En esta plataforma, el perfil metabólico fue obtenido mediante un cromatógrafo de gases (Agilent Technologies 7890A) acoplado a un autoinyector (Agilent Technologies 7693) y un cuadrupolo (Agilent Technologies 5975). La columna elegida fue una DB5-MS de 30 m de longitud, 0.25 mm de diámetro interno y 0.25 µm de recubrimiento interno, formado este por una película de dimetilpolisiloxano (95 %) y difenilpolisiloxano (5 %). Esta se protegió con una precolumna de 10 m (Agilent 122-5532G), inyectándose 2 µL de muestra derivatizada. El flujo del gas portador (He) se fijó en 1 mL/min y la temperatura del inyector en 250 °C. La relación de split fue 1:10, usándose un liner con lana de vidrio desactivada (Restek 20782). El gradiente de la temperatura comenzó a 60 °C, mantenidos durante un minuto, e incrementándose a partir de aquí hasta los 325 °C a razón de 10 °C/min. Finalmente se refrescó el sistema durante 10 minutos a fin de acondicionarlo para la siguiente inyección. El tiempo total de análisis fue de 37.5 minutos. La línea de transferencia del detector, el filamento de la fuente y la temperatura del cuadrupolo se fijaron respectivamente en 290 °C, 230 °C y 150 °C. Por su parte, la fuente de ionización de 68 Efecto y resistencia de los fármacos antimoniales sobre Leishmania infantum, un enfoque multiplataforma impacto electrónico trabajó a -70 eV, midiéndose en polaridad positiva con un rango de barrido de 50 a 600 m/z y detectando 2 espectros por segundo. Tras el trabajo de laboratorio, este inmenso volumen de datos recolectados se trató de dos maneras distintas, de una para LC-MS y CE-MS y de otra para GC-MS. En LC y CE los archivos resultantes se procesaron mediante el algoritmo de deconvolución MFE, herramienta incluida en el programa informático Mass Hunter Qualitative Analysis (B.04.00, Agilent). Acto seguido se alinearon de manera independiente para cada técnica todos los cromatogramas mediante el programa informático MassProfiler Professional (B.02.01, Agilent). Las m/z se filtraron en base a su presencia en las muestras de los distintos grupos (QCs, ST, SNT y R), fijándose como criterio para todas las técnicas un 50 % de presencia en los QCs además de un 75 % de presencia mínima de cada m/z en cada grupo (ST, SNT y R). Procediéndose a la comparación por parejas (ST vs SNT para investigar el efecto del tratamiento y R vs SNT para indagar sobre las causas de la resistencia), las diferencias significativas se evaluaron mediante un test estadístico univariante (MannWhitney U, p valor ≤ 0.05). Esta lista de masas se contrastó con la base de datos de libre acceso METLIN. Para aquellos compuestos que resultaron ser más interesantes se procedió a la confirmación de su identificación con LC-MS/MS, para esto se repitió el análisis en las mismas condiciones pero fragmentándose los iones seleccionados mediante disociación por colisión inducida. Así se generaron sus espectros de MS/MS. Comparando estos con los de las estructuras propuestas fue posible concluir a cuál de ellas se correspondían. La información para esto se obtuvo a partir de tres fuentes: METLIN, los patrones comerciales (en el caso de estar disponibles) y el programa informático MS Fragmentor (12.01, ACD/Labs). En lo que respecta a GC-MS el tratamiento de datos comenzó con la identificación de los metabolitos. Esta, junto con la deconvolución, se realizó mediante el programa informático AMDIS115 (versión 2.69), el cual compara los espectros y los índices de retención o tiempos de elución de los datos experimentales con los de la biblioteca de Fiehn116. La fiabilidad de este procedimiento viene garantizada por la reproducibilidad de los patrones de fragmentación en una fuente de impacto electrónico así como por el 69 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos reajuste de la elución de los distintos compuestos en base al RT del patrón interno, que en la biblioteca de Fiehn es de 19.663 minutos. El filtrado fue análogo al descrito anteriormente. Finalmente se procedió al análisis de las muestras cultivadas con 13C mediante LCMS y CE-MS, siguiéndose las mismas condiciones metodológicas ya descritas para ambas técnicas. Para la determinación de la presencia o ausencia de la marca de 13C se compararon las cepas control y las tratadas con L-arginina marcada, identificándose el correspondiente pico [M+nº13C+H]+ en el espectro de masas de alguna de aquellas entidades que resultaron ser estadísticamente significativas (Mann-Whitney U, p valor ≤ 0.05). V.3 - Resultados En aras de demostrar la calidad del modelo biológico y el rigor analítico del experimento se procedió a la construcción de tres modelos de PCA mediante el programa SIMCAP+ (12.0.1.0, Umetrics) (figura 19). En base a la separación observada entre los grupos, así como por el agrupamiento de los QCs, se confirmó la validez de los resultados en ambos aspectos. Figura 19. Modelos de PCA construidos con los features filtrados al 50 % de presencia en los QCs. A) LC-MS: 2 componentes, R2=0.620, Q2=-0.029. B) CE-MS: 2 componentes, R2=0.872, Q2=0.694. C) GC-MS: 2 componentes, R2=0.515, Q2=0.235. 70 Efecto y resistencia de los fármacos antimoniales sobre Leishmania infantum, un enfoque multiplataforma Con idéntico propósito y llegando a las mismas conclusiones se confeccionaron los modelos de PCA para los análisis de 13C (figura 20). Esto supone de facto una validación biológica de los resultados obtenidos tras el primer experimento. Figura 20. Modelos de PCA construidos con los features filtrados al 50 % de presencia en los QCs (muestras control y 13C). A) LC-MS: 3 componentes, R2=0.428, Q2=0.107. B) CE-MS: 2 componentes, R2=0.577, Q2=0.424. La tabla 5 resume el número de m/z que superaron cada una de las etapas de filtrado descritas en el apartado anterior. De aquellas que resultaron ser estadísticamente significativas sus identificaciones, naturaleza bioquímica y porcentajes de cambio (para cada comparación ST vs SNT y/o R vs SNT) se recogen en la tabla 6 (anexo), complementada con la tabla 7 (anexo) donde se han consignado los fragmentos usados para la identificación por LC-MS/MS. La lista de los metabolitos marcados con 13C estaría reflejada en la tabla 8 (anexo). Por su parte, en la figura 21 se presenta un gráfico con el número de compuestos identificados por técnica. Ya en este punto se hace evidente lo útil que resulta un análisis multiplataforma pues solo 10 de los 61 compuestos (16 %) son comunes a dos técnicas y ninguno de ellos se detectó en las tres. Esto significa que el 84 % restante es exclusivo de una técnica, repartido más o menos equitativamente entre las tres plataformas al identificarse un 35 % en CE-MS, un 26 % en GC-MS y un 23 % en LCMS/MS. 71 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Tabla 5. Número de compuestos tras el alineamiento, el filtrado y la estadística para cada una de las comparaciones (ST vs SNT y R vs SNT) y técnicas de análisis. Número de m/z Tras el alineamiento Tras el filtrado Tras la estadística Identificadas LC-MS ST vs. R vs. SNT SNT CE-MS ST vs. R vs. SNT SNT 7299 7299 1072 1072 89 89 1197 283 1074 278 79 32 157 97 36 23 40 24 14 31 GC-MS ST vs. R vs. SNT SNT 26 Figura 21. Número de compuestos identificados por técnica de análisis. En esta línea, la figura 22 representa la clasificación de los compuestos identificados por técnica en base a su naturaleza bioquímica. En general, la categoría más abundante es la de los aminoácidos, péptidos y conjugados, con al menos un 22 %. A ella le siguen la de los ácidos orgánicos y las aminas. No obstante, las diferencias por técnica son importantes. En CE-MS los aminoácidos, péptidos y conjugados son el grupo más destacado con un 67 %, tras este sitúan las purinas y pirimidinas con un 13 % y los ácidos orgánicos con un 10 %. Por su parte, en GC-MS, tras los aminoácidos (42 %), el colectivo más significativo es el de los carbohidratos con un 27 % y luego el de las purinas y pirimidinas con un 12 %... y lo que es más, tanto carbohidratos como esteroles y prenoles no se han detectado en ninguna otra plataforma. En lo que atañe a LC-MS/MS el grupo dominante es el de los ácidos grasos con un 36 %, seguido del de los aminoácidos con un 22 % y los esfingolípidos y bases esfingoideas con un 21 %. Asimismo tanto los ácidos grasos como los esfingolípidos y los glicerofosfolípidos son exclusiva de esta técnica. 72 Efecto y resistencia de los fármacos antimoniales sobre Leishmania infantum, un enfoque multiplataforma Aminas Ácidos grasos Ácidos orgánicos Aminoácidos, péptidos y conjugados Carbohidratos Cetonas y aldehidos Esfingolípidos y bases esfingoideas Esteroles Glicerofosfolípidos Purinas/pirimidinas y conjugados Figura 22. Porcentaje de compuestos identificados por técnica clasificados en función de su naturaleza bioquímica. Los colores indican el grupo biológico, referenciado este en la tabla contigua. V.4 - Discusión Generalmente se ha venido aceptando que los antimoniales pentavalentes necesitan reducirse a su forma trivalente para tener actividad antileishmania77. No obstante, tanto el lugar donde esto ocurre (macrófago o amastigote) como el mecanismo que media el proceso (enzimático o no enzimático) son fuente de controversia. Por ejemplo, algunos estudios117 118 119 120 sugieren que los amastigotes axénicos son sensibles al Sb (V) mientras que no lo son los promastigotes, lo que apuntaría a que la reducción se produce en esta etapa del ciclo de vida del parásito. Sin embargo, la situación opuesta también ha sido objeto de publicación121. Asimismo ha de tenerse en cuenta que tanto el glutatión como el tripanotión pueden reducir Sb (V) de manera no enzimática bajo condiciones ácidas122 123 124 125 126, si bien también es posible que esto acontezca por una vía enzimática mediada por una reductasa tiol dependiente -relacionada con la glutatión S-transferasa-127 o por un homólogo de la arsenato reductasa128. Precisamente para evitar esta polémica