ANEXO TEÓRICO PRÁCTICO TSGA
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Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 ANEXO TEÓRICO PRÁCTICO (TSGA) DIVERSIDAD MICROBIANA I Universalidad de microorganismos: Los microorganismos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, pues se hallan en casi todas partes. Los encontramos en charcos, arroyos, aguas de mar, residuos cloacales, en el suelo, aire, alimentos, materia orgánica en descomposición, en la superficie y cavidades de nuestro cuerpo, etc. Esto refleja la diversidad de hábitats dentro de los cuales los microorganismos pueden desarrollarse y evolucionar afectando de varios modos los ambientes en que viven, algunos de ellos causando enfermedades y otros desempeñando papeles beneficiosos. La microbiología es el estudio de los microorganismos, grupo grande y diverso de formas de vida libre que existen como células aisladas o formando grupos. Así pues, las células microbianas son diferentes de las células de los animales y las plantas que son incapaces de vivir aisladas en la naturaleza, en vista de que únicamente pueden sobrevivir como parte de organismos multicelulares. Todas las células contienen proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y polisacáridos. Debido a que estos componentes químicos son comunes a todo el mundo vivo, se piensa que todas las células descienden de un ancestro común. A través de millones de años de evolución se ha originado la extraordinaria diversidad de tipos celulares que existen en la actualidad. Los microorganismos pueden dividirse para su estudio en cinco grupos principales: algas, hongos, protozoarios, bacterias y virus. Estos cinco grupos pueden dividirse a su vez según su organización celular en eucariotas (algas, hongos y protozoarios) y procariotas (bacterias); los virus no presentan estructura celular. Características más importantes de los grupos de organismos eucarióticos: Algas: Conjunto grande y variado de organismos eucarióticos que contienen clorofila y otros pigmentos fotosintéticos en estructuras membranosas llamados cloroplastos. Llevan a cabo una fotosíntesis oxigénica. No deben confundirse con las cianobacterias (antiguamente llamadas "algas verde-azuladas"), nombre que recalca su forma procariótica). Son unicelulares o coloniales. Cuando las células se acomodan extremo con extremo se las llama filamentosas. Algunas llegan a medir varios metros de longitud. Dentro de los principales grupos de algas podemos mencionar: Clorophyta (algas verdes), Euglenophyta (euglénidos), Chrysophyta (algas pardo-doradas, diatomeas), Phaeophyta (algas pardas), Pyrrophyta (dinoflagelados), Rhodophyta (algas rojas). Hongos: En contraste con las algas, los hongos carecen de clorofila. Se diferencian de las bacterias porque las células fúngicas son mucho mayores y contienen un núcleo, vacuolas y mitocondrias, típicas de las células eucarióticas. Todos los hongos son organotróficos. Los hábitats son muy 1 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 diversos: acuáticos, terrestres, patógenos de plantas y animales. Tres grupos de hongos tienen una importancia práctica: mohos, levaduras y setas. Los mohos son hongos filamentosos (se desarrollan sobre el pan, queso o fruta). Cada filamento único se llama hifa, y su conjunto se denomina micelio. Presentan esporas asexuales (conidios) y sexuales. Las levaduras son hongos unicelulares. Las células son esféricas, ovales o cilíndricas y en general la división celular se lleva a cabo por gemación. Las levaduras florecen en hábitats donde hay azúcares, por ejemplo, frutas, flores y la corteza de los árboles. Algunas especies viven en simbiosis con animales, sobre todo insectos y algunas son patógenas para los animales y el hombre. Las más importantes comercialmente pertenecen al género Saccharomyces. Las setas son hongos filamentosos que forman estructuras grandes llamadas cuerpos fructificantes, que es la parte comestible de la seta. Protozoarios: Son microorganismos eucarióticos unicelulares que carecen de paredes celulares. Por lo general son incoloros y móviles. Los protozoarios se encuentran en una variedad de hábitats de agua dulce y de agua de mar, gran cantidad de ellos son parásitos de otros animales, incluyendo al hombre y algunos se encuentran sobre la tierra o en hábitats aéreos, por ejemplo las superficies de los árboles. Se alimentan ingiriendo partículas o macromoléculas. Los protozoarios que se mueven con movimientos ameboideos se denominan Sarcodina, los que utilizan flagelos son los Mastigóforos, y los que utilizan cilios, los Cilióforos. Los Esporozoos, generalmente no son móviles y son parásitos de otros animales. Una demostración simple de laboratorio - la columna de Winogradsky- ilustra cómo diferentes microorganismos interactúan entre sí, de forma tal que la actividad metabólica de un microorganismo posibilita el crecimiento de otros y viceversa. Estas columnas, que llevan el nombre del microbiólogo ruso que las utilizó por primera vez, son sistemas completos autoreciclables, puestos en marcha solamente por energía lumínica. La Columna de Winogradsky Bacterias y Archaeas (procariotas), exhiben una diversidad metabólica tan sorprendente que difícilmente podremos encontrarla en animales, plantas, hongos u otros organismos "superiores" (eucariotas). Los procariotas, literalmente, mantienen su sistema biológico