produccion de plantas resistentes a los virus a traves de la

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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kInt. Cl. : C12N 5/10
11 Número de publicación:
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ESPAÑA
k
2 166 361
A01N 63/02
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 93906130.5
kFecha de presentación: 18.02.1993
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 626 998
kFecha de publicación de la solicitud: 07.12.1994
T3
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54 Tı́tulo: Producción de plantas resistentes a los virus a través de la introducción de RNA viral
intraducible de sentido positivo.
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73 Titular/es: THE STATE OF OREGON
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72 Inventor/es: Dougherty, William G. y
30 Prioridad: 19.02.1992 US 838509
acting by and through THE OREGON STATE
BOARD OF HIGHER EDUCATION on behalf
of OREGON STATE UNIVERSITY
Corvallis, OR 97331, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.04.2002
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45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 166 361 T3
16.04.2002
Aviso:
k
k
Lindbo, John A.
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74 Agente: Dávila Baz, Angel
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 166 361 T3
DESCRIPCION
Producción de plantas resistentes a los virus a través de la introducción de RNA viral intraducible de
sentido positivo.
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Campo de la invención
Esta invención se dirige a la producción de plantas con una susceptibilidad reducida a la infección por
virus.
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Antecedentes de la invención
Los virus de plantes son responsables de pérdidas importantes en la producción de cultivos en todo
el mundo. Se dirigen muchos esfuerzos hacia el desarrollo de nuevas variedades de plantas que exhiban
resistencia incrementada a la infección viral. Hasta hace poco, tales esfuerzos se basaban principalmente
en el sistema de mejora genética de plantas tradicional, sin embargo, este sistema a menudo está limitado
por una falta de fuentes de resistencia dentro de la especie de cultivo. La llegada de las técnicas de
biologı́a molecular modernas ha facilitado el desarrollo de nuevos métodos para hacer a variedades de
plantas resistentes al ataque por virus, que no está limitados por un requerimiento de genes de resistencia
preexistentes dentro de una especie.
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Sistemas Moleculares
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Muchos de estos sistemas moleculares se basan en la teorı́a de la resistencia derivada de patógenos
(Sanford y Johnston, 1985). Esta teorı́a predice que puede romperse una relación de huésped (planta)patógeno (virus) “normal” si el organismo huésped expresa genes derivados del patógeno esenciales. Se
ha propuesto que los organismos huésped que expresan productos génicos de patógeno en cantidades
excesivas, en una fase de desarrollo inapropiada o en una forma disfuncional, pueden romper el ciclo
replicativo normal del patógeno y dar como resultado una infección atenuada o abortada del huésped.
Dos sistemas tipifican esta resistencia derivada de patógenos: resistencia mediada por proteı́na de
envuelta y expresión de RNA antisentido. Se ha demostrado que las plantas transgénicas que expresan
una proteı́na de envuelta de virus de plantas pueden ser resistentes a la infección por el virus homólogo.
Esta resistencia mediada por la proteı́na de la envuelta se ha demostrado para diversos grupos de virus. Aunque el mecanismo de esta resistencia no se entiende todavı́a totalmente, se ha sugerido que la
presencia de la proteı́na de envuelta sintetizada por la planta evita la retirada de la envuelta proteı́nica
(desenvolvimiento) de un virus invasor y/o el movimiento de un virus dentro de la planta infectada,
conduciendo a la resistencia.
Las plantas que expresan una molécula de RNA que es complementaria a una especie de RNA de
sentido positivo codificada por el virus pueden mostrar una susceptibilidad disminuida a la infección por
ese virus. Tal molécula de RNA complementaria se denomina RNA antisentido. Se cree que el RNA
antisentido codificado por la planta se une al RNA viral y ası́ inhibe su función.
Potivirus
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La familia del virus de la patata Y, o potivirus, representa un gran número de patógenos virales
de plantas que colectivamente pueden infectar la mayorı́a de las especies de cultivo incluyendo plantas
tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. La infección por potivirus puede inducir una variedad de
sı́ntomas incluyendo el moteado foliar, la distorsión de las semillas y los frutos y puede comprometer
gravemente el rendimiento y/o la calidad del cultivo (Hollings y Brunt, 1981).
Los potivirus tienen un RNA de sentido positivo de una sola hebra de alrededor de 10.000 nucleótidos
que tiene una proteı́na codificada viralmente conectada al extremo 5’ y una región de poliadenilato 3’.
