NIVEL III AIDIS Activadid Bactericida del KMnO en Agua Superficial

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NIVEL III
AIDIS
Activadid Bactericida del KMnO4
en Agua Superficial para el Riego
de Campos Agrícolas
Por Cristobal Chaidez Quiroz*, Marcela Soto Beltrán, Celida Martínez Rodríguez, Andrés Medrano Félix
Resumen
de hepatitis A y Norovirus, están presentes en productos frescos
(Cifuentes et al., 2000). E. coli O157:H7 ha sido aislada de productos
El agua de uso agrícola puede constituir un factor importante de
contaminación de frutas y hortalizas, cuando es utilizada para la
frescos como manzana, melón, hojas de lechuga y espinacas (Solomon
irrigación, lo que hace necesario el control de su calidad microbiológica.
et al., 2002; FDA, 2006), su presencia se ha asociado al uso de suelo
En México, el 42% del agua de uso agrícola es de fuentes superficiales.
y agua de riego contaminada. Se estima que cada año se presenta en
Los compuestos elaborados a base de cloro son la alternativa química
EUA, 76 millones de enfermos y 5,000 muertes, asociados al consumo
más empleada para desinfectar el agua superficial, sin embargo ciertas
de alimentos (DeWaal et al., 2000). Recientemente y debido a la
desventajas del cloro motivan la búsqueda de nuevas alternativas de
consistencia de brotes, existe la percepción que los microorganismos
desinfección. La estabilidad en agua turbia y su capacidad oxidante
presentes en frutas y hortalizas frescas son la principal causa de
hacen del permanganato de potasio una alternativa de desinfección.
enfermedades (Beuchat, 1996).
Actualmente el KMnO4 se emplea en la desinfección del agua superficial
En los últimos años, se ha intensificado la búsqueda de
alternativas que permitan reducir o eliminar patógenos sobre la
sin sustento científico por lo tanto, el objetivo de la presente
superficie de productos frescos. Estudios previos han demostrado
investigación fue evaluar la actividad bactericida del KMnO4 contra
que los métodos de desinfección solo reducen de manera parcial las
Escherichia coli y Bacillus subtilis, usando dos concentraciones de
poblaciones microbianas presentes en las
desinfectante, tres tiempos de contacto y agua
Tabla 1.
superficie de los productos (Beuchat, 2001).
turbia. Se utilizó la técnica de extensión en placa
Características del suelo en estudio
No existe un método estándar que
y los datos fueron estadísticamente analizados
Parámetro
Resultado
permita evaluar la efectividad de un
mediante análisis de varianza. Los resultados
pH (25ºC)
7.38
desinfectante sobre productos frescos
demostraron la efectividad del KMnO4 contra
(Beuchat, 1998). Por el contrario existen
ambas bacterias. Se obtuvieron porcentajes de Conductividad eléctrica (ds/m)
0.39
recomendaciones como las descrita por la
reducción de 99.9999% y 99.99% para E. coli
2
Materia orgánica
2.07
Agencia de Protección Ambiental de Estados
y B. subtillis, respectivamente. Por lo tanto, el
1
Nitrógeno N-NO3
4.0
Unidos (USEPA, siglas en inglés) la cual
KMnO 4 puede considerarse como una
Fósforo P-PO4 1
38.5
menciona una reducción de al menos 2 Log10
alternativa para la desinfección del agua
Sodio 1
117.038
superficial. Palabras clave: Desinfección,
de la población bacteriana presente en la
superficie de los mismos (USEPA, 1997)
Escherichia coli, Bacillus subtilis, KMnO4.
Potasio 1
403.534
Bitton (1994) y Gelderich (1996) establecen
1
Calcio
5194
que un agente puede considerarse como un
Introducción
Magnesio 1
1936.29
desinfectante efectivo si logra reducir un
La calidad microbiológica del agua
Fierro 1
49.03
99.9999% (6 log 10 ). Mientras tanto el
utilizada para irrigar cultivos agrícolas es de
Manganeso 1
177.66
vital importancia, ya que esto contribuye a
“Método Oficial 960.09 de la AOAC, Acción
reducir la presencia de microorganismos
de Sanitización Germicida y Detergente de
Cinc 1
3.39
patógenos en frutas y hortalizas (FDA, 2001).