utilizando y reciclando, una y otra vez, todos los elementos minerales necesarios para su soporte vital. Toda la vida sobre la Tierra podría clasificarse en función de las fuentes de carbono y energía de las que depende cada organismo: la energía puede obtenerse de reacciones luminosas (fotótrofos) o de oxidaciones químicas (a partir de compuestos orgánicos o inorgánicos); el carbono para la síntesis celular puede obtenerse del CO2 (autótrofos) o de compuestos orgánicos preformados (heterótrofos). Combinando estas categorías tendremos las cuatro estrategias básicas de los seres vivos: fotoautótrofos (plantas), quimioheterótrofos (animales, hongos), fotoheterótrofos y quimioautótrofos. Sólo entre las bacterias se pueden encontrar estas cuatro estrategias básicas de la vida. 2 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 Dos famosos microbiólogos fueron pioneros en el estudio de estos procesos: Sergei Winogradsky (1856-1953) y Martinus Willen Beijerinck (1851-1931). En contraste con los estudios sobre cultivos puros de otros microbiólogos como Louis Pasteur o Robert Koch, estos investigadores se centraron en estudiar las relaciones entre diferentes tipos de microorganismos en comunidades mixtas. La columna de Winogradsky es una demostración clásica de cómo los microorganismos ocupan "microespacios" altamente específicos de acuerdo con sus tolerancias medioambientales y sus necesidades vitales (requerimientos de carbono y energía) y que, además, ilustra cómo diferentes microorganismos desarrollan sus ciclos, y la interdependencia que llega a existir entre ellos (las actividades de un microorganismo permite crecer a otro y viceversa). Esta columna es un sistema completo y autónomo de reciclamiento, mantenido sólo por la energía de la luz. El montaje consta de un cilindro ancho de cristal que se llena con lodos ricos en materia orgánica hasta 1/3 de su volumen. Se añaden restos orgánicos de diferente origen (tiras de papel de periódico, aserrín, restos de raices de plantas, carne piada, etc). Se añade a la mezcla un suplemento compuesto de SO4Ca y CO3Ca (que actúan como fuente de sulfato y tampón respectivamente). La mezcla, bien apretada para que no queden burbujas de aire, se cubre con agua procedente de un lago, estanque, acequia (o alguna fuente similar), se cubre con papel de aluminio y se deja en una ventana donde reciba la luz del sol. A lo largo de la columna se desarrollan diversos organismos. En la zona inferior de lodos se desarrollan organismos que desarrollan procesos fermentativos que producen alcohol y ácidos grasos como subproductos de su metabolismo. Estos productos de "desecho" son a su vez el sustrato para el desarrollo de bacterias reductoras de sulfato. Como resultado se liberan sulfuros que difunden a la zona superior oxigenada creando un gradiente en el que se desarrollan bacterias fotosintéticas que utilizan el azufre. Por encima de esta zona pueden desarrollarse las bacterias púrpura que no utilizan el azufre. Cianobacterias y algas crecen en la parte superior y liberan oxígeno que mantiene aerobia esta zona. Microbiología de la columna de Winogradsky Entre cuatro y seis semanas después de su instalación, la columna debe estabilizarse en tres ambientes básicos distintos en los que se desarrollarán comunidades bacterianas específicas en función de sus requisitos medioambientales. Comenzando desde la parte más profunda de la columna: Zona anaerobia (sin Oxígeno) Hay dos tipos de organismos que pueden crecer en condiciones anaerobias: los que fermentan la materia orgánica o los que realizan la respiración anaerobia. La fermentación es un proceso en el que los compuestos orgánicos son degradados de forma incompleta (por ejemplo, las levaduras 3 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 fermentan los azúcares a alcohol). La respiración anaeróbica es un proceso en el que los sustratos orgánicos son completamente degradados a CO2, pero usando una substancia distinta del oxígeno como aceptor terminal de electrones (Algunas bacterias, por ejemplo, utilizan nitratos o iones sulfato en vez del oxígeno). En el nivel más bajo de la columna, en un ambiente con alta concentración de SH2, aparecen varios grupos diferentes de bacterias: En el fondo de la columna, dependiendo del tipo de barro utilizado, puede aparecer una capa de color rosado formada por bacterias púrpura del azufre portadoras de vesículas de gas. Una especie característica es Amoebobacter En esta misma zona, en condiciones estrictamente anaerobias al cabo de unas semanas, y utilizando la carga de celulosa aportada por los restos de papel incorporados en el sedimento como fuente primaria para su metabolismo, aparecen las bacterias del género Clostridium. Todas las especies de este género son anaerobias estrictas porque, aunque sus esporas pueden sobrevivir en condiciones aerobias, las células vegetativas mueren si están expuestas al oxígeno. Por eso no empiezan a crecer hasta que éste desaparece del sedimento. Estas bacterias degradan la celulosa a glucosa y, a continuación, fermenta la glucosa para obtener la energía que necesitan, produciendo una serie de compuestos orgánicos simples (etanol, ácido acético, ácido succinico, etc) como productos finales de esa fermentación. Un poco por encima, las bacterias reductoras del azufre, que se visualizan como una profunda capa negra y están representadas por