Un solo marco de lectura abierto codifica una poliproteı́na de 351 kDa que es procesada proteolı́ticamente
en productos génicos virales maduros. El RNA es encapsidado por aproximadamente 2.000 copias de un
monómero proteı́nico de envuelta para formar un virión. Esta proteı́na de la cápsida es codificada por la
secuencia presente en el extremo 3’ del marco de lectura abierto grande.
Los potivirus pueden ser transmitidos por áfidos y otros insectos que se alimentan de savia y en algunos
casos también pueden ser transmitidos en las semillas de plantas infectadas. Se cree que la replicación
del RNA viral se produce en el citoplasma de células de plantas infectadas después del desenvolvimiento.
El mecanismo de replicación implica tanto traducción del RNA de sentido positivo para dar productos
génicos virales (que incluyen una replicada y una proteinasa) como también la sı́ntesis de una hebra de
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RNA de sentido negativo. Esta hebra de sentido negativo actúa a continuación como una plantilla para la
sı́ntesis de muchos genomas de sentido positivo que posteriormente se encapsidan en proteı́na de envuelta
para dar “viriones” maduros infecciosos, ası́ se completa el ciclo replicativo del virus.
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Se han presentado experimentos en los que plantas transgénicas que expresan el gen de la proteı́na
de envuelta de un potivirus muestran una susceptibilidad reducida a infección por virus (Lawson y otros,
1990; Ling y otros, 1991; Stark y Beachy 1989).
EP-A-0242016 describe la incorporación de material genético, en particular cDNA que corresponde a
RNA satélite viral de planta, en una planta tal que, cuando la planta es infectada por un virus de planta,
la expresión del material incorporado modifica el virus de planta o sus efectos.
WO-A-9213090 describe un método para producir plantas transgénicas con susceptibilidad reducida
a los virus.
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Sumario de la invención
La invención descrita trata de un método para producir plantas con una susceptibilidad disminuida a
la infección por virus. Esto se alcanza transformando plantas con una molécula de DNA que incluye un
gen derivado en parte del genoma de un virus de planta. Este gen se construye especı́ficamente para producir una versión intraducible de una molécula de RNA de sentido positivo requerida para la replicación
viral. Ası́, la expresión del gen dentro de la planta provoca la producción de esta molécula no funcional
que a continuación inhibe la replicación viral dentro de la planta, haciendo a la planta resistente a la
infección viral.
En particular, la invención proporciona un sistema alternativo y nuevo para hacer a las plantas resistentes a infección por potivirus.
Las plantas se transforman con un constructo génico diseñado para expresar una forma intraducible
del RNA de sentido positivo que codifica la proteı́na de envuelta de un potivirus.
En el caso del virus del grabado del tabaco (TEV) se demuestra que las plantas de tabaco transformadas con tal constructo génico acumulan el RNA intraducible de sentido positivo pero no producen
niveles detectables de la proteı́na de envuelta. Se observa además que estas plantas son resistentes a la
infección por TEV. También se observa que las células de tabaco que expresan este RNA intraducible de
sentido positivo no soportan replicación de TEV, a diferencia de células de tabaco de control y también
a diferencia de células de tabaco que se manipulan para expresar el RNA traducible de sentido positivo y
que, como resultado, acumulan proteı́na de envuelta de TEV. Aunque se desconoce el mecanismo exacto,
se propone que el RNA intraducible de sentido positivo inhibe la replicación viral uniéndose al RNA de
sentido negativo y evitando que el RNA de sentido negativo funcione en el ciclo de replicación.
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Se cree que este sistema será aplicable a otros potivirus, a genes diferentes al gen de la proteı́na de
envuelta y a otras familias de virus de RNA de sentido positivo. También se cree que este medio para
inhibir la función génica es aplicable a otros sistemas biológicos, incluyendo virus de mamı́feros.
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Descripción de los dibujos
La figura 1 representa una secuencia nucleotı́dica del genoma del virus del grabado del tabaco y su
secuencia de aminoácidos deducida, de acuerdo con Allison y otros (1986). Se da la secuencia nucleotı́dica
de la hebra de sentido positivo de los insertos de DNA. El primer nucleótido (N) no podrı́a determinarse
inequı́vocamente. La secuencia de aminoácidos predicha del ORF grande del marco de lectura tres del
RNA de sentido del virión se presenta en la secuencia nucleotı́dica. Esta secuencia también se indica en
la ID SEC N: 1 del listado de secuencias adjunto. El codón de terminación en el extremo del ORF grande
está marcado con un ∗ . El sitio de segmentación putativo entre la proteı́na de inclusión nuclear grande
(Pm 54.000) y la proteı́na de la cápsida está indicado por la flecha. Los sitios de unión de cebadores
oligonucleotı́dicos están subrayados y marcados.
