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DESARROLLO DE UN BIOINSECTICIDA BASADO EN UN NUEVO
AISLADO DE Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.
J Malo, JA Nicolás, AI Fernández, M Villaverde
Probelte S.A. Carretera de Madrid Km 389, 30100 Murcia, [email protected]
RESUMEN
Bacillus thuringiensis se diferencia del resto de las especies de su género por su
capacidad de producir cuerpos parasporales cristalinos de naturaleza proteica. El
cristal parasporal contiene una o más proteínas (conocidas como endotoxinas) que
son tóxicas y altamente específicas contra ciertas larvas de insectos plaga. Debido a
su efectividad en el campo y a su ausencia de toxicidad frente a organismos hacia los
que no va dirigido, en la actualidad, Bacillus thuringiensis es el agente de control
biológico de plagas más ampliamente utilizado. El objetivo del presente estudio fue el
desarrollo de un nuevo bioinsecticida basado en una cepa autóctona de la bacteria
Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, eficaz para combatir orugas de lepidópteros
plaga. Así, se consiguió aislar y caracterizar una cepa (PB54) con alta toxicidad y se
inició el escalado para su producción a nivel industrial. Paralelamente se procedió al
diseño de un producto en forma de polvo mojable (Belthirul) con 32.000 UI/mg de
potencia insecticida y con una alta estabilidad en campo, debido a la incorporación al
formulado de potenciadores de la actividad insecticida y de protectores contra la
radiación solar. En la actualidad tanto la cepa PB54 de Bacillus thuringiensis, como el
formulado Belthirul están en fase de evaluación por parte de las autoridades para el
registro único en la Unión Europea y se ha solicitado la autorización del producto
Belthirul para su utilización en Agricultura Ecológica.
Palabras clave: control biológico de plagas, lepidópteros.
INTRODUCCIÓN
Bacillus thuringiensis (Bt) fue aislado por primera vez en Japón por Ishiwata (1901).
Posteriormente lo reaisló Berliner (1915) en Thuringia (Alemania), en una infestación
en poblaciones de Ephestia kuehniella, plaga de granos almacenados y este autor fue
quien le asigno el nombre.
En 1953 Hannay, trabajando con esta especie, sugirió por primera vez que la
patogeneidad podía estar asociada con cuerpos cristalinos o cristales formados en la
célula durante la esporulación. Son las llamadas δ-endotoxinas, cristales o cuerpos
parasporales (figura 1). Su constitución es glicoproteica, representando normalmente
entre el 20 y 30% del peso seco de la célula, siendo tóxica a una gama de insectos de
los órdenes Lepidóptera, Díptera y Coleóptera (Bulla et al., 1979). Algunos aislados de
Bt producen las denominadas β-exotoxinas, que son tóxicas para mamíferos, por lo
cual un buen aislado de Bt cuyo objetivo sea su utilización como control biológico de
plagas en la agricultura, no deberá producir este tipo de toxinas.
Se han aislado diferentes subespecies de Bt capaces de ejercer control sobre una
amplia gama de lepidópteros, como Bt subsp. kurstaki (Btk) y Bt subsp. aizawai (Bta),
dípteros como Bt subsp. israeliensis (Bti) y coleópteros como Bt subsp. tenebrionis
(Btt).
Bacillus thuringiensis (Bt) es un microorganismo que ha ganado reciente popularidad
por su capacidad para controlar ciertas plagas de insectos de manera natural y
respetuosa para el medio ambiente, siendo el insecticida microbiano más
comercializado en el mundo.
Esta bacteria posee todas las características requeridas para ser utilizada como
insecticida biológico. Entre las ventajas que presenta destacan:
1) El espectro de hospedantes está limitado a especies de los órdenes
Lepidóptera, Díptera o Coleóptera. Los parasitoides o predadores
(entomofauna beneficiosa), en general, no son afectados por la acción
patogénica de Bt.
2) No se han detectado efectos tóxicos en vertebrados, siendo segura su
manipulación y utilización aún hasta la fecha de la cosecha, lo cual la hace
especialmente apropiada para el tratamiento de frutas y hortalizas.