se decidió usar directamente antimonio trivalente sobre promastigotes de L. (L.) infantum. Tal y como se ha expresado en la introducción, es bien sabido que los fármacos antimoniales alteran el equilibrio redox de Leishmania spp. al interferir en su capacidad para producir antioxidantes derivados del tripanotión. Sin embargo, las últimas investigaciones han demostrado que esto es más complejo de lo que se pensaba en la medida en la que se ha constatado una significativa reacción del sistema inmune del hospedador al gluconato sódico de antimonio, capaz de activar tanto la inmunidad 73 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos innata129 como la adaptativa130. En cuanto al primer tipo de inmunidad, se ha visto como el gluconato sódico de antimonio induce la generación de radicales libres en las células sanguíneas periféricas de ratones infectados con L. infantum131 así como la producción de NO en leishmaniasis canina132. En lo que atañe a la inmunidad celular ha de mencionarse que el gluconato sódico de antimonio induce la proliferación de los linfocitos T, concretamente los Th1133 134 y los T citotóxicos135, si bien no actúa sobre los linfocitos B, lo que podría constituir una buena explicación de la pobre respuesta registrada al tratamiento con antimoniales en pacientes coinfectados con Leishmania spp. y VIH. Tal y como se observa en los resultados (tabla 6, anexo), tanto la arginina como sus subproductos ornitina, putrescina y tripanotión disulfuro están disminuidos en los parásitos tratados. Por otro lado, tanto la arginina como el tripanotión disulfuro, la putrescina y la ornitina están incrementados en las cepas resistentes. A este respecto algunos estudios han sugerido que la disponibilidad de arginina es uno de los factores limitantes para la supervivencia del parásito136 137. Esto se entiende en tanto que la arginina puede usarse para la producción de citrulina y ornitina y esta a su vez para sintetizar putrescina y espermidina. Esta última se usa junto con el glutatión para formar glutationil-espermidina y tripanotión, el principal antioxidante del parásito138. Si un primer pensamiento nos induciría a afirmar que el tratamiento con antimoniales estaría actuando vía aumento de la producción de NO, compuesto que mataría al parásito, esto debe matizarse, pues conforme avanza la terapia y decrece el número de parásitos, también lo hace la producción de NO, hecho que parece apuntar a que la principal acción del antimonio se ejercería de manera directa sobre el metabolismo del parásito139 y no sobre el del hospedador. En este sentido los resultados confirman uno de los mecanismos propuestos para explicar la actuación del Sb (III) vía perturbación de la síntesis de tripanotión disulfuro. Asimismo apuntan hacia una novedosa explicación del fenómeno de la resistencia, que estaría causada por un aumento permanente de los niveles de arginina y sus subproductos (figura 23). El rol central del metabolismo de este aminoácido queda confirmado por la marcación con 13C de la ruta de las poliaminas (tabla 8, anexo). 74 Efecto y resistencia de los fármacos antimoniales sobre Leishmania infantum, un enfoque multiplataforma Figura 23. Representación esquemática de las principales alteraciones del metabolismo. Verde: metabolito aumentado. Rojo: metabolito disminuido. Subrayado: detectado con 13C. Flecha continua: relación bioquímica directa. Flecha discontinua: relación bioquímica mediada por dos o más enzimas. A) ST vs SNT. B) R vs SNT. V.5 - Conclusiones Los resultados recogidos en este capítulo demuestran la necesidad de un enfoque multiplataforma para lograr una cobertura del metaboloma tan completa como sea posible, detectándose un tipo u otro de compuestos según la técnica utilizada. Asimismo, se evidencia el potencial explicativo de la metabolómica en cuanto a herramienta bioanalítica per se, capaz de generar un modelo explicativo en respuesta a las preguntas 75 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos sobre el mecanismo de acción del Sb y la generación de resistencias por Leishmania (L.) infantum. 76 VI Contaminación, biodegradación y actividad microbiana en el Mediterráneo y el mar Rojo, hacia la integración multiómica Contaminación, biodegradación y actividad microbiana en el Mediterráneo y el mar Rojo, hacia la integración multiómica VI - Contaminación, biodegradación y actividad microbiana en el Mediterráneo y el mar Rojo, hacia la integración multiómica VI.1 - Introducción El mar Mediterráneo es una de las áreas geográficas más amenazadas por el alto riesgo de contaminación que sufren sus aguas, debida tanto al gran número de conducciones residuales y vertidos industriales como al intenso tráfico marítimo. Sirva como ejemplo que, solo este último, se estima en unos 55 millones de toneladas métricas de crudo por año140 141, lo que supone el 20 % de la producción mundial, cantidad increíble si se tiene en cuenta que el Mediterráneo apenas representa el 1 % de la superficie marítima planetaria. A tenor de estas cifras no resulta sorprende que, por ejemplo en el año 2000, hubiera unas 600 mil toneladas métricas de vertidos de crudo142 143. En esta línea, diversos estudios han demostrado que un alto número de ensenadas, puertos y estuarios están contaminados144, incluyendo una cifra considerable de productos metabolizados que son incluso más dañinos que los de partida145, lo que ocasiona indeseables sinergias y aumenta así la toxicidad total146. Por si fuera poco, todo esto se ve agravado por el perfil geográfico del Mediterráneo y su carácter de cuenca semi-cerrada, motivo por el cual estas especies químicas se ven atrapadas y tienden a acumularse. Por todo ello resulta crucial tanto una mejor comprensión del destino y recuperación de estas áreas147 como del impacto de estos vertidos sobre nuestra cadena alimentaria148, además de poder conocerse que poblaciones microbianas pueden vivir en tales ambientes. En este sentido, la distribución de las especies bacterianas debe resultar de especial interés dada la gran diversidad de sedimentos, salinidades, oreografías, climas, tipos de nutrientes y posibles asociaciones entre los distintos consorcios de procariotas 149 150, lo que no es sino muestra de la flexibilidad y adaptabilidad de sus metabolismos 151. Las especies microbianas que más contribuyen a la degradación de crudo pertenecen al grupo de las Gammaproteobacteria (particularmente a los géneros Alcanivorax, Marinobacter, Oleispira, Thalassolitus, Oleiphilus, Cyclocasticus y Neptunomonas) y de las 79 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Alphaproteobacterias (en especial el orden Rhodobacterales), siendo mucho menos frecuentes los Firmicutes (concretamente los del género Planomicrobium). En su conjunto, este es el elenco dominante en estos ecosistemas contaminados, si bien, cada organismo tiene sus preferencias. Por ejemplo, los géneros Cycloclasticus y Neptunomonas son especialista en la degradación de hidrocarburos policíclicos aromásticos146, por su parte Oleispira antárctica152 y Thalassolitus oleivorans153 optan por las aguas frías, mientras que Oleiphilus messinensis y Alcanivorax borkumensis154 se decantan por las de temperatura más moderada. La situación, per se, dista de ser sencilla, para complicarse aún más al deberse tener en cuenta las influencias de la concentración de crudo en el agua 155 156 157 158, su propia diversidad química158 y su interacción con los diversos procesos geoquímicos locales158. En conclusión, tanto la diversidad microbiana como su carga genética se ven profundamente afectadas por los vertidos de petróleo148 156 159 160 161, fenómeno que, tras los estudios de los derrames de crudo que se produjeron en la plataforma Deepwater Horizon en 2010 en el Golfo de México, se ha determinado que aproximadamente tarda un mes en manifestarse162. Sin embargo, y a pesar de todo lo que se ha investigado, hasta la fecha no se han combinado técnicas de secuenciación génica con modelos computacionales para estudiar la estructura de las poblaciones de procariotas y sus rutas metabólicas de biodegradación de tóxicos en lugares contaminados por petróleo. Asimismo, muchas secuencias génicas de las que disponemos no han podido ser vinculadas con una especie en concreto. En este sentido este trabajo es el siguiente paso lógico, estudiar la composición de la comunidad bacteriana y su actividad combinando datos genómicos y metabolómicos, en los cuales aquí nos centraremos especialmente. Todo ello se ha desarrollado gracias a la financiación y colaboración de tres proyectos a nivel comunitario, a saber, MAGICPAH163, ULIXES164 y KILLSPILL165. Bajo este marco, los objetivos planteados por la Unión Europea fueron tres: determinar la influencia de las contaminaciones crónicas de petróleo en la diversidad microbiana, estudiar la capacidad metabólica de las comunidades de procariotas 80 Contaminación, biodegradación y actividad microbiana en el Mediterráneo y el mar Rojo, hacia la integración multiómica establecidas en tales áreas y, en base a esto, intentar desarrollar nuevos biométodos para su descontaminación. En esta línea y enlazando con lo referido en primer lugar, el mar Mediterráneo es un área de particular interés y todavía no muy estudiada por la comunidad internacional a este nivel. Para tales propósitos se recogieron muestras de sedimentos de ocho lugares (figura 24) contaminados por crudo y diseminados a lo largo y ancho de sus costas, procedentes de ubicaciones tan dispares como Marruecos, Túnez, Egipto, Grecia e Italia (del golfo de Génova y de las aguas de Mesina y Siracusa). La lista se completó con una muestra del puerto de Aqaba (Jordania) en el mar Rojo. Figura 24. Localización geográfica y nomenclatura adoptada para cada una de las muestras procedentes de los correspondientes emplazamientos contaminados. Cada uno de estos emplazamientos resulta interesante por diversos motivos. El Max (ELMAX) se localiza al oeste de la ciudad de Alejandría, siendo éste el punto más contaminado de las costas egipcias al exceder ampliamente el límite legal en las concentraciones de metales pesados, hidrocarburos aromáticos y otros derivados del 81 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos petróleo. En el extremo occidental, la ensenada Mar Chica (MCh) es una de las mayores bahías de todo el Mediterráneo en la cual se recogen todos los vertidos de la ciudad marroquí de Nador. Por su parte, la ensenada de Bizerta (BIZ) se localiza en las aguas de Túnez y está contaminada tanto por la urbanización costera como por la refinería STIR. Más al este, el golfo de Aqaba (AQ), de territorialidad jordana, da cobijo a una de las mayores terminales petroleras del mundo con unos 20 ó 30 millones de toneladas métricas anuales de tránsito, lugar en el que los vertidos accidentales por las operaciones de carga y descarga son relativamente frecuentes. Por otro lado, el puerto de Priolo (PRI) Gargallo, próximo a las aguas de la localidad siciliana de Siracusa, se caracteriza por una densa concentración de industrias pesadas que conllevan un intenso tráfico marítimo, relacionado tanto con la exportación de su producción como con su abastecimiento de hidrocarburos. También en Sicilia, pero al norte, se ubica el puerto de Mesina (MES) el cual sufre de una contaminación crónica de petróleo y sus derivados debida a la baja renovación hidrodinámica de sus aguas. Por su parte, en el golfo de Génova se hundió en 1991 el petrolero MT Haven (HAV). Finalmente, Elefsina (ELF), bahía próxima a Atenas, presenta altos grados de contaminación debidos a los vertidos de la refinería ELPE. Al margen de estas consideraciones geográficas, las expectativas europeas se concretaron en cuatro puntos, objetivos de un trabajo más amplio que el aquí consignado. En primer lugar, caracterizar el ambiente geoquímico de las zonas contaminadas. En segundo término, determinar que microbios ocupan dichos nichos ecológicos. Seguidamente, averiguar si los cambios en la población microbiana de las distintas zonas se asocian a sus capacidades biodegradativas y/o a las especies químicas del ambiente. Finalmente, acometer una caracterización metabólica detallada de los mecanismos de biodegradación propuestos en base a una reconstrucción computacional elaborada a partir de datos de secuenciación génica. Para esto último se han dado tres pasos: secuenciar el DNA total, relacionar estos datos con secuencias génicas conocidas y contenidas en las base de datos de KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) e integrar esta información con los resultados de un análisis metabólico dirigido de las especies químicas más relevantes. 82 Contaminación, biodegradación y actividad microbiana en el Mediterráneo y el mar Rojo, hacia la integración multiómica VI.2 - Materiales y Métodos La toma de muestra se llevó a cabo entre abril de 2011 y septiembre de 2013 en los ocho lugares ya referidos (figura 24). Para ello se recogieron entre 10 y 1200 g de sedimento marino, a continuación almacenados en frío. A partir de estas muestras se acometieron las correspondientes medidas de los parámetros geoquímicos de interés y se realizaron los tratamientos pertinentes a fin de prepararlas para su análisis genómico y metabolómico. Todo este proceso, así como la planificación experimental del proyecto, corrió a cargo del Dr. Michail M. Yakimov, miembro del Institute for Coastal Marine Environment (Messina, Italia), del Dr. Daniele Daffonchio, catedrático de la Università degli studi di Milano (Italia) y del Dr. Manuel Ferrer, miembro del Instituto de Catálisis del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Madrid, España). Tanto los cultivos microbianos, como los datos de genómica y la reconstrucción informática de las rutas metabólicas que se recogen en el presente capítulo es fruto del trabajo de sus equipos así como de su coordinación. El tratamiento de las muestras para su análisis metabolómico de fingerprinting partió de 5 g de sedimento, mezclados con 10 mL de MeOH frío (-80 °C). Estos fueron sonicados durante 2 minutos, procedimiento que se repitió cuatro veces mediando entre cada una de las mismas lapsos de 2 minutos. Durante todo este tiempo las muestras se mantuvieron refrigeradas. A continuación se procedió a retirar el sobrenadante, luego centrifugado a 10000 g y 4 °C durante 30 minutos. Precipitadas todas las impurezas sólidas, el extracto de interés se almacenó a -80 °C hasta su llegada al laboratorio de metabolómica, donde no recibió más tratamiento que su purificación a través de un filtro de nilón de 0.2 µm de tamaño de poro. Dada la limitación en la cantidad de sedimento de partida solo PRI, HAV, MES y AQ fueron objeto de fingerprinting, analizándose tres réplicas de cada una obtenidas de las división del extracto metanólico inicial. Los correspondientes QCs se prepararon mediante la mezcla de una parte alícuota tomada de cada una de las muestras. El perfil metabólico fue obtenido mediante LC-MS, cuyo método, columna y equipo se corresponden con los ya descritos en el capítulo I de la presente tesis. Los archivos resultantes se procesaron mediante el algoritmo de 83 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos deconvolución MFE, herramienta incluida en el programa informático Mass Hunter Qualitative Analysis (B.05.00, Agilent). Acto seguido se alinearon todos los cromatogramas (muestras y QCs) mediante el programa informático MassProfiler Professional (B.02.01, Agilent), procediéndose a su filtrado en base a la selección de aquellas variables presentes en al menos el 50 % de los QCs y en el 100 % de las muestras de cada grupo. De este modo en LC-MS (+) el número de variables se redujo de 114050 a 3390 y en LC-MS (-) de 54358 a 1485. Seguidamente se llevó a cabo un análisis multivariante de los datos filtrados mediante el uso de SIMCAP+ (12.0.1.0, Umetrics) (figura 26 A). Asimismo se realizó un HCA previa normalización de los datos mediante la división de sus abundancias individuales por la desviación estándar de cada variable (figura 26 B), procedimiento llevado a cabo gracias a la página web de libre acceso MetaboAnalyst 2.0166. Por otro lado, el análisis metabolómico dirigido comenzó con la preparación de nuevas muestras. Para tal fin se suplementó un medio mínimo ONR7a con una mezcla de los siguientes sustratos al 0.1 % de concentración final. Estos fueron: naftaleno, tetradecano, ácido benzoico, ácido 4-clorobenzoico, ácido 3-nitrobenzoico, ácido 4hidroxibenzoico, ácido ftálico, ácido isoftálico, ácido tereftálico, antraceno, 2,3dihidroxibifenilo, ácido 4-hidroxifenilpirúvico, ácido 3,4-fenoxibenzoico, carbazol, fenol, 2,4,6-trihidroxitolueno y ácido gálico, todos ellos del proveedor Fluka-Aldrich-Sigma Chemical Co. (St. Louise, MO, USA). Una vez conseguida esta preparación, 300 mL de esta mezcla fueron añadidos a 100 mL de sedimento marino de cada uno de los lugares de muestreo, los cuales previamente habían sido convenientemente mezclados con 10 mL de petróleo árabe esterilizado por filtración. Estos 100 mL de sedimento contaban aproximadamente con una densidad celular de 2.0 x 105 células/g. Finalmente se añadieron NH4Cl y Na2HPO4 hasta alcanzar una concentración de 5 mM y 0.5 mM respectivamente. Estos cultivos se mantuvieron en agitación constante a 250 rpm, controlándose tanto su temperatura como su concentración de O2 a fin de reproducir las condiciones medioambientales (tabla 9). Los tiempos de incubación hasta la toma de muestra fueron de 1 día (R0) , 2 semanas (R2) y 3 semanas (R3), contándose por tanto con una batería de 24 muestras a analizar. Para su recolección se centrifugó el cultivo a 13000 84 Contaminación, biodegradación y actividad microbiana en el Mediterráneo y el mar Rojo, hacia la integración multiómica g durante 5 minutos, añadiéndose posteriormente 1.2 mL de MeOH frío sobre la fracción celular, a partir de lo cual se siguió el procedimiento ya descrito en el capítulo II de la presente tesis y objeto de la citada publicación71. Asimismo y a fin de determinar la presencia o ausencia de los citados metabolitos junto a la de sus productos de degradación (catecol, clorocatecol, ácido salicílico, ácido mucónico, ácido gentísico, ácido protocatecuico, ácido homogentísico, ácido mirístico, tolueno y ácido homoprotocatecuico) se prepararon las correspondientes patrones (proveedor FlukaAldrich-Sigma Chemical Co., St. Louise, MO, USA) en MeOH a una concentración aproximada de 100 ppm, analizándose estos en una secuencia separada de la de las muestras. A nivel experimental tanto patrones como muestras se analizaron por LC-MS (método, columna y equipo especificados en el capítulo I) y GC-MS (método, columna y equipo especificados en el capítulo III). Aun cuando se trató de un análisis dirigido se prepararon QCs a fin de garantizar la estabilización inicial del sistema cromatográfico. La correspondiente identificación y caracterización de los picos cromatográficos de los estándares se basó tanto en su espectro como en su tiempo de retención, a partir de los cuales se confeccionaron dos bibliotecas, una para cada una de las plataformas de análisis. Mediante los programas informáticos ChemStation (G1701EA E.02.00493, Agilent) en GCMS y Mass Hunter Qualitative Analysis (B.05.00, Agilent) en LC-MS y en base a estas bibliotecas se realizó en las muestras la identificación e integración de los picos correspondientes a los compuestos de interés (tabla 10). VI.3 - Resultados La caracterización de los distintos ambientes geoquímicos (tabla 9) constituyó el primer paso para determinar si es su diversidad la que induce un crecimiento de comunidades microbianas distintas o si por el contrario los responsables son los contaminantes. 