Desinfectantes” sugiere que la evaluación de
Cobre 1
2.27
La principal fuente de contaminación son las
sanitizantes para superficies pre-limpiadas,
ClC (meq/100g)
43.65
aguas residuales tratadas y no tratadas vertidas
no porosas que estén en contacto con
Textura
Arcillosa
en aguas de ríos y canales usadas para riego
alimentos, debe reducir un 99.999% de
de cultivos agrícolas (Thurston-Enriquez et al.,
bacterias (5 Log10) (Sapers, 2003).
Arcilla 2
46.48
2002; FAO, 2003, Craun y Castro, 1996) y con
La eficacia de la desinfección depende
Limo 2
27.28
menor frecuencia en el lavado y desinfección
del tipo de microorganismo, la temperatura,
2
Arena
26.24
de productos frescos.
nivel de pH del agua y tiempo de contacto,
Tamaño de partícula
425µm
El riesgo de infección aumenta cuando
así como la estructura de la superficie de
1
ppm; 2 %
patógenos, como Salmonella, Shigella, virus
productos frescos (FDA, 1998).
volumen 8, número 1
A G U A
L A T I N O A M É R I C A
El cloro es el desinfectante más utilizado en empaques agrícolas.
Su capacidad oxidante elimina rápidamente a los microorganismos,
sin embargo la materia orgánica limita su actividad oxidante, lo cual ha
motivado la búsqueda de alternativas de desinfección en aguas turbias
(Chaidez et al., 2007).
El KMnO4, obtenido a partir del dióxido de manganeso (MnO2) es
utilizado para control de olor y color, mejora el sabor e inactiva a
coliformes, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, poliovirus y bacteriófagos
en el tratamiento de agua para consumo (EPA, 1999). El KMnO4 oxida
y/o destruye enzimas celulares, siendo el ión MnO4 el responsable de
esta acción (EPA, 1999). El KMnO 4 también forma dióxido de
manganeso, el cual tiene una capa externa de grupos oxidrilos capaces
de fijar, por absorción, partículas neutras o cargadas, incluyendo
microorganismos que son fijados al precipitado coloidal para ser
inactivados (EPA, 1999).
Actualmente el permanganato de potasio se emplea en actividades
agrícolas para la desinfección del agua superficial, sin embargo, la
información científica que demuestre su eficacia como agente
desinfectante y lo respalde para su uso, resulta insuficiente. Por lo tanto,
el objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad bactericida in
vitro del permanganato de potasio en agua superficial de uso agrícola,
utilizando como microorganismos indicadores Escherichia coli y Bacillus
subtilis.
Materiales y Métodos
Purificación de la bacteria
6
), y 0.1mL de cada dilución decimal fue colocada en cajas petri
conteniendo agar selectivo mFC (DifcoTM, Maryland, USA) y agar papa
dextrosa (Bioxon, México) e incubadas a 37°C durante 24h para E. coli
y B. subtilis, respectivamente. Finalmente, la concentración bacteriana
se cuantificó en base a las unidades formadoras de colonia observadas
en el medio y el resultado fue expresado en Log10 UFC/mL.
La concentración inicial de las bacterias fueron 3.4x107UFC/mL y
3.3x10 7 UFC/mL para Escherichia coli y Bacillus subtilis ,
respectivamente.
Preparación del KMnO4
El desinfectante se adquirió de manera comercial (CAS 7722-647). El KMnO4 tiene como ingrediente activo el ión permanganato (MnO4).
Las concentraciones utilizadas durante el experimento fueron de 1.5 y
3 mg/L para Escherichia coli y 3 y 4.5 mg/L para Bacillus subtilis. Estas
concentraciones fueron determinadas de acuerdo a las empleadas
empírica-mente en actividades agrícolas para la desinfección del agua
superficial. Dato proporcionado por los técnicos de empaques agrícolas.
Preparación de turbidez en el agua
Se utilizó una concentración de 170UNT, simulando la materia
orgánica presente en agua superficial de uso agrícola, la cual fue ajustada
con tierra estéril obtenida de la localidad de Culiacán, Sinaloa (Tabla
1). Para ajustar dicha turbidez se adicionaron 0.85g de tierra estéril en
un litro de agua purificada estéril. La muestra se homogenizó y se colocó
en una celda para ser leída utilizando un espectro-fotómetro marca
HACH modelo DR 2010, de acuerdo a la APHA (1998). Los valores de
turbidez se expresaron en unidades nefelométricas (UNT).