3) Por último, su producción a gran escala no presenta grandes inconvenientes
(Bulla et al., 1975).
Distintas formulaciones de Bt han sido empleadas durante más de cuatro décadas
para controlar plagas agrícolas y, más recientemente, insectos vectores de una
variedad de enfermedades humanas y animales.
La producción comercial de Bt comenzó hacia 1938 en Francia, con el lanzamiento de
un insecticida conocido con el nombre de “Sporeine” (Weiser, 1986).
Tal vez, uno de los avances más significativos fue el aislamiento, por parte de
Dulmage (1970), de la cepa HD-1. Esta cepa de Btk contaba con una potencia 16
veces superior a la de las utilizadas a nivel industrial. Ese hallazgo dio un vuelco
fundamental en el mercado de los bioinsecticidas, ya que los rendimientos obtenidos
con dicha cepa hacían mucho más rentable la producción.
Precisamente una cepa similar a la HD-1 pero aislada en Murcia es la cepa elegida por
el equipo técnico de Probelte para la fabricación del bioinsecticida Belthirul.
Para el diseño de un formulado basado en Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki en
forma de polvo mojable (WP), nos marcamos varios objetivos, que tuviera unas
determinadas características físico-químicas (mojabilidad inferior a 3 minutos,
suspensibilidad superior al 70%, pH inferior a 5 y tamaño medio de partícula inferior a
70μm), estabilidad al almacenamiento a temperatura ambiente (20-25ºC) y una
potencia insecticida mayor de 32x106 UI/g.
Además, buscamos una mayor eficacia del formulado en el campo, dotándolo de
protectores contra la luz ultravioleta, pues las δ-endotoxinas son poco estables y se
desnaturalizan por la luz y el calor (Arcas, 1996) y a su vez, se buscaron atrayentes
que mejoren la palatabilidad del producto para los insectos diana.
Todos los ingredientes del formulado deberán estar autorizados para su uso en
Agricultura Ecológica, con el fin de certificar el producto para este tipo de agricultura.
En resumen, el objetivo principal del presente estudio, ha sido el desarrollo de un
nuevo bioinsecticida basado en una cepa autóctona de la bacteria Bacillus
thuringiensis subsp. kurstaki, eficaz para combatir orugas de lepidópteros plaga. Este
formulado ha de tener unas determinadas características físico-químicas y de
estabilidad, que permitan una buena aplicación en campo y una composición, que
aumente su eficacia al protegerlo de la degradación por la luz ultravioleta y al
aumentar su atracción para las larvas de los insectos diana a los que va dirigido.
MATERIAL Y MÉTODOS
Aislado de la cepa PB54.
A partir de muestras de suelos cultivables procedentes de la Región de Murcia, se
realizaron diferentes aislamientos con el objeto de seleccionar una cepa de Bacillus
thuringiensis subsp. kurstaki con alta capacidad insecticida. Para ello todas las
muestras se trataron de la siguiente forma: se tomó 1g de suelo y se resuspendió en
10 mL de agua destilada estéril, posteriormente se colocó en un baño a 65oC durante
30 minutos. Pasado este tiempo se realizaron diluciones seriadas sembrándose en
placas de agar nutritivo.
Cultivo de la cepa PB54.
Una vez depuradas las colonias, las mismas se propagaron en caldo nutritivo para ser
observadas al microscopio óptico y seleccionar aquellas que formaran cuerpos
parasporales en forma de cristal y además arrojaran resultados positivos frente a la
prueba de la catalasa. Posteriormente las colonias seleccionadas fueron enfrentadas a
larvas de Spodoptera exigua determinándose, mediante un bioensayo, la más
virulenta.
La cepa seleccionada se analizó posteriormente mediante un estudio de cromatografía
HPLC con el objetivo de detectar presencia o no de β-exotoxina .De igual forma fue
sometida a estudios electroforéticos por SDS PAGE y por el sistema Experion para
analizar las proteínas Cry.
Finalmente la cepa se envió a la CECT para su identificación.
Bioensayos de toxicidad y ausencia de β-exotoxinas.