La figura 2 es una representación esquemática de pTC:FL, utilizado en la construcción de vectores de
transformación para la invención. Se introdujeron sitios de endonucleasas de restricción en pTL 37/8595
en las posiciones A, B y C del diagrama. Después de estos cambios de nucleótidos, el pTL 37/8595
mutado se digirió con la enzima de restricción NcoI, el fragmento de DNA definido por los sitios de las
enzimas de restricción en B y C se retiró y el plásmido se religó para genera pTC:FL. pTC:FL contiene la
secuencia nucleotı́dica de la proteı́na de envuelta del virus del grabado del tabaco (TEV) flanqueada por
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sitios de restricción BamHI y las secuencias no traducidas (UTS) 5’ y 3’ de TEV. También se muestran
los promotores de T7 y SP6. Las abreviaturas usadas en este diagrama son como sigue: T7, secuencia
promotora de RNA polimerasa de T7; SP6, secuencia promotora de RNA polimerasa de SP6, ori, origen
de replicación; ori de M13, origen de replicación de una sola hebra del bacteriófago M13; ampr , gen de
β-lactamasa. Las áreas ligeramente punteadas son secuencias no traducidas 5’ y 3’ de TEV; área negra
sólida, nucleótidos 144 a 200 de cDNA del genoma de TEV; área rayada, una porción del gen NIb de
TEV (nt de TEV 8462-8517); áreas intensamente punteadas, cDNA de la secuencia nucleotı́dica de CP
de TEV (nt de TEV 8518-9309).
La figura 3 es una representación esquemática de las formas del gen de la proteı́na de envuelta del
virus del grabado del tabaco insertado en tabaco en la invención. Todos los constructos contenı́an el
promotor 35S de CaMV estimulado (35S Enh), la secuencia no traducida (UTS) 5’ de 35S de CaMV de
50 pb y la UTS 3’ de 35S de CaMV/sitio de poliadenilación de 110 pb. La nomenclatura usada para
describir las lı́neas de planta transgénica se presenta junto con los productos génicos producidos en esas
lı́neas de planta (columna más a la derecha). Las abreviaturas son como sigue: 35S, plantas transgénicas
que contienen el promotor 35S de CaMV y UTS 5’ y 3’ solo; FL, plantas transgénicas que contienen
el transgén que codifica la longitud completa; las plantas transgénicas AS y RC contienen el transgén
expresado como una forma de antisentido del gen CP de TEV, o una forma de sentido no traducida
del gen CP de TEV, respectivamente. Las áreas punteadas representan diversas formas de la secuencia
nucleotı́dica de CP de TEV.
La figura 4 es una representación gráfica de la aparición de sı́ntomas sistémicos en plantas infectadas
con virus del grabado del tabaco que muestra respuestas de plantas de control y plantas transformadas
generadas como se describe en la invención. Diez plantas B49 (tipo silvestre) y diez plantas R2 de lı́neas
de plantas transgénicas 35S N◦ 4, FL N◦ 3, FL N◦ 24, homocigóticas para el gen de TEV insertado,
fueron inoculadas mecánicamente con 50 µl de dilución 1:10 de savia de plantas infectadas (A). Veinte
plantas B49 y veinte plantas R1 de las lı́neas AS N◦ 3 y RC N◦ 5 fueron inoculadas mecánicamente con
50 µl de 5 µg/ml de TEV (B). Las plantas fueron examinadas diariamente con respecto a la aparición
de sı́ntomas sistémicos. Las plantas fueron evaluadas diariamente, y cualquier planta que presentara
sı́ntomas sistémicos (atenuada o de tipo silvestre) se registró como sintomática.
Listado de secuencias
El listado de secuencias adjunto indica secuencias nucleotı́dicas relevantes para la presente invención.
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La ID SEC N◦ 1 es la secuencia de DNA complementario correspondiente al genoma del virus del
grabado del tabaco.
La ID SEC N◦ 2 es la secuencia nucleotı́dica del gen de proteı́na de envuelta del virus del grabado del
tabaco, modificado, presente en pTC:FL.