Desulfovibrio, pueden utilizar estos subproductos de la fermentación para su respiración anaerobia, usando sulfato, u otras formas parcialmente oxidadas de azufre como el tiosulfato, generando grandes cantidades de SH2 en el proceso. Este SH2 reaccionará con cualquier hierro presente en el sedimento, produciendo sulfuro ferroso, que da color negro. Es por esto que los sedimentos acuáticos son frecuentemente negros. Sin embargo, no todo el SH2es utilizado. Como veremos un poco más adelante, ciertas cantidades difunde hacia arriba a lo largo de la columna de agua y son utilizados por otros organismos que crecen en las zonas superiores. Este crecimiento se visualiza bajo la forma de dos bandas estrechas, brillantemente coloreadas, inmediatamente por encima del sedimento: en una primera franja, las bacterias verdes del azufre (como Chlorobium) procesan los sulfatos a azufre y aparecen en una franja verdosa. En otras zonas cercanas, bacterias como Gallionella procesan el Hierro formando una capa negra que se forma justamente por debajo de la anterior. Un poco más arriba, algo más alejadas por tanto de las altas concentraciones de sulfídrico se desarrolla una zona de bacterias púrpuras del azufre, como Chromatium, caracterizada por su color rojo-púrpura. Estas bacterias del azufre, verdes y púrpuras, obtienen energía de las reacciones luminosas y producen sus materiales celulares a partir de CO2. En gran medida, de manera muy similar a cómo 4 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 lo hacen las plantas aunque, sin embargo, hay una diferencia esencial: no producen oxígeno durante la fotosíntesis porque no utilizan H2O como elemento reductor sino SH2. Las ecuaciones simplificadas que siguen muestran el paralelismo de ambos procesos: 6 CO2 + 6 H2O C6H12O6 + 6 O2 (fotosíntesis 6 CO2 + 6 SH2 C6H12O6 + 6 S ( fotosíntesis de las bacterias anaerobias) de las plantas) Un poco por encima de esta zona nos encontramos una franja de bacterias púrpuras no del azufre, como Rhodospirillum y Rhodopseudomonas, que adquiere un color rojo-anaranjado. Su mayor o menor abundancia dependerá de la cantidad de sulfhídrico que se haya producido y de la cantidad que, no utilizada por otros organismos, difunda hacia arriba, ya que su presencia inhibe a estas bacterias. Son anaerobios fotoorganotrofos que sólo pueden realizar la fotosíntesis en presencia de una fuente de carbono orgánico. Zona aerobia (rica en Oxígeno) La parte superior de la columna de agua puede contener abundantes poblaciones de bacterias de diferentes tipos. Son organismos aerobios que se encuentran habitualmente en los hábitats acuáticos ricos en materia orgánica (estanques poco profundos, arroyos contaminados, etc). Suelen ser flagelados, lo que les permite moverse y establecerse en nuevas áreas. Puede desarrollarse también microorganismos fototróficos variados procedentes directamente del agua o del barro utilizado originalmente en el montaje de la columna. La superficie del barro puede presentar en esta zona un ligero color castaño. Esta es la parte de la columna más rica en oxígeno y más pobre en azufre. Sin embargo, también aquí llegarán por difusión, procedentes del barro de zonas inferiores, ciertas cantidades de SH2 que será oxidado a sulfato por bacterias que oxidan azufre (como Beggiatoa y Thiobacillus). Estas bacterias obtienen energía oxidando el SH2 a azufre elemental y sintetizan su propia materia orgánica a partir de CO2. Por esto se les llama quimoautótrofas. En las zonas superiores pueden crecer también cianobacterias fotosintéticas, lo que se visualizaría cómo un tapete de césped de color verde. Éstas bacterias se caracterizan por ser las únicas que realizan una fotosíntesis similar a la de las plantas. De hecho, hay poderosas evidencias de que los cloroplastos de las plantas proceden de cianobacterias ancestrales que se establecieron como simbiontes dentro de células de algún eucariota primitivo. De forma paralela hay también evidencias igualmente fuertes de que las mitocondrias de los eucariotas actuales se derivaron de bacterias púrpuras ancestrales por un similar sistema de endosimbiosis. 5 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 Procedimiento para el armado de la columna de Winogradsky Colectar una cantidad de tierra o barro de un arroyo, lago, pantano o costa de río (aproximadamente 100 –150 gr de sedimento superficial o subsuperficial) para llenar el recipiente hasta una altura aproximada de 10 cm. Remover las piedras, ramas o partículas grandes del material en estudio. Mezclarlo con las sales (5 gr de cada una de las siguientes sales: CaCO3, CaSO4, CaHPO4) y el papel de filtro o papel de diario finamente cortado. Colocar la mezcla en un recipiente adecuado (en nuestro caso una probeta de vidrio de 500 ml) y añadir suficiente agua destilada hasta aproximadamente 3 – 5 cm del borde. Revolver la mezcla para eliminar burbujas de aire. Colocar 3 o 4 portaobjetos en una posición vertical sobre el sustrato inclinados contra la pared del recipiente. Marcar el nivel de agua y cubrir la boca de la probeta con una envoltura plástica para reducir la evaporación. Puede ser necesario reponer agua para mantener el nivel original. Incubar a temperatura ambiente cerca de una ventana para que reciba una adecuada cantidad de luz, pero no excesiva. 