Uno de los parámetros más importantes a tener en cuenta a la hora de seleccionar un
aislado de Bt, así como, para garantizar la utilidad de un producto elaborado con Bt, es
determinar su actividad insecticida sobre un insecto diana.
Para la determinación y evaluación de la potencia insecticida se realizan una serie de
ensayos biológicos (también llamados bioensayos) en los que se relacionan
concentración y tiempo de exposición al producto, atendiendo al tipo de insecto y a su
estado larvario.
En nuestro caso trabajamos con larvas de Spodoptera exigua, criadas en nuestro
laboratorio con una dieta artificial y mantenidas en cámaras climáticas a 25ºC de
temperatura, 65% de HR y un ciclo de luz:oscuridad de 16:8 horas (figura 2).
Para la realización de los bioensayos seguimos un método desarrollado en los
laboratorios de Probelte S.A. y validado por el Departamento de Genética de la
Universidad de Valencia.
En el bioensayo trabajamos con 5 diluciones 1:3 de la muestra a analizar, que
depositamos sobre la dieta solidificada y que dejamos secar antes de colocar las
larvas neonatas, se ponen 24 larvas para cada una de las 5 diluciones, en pocillos
individuales. Además, siempre se pone un Standard con potencia insecticida conocida
(32x106 UI/g).
Tras el tiempo de exposición (4 días) se registra, tanto el número total (n) de insectos
de cada dilución como el número de muertos (o sobrevivientes) (r). El dato resultante
se expresa como proporción (r/n) o como porcentaje (r/n) x 100. En la figura 3
podemos observar dos larvas neonatas de Spodoptera exigua durante la lectura de un
bioensayo de toxicidad.
Los bioensayos permiten calcular el valor de la LC50 (concentración a la cual el 50% de
los individuos de la población morirán), establecer límites fiduciales y obtener la
pendiente de la línea de regresión, a través de datos de concentración-mortalidad, que
serán procesados y analizados utilizando el análisis probit (Finney et al., 1962) con el
programa de ordenador POLO-PC (Rusell et al., 1977).
Para determinar la ausencia de β-exotoxinas, seguimos el procedimiento de
Hernández (2001), utilizando larvas neonatas de Ephestia kuehniella, ya que este
lepidóptero es sensible a este tipo de toxinas.
Formulación Belthirul.
En el primer paso de formulación, los cultivos de Bt se concentran para reducir el
volumen. Para procesar volúmenes grandes, el método más apropiado es la
centrifugación (Bernhard y Utz, 1993). Se utilizará una centrífuga de flujo continuo que
descarga periódicamente el contenido sólido del cultivo, en el que se encuentran las
esporas y los cristales de insecticida.
El producto obtenido de la centrifugación no debe mantenerse a temperatura ambiente
más de 24 h, ya que necesita ser estabilizado. Para hacerlo, la técnica más apropiada
es el secado mediante un spray drier. El producto húmedo procedente de la centrífuga
es pulverizado como un fino spray dentro de un gran vaso a través del cual circula aire
caliente. El agua se evapora rápidamente y las pequeñas gotas se transforman en
partículas de polvo. De esta manera se conseguirá un polvo fino y estable que podrá
ser almacenado para su formulación posterior.
Antes de continuar con el proceso de formulación, es necesario evaluar la potencia
insecticida del lote en cuestión mediante bioensayo. En función de la potencia que
presente el polvo obtenido de Bt, será necesario añadir mayor o menor cantidad de
substancias inertes para conseguir que el producto final tenga siempre la misma
potencia y no se produzca variación alguna entre los distintos lotes. Además hay que
añadir otros aditivos como dispersantes, adhesivos, protectores UV y atrayentes que
mejorarán las propiedades físicas del producto y su efectividad (Arcas, 1996).
Para determinar las propiedades físico-químicas del formulado (mojabilidad, pH,
suspensibilidad y tamaño de partícula se siguieron los Procedimientos Normalizados
de Trabajo del sistema de buenas Prácticas de Laboratorio establecido en Probelte
S.A., todos ellos basados en los métodos CIPAC apropiados (FAO y OMS,2002). El
formulado final seleccionado, también será sometido a un test de estabilidad al
almacenamiento durante 1 año a 20-25ºC (FAO y OMS, 2002), para comprobar que la
perdida de potencia insecticida es menor del 10%.