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La ID SEC N◦ 3 es la secuencia nucleotı́dica del gen de proteı́na de envuelta del virus del grabado del
tabaco, modificado, presente en pTC:RC.
La ID SEC N◦ 4 es la secuencia nucleotı́dica del gen de proteı́na de envuelta del virus del grabado del
tabaco, modificado, presente en pTC:AS. Es el complemento inverso de la ID SEC N◦ 2.
Descripción detallada
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La presente invención se refiere a plantas manipuladas genéticamente que se transforman con una
molécula de DNA que codifica una molécula de RNA intraducible de sentido positivo.
Definición de términos
Planta susceptible: Una planta que soporta replicación viral y presenta sı́ntomas inducidos por virus.
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Planta resistente: Una planta en la que los sı́ntomas inducidos por virus están atenuados y la replicación del virus está atenuada.
RNA de sentido positivo (y RNA de sentido): La forma de un RNA que puede servir como RNA
mensajero.
RNA de sentido negativo: La forma de RNA usada como una plantilla para la producción de RNA
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de sentido positivo.
RNA antisentido: RNA complementario a la forma de RNA de sentido positivo.
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Generación R0 : Transformantes primarios.
Generación R1 : Progenie de transformantes primarios.
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Generación R2 : Progenie de segunda generación de la generación R0 (es decir, progenie de la generación R1 ).
Un gen derivado en parte de una molécula de RNA de virus de planta: al menos la porción del gen
que codifica la molécula de RNA intraducible se deriva de una molécula de RNA de virus de planta.
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Descripción general
Una molécula de RNA intraducible de sentido positivo es codificada por un gen situado sobre la
molécula de DNA. El gen comprende DNA derivado de un genoma de RNA de virus de planta y también
DNA de fuentes heterólogas. El DNA de fuentes heterólogas incluye elementos que controlan la expresión
de las secuencias de DNA derivadas de virus. La secuencia de DNA del gen está alterada especı́ficamente
a fin de hacer intraducible la molécula de RNA transcrita a partir del gen. La presencia de este RNA
intraducible de sentido positivo dentro de las células de la planta transformada reduce la susceptibilidad
de la planta a la infección viral. Más particularmente, la porción del gen que comprende DNA de un
virus de planta se han aislado de un potivirus. Las plantas transformadas con la molécula de DNA que
contiene el gen son menos susceptibles a la infección por potivirus. Lo más especı́ficamente, el DNA de
la fuente de potivirus se ha derivado del gen de la proteı́na de envuelta del virus del grabado del tabaco y
las plantas transformadas son resistentes a la infección por el virus del grabado del tabaco. Plantas que
pueden hacerse resistentes a infección por potivirus incluyen, pero no se limitan a, tabaco.
De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un método para manipular genéticamente
plantas mediante inserción, en el genoma de la planta, de un constructo de DNA que contiene un gen
recombinante derivado de un genoma de potivirus tal que las plantas manipuladas presentan resistencia
al potivirus.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se producen plantas transformadas genéticamente
que son resistentes a infección por un potivirus de planta insertando en el genoma de la planta una secuencia de DNA que provoca la producción de un RNA de proteı́na de envuelta intraducible del potivirus.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una secuencia de DNA para
funcionar en células de planta para provocar la producción de una molécula de RNA intraducible de sentido positivo. También se han proporcionado, de acuerdo con otro aspecto más de la presente invención,
células bacterianas y transformadas de planta que contienen el DNA descrito anteriormente. De acuerdo
con otro aspecto más de la presente invención, se ha proporcionado una planta de tabaco diferenciada que
comprende células de tabaco transformadas que expresan el RNA intraducible de la proteı́na de envuelta
del virus del grabado del tabaco, plantas que exhiben resistencia a la infección por virus del grabado del
tabaco.
Se propone un mecanismo por el que una molécula de RNA intraducible de sentido positivo, tal como
la descrita en la presente invención, puede funcionar para inhibir la función biológica normal de una
molécula de RNA de sentido negativo. Un experto en la técnica reconocerá que el nuevo sistema descrito
aquı́ no está limitado al ejemplo experimental especı́fico dado y apreciará la utilidad potencial más amplia
de la invención.
La expresión de un gen de planta que existe en forma de DNA de doble hebra implica la transcripción de RNA mensajero (mRNA) de una hebra del DNA mediante la enzima RNA polimerasa, y el
procesamiento posterior del transcrito primario de mRNA en el núcleo. Este procesamiento implica una
región no traducida 3’ que hace que los nucleótidos poliadenilados se añadan al extremo 3’ del RNA viral.