85 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Tabla 9. Características fisicoquímicas principales de los sedimentos investigados. (-): no determinado. Masa muestra (g) Temperatura (°C) Conductividad (mS/cm) pH Profundidad (m) Densidad microbiana (células/g) [Petróleo total] (ppm) [Ca2+] (mg/L) [Cl-] (mg/L) [O2] (mg/L) AQ 50 27 89 8.30 18 3.4 x 105 2400 126 20000 20.0 BIZ 50 13 7.76 2.6 x 105 1120 20000 - ELF 50 13 57 7.50 16 2.3 x 105 500 20000 6.0 ELMAX 50 20 77 7.59 9 3.0 x 105 1822 20000 18.0 HAV 1200 15 49 8.05 78 1.9 x 106 Alquitrán 420 20000 6.0-6.5 MCh 10 21 54 8.62 32 2.6 x 105 5100 87 20000 22.0 MES 1200 23 70 7.37 1 2.2 x 105 1000 420 20000 1.0-2.2 PRI 1200 19 49 6.85 6 4.0 x 105 4000 420 20000 0.0 El siguiente paso lógico fue el procesamiento de la información procedente de la secuenciación génica, obtenida esta mediante amplificación por PCR de rRNA 16S, a fin de determinar la variedad taxonómica en las muestras de sedimentos contaminados. La correlación de estos datos con las unidades taxonómicas operacionales queda reflejada en la figura 25 A, donde se dan noticia de los distintos phyla microbianos presentes. Su interrelación se estableció mediante el correspondiente modelo de PCA (figura 25 B). Figura 25. Resultados de la secuenciación de rRNA 16S. A) Diversidad y abundancia relativa de los distintos phyla microbianos. B) PCA. Esta batería de resultados, luego usados para la reconstrucción computacional de las rutas de degradación, se complementó con los datos metabolómicos (figura 26 y tabla 10). El agrupamiento de las muestras observado en los modelos de PCA (figura 26 A) 86 Contaminación, biodegradación y actividad microbiana en el Mediterráneo y el mar Rojo, hacia la integración multiómica demuestra que la dispersión entre estas es debida a una diferencia biológica real y no al azar, lo que asimismo refuerza la validez de la metodología de análisis. Por otra parte, la relación entre las muestras en base a su huella metabólica se expone en el HCA (figura 26 B). La tabla 10 recoge las abundancias de los distintos metabolitos cuya biodegradación fue predicha por el modelo computacional. Figura 26. A) Modelos de PCA construidos con los datos filtrados. A1) LC-MS (-): 2 componentes principales, R2=0.338, Q2=0.013. A2) LC-MS (+): 2 componentes principales, R2=0.491, Q2=0.210. B) HCA construido con los datos filtrados y normalizados. B1) LC-MS (). B2) LC-MS (+). 87 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Tabla 10. Abundancias relativas de los distintos compuestos cuyo metabolismo fue predicho computacionalmente. N.D.: no detectado. Metabolito Fórmula Técnica analítica Masa monoisotópica Ion principal Ion cualificador RT patrones (min) AQ R1 AQ R2 AQ R3 BIZ R1 BIZ R2 BIZ R3 ELF R1 ELF R2 ELF R3 ELMAX R1 ELMAX R2 ELMAX R3 HAV R1 HAV R2 HAV R3 MCh R1 MCh R2 MCh R3 MES R1 MES R2 MES R3 PRI R1 PRI R2 PRI R3 2,3-dihidroxibifenilo C12H10O2 GC-MS 186.0681 330 212 16.9 8862 74787 55052 5641 165527 117000 9518 103999 106625 7745 202856 168988 8305 191023 238394 6406 140359 156961 9356 56319 56033 8041 344736 289554 2,4,6trihidroxitolueno C7H8O3 GC-MS 140.0473 341 253 15.3 176 264 69 70 57 74 334 57 64 75 175 64 121 102 59 60 63 135 388 84 195 57 77 158 Ácido 3,4fenoxibenzoico C13H10O3 GC-MS 214.0630 271 227 18.0 23274 547560 517007 22639 260227 251671 24118 571067 508540 22543 549540 576060 21740 509050 480614 20279 254960 249900 22962 87005 84240 27034 77950 71447 Ácido 3nitrobenzoico C7H5NO4 GC-MS 167.0219 224 178 14.4 4700 7776 8487 4060 78839 75111 4930 47830 42410 4903 45388 46095 3959 86875 82738 4295 65027 64505 4394 26025 25941 5195 83944 75850 Ácido 4clorobenzoico C7H5ClO2 GC-MS 155.9978 213 169 11.8 13983 65242 38631 5672 124621 102480 8515 16117 17827 6429 119830 88384 9801 228563 317203 5866 216731 489522 10230 145635 168756 7019 254822 178336 Ácido 4hidroxibenzoico C7H6O3 GC-MS 138.0317 267 193 14.5 26448 45953 46369 26513 483165 465397 27771 285352 259072 22772 279783 280859 25978 551171 521734 24109 395442 405647 27480 157391 145657 33203 516449 491910 Ácido 4hidroxifenilpirúvico C9H8O4 GC-MS 180.0423 338 277 17.5 1707 2343 2000 1794 13973 17624 2326 36402 29844 2348 21157 24666 1761 52056 36792 2038 18725 18210 2087 17856 7566 1627 30778 26887 Ácido benzoico C7H6O2 GC-MS 122.0368 179 135 9.6 23902 114339 47362 8627 100108 67699 9893 99118 126325 8169 125513 66258 22978 171913 249503 6145 152077 147238 21695 63417 82273 8495 447107 233860 Ácido ftálico C8H6O4 GC-MS 166.0266 295 221 15.2 14793 76770 70839 12883 284322 285619 15070 78214 84850 13431 77711 77529 15876 271743 245441 12666 300780 296548 14856 297451 274646 17503 245779 245717 Ácido gálico C7H6O5 GC-MS 170.0215 281 458 18.0 162 1310 273 319 425 396 610 598 611 555 840 523 355 503 334 282 682 602 363 276 412 199 496 633 Ácido gentísico C7H6O4 GC-MS 154.0266 355 223 16.1 205 1175135 1115646 279 773058 729340 305 769203 680102 120 741399 744763 300 213 65 216 754751 731086 66 979088 974244 469 124270 54961 Ácido homogentísico C8H8O4 GC-MS 168.0423 384 341 16.8 0 725215 717387 0 407526 385442 0 210646 200056 0 311342 324319 0 76429 78153 0 385378 390315 0 374922 376933 0 79216 76891 Ácido homoprotocatecuico C8H8O4 GC-MS 168.0423 267 179 16.7 154 93827 92428 62 51506 50852 69 26522 26982 83 38112 44068 72 63690 62998 68 51364 50861 90 50274 49847 76 64751 62367 Ácido isoftálico C8H6O4 GC-MS 166.0266 279 103 16.0 6187 21371 20130 6233 130990 127135 7628 129076 115155 6643 56084 57070 7080 118810 108083 6330 133503 121757 6861 118009 118709 8041 110311 109213 Ácido mirístico C14H28O2 GC-MS 228.2089 285 117 17.0 1734 986624 938952 2065 597912 603556 2109 722878 673676 2138 575668 578089 2743 338900 113887 2286 580996 554256 2717 799450 804206 3014 419719 401038 Ácido mucónico C6H6O4 GC-MS 142.0266 271 227 14.4 0 65 10425 0 1256 1613 0 722 737 0 726 1014 0 1427 1350 0 833 1272 0 425 196 0 1846 1353 Ácido protocatecuico C7H6O4 GC-MS 154.0266 311 281 16.6 590 431043 419393 279 118309 114848 281 237657 214052 182 411610 427341 246 3491 7106 153 320401 317765 269 462813 472842 670 84384 37769 Ácido salicílico C7H6O3 GC-MS 138.0317 267 135 13.0 114 774815 519869 1759 411517 261805 154 396511 405143 88 386143 283689 110 378607 490665 1110 412476 377854 129 433339 462997 113 6622 3473 Ácido tereftálico C8H6O4 GC-MS 166.0266 221 103 16.3 7728 52451 50647 5452 50334 49118 7596 55080 48302 6841 59099 59769 7340 51974 123129 7030 69294 462066 7661 29995 31570 12804 43766 43127 Antraceno C14H10 GC-MS 178.0783 178 152 16.6 1221 3783 2752 1128 1397 2100 1089 58906 55314 985 8431 5301 1221 39827 78322 1026 3517 13263 70 12946 10185 1903 35218 31234 Carbazol C12H9N GC-MS 167.0735 166/167 140/139 18.4/17.1 280 7022 5960 592 27479 20481 586 92952 106032 380 14044 17508 222 56407 99294 528 27633 49883 413 85560 94440 681 48967 79026 Catecol C6H6O2 GC-MS 110.0368 254 239 10.5 57 531445 282517 655 335313 176719 980 397974 452708 697 384088 216036 611 433624 377058 491 492913 433979 653 292499 358364 1052 492238 358121 Clorocatecol C6H5ClO2 GC-MS 143.9978 288 185 12.7 0 91010 55919 0 22755 15015 58 88311 97264 0 29431 21041 66 100244 122273 0 74 0 0 34601 35326 0 130702 101142 Fenol C6H6O GC-MS 94.0419 151 166 6.8 1709 13272 3452 1212 4749 3968 1177 13594 22914 1307 22047 7222 1269 82722 113455 1403 9362 14336 1531 5010 6702 1430 33806 14352 Naftaleno C10H8 LC-MS (+) 128.0626 4.8 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 2063 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 198.2348 N.D. 92.0626 N.D. Tetradecano C14H30 Tolueno C7H8 88 GC-MS / LC-MS (±) GC-MS / LC-MS (±) Contaminación, biodegradación y actividad microbiana en el Mediterráneo y el mar Rojo, hacia la integración multiómica VI.4 - Discusión La caracterización geoquímica de los ambientes en estudio muestra su gran diversidad (tabla 9). Por ejemplo, en lo que a la temperatura media respecta se observa una marcada variación entre los relativamente fríos 13 °C de ELF y los 27 °C de AQ. Análogamente ocurre con el pH, que oscila entre un valor ligeramente ácido de 6.85 en PRI y otro básico de 8.62 en MCh. Por su parte, la saturación de oxígeno, parámetro crítico para el crecimiento bacteriano, abarca cifras que van desde la anoxia en PRI o la microaerobiosis en MES a datos de aguas bien oxigenadas como las de AQ. Asimismo, la cantidad de petróleo oscila entre las 500 ppm de ELF y las 5100 de MCh. Sin embargo, el número de células por gramo de muestra revela ciertas sorpresas dado que la anóxica PRI tiene valores relativamente altos para carecer de O2, siendo el máximo absoluto el de HAV y el mínimo el de MES. A tenor de esta situación se realizó un intento de análisis multivariante sobre estas variables, cuya conclusión es la ausencia de diferencias significativas entre las muestras en el nivel de sus características geoquímicas. Por otro lado, los datos de la secuenciación génica de rRNA 16S muestran la diversidad de las comunidades microbianas (figura 25 A). Su análisis de componentes principales (figura 25 B) pone de manifiesto la existencia de dos grupos: HAV, PRI, BIZ y ELF frente a AQ, MES, MCh y ELMAX. Esto sugiere que el parámetro geoquímico más influyente es la temperatura, pues HAV, PRI, BIZ y ELF se sitúan en un rango de 13 a 19 °C, frente a AQ, MES, MCh y ELMAX que están entre 20 y 27 °C. A su vez, la subdivisión dentro de este grupo es nuevamente debida a la temperatura (ELMAX y MCh tienen 20-21 °C frente a MES y AQ que están en los 23-27 °C). Esta distribución no se correlaciona con el resto de parámetros geoquímicos, cosa particularmente llamativa en el caso de la saturación de O2 pues MES y PRI, que son las dos muestras con una menor concentración de este, no se agrupan en la figura 25 B. En relación a la figura 25 A queda de manifiesto que el phylum más abundante en todas las muestras es el de Proteobacteria, del cual la clase de Gammaproteobacteria es la predominante en AQ, HAV, PRI, MES y BIZ cuyos géneros más insignes, a saber: Marinobacter, Pseudoalteromonas y Cyclocasticus, son bien conocidos por su actividad biodegradativa167 