Para comprobar la efectividad de los protectores UV, se aplico este tipo de luz durante
16 horas a las diferentes muestras depositadas sobre la comida preparada para un
bioensayo, posteriormente se continuó con el mismo proceso de un bioensayo
normal.
Eficacia en campo.
Para el registro de un insecticida a nivel oficial, es necesario llevar acabo diferentes
ensayos de eficacia en campo sobre las plagas diana y en sus plantas hospedantes.
En este caso se realizaron ensayos sobre Lobesia botrana, Prays citri, Spodoptera
exigua y Chrysodeixis chalcites en viña, limonero, tomate y lechuga.
Para estos ensayos se siguieron los procedimentos de trabajo que tiene establecidos
Probelte S.A., como entidad acredita para la realización de ensayos de eficacia
(OR/032).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cepa PB54
La cepa identificada como Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki fue la PB54 (CECT
7209). Al llevar a cabo los estudios electroforéticos se comprobó (calles 1 a la 5) que
posee las proteínas Cry I y Cry II (figura 4).
Belthirul
En la figura 5 tenemos los valores medios de las propiedades físico-químicas y la
actividad insecticida del formulado Belthirul, una vez incorporados los aditivos como
dispersantes, adhesivos, protectores UV y atrayentes. Como se puede observar se
cumplen las especificaciones buscadas, por lo que el producto obtenido cumple los
requerimientos obtenidos para facilitar su aplicación en campo.
El test de almacenamiento a temperatura ambiente durante un año, también ha
resultado positivo, observándose una mínima pérdida de potencia transcurrido el
periodo de almacenamiento requerido (figura 6).
Todos los ingredientes que se probaron como protectores de la luz ultravioleta fueron
de origen natural y autorizados para su uso en Agricultura Ecológica, para comprobar
su efectividad, se analizaron las siguientes muestras: Standard (no sometido a UV),
Belthirul (no sometido a UV), Standard (sometido a UV), Belthirul con protectores
(sometido a UV) y Belthirul sin protectores (sometido a UV). Los resultados se
muestran en la figura 7 y demuestran la efectividad de estos protectores que evitan
una más rápida desnaturalización de las δ-endotoxinas. Se puede comprobar como el
estándar sometido a UV tiene una perdida de potencia insecticida de un 48.7%,
mientras que el producto Belthirul sin los protectores y sometido a UV pierde un
46.1%, pero con los protectores esta perdida de potencia insecticida, se reduce hasta
un 24.1%, lo que demuestra su eficacia.
El resultado del análisis para la detección de β-exotoxinas ha dado no negativo, no
registrándose muertes en las larvas de Ephestia kuehniella que se sometieron al
ensayo diseñado por Hernández (2001).
Los ensayos de eficacia realizados en campo fueron muy positivos observándose
eficacias entre el 50 y el 85%, según la plaga y el cultivo tratado.
CONCLUSIONES
El aislado PB54 (CECT 7209) de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, cumple todos
los objetivos planteados, posee buena actividad insecticida y no produce β-exotoxinas,
todo esto permite su producción a nivel industrial.
El diseño del formulado también cumple las expectativas que se buscaban, su
potencia insecticida es superior a los 32.000 UI/mg, las propiedades físico-químicas
cumplen las especificaciones marcadas y la potencia se mantiene estable superado el
periodo de almacenaje, además el producto está libre de β-exotoxinas.
En cuanto a los protectores UV incorporados al formulado, se ha comprobado su
efectividad en la protección de la toxina del Bt.
El producto Belthirul también fue probado en campo, con resultados muy positivos
sobre diferentes lepidópteros plaga y en diferentes matrices vegetales, lo que llevo a
su autorización por parte del Ministerio de Agricultura, para su aplicación en el control
de orugas defoliadoras y frugívoras en numerosos cultivos (De Liñán, 2007).