La transcripción de DNA en mRNA es regulada por una región de DNA denominada habitualmente el
“promotor”. La región promotora contiene una secuencia de bases que señala la RNA polimerasa para
asociarse con el DNA y para iniciar la transcripción de mRNA usando una de las hebras de DNA como
una plantilla para elaborar una hebra de RNA correspondiente.
Se ha descrito en la literatura un número de promotores que son activos en células de planta. Pro5
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motores que son conocidos o se encuentra que provocan transcripción de RNA viral en células de planta
pueden usarse en la presente invención. Tales promotores pueden obtenerse a partir de plantas o virus e
incluyen, pero no se limitan a, el promotor 35S de CaMV. Según se describe posteriormente, se prefiere
que el promotor particular seleccionado sea capaz de provocar una expresión suficiente para dar como
resultado la producción de una cantidad eficaz de RNA intraducible de sentido positivo para hacer a la
planta sustancialmente resistente a la infección por virus. La cantidad de RNA intraducible de sentido
positivo necesaria para inducir la resistencia puede variar con el tipo de planta. De acuerdo con esto,
aunque se prefiere el promotor 35S, debe entenderse que este promotor puede no ser el óptimo para todas
las modalidades de la presente invención. Por otra parte, los promotores usados en los constructos de
DNA de la invención pueden modificarse, si se desea, para afectar a sus caracterı́sticas de control. Se
han identificado secuencias de DNA que confieren especificidad reguladora sobre regiones promotoras.
Por ejemplo, la subunidad pequeña del gen de ribulosa bis-fosfato carboxilasa (ss RUBISCO) se expresa
en hojas de planta pero no en tejidos de raı́z. Se ha identificado un motivo de secuencia que reprime
la expresión del gen ss RUBISCO en ausencia de luz, para crear un promotor que es activo en hojas
pero no en tejido de raı́ces. Este y/u otros motivos de secuencia reguladores pueden ligarse a promotores
tales como el promotor 35S de CaMV para modificar los modelos de expresión de un gen. Promotores
quiméricos ası́ construidos pueden usarse según se describe aquı́. Para los propósitos de esta descripción,
la expresión “promotor 35S de CaMV” incluirá por lo tanto todos los promotores derivados por medio
de ligación con regiones operadoras, mutagénesis aleatoria o controlada, ası́ como copias en tándem o
múltiples de elementos estimuladores, y similares.
La región no traducida 3’ de genes que se sabe o se encuentra que funcionan como sitios de poliadenilación para RNA viral en células de planta puede usarse en la presente invención. Tales regiones no
traducidas 3’ incluyen, pero no se limitan a, la región no traducida transcrita 3’ del gen 35S de CaMV
y las regiones no traducidas transcritas 3’ que contienen las señales de poliadenilación de los genes inductores de tumores (TI) de Agrobacterium, tal como el gen grande de morfologı́a tumoral (tml). Para
los propósitos de esta descripción, la expresión “región no traducida 3’ de 35S de CaMV” incluirá por lo
tanto todas estas regiones no traducidas 3’ apropiadas.
Los constructos de DNA de la modalidad descrita contienen, en forma de DNA de doble hebra, una
porción de una versión de cDNA del genoma de RNA de una sola hebra de TEV. En los potivirus,
incluyendo el TEV, el genoma viral incluye genes que codifican la proteı́na de la envuelta, una enzima
replicasa y una proteinasa. La modalidad descrita utiliza la región del genoma que codifica el gen de la
proteı́na de envuelta. Al considerar la presente invención y la evidencia del mecanismo propuesto por el
que una molécula de DNA intraducible de sentido positivo puede inhibir la replicación viral, los expertos
en la técnica reconocerán que el gen de la proteı́na de envuelta podrı́a sustituirse por otras porciones
de un genoma de potivirus. Por otra parte, será evidente que las porciones genómicas adecuadas no se
limitan a secuencias génicas completas.