168. Por su parte, en MCh el phylum 89 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos predominante es el de Bacteroidetes, cuya clase más importante es la de Flavobacteria. A nivel medioambiental el grupo de los Bacteroidetes es importante en el ciclo marino del carbono por su reconocida capacidad de degradar moléculas de alto peso molecular y biopolímeros169. La presencia de los Bacteroidetes también es significativa en MES, en la que sin embargo lo más llamativo es la existencia del candidato a división OD1, grupo encontrado previamente en ambientes anóxicos y con altas concentraciones de sulfuro170. No obstante, el estudio de las relaciones entre los miembros de las distintas comunidades bacterianas debe tener en cuenta su abundancia relativa en cada una de las muestras. Así, el criterio propuesto por Jed A. Fuhrman et alii171 apuesta por distinguir entre taxones raros (menos del 1 %), frecuentes (1-10 %) y muy abundantes (más del 10 %). Incluyendo esto y reanalizando los datos de la secuenciación (figura 27) se observa con total nitidez que las diferencias entre las muestras son debidas a aquellos grupos presentes en menor medida, correlacionándose los resultados de la figura 27 A (genéticos) con los de la 26 (metabólicos). Figura 27. HCA en base a los datos de secuenciación de rRNA 16S cuya distancia se ha estimado en base a la función de Pearson. A) Taxones raros. B) Taxones frecuentes. C) Taxones muy abundantes. Partiendo de estos datos de secuenciación se identificaron un total de 238449 genes potencialmente codificadores de proteínas, complementándose la información proporcionada por el análisis del rRNA 16S con datos de secuenciación de DNA de cada 90 Contaminación, biodegradación y actividad microbiana en el Mediterráneo y el mar Rojo, hacia la integración multiómica una de las poblaciones. Este análisis metagenómico se orientó hacia la caracterización de las posibles rutas de degradación que están operando en cada una de las muestras, entre las cuales también aquí se observa cierta diversidad siendo PRI la que menos genes potencialmente codificadores presenta (5858) frente a BIZ, que es la que más (55601). Su asignación funcional se realizó enfrentando estos datos con los de la base de datos de KEGG. De acuerdo con esto y con la información sobre las funciones bioquímicas de cada una de las enzimas potencialmente presentes se planteó una red hipotética de catabolización para los distintos alcanos y compuestos aromáticos construida mediante un algoritmo programado a fin de interrelacionar todas estas variables172. En total se predijo el metabolismo de 42 sustratos y sus intermediarios, perteneciendo estos a diversos grupos, a saber: alcanos, ácidos grasos e hidrocarburos policíclicos aromáticos (naftaleno, carbazol, fenantreno y quinolinas) y sus intermediarios (ácido salicílico, catecol y ácido gentísico), derivados del catecol (fenol, bifenol, benceno y ácido 2-clorobenzoico), derivados del ácido protocatecuico (ácido ftálico, ácido 3-fenoxibenzoico y ácido 3nitrobenzoico) y derivados del ácido 4-hidroxifenilacético y sus intermediarios (ácido homoprotocatecuico, ácido 4-hidroxifenilpirúvico, tolueno, ácido gálico, 2-aminofenol, ácido 3-clorobenzoico). Es asimismo llamativo que la distribución enzimática predicha (figura 28) presente un agrupamiento concordante con los datos genómicos (figura 27 A) y metabolómicos (figura 26). Figura 28. HCA de la distribución enzimática predicha en base a los datos de secuenciación. La distancia entre los grupos se ha estimado en base a la función de Pearson. 91 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Sin embargo, los datos de secuenciación no necesariamente han de correlacionarse con aquello que esté teniendo lugar en el sistema biológico en estudio y, lo que es más, todavía se desconoce la función, e incluso la secuencia, de muchos genes. Por ello la validación de este modelo teórico necesita apoyarse en los resultados concretos de la metabolómica (tabla 10), que es la única disciplina ómica capaz de proporcionar una instantánea de lo que está pasando. La figura 29 muestra el grado de degradación de cada uno de los contaminantes así como la producción de los distintos intermediarios tras tres semanas de incubación. Comparando los datos de abundancia de la tabla 10 a tiempo R0 y R3 se puede estimar de manera concluyente en que porcentaje se degrada cada uno de los tóxicos en cada muestra. De este modo se observa que AQ y BIZ metabolizan todos los contaminantes, respectivamente en un grado del 99 al 41 % y del 97 al 4 %. ELMAX no cataboliza fenol y carbazol, procesando los otros en un ratio del 98 al 29 %. Por su parte HAV no degrada ácido clorobenzoico, carbazol, fenol y antraceno, siendo los porcentajes del resto del 98 al 4 %. MES no metaboliza antraceno ni carbazol, degradando el resto del 99 al 47 %. PRI cataboliza los tóxicos del 88 al 30 % excepto el ácido benzoico, el ácido clorobenzoico, el 2,3-dihidroxibifenilo y el carbazol. Finalmente, MCh es capaz de degradar los sustratos de un 96 a un 55 % excepto el ácido clorobenzoico, el ácido tereftálico y el carbazol. 92 Contaminación, biodegradación y actividad microbiana en el Mediterráneo y el mar Rojo, hacia la integración multiómica Figura 29. A) En porcentaje, degradación de los contaminantes. 100 % significa no degradación. B) Producción de las especias químicas intermedias. El máximo se representa en rojo. En ambos casos no se han tenido en cuenta los datos de ELF cuyos valores están fuera del rango de la escala. VI.5 - Conclusiones Los ambientes marinos contaminados y la actividad bioquímica que en ellos tiene lugar constituyen un tema crucial, no solo en aras de una posible biosolución del problema, sino por la comprensión per se de lo que allí está aconteciendo. Para ello se requiere de un estudio ómico global, demostrándose en este capítulo como, lo que a nivel teórico es esperable, se constata en la práctica. Así queda de manifiesto como a partir de datos de secuenciación genética, que es el nivel de regulación más alto en la jerarquía funcional, es posible predecir tanto la actividad enzimática como la metabólica, reconstruyéndose de este modo las rutas biodegradativas de cada uno de los sistemas, las cuales conscientemente se han dejado fuera de este capítulo tanto por su complejidad como por no relacionarse directamente con el trabajo desarrollado para la presente tesis. En esta línea, lo reseñable es el uso la metabolómica, tanto desde su óptica de fingerprinting como desde la del análisis dirigido, para cubrir con ella la validación de los resultados de dos etapas cruciales comprendidas en el marco de una investigación mucho mayor y que aquí se ha intentado esbozar. De este modo se concluye como la 93 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos caracterización de cada uno de los ambientes no depende en primer término de las características geoquímicas de los mismos, sino de las poblaciones microbianas que allí habitan y, por ende, del conjunto de genes que les permiten llevar a cabo tal o cual proceso bioquímico. Dado que la diferencia principal entre cada una de las muestras viene marcada por el tipo de contaminación es lícito suponer que es este factor el determinante en el condicionamiento de las especies bacterianas que allí habitan, las cuales en un futuro quizá puedan ser usadas al servicio de nuestros intereses. 94 VII Conclusiones Conclusiones VII - Conclusiones La presente tesis doctoral ha centrado sus esfuerzos en la exploración de las capacidades analíticas de diversas técnicas al servicio de la metabolómica, tanto desde la perspectiva del fingerprinting como de la del análisis dirigido. Así, a lo largo de cuatro capítulos, ha sido posible contribuir, con un cierto éxito, a la explicación de aquello que está pasando en los distintos sistemas biológicos estudiados, cuyo denominador común han sido los organismos unicelulares. En tanto que, a nivel particular, ya han sido expuestas diversas conclusiones individuales para cada uno de los epígrafes, nos centraremos aquí en señalar los aspectos generales que se ubican por encima de las anteriores. En primer lugar ha de remarcarse la necesidad de la combinación de varias plataformas analíticas si lo que se desea es una cobertura metabólica global, o al menos tan amplia como sea posible. Cada analito rige un cierto tipo de técnica ideal para su medición, de lo que son ejemplo los capítulos I y IV y, especialmente, el III, en el cual se demuestra de manera rotunda la ventaja de contar con tres plataformas de análisis complementarias tales como GC-MS, LC-MS y CE-MS. En segundo término impera una mención expresa a la potencia explicativa del análisis no dirigido. De ello son buena muestra los capítulos II y III, en los cuales el fingerprinting ha contribuido satisfactoriamente a aumentar el conocimiento sobre dos escenarios biológicos cuyo estudio no se había sesgado con ninguna hipótesis previa. Y, finalmente, es ineludible una última alusión a las consecuencias derivadas del paradigma que rige el dogma central de la biología molecular. Si el DNA está en la base de aquello que es posible que ocurra, si el RNA muestra lo que parece estar ocurriendo y aun cuando las proteínas, particularmente las enzimas, son las herramientas que lo posibilitan; son únicamente los metabolitos los responsables de la situación final, antes y después, de un sistema biológico, estableciendo relaciones de retroalimentación con el resto de niveles de la jerarquía funcional. Por ello, un ser vivo es un todo integrado y es esta la principal conclusión a la que se puede llegar tras recorrer los cuatro capítulos de la 97 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos presente tesis, en los que, en cuatro situaciones radicalmente distintas, ha sido posible alcanzarse a atisbar la convergencia y concordancia de los resultados procedentes de las tres principales disciplinas ómicas; siendo la metabolómica la validación empírica de las conclusiones derivadas de las dos primeras. 