6 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 Bibliografía: Brock, Biología de los Microorganismos (10a Ed.): Capítulos 20 (20.1 al 20.3 y 20.5), Capítulo 4 (4.8, 4.9 y 4.15). Russell AD, Hugo WB y Ayliffe GA J. “Principles and practice of disinfection, Preservation and Sterilization” Ed Blackwell Science (1999) Ferrari SG, Mattana CM, Di Genaro, MS y Favier, GI. “Manual de Seguridad en el Laboratorio de Microbiología”, Nueva Editorial Universitaria, UNSL (2011) La Herencia de Winogradsky. Brock: Biología de los microorganismos. 8ª edición. p. 493. Apuntes teóricos de la Asignatura. 7 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 DIVERSIDAD MICROBIANA II HONGOS, PROTOZOOS, CIANOBACTERIAS Y ALGAS VERDADERAS HONGOS Objetivos Reconocer y diferenciar las distintas estructuras (micelios, hifas, esporas, etc.) de los hongos unicelulares y pluricelulares, por observación microscópica en fresco. Comparar el tamaño de las levaduras con el tamaño de las bacterias, por observación microscópica en fresco o por tinción de Gram. Introducción Los hongos son organismos eucariotas, provistos de pared, sin clorofila, que presentan esporas. Son quimioorganotrofos, es decir, que para su nutrición necesitan sustancias orgánicas elaboradas por otros organismos. Pueden ser unicelulares (levaduras) o pluricelulares y filamentosos (mohos). En ambos casos, una sola célula o un conjunto de ellas forman un cuerpo que desempeña todas las funciones vitales. Esto es lo que se conoce con el nombre de talo. Talo: es la organización anatomo-fisiológica capaz de cumplir con todas las funciones de un organismo vivo. El talo puede ser unicelular (hongos levaduriformes) o pluricelulares (hongos filamentosos). 8 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 Micrografía electrónica mostrando hongos levaduriformes o unicelulares (algunos en gemación) El talo pluricelular generalmente está constituido por filamentos pluricelulares ramificados. Cada filamento individual se llama hifa y al conjunto de hifas se lo denomina micelio. Las hifas pueden ser tabicadas o no tabicadas (cenocíticas) originando micelios. Hifas tabicadas Hifas no tabicadas 9 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 De acuerdo a su función los micelios se clasifican en: - micelio aéreo o de reproducción micelio vegetativo Micelio de reproducción tiene como única función producir elementos para perpetuar la especie, las esporas, que en los hongos pueden ser asexuales y sexuales. Este micelio está formado por órganos generadores de esporas y órganos accesorios de protección y sostén. Micelio vegetativo: cumple funciones de absorción, asimilación y fijación al medio en que vive. La reproducción asexual en los hongos puede ser por: - Fisión somática de células, que da origen a 2 nuevas células iguales. Gemación de células somáticas donde cada gema es una pequeña proyección de la célula madre que se desarrollará en un nuevo individuo. Ej.: la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae). Forma unicelular de la levadura con sus cicatrices de nacimiento (cóncava) y gemación (convexa). - Fragmentación o disrupción de células de una hifa. Cada fragmento se transformará en un nuevo individuo. Esporulación: existen diferentes clases de esporas en la reproducción asexual: 1.-esporangiosporas: estas esporas se forman en sacos llamados esporangios, que se encuentran en la parte final de una hifa especializada (esporangióforo). Ej.: Aspergillus y Penicillium. 2.-conidiosporas o conidias: cuando la conidia es pequeña se llama microconidia. Cuando son grandes y multicelulares son macroconidias. Se forman en el extremo de una hifa o lateralmente a ella. Entre ellas se encuentran: 2.-a- artrosporas: estas esporas se forman por disrupción de las células de una hifa. 10 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 2.-b-clamidosporas: son esporas rodeadas de una gruesa pared altamente resistentes a múltiples condiciones. Se forman a partir de células vegetativas de la hifa. 2-.c--blastosporas: son esporas formadas por gemación. Las yemas se alargan y no se separan dando lugar a pseudohifas y pseudomicelio. 11 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 La reproducción sexual en hongos consta de tres fases: 1.-Plasmogamia: un nucleo haploide de una celula donante (+) penetra en el citoplasma de una celula receptota (-). 2.-Cariogamia: Los nucleos (+) y (-) se fusionan para formar un nucleo cigotico diploide. 3.-Meiosis: El nucleo diploide da origen a nucleos haploides: esporas sexuales. Estas esporas sexuales caracterizan a los grupos (filos) de los hongos: Grupo o filo Espora sexual Caracteristicas espora de la Genero caracteristico ZIGOMYCOTA zigospora Grande, encerrada en Rhizopus (hongo una pared gruesa negro del pan) ASCOMYCOTA ascospora Se encuentran dentro Aspergillius de un saco denominado asco ASIDIOMYCOTA basiodospora Se forman Cryptococcus externamente sobre una base o pedestal denominado basidio Además, la reproducción sexual en hongos puede realizarse por distintos mecanismos: Copulación de gametos: pares de células sexuales o gametos especializadas llamadas gametangios, se fusionan. formados en estructuras Copulación gameto-gametangial: es la fusión de un gameto diferenciado de un sexo con un gametangio del otro sexo. Copulación gametangial: es la fusión directa de gametangios sin diferenciación de gametos, Copulación somática: fusión de hifas. 