Se seleccionaron E. coli (ATCC 15597) y B. subtilis, como
microorganismos indicadores debido a la incidencia de las mismas en
agua de uso agrícola (Cazarez Diarte et al., 2004). E. coli y B. subtilis,
fueron obtenidos del laboratorio de Microbiología Ambiental y de
Evaluación del KMnO4
Alimentos y del laboratorio de Fitopatología, ambos del Centro de
Se utilizó un recipiente de cuatro litros de capacidad, el cual fue
Investigación en Alimentación y Desarrollo, Unidad Culiacán
llenado con un litro de agua purificada estéril; se adicionaron 0.85g de
respectivamente.
tierra estéril para ajustar la turbidez a
Cada bacteria fue purificada
Tabla 2. Porcentaje de reducción de Escherichia coli 170UNT. Una vez ajustada la turbidez
empleando la metodología descrita por
se inoculó el agua con concentraciones
con permanganato de potasio
Ukuku y Sapers (2001). Una colonia por
de 3.4x107 y 3.3x107UFC/mL de E. coli
Permanganato Tiempo de
Porcentaje de
separado, de cada bacteria, fue
y
B. subtilis respectivamente, adicionacontacto 2 Turbidez 3 reducción %
de potasio 1
inoculada en 5mL de caldo de soya y
das en recipientes separados, y se
1
98.83 b
tripticaseina (TSB, Difco; Detroit, MI),
aplicaron las concentraciones del
e incubadas por 24h a 37°C.
1.5
3
99.90 b
desinfectante KMnO4, 1.5 y 3mg/L para
c
Posteriormente se adicionó 1mL del
E.
coli y 3 y 4.5mg/L para B. subtilis,
6
99.99
170
crecimiento bacteriano en 25mL de
todo
esto con agitación constante.
1
99.9999 a
caldo TSB, y se incubó por 24h a 37ºC.
Se
procedió a tomar alícuotas
3
3
99.9999 a
La suspensión bacteriana fue
después de transcurrir 1, 3 y 6h de
6
99.9999 a
centrifugada a 13, 080 X g (Beckman,
tiempo de contacto, simulando el tiempo
J2-MI, USA) durante 10min a 4ºC. El Tabla 3. Porcentaje de reducción de Bacillus subtilis en el que se lleva acabo la desinfección
sedimento obtenido se lavó y con permanganato de potasio
en el agua superficial de uso agrícola,
resuspendió en 25mL de solución buffer
dato proporcionado por técnicos del
Permanganato Tiempo de
Porcentaje de
estéril (PBS, 0.1M, pH de 7.2) y se
laboratorio de Microbiología Ambiental
de potasio 1
contacto 2 Turbidez 3 reducción %
centrifugó nuevamente a las mismas
y de Alimentos del Centro de Investiga1
98.98 a
condiciones. El procedimiento de
ción en Alimentación y Desarrollo. La
3
3
99.90 a
lavado, se repitió dos veces. La bacteria
reducción bacteriana por efecto del
6
99.99 a
purificada se mantuvo a 4ºC antes de
permanganato de potasio se determinó
170
b
ser utilizada.
utilizando la técnica de extensión en
1
99.94
La concentración inicial de la
placa (APHA, 1998). Se realizaron
4.5
3
99.87 b
suspensión bacteriana fue determinada
diluciones decimales por triplicado (106
99.94 b
2
utilizando la técnica de extensión en
,10-4 y 10-6), y 0.1mL de cada dilución
placa (APHA, 1998), diluciones Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos decimal fue colocada en cajas petri
1
ppm; partes por millón; 2 horas; 3 Unidades Nefelométricas de turbidez
decimales por triplicado (10-2,10-4 y 10conteniendo agar selectivo mFC (Difco™,
A G U A
L A T I N O A M É R I C A
volumen 8, número 1
Maryland, USA) y agar papa dextrosa (Bioxon, México) e incubadas a
37°C durante 24h para E. coli y B. subtilis, respectivamente. Finalmente,
la concentración bacteriana se cuantificó en base a las unidades
formadoras de colonia observadas en el medio y el resultado fue expresado
en porcentaje de reducción.