98 VIII Bibliografía Bibliografía VIII - Bibliografía 1. Miller, S. L., A production of amino acids under possible primitive earth conditions. Science 1953, 117 (3046), 528-9. 2. Prescott, L. M.; Harley, J. P.; Klein, D. A., Microbiología, Madrid, Mc Graw Hill, 2004. 3. Margulis, L., Symbiosis and evolution. Sci Am 1971, 225 (2), 48-57. 4. Whittaker, R. H., New concepts of kingdoms or organisms. 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Las abundancias se corresponden con la media aritmética calculada a partir de las tres muestras recogidas en cada uno de los citados días. % hace referencia a la probabilidad de correspondencia de cada una de las fórmulas moleculares con el perfil de distribución isotópica. En gris, compuestos de interés. m/z RT Día 0 Día 6 Día 11 Día 14 Día 40 Fórmula % Tipo de metabolito Nombre 184.1462 23.20 20289 362828 3501 61896 256773 C11H20O2 99.6 Ácido graso (insaturado) 184.1464 31.61 1 5401 1 1 22103 C11H20O2 55.0 Ácido graso (insaturado) Citronellyl formate / Dimethyl-nonenoic acid / Ethyl-methyl-octenoic acid / Hendecenoic acid / Nonenyl acetate / Undecanolactone / Undecenoic acid Citronellyl formate / Dimethyl-nonenoic acid / Ethyl-methyl-octenoic acid / Hendecenoic acid / Nonenyl acetate / Undecanolactone / Undecenoic acid 200.1776 210.1620 21.87 24.31 22290 1 39301 6516 23294 1 28811 1 58374 27879 C12H24O2 C13H22O2 86.2 80.9 Ácido graso (saturado) Ácido graso (insaturado) Decyl acetate / Isolauric acid / Lauric acid / Methyl-undecanoic acid 224.1777 24.31 1 4125 1 1 46480 C14H24O2 82.1 Ácido graso 3,4-tetradecadienoic acid / Alepric acid / Dodecadienyl acetate / Myristic acid alkyne / Oxo-tetradecenal / Tetradecadienoic acid / Tetradecynoic acid 236.2138 262.2294 18.63 26.27 1 1 29516 4631 1 1 1 1 48648 85210 C16H28O2 C18H30O 92.5 - Ácido graso Ácido graso Hexadecadienal / Hexadecatrienol / Hexadecenynol / Hexadecynal 262.2297 28.67 7005 33057 1 15204 276997 C18H30O - Ácido graso 262.2298 25.68 1 1 27467 1 143620 C18H30O 99.1 Ácido graso (hydroxypropanyl)-isolongifolene / (methoxyethyl)-isolongifolene / Ladderane-hexanol / Octadecatrienal (hydroxypropanyl)-isolongifolene / (methoxyethyl)-isolongifolene / Ladderane-hexanol / Octadecatrienal 264.2452 264.2453 266.2607 28.70 23.20 32.05 1 277000 10797 15738 2905113 11314 5211 28579 4565 1 566782 14001 84131 2079951 1 C18H32O C18H32O C18H34O 99.5 97.8 Ácido graso Ácido graso Ácido graso con aldehídos/alcoholes 268.2403 20.95 1 24350 1 11401 26852 C17H32O2 86.3 Ácido graso 280.2401 28.86 13954 52274 16722 1 844063 C18H32O2 75.3 Ácido graso (insaturado) 282.2560 23.20 823175 8655754 304502 1689218 6242216 C18H34O2 99.3 Ácido graso (insaturado) 287.2825 13.52 1 46058 1 30733 5538 C17H37NO2 83.1 Esfingolípido 294.2195 20.66 1 1 1 1 12406 C18H30O3 88.5 Ácido graso (insaturado) 296.2353 22.43 1 9430 1 1 33171 C18H32O3 86.2 Ácido graso (insaturado) 297.3030 298.2510 18.65 24.31 1 31755 1 741682 1 15881 17162 65783 4078 2080169 C19H39NO C18H34O3 96.2 Ácido graso de etanolamida Ácido graso Tridecadienoic acid / Tridecynoic acid Ladderane-hexanol / Octadecatrienal (hydroxypropanyl)-isolongifolane / Octadecadienal / Octadecatrienol (hydroxypropanyl)-isolongifolane / Octadecadienal / Octadecatrienol Octadecadienol / Octadecenal Cyclohexylundecanoic acid / Heptadecenoic acid / Heptadecylenic acid / Hexadecenoic acid methyl ester / Methyl-hexadecenoic acid / Pentadecenyl acetate Chaulmoogric acid / Conjugated linoleic acid / Hexadecadienyl acetate / Hexadecynyl acetate / Linoelaidic acid / Linoleic acid / Malvalic acid / Methyl-heptadecadienoic acid / Octadecadienoic acid / Octadecynoic acid / Stearolic acid / Trans-octadecadienoic acid Cycloheptylundecanoic acid / Elaidic acid / Hexadecenyl acetate / Methylheptadecenoic acid / Octadecenoic acid / Octadecylenic acid / Oleic acid / Palmitoleic acid ethyl ester / Petroselaidic acid / Petroselinic acid / Vaccenic acid C17 Sphinganine (hexylfuranyl)-octanoic acid / Colneleic acid / Dihydro-oxo-phytoenoic acid / EpODE / Epoxy-octadecadienoic acid / HOTE / HOTrE / Hydroxylinolenic acid / Hydroxy-octadecatrienoic acid / Hydroxy-octadecenynoic acid / Kamlolenic acid / Keto-octadecadienoic acid / Oxo-octadecadienoic acid / Oxo-octadecynoic acid / OxoODE / Oxo-phytoenoic acid Artemisic acid / Avenoleic acid / Densipolic acid / Dimorphecolic acid / EpOME / Epoxy-octadecenoic acid / HODE / Hydroxy-linoleic acid / Hydroxy-octadecadienoic acid / Hydroxy-octadecynoic acid / Ketooctadecenoic acid / Methoxy-methyl-hexadecadienoic acid / Oxooctadecenoic acid / Oxo-pentyl-cyclopentaneoctanoic acid / Vernolic acid Palmitoyl N-Isopropylamide Epoxy-octadecanoic acid / Epoxy-stearic acid / Hydroxy-octadecenoic acid 123 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Esfingolípido 24 / Hydroxy-oleic acid / Keto-stearic acid / Methyl-oxo-heptadecanoic acid / Oxo-octadecanoic acid / Ricinelaidic acid / Ricinoleic acid / Trimethyldodecadienoic acid Amino-octadecanoic acid / Aminooctadecenediol / Hydroxy-sphingosine / Ketosphinganine / Palmitoyl ethanolamide / Sphingosine Amino-octadecanoic acid / Aminooctadecenediol / Hydroxy-sphingosine / Ketosphinganine / Palmitoyl ethanolamide / Sphingosine 299.2825 14.73 330574 188524 73969 139384 3376 C18H37NO2 99.0 299.2827 16.37 120874 102452 78053 593343 24627 C18H37NO2 98.2 Acilcarnitina 300.1111 3.98 1 1 1 17697 1 C16H16N2O4 57.7 Ácido nitro-fenilpropilaminobenzoico Nitro-phenylpropylaminobenzoic acid 300.2663 23.20 86097 2214730 1 230241 1507505 C18H36O3 90.6 Ácido graso (saturado) Hydroxy-methyl-heptadecanoic acid / Hydroxy-octadecanoic acid / Hydroxy-stearic acid 325.2979 343.3086 26.40 24.32 51360 1 192919 21210 115476 1 123459 1 9127 58112 C20H39NO2 C20H41NO3 84.5 74.3 Ácido graso de etanolamida Esfingolípido Oleoyl ethanolamide 354.2768 26.25 1 1 1 1 430139 C21H38O4 - Glicerolípido/Prostaglandina/Ácido graso 354.2773 25.68 1 1 116225 1 564843 C21H38O4 98.2 Glicerolípido/Prostaglandina/Ácido graso Ceriporic acid B / Linoleoyl glycerol / MG (0:0/18:2/0:0) / MG (18:2/0:0/0:0) / PGF2 Alcohol methyl ether Ceriporic acid B / Linoleoyl glycerol / MG (0:0/18:2/0:0) / MG (18:2/0:0/0:0) / PGF2 Alcohol methyl ether 356.2925 358.2869 358.2873 28.65 21.46 19.51 1 1687 1 1 35548 1 4042 1 1 1 1 1 772119 373172 61030 C21H40O4 C24H38O2 C24H38O2 89.1 98.6 - Glicerolípido Esterol Esterol 372.2666 23.93 1 1 1 1 17252 C24H36O3 - Esterol 372.2667 11.56 523082 322577 382758 173663 50527 C24H36O3 99.9 Esterol 393.1896 24.32 1 9517 1 1 54483 C19H27N3O6 60.1 Péptido 394.2152 394.2483 397.1738 397.3345 399.3349 399.3499 409.319 439.2701 31.06 31.37 24.31 6.86 18.25 7.58 16.22 18.00 125587 1 1 2258 5541 1 1 17665 230574 16953 20273 3945 45983 1 1 60176 133616 1 1 1 83227 1 1 61916 153433 1 1 1 96855 1 1 167517 147468 67334 51258 735546 30422 29532 166856 42281 C22H31FO5 C19H39O6P C19H27NO8 C27H43NO C23H45NO4 C27H45NO C24H43NO4 C20H42NO7P 52.8 73.9 83.4 99.3 82.8 98.8 98.9 91.3 Esterol Glicerofosfolípido (plasmalógeno) Glucurónido de ácido graso Esterol Ácido graso de etanolamida Esterol Ácido graso (derivado de prostaglandina) Glicero(liso)fosfolípido 444.3606 29.13 1 1 1 1 136523 C29H48O3 75.1 Esterol 453.2854 20.01 101857 253926 128077 594140 228176 C21H44NO7P 99.9 Glicero(liso)fosfolípido 495.3324 495.3327 519.3323 521.3478 19.41 20.19 18.64 21.14 5972 262254 2257 1 1 109518 6027 3442 74426 2658276 19420 46255 42252 989897 10683 20110 1 30635 1 1 C24H50NO7P C24H50NO7P C26H50NO7P C26H52NO7P 99.8 99.8 77.4 96.7 Glicero(liso)fosfolípido Glicero(liso)fosfolípido Glicero(liso)fosfolípido Glicero(liso)fosfolípido 640.5066 124 32.02 1 37727 64674 1 84188 C41H68O5 78.5 Glicerolípido Dihydroceramide C2 Heneicosanedioic acid / MG (0:0/18:1/0:0) / MG (18:1/0:0/0:0) Bufanolide skeleton / Cholenoic acid / Hyrtial / Ladderane-dodecanoic acid Bufanolide skeleton / Cholenoic acid / Hyrtial / Ladderane-dodecanoic acid Cholacalcioic acid / Trinorvitamin D3 carboxylic acid / Trinorcholecalciferol carboxylic acid / Hydroxycholadienoic acid / Oxocholenic acid / Oxocholenoic acid Cholacalcioic acid / Trinorvitamin D3 carboxylic acid / Trinorcholecalciferol carboxylic acid / Hydroxycholadienoic acid / Oxocholenic acid / Oxocholenoic acid Asp Ile Phe / Asp Leu Phe / Asp Phe Ile / Asp Phe Leu / Glu Phe Val / Glu Val Phe / Ile Asp Phe / Leu Asp Phe / Phe Glu Val Dihydrodexamethasone LPA (P-16:0e/0:0) Diethylpropion (metabolite V-glucuronide) Solanidine / Verazine Palmitoyl-carnitine Demissidine / Spirosolane skeleton Lumula / PGF2 diethyl amide LysoPE (0:0/15:0) / LysoPE (15:0/0:0) / PA (17:1/0:0) / PC (12:0/0:0) Carboxy-methyl-cholestaenol / Dihydroxy-dihomo-epivitamin D3 / Dihydroxy-dihomo-epicholecalciferol / Dihydroxy-dihomovitamin D3 / Dihydroxy-dihomocholecalciferol / Dihydroxy-dimethylvitamin D3 / Dihydroxy-dimethylcholecalciferol / Ethyl-dihydroxyvitamin D3 / Ethyldihydroxycholecalciferol / Hydroxy-methyl-cholestene-carboxylic acid Glycerophospho-N-palmitoyl ethanolamine / LysoPE (0:0/16:0) / PE (16:0/0:0) LysoPC (16:0) / PC (16:0/0:0) LysoPC (16:0) / PC (16:0/0:0) Linoleoylglycerophosphocholine / LysoPC (18:2) LysoPC (18:1) / PC (18:1/0:0) / PC (O-16:1/2:0) DG (16:0/22:6/0:0) / DG (16:1/22:5/0:0) / DG (18:1/20:5/0:0) / DG (18:2/20:4/0:0) / DG (18:3/20:3/0:0) / DG (18:4/20:2/0:0) / DG (20:2/18:4/0:0) / DG (20:3/18:3/0:0) / DG (20:4/18:2/0:0) / DG (20:5/18:1/0:0) / DG (22:5/16:1/0:0) / DG (22:6/16:0/0:0) Anexo Tabla 6. Compuestos estadísticamente significativos identificados en L. (L.) infantum. En GC-MS el error no está disponible al no generar este equipo datos de masa exacta. (4,8,10-d18:3)Sphingosine 2-Oxo-5-methylthiopentanoic acid Masa monoisotópica 295.2511 162.0351 Fórmula molecular C18H33NO2 C6H10O3S 4-Hydroxy-proline / 5-amino-2-oxopentanoate 131.0582 C5H9NO3 129.0426 C5H7NO3 1 173.0800 267.0968 202.1430 89.0477 