12 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 Condiciones de cultivo de los hongos: Los hongos son organismos heterotróficos. Se pueden cultivar en el laboratorio y si se los compara con las bacterias heterotróficas, presentan requerimientos más simples. El pH de crecimiento óptimo oscila entre 4.5 y 5.5. La temperatura óptima es de alrededor de 30°C y crecen en ambientes con baja humedad o donde la concentración de azucares o sales es relativamente elevada. Medios de cultivo: -Agar Sabouraud-dextrosa Peptona 10 g Dextrosa 40 g Agar 15 g A.D. 1000 ml pH .= 5.6 Se disuelven los componentes en A.D. Homogeneizar bien. Fundir y distribuir en tubos. Esterilizar en autoclave durante 15 min a 121°C. Colocar en soporte para que solidifique en pico de flauta. 13 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 -Agar Czapek Dox NaNO3 2g KCl 0.5 g Glicerofosfato de Mg 0.5 g FeSO4 0.01 g K2SO4 0.35 g Sacarosa 30 g Agar 12 g pH = 6.8 Se disuelven los componentes en un litro de agua destilada. Se funde, envasa y esteriliza 20 min a 121°C. Si es necesario disminuir el pH a 3.5 para microorganismos acidófilos, adicionar 10 ml de ácido láctico al 10 por litro de medio de cultivo antes de esterilizar. Técnicas micológicas: Se llama así al conjunto de operaciones y observaciones de laboratorio que permiten el estudio morfológico y biológico de los hongos y cuyo resultado conduce a su clasificación sistemática. Los hongos a estudiar pueden ser tomados del hábitat natural (suelo, aire, agua, etc), de las lesiones que producen o de los medios de cultivo donde ya han desarrollado. El material de laboratorio que se emplea es el de uso corriente en Microbiología. Observación: el estudio y taxonomía de los hongos se hace en base a los caracteres morfológicos macro y microscópico de su desarrollo. Observación macroscópica: forma, aspecto, color, consistencia, tamaño y estructura de las colonias. Observación microscópica: en fresco, sobre portaobjetos, se disgrega el material con una gota de solución fisiológica o agua destilada, o colorantes vitales. Para mejor contraste se puede usar azul de lactofenol. Otra coloración empleada es la de Gueguén (ácido láctico, Sudán III, azul cotton y tintura de yodo-alcohol). Se coloca cubreobjetos y se lleva al microscopio. Tratar de reconocer las distintas estructuras del hongo: micelios, hifas, esporas, etc. 14 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 PROTOZOOS Objetivo Reconocer y diferenciar las distintas estructuras (flagelos, cilios, núcleos, vacuolas, etc.) que presentan los protozoos. Determinar si presentan movilidad por cilios, flagelos o pseudópodos, por observación microscópica en fresco. Distinguir formas quísticas y trofozoítos. Introducción Son protistas eucariotas, generalmente unicelulares. A diferencia de otros protistas, poseen movilidad en algún estadio de su ciclo vital, carecen de pared celular y pueden obtener su alimento por pinocitosis y/o fagocitosis. Desde el punto de vista ecológico, se dividen en: -formas de vida libre o simbióticos -parásitos Los protozoos de vida libre se encuentran en una gran variedad de hábitats (agua salada, agua dulce, arena, tierra, materiales en descomposición, etc). Los factores que afectan a estos microorganismos son: -humedad -luz -pH: algunos toleran un amplio rango (entre 3.2 y 8.7). Para la mayoría el pH óptimo para su máxima actividad metabólica está entre 6 y 8. -temperatura: la mínima óptima está entre 16 y 25°C y la máxima entre 36 y 40°C. Son poco afectados por las bajas temperaturas. En estado de quiste pueden soportar grandes variaciones. -nutrientes: algunos crecen en aguas ricas en O2, con bajas concentraciones de nutrientes orgánicos. Otros requieren aguas ricas en minerales. Algunos desarrollan mejor en ambientes con activa oxidación y degradación de materia orgánica. Otros necesitan la presencia de bacterias y otros protozoos para alimentarse. Muchos protozoos forman cistos o quistes en alguna etapa de su vida. Estos son formas de resistencia capaces de sobrevivir en condiciones ambientales adversas tales como deshidratación, baja concentración de nutrientes, anaerobiosis. En los protozoos parásitos, la transmisión de un huésped a otro se hace generalmente a través de quistes. 15 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 Como regla general, los protozoos se reproducen asexualmente. Los más evolucionados pueden multiplicarse sexualmente. Algunas especies parásitas tienen una fase asexual en un huésped y una fase sexual en otro. La reproducción asexual puede ocurrir mediante fisión binaria o múltiple o por gemación. Un método de clasificación se basa en la forma de locomoción que presentan: Clase Sarcodina (amébidos): son protozoos de membrana fina que se desplazan por emisión de pseudópodos (movimiento ameboide), que les permiten incorporar partículas diversas (fagocitosis). Clase Mastigophora (flagelados): son protozoos que se desplazan empleando apéndices largos y ondulados, muy móviles, denominados flagelos. Clase Ciliphora o Ciliata (ciliados): protozoos que presentan numerosos apéndices cortos o cilios que facilitan el movimiento y la nutrición. Clase Sporozoa (esporozoos): especies parásitas inmóviles en sus formas adultas, que presentan complejos mecanismos de reproducción, los cuales incluyen ciclos asexuales y sexuales en diversos huéspedes, y alternan formas vegetativas, esporuladas y gametocitos. 