Por todos estos motivos consideramos que el producto Belthirul, cuya materia activa
es el Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, puede ser un buen instrumento para el
control de lepidópteros plaga en Agricultura Ecológica.
BIBLIOGRAFÍA
Arcas J.A. 1996. Producción de bacterias entomopatógenas. En “Microorganismos
patógenos empleados en el control microbiano de insectos plaga”, Leucona RE
(ed.), pp. 207-222.
Berliner E. 1915. Ueber die Schlaffsucht der Mehlmottenraupe (Ephestia kuehniella
Zell.) und ihren Erreger Bacillus thuringiensis n. sp. Z Angeww Entomol 2: 2956.
Bernhard K., R. Utz. 1993. Production of Bacillus thuringiensis insecticides for
experimental and commercial uses. En “Bacillus thuringiensis, an environmental
biopesticide: theory and practice” Entwistle PF, Cory JS, Bailey S y Higgs S
(eds.), Wiley, pp. 255-267.
Bulla L.A. Jr, R.A. Rhodes, G.S. Julian. 1975. Bacteria as insect pathogen. Ann Rev
Microbiol 29: 163-190.
Bulla L.A. Jr, L.I. Davison, K.J. Kramer, B.L. Jones. 1979. Purification of the insecticidal
toxin from the parasporal crystal of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.
Biochemical and Biophysical Research Comunications 91: 1123-1130.
De Liñán Carral C., C De Liñán Vicente. 2007. Ecovad de productos e insumos para
Agricultura Ecológica. Ediciones Agrotécnicas S.L.
Dulmage H.T. 1970. Insecticidal activity of HD-1, a new isolate of Bacillus thuringiensis
var. alesti. J Invert Pathol 15: 232-239.
FAO y OMS. 2002. Manual sobre Elaboración y Empleo de las Especificaciones de la
FAO y de la OMS para Plaguicidas - Primera Edición. Especificaciones de
Plaguicidas. Roma.
Finney D.J. 1962. Probit Analysis. Cambridge University Press, Cambridge.
Hernández, C.S., J. Ferré, I. Larget-Thiéry. 2001. Update of the detection of β-exotoxin
in Bacillus thuringiensis strains by HPLC analysis. Journal of Applied
Microbiology 90: 643-647.
Ishiwata S. 1901. One of a kind of several flasherve (sotto disease). Dainiham Sambshi
Kaiho 9: 1-15.
Rusell R.M., J.L. Robertson, N.E. Savin. 1977. Polo: A new computer program for
probit analysis. Bulletin of the Entomological Society of America 23, 209-213.
Weiser J. 1986. Impact of Bacillus thuringiensis in applied entomology in Eastern
Europe and in the Soviet Union, p. 37-50. En: A. Krieg y A.M. Huger (ed.),
Mitteilungen aus der biologischen Bundesansdalt fur Land- und Forstwirtschaft
Berlin-Darlem. Berlin.
FIGURAS
Figura 1. Fotografía al microscopio donde se observan las esporas y cristales
proteicos de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.
Figura 2. Cría de Spodoptera exigua en el laboratorio con dieta artificial.
Figura 3. Efecto de Belthirul sobre larvas de Spodoptera exigua. Derecha:
larva muerta por ingestión de Belthirul. Izquierda: larva control (sin tratar).
Figura 4. Electroforesis en un sistema automatizado Experion
Potencia
insecticida
Mojabilidad
(UI/mg)
(seg.)
Belthirul
38.525
95
Especificacion
es requeridas
>32.000
<300
pH
Suspensibili
dad
Tamaño
de
Partícula
(%)
(μm)
4.58
81.8
37.7
<5
>70
<70
Figura 5. Caracterización físico-química y potencia insecticida del formulado
Belthirul.
Belthirul
Tiempo 0
1 año
Porcentaje de
perdida
(UI/mg)
(UI/mg)
(%)
38.525
37.981
1.41
Figura 6. Potencia insecticida del formulado Belthirul antes y después del
periodo de almacenamiento.
Figura 7. Potencia insecticida de un Standard y de Belthirul, antes y después
de someterse al efecto de la luz Ultra Violeta.