176.0546 174.1117 C6H11N3O3 C10H13N5O4 C8H18N4O2 C3H7NO2 C4H8N4O4 C6H14N4O2 0 Asparagine /N-carbamoyl Sarcosine 132.0535 C4H8N2O3 Aspartic acid Aspartyl-leucine Bis(glutathionyl)spermine C17 Sphinganine Cellobiose Choline Citrulline Cystathionine Ergosterol Glucose-6-phosphate Glutamate / Isoglutamate / 2- Oxo-4 hydroxy-5aminovalerate / L4-Hidroxy Glutamate semialdehyde Glutamine Glycerophosphocholine Guanine 133.0375 246.1216 780.3622 287.2824 342.1162 103.0997 175.0957 222.0674 396.3392 260.0297 C4H7NO4 C10H18N2O5 C30H56N10O10S2 C17H37NO2 C12H22O11 C5H13NO C6H13N3O3 C7H14N2O4S C28H44O C6H13O9P 147.0532 C5H9NO4 146.0691 257.1028 151.0494 C5H10N2O3 C8H20NO6P C5H5N5O Histidine 155.0695 C6H9N3O2 Nombre 4-Oxoproline / L-1-Pyrroline-3-hydroxy-5-carboxylate / 1Pyrroline-4-hydroxy-2-carboxylate 2-Oxoarginine Adenosine ADMA / SDMA Alanine / Sarcosine Allantoic acid Arginine Hypoxanthine 136.0385 C5H4N4O Imidazole lactate Lauric acid Lauric Acid ethyl ester 156.0535 200.1776 228.2089 C6H8N2O3 C12H24O2 C14H28O2 Leucine 131.0946 C6H13NO2 Error (ppm) 2 7 0 0 6 10 1 5 15 13 4 3 0 2 0 1 0 0 0 0 1 1 0 ST vs SNT Técnica analítica LC-MS CE-MS CE-MS GC-MS p valor R vs SNT p valor Disminuido < 0.01 Disminuido Disminuido Aumentado < 0.05 < 0.01 < 0.05 Disminuido < 0.01 Aumentado < 0.05 CE-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados Aumentado Disminuido Aumentado Aumentado Disminuido Aumentado Aumentado < 0.01 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.01 < 0.05 < 0.05 Ácidos orgánicos Purinas/pirimidinas y conjugados Aminoácidos, péptidos y conjugados Aminoácidos, péptidos y conjugados Ácidos orgánicos Aminoácidos, péptidos y conjugados Aumentado Aumentado Aumentado Disminuido Disminuido Disminuido < 0.01 < 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.05 Disminuido Disminuido Aumentado < 0.01 < 0.05 < 0.05 < 0.01 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.01 < 0.05 < 0.05 CE-MS GC-MS CE-MS CE-MS LC-MS CE-MS CE-MS GC-MS GC-MS LC-MS LC-MS LC-MS GC-MS CE-MS CE-MS CE-MS GC-MS GC-MS Naturaleza bioquímica Esfingolípidos y bases esfingoideas Ácidos orgánicos Aminoácidos, péptidos y conjugados Aminoácidos, péptidos y conjugados Aminoácidos, péptidos y conjugados Aminoácidos, péptidos y conjugados Aminoácidos, péptidos y conjugados Esfingolípidos y bases esfingoideas Carbohidratos Aminas Aminoácidos, péptidos y conjugados Aminoácidos, péptidos y conjugados Esteroles Carbohidratos Disminuido Aumentado Disminuido Aumentado Aumentado Disminuido < 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.05 < 0.01 < 0.05 Disminuido Aumentado Aumentado Aumentado Disminuido Aumentado Disminuido Disminuido Disminuido < 0.01 Aumentado < 0.05 CE-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados Disminuido Aumentado < 0.05 < 0.01 Disminuido < 0.05 Aumentado Aumentado < 0.01 < 0.01 Aminoácidos, péptidos y conjugados Glicerofosfolípidos Purinas/pirimidinas y conjugados Aumentado Aumentado < 0.01 < 0.01 Disminuido Disminuido < 0.05 < 0.05 GC-MS LC-MS CE-MS CE-MS GC-MS CE-MS GC-MS CE-MS LC-MS LC-MS CE-MS GC-MS Aumentado Disminuido Aumentado Disminuido Aumentado < 0.05 < 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.05 Disminuido Disminuido < 0.05 < 0.05 Aminoácidos, péptidos y conjugados Purinas/pirimidinas y conjugados Ácidos orgánicos Ácidos grasos Ácidos grasos Aminoácidos, péptidos y conjugados 125 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos 126 Leucyl-Alanine Linoleic acid Linolenic Acid 202.1317 280.2402 278.2246 C9H18N2O3 C18H32O2 C18H30O2 Lysine 146.1055 C6H14N2O3 Malic acid Methylhistidine Myo-inositol Myristic acid Myristic Acid ethyl ester N-Acetylaminobutanal/ Pipecolic acid N-Acetyl-lysine Norleucine 134.0215 169.0851 180.0632 228.2089 256.2402 129.0790 188.1161 131.0946 C4H6O5 C7H11N3O2 C6H12O6 C14H28O2 C16H32O2 C6H11NO2 C8H16N2O3 C6H13NO2 Ornithine 132.0899 C5H12N2O2 Palmitic Acid ethyl ester Phosphocholine Phytosphingosine Proline 284.2715 183.0660 317.2930 115.0633 C18H36O2 C5H14NO4P C18H39NO3 C5H9NO2 0 0 0 Aumentado Aumentado < 0.01 < 0.05 Aumentado Disminuido < 0.01 < 0.05 Disminuido Disminuido Aumentado < 0.01 < 0.05 < 0.05 0 1 0 1 19 0 3 2 3 1 6 Disminuido Disminuido Aumentado Aumentado Aumentado <0.05 < 0.05 < 0.01 0.011 0.012 Disminuido < 0.01 Aumentado Aumentado Disminuido Aumentado Aumentado Disminuido Aumentado < 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.05 Aminoácidos, péptidos y conjugados Ácidos grasos Ácidos grasos < 0.01 CE-MS GC-MS LC-MS CE-MS GC-MS GC-MS CE-MS GC-MS GC-MS LC-MS CE-MS CE-MS LC-MS CE-MS GC-MS LC-MS LC-MS LC-MS CE-MS CE-MS GC-MS Aumentado < 0.05 Aumentado Aumentado Disminuido Aumentado < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 Disminuido < 0.01 Aumentado < 0.05 Aumentado Aminoácidos, péptidos y conjugados Ácidos orgánicos Aminoácidos, péptidos y conjugados Carbohidratos Ácidos grasos Ácidos grasos Cetonas y aldehidos Aminoácidos, péptidos y conjugados Aminoácidos, péptidos y conjugados Aminoácidos, péptidos y conjugados Ácidos grasos Aminas Esfingolípidos y bases esfingoideas Aminoácidos, péptidos y conjugados Putrescine 88.1000 C4H12N2 Ribitol / Arabitol / Xylitol 152.0685 C5H12O5 Aumentado < 0.01 Aumentado < 0.05 GC-MS Carbohidratos Ribose / Lyxose Ribose-5-phosphate S-Adenosylhomocysteine S-Adenosylmethionine Serine Sorbitol / Mannitol Threonine Threonine / Homoserine Trypanothione disulfide 150.0528 228.0046 384.1216 398.1372 105.0426 182.0790 C5H10O5 C5H9O8P C14H20N6O5S C15H22N6O5S C3H7NO3 C6H14O6 Disminuido Aumentado < 0.05 < 0.01 Disminuido Disminuido Disminuido Aumentado < 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 Disminuido Aumentado Aumentado Aumentado Disminuido < 0.05 < 0.01 < 0.05 < 0.05 < 0.01 Carbohidratos Carbohidratos Purinas/pirimidinas y conjugados Purinas/pirimidinas y conjugados Aminoácidos, péptidos y conjugados Carbohidratos 0 0 0 Disminuido < 0.01 1 Disminuido < 0.01 Aumentado Aumentado Aumentado Aumentado Aumentado Aumentado < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 GC-MS GC-MS CE-MS CE-MS GC-MS GC-MS GC-MS CE-MS CE-MS CE-MS GC-MS CE-MS GC-MS 119.0582 C4H9NO3 721.2887 C27H47N9O10S2 Tyrosine 181.0739 C9H11NO3 Valine / Betaine / 5-Aminopentanoate Xanthine 117.0790 152.0334 C5H11NO2 C5H4N4O2 0 2 Aminas Aminoácidos, péptidos y conjugados Aminoácidos, péptidos y conjugados Aminoácidos, péptidos y conjugados Aminoácidos, péptidos y conjugados Purinas/pirimidinas y conjugados Anexo Tabla 7. Compuestos identificados por LC-MS/MS y sus fragmentos característicos. Nombre (4,8,10-d18:3) sphingosine Allantoic acid Aspartyl-leucine Bis(glutathionyl)spermine C17 sphinganine Glycerophosphocholine Lauric acid Lauric acid ethyl ester Linolenic acid Myristic acid ethyl ester Norleucine Palmitic acid ethyl ester Phosphocholine Phytosphingosine Masa monoisotópica 295.2511 176.0546 246.1216 780.3622 287.2824 257.1028 200.1776 228.2089 278.2246 256.2402 131.0946 284.2715 183.0660 317.2930 Fórmula molecular C18H33NO2 C4H8N4O4 C10H18N2O5 C30H56N10O10S2 C17H37NO2 C8H20NO6P C12H24O2 C14H28O2 C18H30O2 C16H32O2 C6H13NO2 C18H36O2 C5H14NO4P C18H39NO3 Error (ppm) 2 10 15 13 4 1 1 1 0 1 19 3 2 3 Fragmentos 57.07, 81.07, 95.08, 121.10, 162.10, 204.11, 222.12, 279.23 43.06, 60.06, 70.06, 71.05, 116.07, 130.09, 134.08, 175.19, 176.10, 177.10 70.03, 86.09, 132.10, 141.10, 155.11, 201.12, 247.13 70.06, 72.08, 86.09, 104.10, 143.03, 158.96, 184.07, 522.75 69.07, 90.05, 121.10, 164.87, 194.98, 196.97, 227.19, 254.25, 272.25 60.08, 86.09, 104.11, 104.18, 105.11, 124.99, 184.07, 258.11 29.04, 41.04, 43.05, 55.05, 57.07, 69.07, 71.08, 89.06, 103.07, 117.09, 131.10, 151.86, 172.86, 183.85, 201.12 43.05, 57.07, 71.09, 89.06, 103.07, 117.09, 229.22 55.06, 67.06, 81.07, 95.09, 109.10, 123.12, 137.13, 173.13, 279.23 43.05, 57.07, 71.09, 89.06, 103.07, 117.09, 257.25 30.03, 41.04, 42.04, 43.06, 44.05, 57.07, 69.07, 86.09, 130.16, 131.16, 132.09 41.04, 43.06, 55.06, 57.07, 69.07, 71.09, 85.10, 89.06, 95.09, 103.08, 117.09, 135.12, 149.13, 173.15, 201.19, 229.21 45.04, 60.08, 86.1, 98.98, 124.99, 184.07 41.04, 55.02, 71.05, 95.05, 113.06, 135.11, 171.10, 219.17, 252.26, 282.27, 300.28, 318.30 Tabla 8. Compuestos con presencia confirmada de 13C. Nombre Arginina Citrulina Ornitina Putrescina Tripanotión disulfuro Masa monoisotópica con 13C 180.1311 181.1152 137.1054 92.1123 725.3030 Fórmula molecular C6H14N4O2 C6H13N3O3 C5H12N2O2 C4H12N2 C27H47N9O10S2 Nº de 13C 6 6 5 4 4 Técnica analítica CE-MS CE-MS CE-MS CE-MS CE-MS 127 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos 128 X Índice de figuras y tablas Índice de figuras y tablas X - Índice de figuras y tablas X.1 - Figuras Figura 1. Árbol filogenético universal propuesto por Olsen y Woese basado en la secuenciación de rRNA 16S. 9 Figura 2. Número de artículos por año en los que se citan las palabras clave metabolomics (azul) o metabonomics (rojo) en su título, según el buscador Web of Knowledge a fecha de 5 de mayo de 2014. 14 Figura 3. Crecimiento de la importancia relativa de la metabol[n]ómica frente a otras disciplinas ómicas durante la pasada década según el buscador Web of Knowledge. En verde, número de artículos que contienen en su título las palabras clave metabolomics o metabonomics; en gris aquellos en los que figuran los términos genomics, transcriptomics o proteomics. Figura 4. Esquema resumen del flujo de trabajo seguido en un estudio metabolómico. 14 15 Figura 5. Mapa de la “región de las fosas anóxicas”. En rojo, las fosas hipersalinas mencionadas. 32 Figura 6. Estructura molecular de la betaína. 32 Figura 7. Recta de regresión calculada a partir de los estándares de betaína. 