16 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 Descripción de un protozoo ciliado: Paramecio Presenta dos núcleos: el micronúcleo, que tiene relación con la herencia y la reproducción sexual, y el macronúcleo, que es responsable de la producción de RNAm para diversos aspectos del crecimiento y funciones celulares. Obtiene su alimento por ingestión de material particulado a través de la región oral o boca. Una vez adentro, las partículas son arrastradas hacia el esófago y al interior del citoplasma donde son encerradas en una vacuola digestiva, una estructura parecida a un lisosoma en la que se secretan enzimas digestivas. Las vacuolas se desplazan de modo regular en el citoplasma y se desintegran en la región del poro anal, donde tiene lugar la excreción de los productos de desecho. Otra vacuola, la vacuola contráctil, interviene en la eliminación de agua y en la regulación osmótica. Además de los cilios, muchos ciliados tienen tricocistos, que son filamentos delgados y largos de naturaleza contráctil anclados en la superficie de la capa celular externa. Permiten que el protozoo se fije a una superficie y contribuyen a la defensa. 17 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 Medios de cultivo Existe una gran variedad de medios para protozoos de vida libre y parásitos. La selección del medio se realiza de acuerdo con los objetivos que se desean alcanzar. Examen microscópico Cuando la cantidad de organismos en la muestra es escaso, se pueden aplicar técnicas de concentración. - Preparaciones en fresco: colocar una suspensión de la muestra entre portaobjetos y cubreobjetos. Comenzar la observación con objetivo de poco aumento. Los objetos pueden medirse rápida y fácilmente si se usa ocular micrométrico. Una gota de solución saturada o al 10% de metilcelulosa puede agregarse a la preparación de ciliados o flagelados para retardar el movimiento activo de los microorganismos sin causar deformaciones. El mismo efecto se logra con una solución débil de sulfato de níquel. - Coloración vital: observar los preparados con soluciones muy diluidas de colorantes: verde B de Janus (1:10000-50000) tiñe las mitocondrias, azul de metileno (1:10000) tiñe gránulos citoplasmáticos, núcleo, etc. y rojo neutro. Sin ser estrictamente una coloración, la solución de lugol permite demostrar organelas como flagelos y cilios. Los cuerpos de glucógeno se tiñen de color castaño rojizo. Lugol permite un mejor examen de quistes o cistos de protozoos intestinales. - Preparaciones permanentes (con colorantes) - Previo a la coloración, la muestra se trata con fijadores. - Fijadores comúnmente usados: -Schaudin Bicloruro mercúrico saturado y frío (6-7%) Alcohol absoluto o de 95° 33 cc Acido acético glacial 5 cc 66 cc -Bouin Acido pícrico (saturado) 75 cc Formaldehido 25 cc Acido acético glacial 5 cc -Coloraciones de uso común -Hematoxilina-hierro -Feulgen -Impregnación argéntica -Giemsa 18 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 Técnica de Giemsa (comúnmente empleada para protozoos parásitos) Fijar los frotis con vapores de tetraóxido de osmio al 2%, o con alcohol metílico, durante 20 a 30 segundos. Teñir con Giemsa durante 1 ó 2 h; se puede disminuir el tiempo a 20 min si se coloca en la siguiente solución: Giemsa 20 gotas Agua destilada 20 ml Lavar en agua corriente y seque al aire. Preparación del colorante: Alcohol metílico 30 ml Glicerina 10 ml Colorante de Giemsa 0.25 g Conservar en frasco oscuro. Este colorante listo para ser usado se puede adquirir en el comercio. Ejemplos de diversas morfologias de protozoos 19 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 Ejemplos de protozoos acuáticos: 20 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 ALGAS ALGAS PROCARIOTAS Objetivo: Reconocer y diferenciar las distintas estructuras de cianobacterias fijadoras de nitrógeno (tricoma, heterocistos etc) por observación microscópica en fresco. Introducción Son un grupo de microorganismos procariotas, fototrofos, con pared celular, no poseen cloroplastos, que presentan las siguientes características fisiológicas: Poseen el mismo aparato fotosintético de las plantas superiores, es decir, 2 fotosistemas con utilización de H2O como agente reductor y desprendimiento de O2. Muchas especies tienen la capacidad de fijar nitrógeno molecular (N2). Presentan pigmentos accesorios para la fotosíntesis, las ficobiliproteínas, que además actúan como reserva proteica. Son clasificadas como bacterias porque: -son procariotas -la estructura y composición de la pared celular es similar al de las bacterias gramnegativas, con presencia de peptidoglicano -la pared contiene ácido diaminopimélico. Son clasificadas como algas porque: -contienen clorofila a -usan CO2 y liberan O2 en el proceso de fotosíntesis Se pueden clasificaar en: Cianobacterias indiferenciadas no fijadoras de N2: no presentan heterocistos Cianobacterias fijadoras de nitrógeno: presentan heterocistos 21 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 Heterocistos: son células de paredes gruesas con gránulos polares que fijan N2 atm. No poseen clorofila. Akinetos: células latentes de paredes gruesas que dan origen a nuevos tricomas. Tricoma: conjunto de células de una cianobacteria organizadas como una unidad con forma de filamento. Ejemplo de cianobacteria: Nostoc La unidad estructural está constituida por un filamento de células o tricoma. La elongación del