Tabla 4. Determinación del perfil fisicoquímico del agua
turbia inoculada con Escherichia coli
Potencial
de hidrogeno
25°C
Determinación del perfil fisicoquímico del agua
1.5
3
6.02
6.02
El diseño estadístico empleado fue de bloques con dos factores
totalmente al azar. Los factores fueron las concentraciones y el tiempo
de contacto, y los microorganismos fueron bloqueados. Al realizar los
análisis de varianza y encontrar diferencias significativas, se aplicó la
prueba de comparación de medias de Tukey con un a=0.05. Los
resultados se expresaron en porcentajes de reducción. El paquete
estadístico empleado fue Stata versión 8 (2003).
Resultados y disusción
Escherichia coli
El análisis de varianza mostró que la concentración del
desinfectante fue significativo (P=0.036) en la reducción de Escherichia
coli , mientras que el tiempo de contacto no mostró diferencias
significativas. El mejor tratamiento se obtuvo al utilizar la concentración
de 3mg/L donde se logró un porcentaje de reducción de 99.9999 (6
log10) para cada tiempo de contacto analizado (Tabla 2). Los resultados
concuerdan con los criterios de reducción bacteriana descritos por
Bitton (1994) y Geldreich (1996), quienes establecen que un agente
químico es efectivo si logra una reducción de 99.9999% (6 log10).
El menor porcentaje de reducción obtenido fue de 98.83%, el cual
se obtuvo al utilizar 1.5mg/L y 1h de tiempo de contacto, con un nivel
de significancia de P=0.05, seguido de 1.5mg/L y 3h de tiempo de
contacto (99.90%) y 1.5mg/L y 6h de tiempo de contacto (99.99%).
Chaidez et al., (2003), observaron que los desinfectantes reducen su
efectividad cuando se utilizan a bajas concentraciones y en presencia
de materia orgánica. Wei et al., (1995) y Karch y Loftis (1998), han
demostrado que la presencia de turbidez en el agua permite que los
microorganismos puedan adherirse a partículas del suelo y protegerse
del desinfectante. La EPA (1999), menciona que la presencia de materia
orgánica reduce la efectividad del permanganato de potasio debido a
que este puede ser consumido al oxidar la materia orgánica e inorgánica
presente en el agua. Un estudio realizado en 1976 en el Distrito Sur de
Las Vegas Nevada del lago Mead mostró que al utilizar bajas dosis de
permanganato (1, 2, 3, 4 y 5mg/L) era necesario tiempos de contacto
prolongados (30min), para reducir la presencia de coliformes, mientras
que solo fue necesario 10min de tiempo de contacto cuando se
emplearon 6mg/L (EPA, 1999).
Al comparar la concentración y tiempo de contacto, el tratamiento
de 3mg/L a 1, 3, 6h logró una reducción de 99.9999% con un nivel de
significancia de P=0.05, demostrando que el porcentaje de reducción
bacteriana es dependiente de la concentración del desinfectante y no
necesariamente del tiempo de contacto. Se requieren altas
concentraciones de permanganato para lograr una reducción total de
la bacteria en estudio, como lo muestra la EPA (1999), donde fue
necesario dosis de 2.5mg/L para obtener una reducción total de
coliformes, así mismo fueron necesarias dosis de 20mg/L con tiempo
de contacto de 24h para reducir Vibrio cholerae, Salmonella typhi y
2
T1 3
T2 4
T3 5
6.02
6.13
6.24
6.05
6.24
6.23
Tabla 5. Determinación del perfil fisicoquímico del agua
turbia inoculada con Bacillus subtilis
Potencial
de hidrogeno
25°C
Análisis de datos
A G U A
Blanco
pH
La medición del potencial de hidrógeno (pH), se realizó utilizando
un potenciómetro portátil marca Oakton wppH y un electrodo HgTaylor
21433. La temperatura se verificó a 25ºC mediante un termómetro de
vidrio previamente calibrado.
volumen 8, número 1
Concentración
KMnO41
Concentración
KMnO41
Blanco
3
4.5
6.02
6.02
pH
2
T1 3
T2 4
T3 5
5.83
5.97
6.15
6.30
6.09
6.11
1
Concentración de KMnO4 expresado en partes por millón (ppm):
Blanco: Muestra de agua con 170 UNT inoculada con bacteria, sin
aplicación de KMnO4; 3 T1 1 hora de tiempo de contacto; 4 T2 3 horas de
tiempo de contacto; 5 T3 6 horas de tiempo de contacto
2
Shigella flexneri . Por lo tanto, el permanganato de potasio a
concentraciones de 3mg/L y 1, 3 y 6h de tiempo de contacto, puede ser
utilizado como bactericida en agua superficial de uso agrícola, ya que
puede alcanzar una reducción del 99.9999% (6 log10).