35 Figura 8. Fragmento de los electroferogramas correspondiente a la determinación de ácido acético. En el eje de abscisas se expresa el tiempo en minutos, en el de ordenadas la absorbancia en U.A. A) muestra con ácido acético. B y C) muestras sin ácido acético. Asimismo se muestra en todas ellas los electroferogramas correspondientes a los patrones de ácido acético 4 mM y 40 mM. 37 131 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Figura 9. Relación entre la salinidad, la temperatura y la concentración de oxígeno respecto de la profundidad en la fosa Medee. Las barras indican el error estándar respecto de la media para tres réplicas. 38 Figura 10. Relación entre la población microbiana y la profundidad en la fosa Medee. Las barras indican el error estándar respecto de la media para tres réplicas. DAPI: 4’,6-diamidino-2-fenilindol, reactivo de tinción fluorescente usado en microscopía para la realización de recuentos celulares. EUB: Eubacteria. ARCH: Archaea. GM1: Grupo Marino 1 de Thaumarchaeota. EURY: Euryarchaeota. 39 Figura 11. Panorámica de la población procariota de la fosa Medee. Su estratificación y abundancia relativa se agrupan por árboles filogenéticos en relación a la profundidad (RAxML program). 40 Figura 12. Modelo de síntesis de novo de materia orgánica a partir de la reducción de betaína y posterior metanogénesis, muestra de la cooperación trófica entre KB1 y MSBL1. 43 Figura 13. Proyecciones PLS-DA. A) Todo el conjunto de datos (8600 features) con predicción de los QCs. 7 componentes principales. R2=0.989. Q2=0.670. B) Variables estadísticamente significativas tras el ttest (382 features). 4 componentes principales. R2=0.978. Q2=0.928. C) Variables estadísticamente significativas identificadas en METLIN (49 features). 4 componentes principales. R2=0.968. Q2=0.915. 51 Figura 14. HCA de las variables estadísticamente significativas tras el ttest (382 features). Las m/z más abundantes se representan en rojo, las menos abundantes en azul. Figura 15. A) Metatranscriptómica. Agrupamiento de las muestras en función del tipo y abundancia de los genes expresados, la distancia entre las mismas se calculó mediante la función Bray-Curtis. B) Proteómica. Agrupamiento de las muestras en función del tipo y abundancia de las 132 52 Índice de figuras y tablas proteínas expresadas, la distancia entre las mismas se calculó mediante la correlación de Pearson. 52 Figura 16. Representación esquemática de la abundancia de los distintos grupos de metabolitos bacterianos a lo largo de la secuencia de muestreo. Grupo 1: ácidos grasos (18), esfingolípido (1), glicerolípidos (2), glicerofosfolípido-LPA (1), esterol-alcaloide (1). Grupo 2: ácido graso con aldehídos y alcoholes (1), esfingolípido (1), carnitinas (2), ácido graso con etanolamida (1). Grupo 3: ácido graso con etanolamida (1), esterolesderivados de vitamina D3/ácidos biliares (4), derivados de prostaglandinas (2), ácido graso insaturado (1). Grupo 4: esfingolípido (1), esterol-derivado de vitamina D3/ácido biliar (1). Grupo 5: esterolcorticoide (1). Entre paréntesis se indica el número de metabolitos de cada clase. 53 Figura 17. Esquema interpretativo de las variaciones de la microbiota y la actividad metabólica en el intestino humano frente a un tratamiento antibiótico. Las líneas continuas indican relaciones, las discontinuas aumentos o disminuciones de las sustancias consignadas en los respectivos recuadros. 56 Figura 18. Esquema del ciclo de vida de Leishmania spp. según el Laboratory Identification of Parasites of Public Health Concern del Centers for Disease Control and Prevention. 62 Figura 19. Modelos de PCA construidos con los features filtrados al 50 % de presencia en los QCs. A) LC-MS: 2 componentes, R2=0.620, Q2=-0.029. B) CE-MS: 2 componentes, R2=0.872, Q2=0.694. C) GC-MS: 2 componentes, R2=0.515, Q2=0.235. 70 Figura 20. Modelos de PCA construidos con los features filtrados al 50 % de presencia en los QCs (muestras control y 13C). A) LC-MS: 3 componentes, R2=0.428, Q2=0.107. B) CE-MS: 2 componentes, R2=0.577, Q2=0.424. 71 133 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos Figura 21. Número de compuestos identificados por técnica de análisis. Figura 22. Porcentaje de compuestos identificados por técnica 72 clasificados en función de su naturaleza bioquímica. Los colores indican el grupo biológico, referenciado este en la tabla contigua. 73 Figura 23. Representación esquemática de las principales alteraciones del metabolismo. Verde: metabolito Aumentado. Disminuido. Subrayado: detectado con 13C. Rojo: metabolito Flecha continua: relación bioquímica directa. Flecha discontinua: relación bioquímica mediada por dos o más enzimas. A) ST vs SNT. B) R vs SNT. 75 Figura 24. Localización geográfica y nomenclatura adoptada para cada una de las muestras procedentes de los correspondientes emplazamientos contaminados. Figura 25. Resultados de la secuenciación de rRNA 16S. A) Diversidad y abundancia relativa de los distintos phyla microbianos. B) PCA. 81 86 Figura 26. A) Modelos de PCA construidos con los datos filtrados. A1) LCMS (-): 2 componentes principales, R2=0.338, Q2=0.013. A2) LC-MS (+): 2 componentes principales, R2=0.491, Q2=0.210. B) HCA construido con los datos filtrados y normalizados. B1) LC-MS (-). B2) LC-MS (+). 87 Figura 27. HCA en base a los datos de secuenciación de rRNA 16S cuya distancia se ha estimado en base a la función de Pearson. A) Taxones raros. B) Taxones frecuentes. C) Taxones muy abundantes. 90 Figura 28. HCA de la distribución enzimática predicha en base a los datos de secuenciación. La distancia entre los grupos se ha estimado en base a la función de Pearson. 91 Figura 29. A) En porcentaje, degradación de los contaminantes. 100 % significa no degradación. B) Producción de las especias químicas intermedias. El máximo se representa en rojo. En ambos casos no se han tenido en cuenta los datos de ELF cuyos valores están fuera del rango de la escala. 134 93 Índice de figuras y tablas X.2 - Tablas Tabla 1. Comparación entre células procariotas y eucariotas. Tabla 2. Composición química del agua hipersalina de la fosa Medee 12 medida en muestras previamente concentradas diez veces mediante evaporación. Concentraciones expresadas en mM salvo explícita mención de otra unidad. 38 Tabla 3. Concentración de betaína y acetato. 41 Tabla 4. Metabolitos microbianos identificados en grado de tentativa. Las abundancias se corresponden con la media aritmética calculada a partir de las tres muestras recogidas en cada uno de los citados días. % hace referencia a la probabilidad de correspondencia de cada una de las fórmulas moleculares con el perfil de distribución isotópica. En gris, compuestos de interés. 123 Tabla 5. Número de compuestos tras el alineamiento, el filtrado y la estadística para cada una de las comparaciones (ST vs SNT y R vs SNT) y técnicas de análisis. 72 Tabla 6. Compuestos estadísticamente significativos identificados en L. (L.) infantum. En GC-MS el error no está disponible al no generar este equipo datos de masa exacta. 125 Tabla 7. Compuestos identificados por LC-MS/MS y sus fragmentos característicos. 127 Tabla 8. Compuestos con presencia confirmada de 13C. 127 Tabla 9. Características fisicoquímicas principales de los sedimentos investigados. (-): no determinado. 86 Tabla 10. Abundancias relativas de los distintos compuestos cuyo metabolismo fue predicho computacionalmente. N.D.: no detectado. 88 135 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos 136 XI Índice de abreviaturas Índice de abreviaturas XI - Índice de abreviaturas AMDIS: Automated Mass spectral Deconvolution and Identification ANOVA: one-way analysis of variance AQ: Aqaba ARCH: Archaea BIZ: Bizerta BSTFA: N,O-bis-trimetilsilitrifluoroacetamida CE: electroforesis capilar (capilar electrophoresis) CV: coeficiente de variación DA: análisis discriminante (discriminant analysis) DAPI: 4’,6-diamidino-2-fenilindol (4’,6-diamidino-2-phenylindole) DNA: ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid) ELF: Elefsina ELMAX: El Max EUB: Eubacteria EURY: Euryarchaeota FDA: Food and Drug Administration GC: cromatografía de gases (gas chromatography) GM1: Grupo Marino 1 HAV: MT Haven HC2: Halophilic Cluster 2 HCA: hierarchical component analysis IR: infrarrojo JS1: Japan Sea 1 KB1: Kebrit Deep Bacteria 1 KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes LC: cromatografía de líquidos (liquid chromatography) LPA: lisoglicerofosfato (lysoglycerophosphate) 139 Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos m/z: relación masa/carga MANOVA: multivariate analysis of variance MBGA: Crenarchaea Marine Benthic Group A MCh: Mar Chica MES: Mesina METLIN: Metabolite and Tandem MS Database MFE: Molecular Feature Extraction MGI: Thaumarchaea Marine Group I MGII: Euryarchaea Marine Group II MS: Espectrometría de masas (mass spectrometry) MSBLx: Mediterranean Sea Brine Lakes x MSTFA: N-metil-N-trimetilsilitrifluoroacetamida MT: tiempo de migración (migration time) NIST: National Institute of Standards and Technology NO: óxido nítrico (nitric oxide) OD1: OP11-derived 1 OP1 y 11: Obsidian Pool 1 y 11 OPLS: ortogonal projections to latent structures p.e.: punto de ebullición PBS: phosphate buffered saline PCA: análisis de componentes principales (principal components analysis) PCR: polymerase chain reaction PLS: partial least squares PRI: Priolo Q2: coeficiente de capacidad predictiva QC: control de calidad (quality control) R: cepas resistentes R0: 1 día, réplica a tiempo 0 R2: 2 semanas, réplica a tiempo 2 semanas 140 Índice de abreviaturas R2: coeficiente de determinación R3: 3 semanas, réplica a tiempo 3 semanas RI: índice de retención (retention index) RMN: resonancia magnética nuclear RNA: ácido ribonucleico (ribonucleic acid) RPMI: medio de cultivo Roswell Park Memorial Institute RT: tiempo de retención (retention time) SA1 y 2: Shaban Deep Archaea 1 y 2 SNT: cepas sensibles no tratadas ST: cepas sensibles tratadas TFA: ácido trifluoroacético (trifluoroacetic acid) TMEG: Terrestrial Miscellaneous Euryarchaeotal Group TOF: tiempo de vuelo (time of flight) UV: ultravioleta VC2: Euryarchaea Hydrothermal Vent VIH: virus de la inmunodeficiencia humana WS3: Wurtsmith aquifer Sequences 3 141