tricoma es acompañado por un incremento en el número de células como consecuencia de divisiones intercaladas. Las células son circulares o elipsoides, provistas con consistente pared. El citoplasma está limitado por la membrana plasmática que lo separa de la pared y por reacciones citoquímicas se puede observar que contiene polisacáridos similares a almidón, una proteína llamada cianoficina, gránulos de volutina y gotas de lípidos. También se encuentran vacuolas que incluyen líquidos metabólicos, fosfatasas o gas. Las vacuolas de gas regulan la flotación de acuerdo con la intensidad de la luz y el estado fisiológico. El aparato fotosintético está compuesto por tilacoides, vesículas largas y aplanadas que se ubican en capas paralelas a la pared. Allí se realizan procesos como fotosíntesis, fosforilación y liberación de O2. En ausencia de una fuente combinada de N2 en el medio, una pequeña fracción de células en el tricoma se transforman en heterocistos, que se caracterizan por su gruesa pared, débil pigmentación, gránulos polares refráctiles y por no poder dividirse. Realizan la fijación de N2 bajo condiciones aeróbicas. 22 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 Nostoc: cianobacteria fijadora de nitrogeno, mostrando su tricoma y sus heterocistos. Het: heterocisto ALGAS EUCARIOTAS (ALGAS VERDADERAS) Son eucariotas, contienen clorofila en cloroplastos y presentan pared compuesta por celulosa. Caracteres utilizados para la clasificación de las algas -aparato fotosintético: todas contienen clorofila a. Algunas poseen otras clorofilas que difieren en detalles estructurales y propiedades ópticas. Algunos grupos de algas se caracterizan por tener pigmentos accesorios. Algunas algas usan dadores de electrones como H2S y H2 en una fotosíntesis que no produce O2. Existen algas que son fototrofos obligados, y otras fototrofos facultativos porque pueden asimilar y desarrollar en la oscuridad sobre azúcares o ácidos orgánicos. -sustancias de reserva: son sintetizados durante la fotosíntesis. Pueen ser almidones, diversos β-1,3-glucanos, azúcares, polialcoholes y lípidos. -morfología: las formas más simples son unicelulares. Otras son filamentosas, con o sin septos, ramificadas o no ramificadas, etc. 23 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 -motilidad: algunas algas en fase vegetativa son móviles por flagelos. En otros casos, las algas son inmóviles en fase vegetativa pero forman gametos móviles. Un movimiento de tipo “reptante” se piensa que se debe a la secreción de una sustancia mucilaginosa. -estructura de la pared celular: está compuesta básicamente por celulosa adicionada con otros polisacáridos como pectina (ácido poligalacturónico), xilanos, ácidos algínicos, etc. A veces la pared está reforzada por la precipitación de carbonato cálcico (algas coralinas), quitina o sílice. -estructura de los cloroplastos: se toma en consideración la forma y número. Cultivo de algas: Se realiza en medios minerales líquidos y sólidos, en presencia de luz (fuente de energía) y anhídrido carbónico o bicarbonato (fuente de carbono). Los recipientes empleados deben ser de vidrio con una elevada relación área/volumen (fotobiorreactores). Medios de cultivo 1- Medio de Johnson (g/l) MgCl.6H2O, 1.5; MgSO4.7H2O, 0.5; KCl, 0.2; CaCl2.2H2O, 0.2; KNO3, 1.0; Tris (se llevó a pH 6.5 con HCl), 2.45; KH2PO4, 0.035; EDTA, 1.89 x 10-3; ZnCl2, 4.1 x 10-5; H3BO3, 6.1 x 10-4; (NH4)6Mo7O24.4H2O; 3.8 x 10-4; VOCl2, 4.1 x 10-5. 2- Medio optimizado de Chlorella vulgaris –BW3 (modificado para el cultivo de cianobacterias) (g/l) KH2PO4, 0.25; NaHCO3, 0.5; MgSO4.7H2O, 0.0375; FeCl3.6H2O, 0.024; Na2-EDTA.2H2O, 8.54 x 102;ZnSO4.7H2O, 4.5 x 10-3; Na2MoO4.2H2O, 2.5 x 10-3; CuSO4.5H2O, 2 x 10-3; CaCl2.2H2O, 0.04; MnSO4.4H2O, 4 x 10-3;Na2B4O7.7H2O, 8.7 x 10-3; NaVO3, 1.25 x 10-4; CoCl2.6H2O, 1.25 x 10-3; NiSO4.7H2O, 2 x 10-4. Observación microscópica Se realiza en preparados en fresco a partir de medios líquidos o sólidos con solución fisiológica (NaCl 0.85%). Para algas muy móviles, se agrega formol al 0.1% para mejorar la observación. 24 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 Ejemplos de algas verdaderas: Materiales y Métodos Muestras de aguas superficiales estancadas, agua de florero, etc. Cultivos frescos de Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus y Penicillium Cultivo fresco de Nostoc (cianobacteria fijadora de N2) Portaobjetos. Cubreobjetos. Microscopio óptico Actividades a desarrollar: Hongos Observacion microscópica de: 1. Levaduras en fresco 2. Frotis de levaduras teñidos al Gram. 25 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 3. Preparados en fresco de hongos pluricelulares Algas procariotas Observación microscópica en fresco de cianobacterias fijadoras de nitrógeno (Nostoc). Bibliografía Madigan, M.T; Martinko, J.M; Stahl, D. A; Clark, D. P. Brock. Biology of microorganisms. 13th ed. Ed Pearson Educación, NSA. 2011.Disponible on line Madigan, M.T; Martinko, J.M; Dunlap, P.V; Clark, D. P. Brock. Biología de los Microorganismos. 12ª ed. Ed Pearson Educación, NSA. 2009. Tortora, G, J., Funke, B.R., Case, C. L. Introducción a la Microbiología. 