Bacillus subtilis
Los resultados obtenidos en la evaluación de KMnO4 contra B.
subtilis no mostraron diferencias significativas con el factor tiempo;
sin embargo, el análisis de varianza mostró diferencias significativas
con el factor concentración P=0.05 (Tabla 3). La concentración de 3mg/
L de KMnO4 resultó ser la más efectiva, alcanzando un porcentaje de
reducción de 99.99% (4 log10). Mientras que la concentración de 4.5mg/
L de KMnO4 logró reducir un 99.9% de bacteria, equivalente a 3
logaritmos de reducción. De acuerdo a la EPA (1999), la actividad
bactericida del permanganato de potasio se ve favorecida en condiciones
ácidas (pH 5.9) a 20ºC. Los resultados obtenidos muestran que la
efectividad del KMnO4 se vio reducida al utilizar concentraciones de
4.5mg/L, debido a que el agua inoculada con B. subtilis a esta misma
concentración y una temperatura de 25°C, alcanzó un pH que osciló
entre 5.97 y 6.11, condiciones menos ácidas a las observadas al utilizar
3mg/L de KMnO4, donde el pH osciló entre 5.89 y 6.09 a la misma
temperatura (Tabla 4 y 5).
Cuando se comparó el porcentaje de reducción de E. coli y B.
subtilis, a la concentración de 3mg/L, se observó una reducción del
99.9999% de Escherichia coli y un 99.99% para B. subtilis, demostrando
que Bacillus presenta una mayor resistencia a los procesos de
desinfección.
Conclusiones
La concentración de 3mg/L de KMnO4 resultó ser efectiva para E.
coli y B. subtilis, lográndose un porcentaje de reducción de 99.9999%
y 99.99%, respectivamente. Concentraciones de 1.5mg/L no fueron
suficientes para reducir Escherichia coli, al no alcanzar más de 3
logaritmos de reducción bacteriana, sin embargo, de acuerdo a las
recomendaciones descrita por la Agencia de Protección Ambiental de
Estados Unidos, una reducción de al menos 2 Log10 de la población de
bacteriana, son suficientes para considerarse buen desinfectante. La
efectividad del desinfectante contra B. subtilis se vio limitada al utilizar
concentraciones de 4.5mg/L de KMnO4, debido al pH final del agua
L A T I N O A M É R I C A
empleada durante la inoculación. Por lo tanto, se concluye que el KMnO4
puede considerarse como una alternativa en los procesos de
desinfección del agua superficial de uso agrícola, siempre y cuando se
tomen en cuenta consideraciones como el pH de la solución, el cual
debe oscilar entre 5.9 o menor, para tener mayor concentración del ión
MnO 4 , el cual oxida y destruye las enzimas celulares de los
microorganismos, así mismo son necesarias temperaturas de 25ºC para
que la efectividad del permanganato de potasio se vea favorecida.
Finalmente, es importante hacer hincapié en la necesidad de generar
información científica sobre la acción del permanganato de potasio
contra otros grupos microbianos (bacteriófagos, virus entéricos, quistes
de protozoarios y bacterias patógenas) que generalmente se encuentran
presentes en aguas superficiales. Esta información permitirá darle un
uso más amplio al permanganato de potasio como agente desinfectante.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Centro de Investigación en Alimentación
y Desarrollo, Unidad Culiacán, por las facilidades otorgadas en la
realización del presente trabajo de investigación.
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Correspondencia
Dr. Cristobal Chaidez Quiroz: Centro de investigación en Alimentación
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C.P. 80129, Culiacán, Sinaloa. Tel/Fax: (667) 760-5536; chaqui@ciad.
11. DeWaal. C.S., L. Alderton, M. F. Jacobson (2000). Outbreak Alert¡.
Washington, DC, Closing the Gaps, in our Federal Food Safety Net. Center for
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A G U A
L A T I N O A M É R I C A
volumen 8, número 1
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