9ª ed. Buenos aires: medica panamericana 2007. www.google.com (imágenes) 26 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 CRECIMIENTO MICROBIANO OBJETIVOS Representar gráficamente la evolución de cultivos en sistema batch y calcular parámetros característicos como velocidad específica de crecimiento, tiempo de duplicación, período lag y rendimiento. Entender la evolución de las variables más importantes que caracterizan el desarrollo de los microorganismos en sistema continuo INTRODUCCIÓN Sistema batch o cerrado Se toman muestras del cultivo a diferentes tiempos y se estima la biomasa en cada momento. El tiempo de reloj se debe convertir en tiempo de experiencia y cada valor de biomasa se debe transformar en ln biomasa. Esto permite ir construyendo una gráfica de ln biomasa (eje y) versus tiempo (h) en eje x. - Sistema abierto o continuo Un cultivo continuo es un sistema abierto, con volumen constante, al que se añade continuamente medio fresco y del que se retira continuamente medio (usado) con células a una velocidad constante (cultivo en medio renovado). Una vez que se alcanza el equilibrio en el sistema, el número de células y el estado metabólico permanecen constantes y se dice entonces que el sistema está en estado de equilibrio. El tipo más común de aparato que se utiliza para obtener un cultivo continuo es le quimiostato. En las figuras se observan: el esquema de un quimiostato y las variables que son importante en un cultivo abierto en estado de equilibrio. 27 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 TRABAJO PRÁCTICO DE AULA (TRABAJO PRÁCTICO Nº 8- CRECIMIENTO MICROBIANO) 1. En la siguiente curva de crecimiento para un microorganismo en sistema cerrado: señalar las distintas fases de crecimiento, cómo evoluciona la velocidad específica de crecimiento a lo largo del proceso? Cómo se calculan desde la gráfica los siguientes parámetros: velocidad específica de crecimiento (µ en h-1), tiempo de duplicación (td en min), periodo lag (en h). 28 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 lnX t (h) µ+ t (h) 0 µ- 2. Un microbiólogo estudió el crecimiento de un microorganismo anaerobio en un medio de cultivo complejo. Desea conocer los parámetros de crecimiento de la bacteria en este medio y compararlos con los obtenidos en un medio de cultivo químicamente definido. Tiempo real Tiempo de experiencia Biomasa.580 nm _________ __________________ _________ 11.00 h 0.142 12.00 0.146 13.00 0.173 15.00 0.778 17.00 4.48 18.00 11.5 20.00 13.71 21.00 14.056 ln biomasa _________ 29 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 en un sistema de ejes graficar ln biomasa vs tiempo. calcular µ en h-1, tiempo de duplicación (td en min) y periodo lag en h. cuando se hizo crecer el mismo microorganismo en un medio de cultivo químicamente definido, los parámetros de crecimiento fueron: µ = 4 h-1, td = 10 min y lag = 0,5 h. Dónde es más eficiente el desarrollo de C. chauvoei? 3. Se estudia el potencial de crecimiento de una levadura en un medio líquido conteniendo glucosa como fuente de C y energía. Obtener la curva de crecimiento a partir de los siguientes datos: Tiempo real Tiempo de experiencia ufc/ml 07.00 h 1.50 x 106 10.00 1.62 x 106 11.00 2.00 x 106 12.00 4.50 x 106 13.00 1.25 x 107 14.00 3.30 x 107 15.00 4.20 x 107 16.00 4.40 x 107 ln ufc/ml b) Calcular µ en h-1, tiempo de duplicación (td en min) y periodo lag en h. c) Establecer el rendimiento (Y) del proceso teniendo en cuenta: - biomasa inicial (x0 ) = 2 g/l - biomasa final (xf ) = 7 g/l - sustrato inicial (s0 ) = 10 g/l - sustrato final (0 g/l) 30 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental 2014 Fórmula de rendimiento: Y = - X / S = - (biomasa final – biomasa inicial) (sustrato final – sustrato inicial) Importante: el valor de Y siempre debe ser positivo! d) Comparar el valor de rendimiento (Y) obtenido en este medio con glucosa, con Y = 0.15 obtenido en una experiencia previa donde el microorganismo utilizó maltosa como fuente de C y energía. Cuál es la fuente de C recomendable para agregar a un medio nutritivo básico? 4. Represente gráficamente el crecimiento de una bacteria capaz de obtener ATP por fermentación, en un medio de cultivo conteniendo fructosa como fuente de C. Estos fueron los resultados obtenidos en el laboratorio: Tiempo de experiencia (h) ___g/l____ 0 0.002 1 0.002 2 0.0025 2.5 0.018 3 0.130 4 0.220 5 0.270 6 0.270 ___ln g/l__ a) Calcular µ en h-1, tiempo de duplicación (td en min) y periodo lag en h. b) Establecer el rendimiento (Y) del proceso teniendo en cuenta: - biomasa inicial (x0 ) = 1 g/l - biomasa final (xf ) = 10 g/l 31 Microbiología Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental - sustrato inicial (s0 ) = 30 g/l - sustrato final (3 g/l) 2014 c) Comparar el valor Y obtenido en este medio con fructosa, con Y = 0.15 obtenido en una experiencia previa donde el microorganismo utilizó arginina como fuente de C. Cuál es la fuente de C recomendable por mayor rendimiento? 5. Teniendo en cuenta las siguientes condiciones presentes en un sistema de cultivo continuo: Velocidad de dilución D = µ (en cualquier punto del eje x) Velocidad de dilución D = Flujo/Volumen Dc = µmáx (en el LAVADO) Productividad P = D x a) Responder colocando falso (F) o verdadero (V): - cuando la velocidad de dilución (D) se duplica, la velocidad específica de crecimiento (µ) permanece constante - al aumentar D, aumenta µ y disminuye el tiempo de duplicación (td) - En el equilibrio, la concentración de sustrato (S) y la biomasa (X) permanecen constantes - Al alcanzar Dc, el flujo (F) alcanza su valor máximo y cae la biomasa (X). 32