Una modalidad descrita de la invención utiliza un DNA complementario (cDNA) de doble hebra derivado de la región del genoma de TEV que codifica el gen de la proteı́na de envuelta. Al extremo 5’ de
este cDNA se liga el promotor 35S de CaMV y la región no traducida 5’ de RNA de 35S de CaMV. Al
extremo 3’ se liga la región no traducida 3’ de 35S de CaMV. Estas secuencias 5’ y 3’ están presentes
para provocar la transcripción del gen en células de planta mediante la enzima celular RNA polimerasa
para producir una molécula de RNA de secuencia correspondiente a la secuencia de la secuencia de cDNA
de la proteı́na de envuelta. Normalmente, tal RNA serı́a traducido a continuación mediante ribosomas
que sintetizarı́an una proteı́na de secuencia de aminoácidos especificada por la secuencia nucleotı́dica de
la molécula de RNA. Los aminoácidos particulares son especificados por tripletes de nucleótidos denominados codones. Los codones que estipulan la iniciación y la terminación de la traducción también están
presentes en moléculas de DNA y RNA. La presente invención se refiere a moléculas de RNA que son
intraducibles por ribosomas. En la modalidad preferida la secuencia del cDNA de TEV que codifica la
proteı́na de envuelta se muta mediante una técnica de mutagénesis in vitro estándar para producir una
mutación por cambio en el marco primeramente en el gen estructural de la proteı́na de envuelta, seguida
inmediatamente por tres codones de señal de terminación de la traducción. Estas mutaciones no afectan
a la capacidad de la RNA polimerasa para transcribir una molécula de RNA a partir del cDNA pero
evitan la traducción del RNA transcrito por ribosomas. Los expertos en la técnica reconocerán que, para
el gen descrito y para otros genes, las secuencias de DNA pueden alterarse de otros modos para hacer
que el DNA codifique una molécula de RNA intraducible de sentido positivo. Ası́, la invención descrita
no se limita a las mutaciones descritas.
Una modalidad descrita utiliza un cDNA que codifica el gen de proteı́na de envuelta de TEV, mutado
a fin de codificar un RNA intraducible de sentido positivo. Será obvio para un experto en la técnica
que podrı́a usarse una alteración adicional de la secuencia de la molécula de cDNA para conferir carac6
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terı́sticas adicionales a la molécula de RNA intraducible de sentido positivo. Caracterı́sticas adicionales
incluyen las que darı́an como resultado una resistencia viral incrementada de plantas transformadas con
molécula de cDNA que codifica un RNA intraducible de sentido positivo. La inclusión de una secuencia
de ribozima que provoca la destrucción catalizada por RNA de la molécula de RNA diana constituirı́a
una de tales caracterı́sticas adicionales. Las secuencias de ribozima adecuadas son conocidas, según se
analiza en Tabler y Tsagris (1991).
Un constructo de DNA de acuerdo con la presente invención se introduce, a través de un vector
adecuado y un método de transformación como el descrito posteriormente, en células de plantas y se
regeneran plantas transformadas con el DNA introducido. Existen diversos métodos para transformar
células de planta y de ese modo generar plantas transgénicas. Métodos que se sabe o se encuentra que son
adecuados para crear plantas transformadas establemente pueden usarse en esta invención. La elección
del método variará con el tipo de planta que ha de transformarse. Los expertos en la técnica reconocerán
la idoneidad de métodos particulares para tipos de plantas dados. Métodos adecuados pueden incluir,
pero no se limitan a: electroporación de protoplastos de plantas; transformación mediada por liposomas; transformación mediada por polietileno; transformación usando virus; microinyección de células de
planta; bombardeo con micropoyectiles de células de planta y transformación mediada por Agrobacterium
tumefaciens (AT). La última técnica es el método de elección para la modalidad preferida descrita de la
presente invención.
En una modalidad de esta invención, las secuencias de DNA que comprenden el promotor 35S de
CaMV y la región 3’ no traducida de 35S de CaMV y el cDNA mutado que codifica un RNA intraducible
de sentido positivo derivado del gen de proteı́na de envuelta de TEV se combinan en un solo vector de
clonación. Este vector se transforma posteriormente en células de AT y las células resultantes se usan
para transformar células de tabaco cultivadas.
Se describen vectores adecuados para la transformación mediada por AT de plantas con el DNA de la
invención. Será obvio para un experto en la técnica que está disponible una gama de vectores adecuados,
incluyendo los descritos por Bevan (1983), Herrera-Estrella (1983), Klee (1985) y EP-A-120516 (Schilperoort y otros). Están disponibles comercialmente vectores adecuados de Clontech (Palo Alto, CA) y
Pharmacia LKB (Pleasant Hill, CA) y otras fuentes.
Después de la transformación de células de planta y la regeneración de plantas transformadas con las
moléculas de DNA según se describe, las plantas regeneradas se prueban con respecto a la resistencia
incrementada al virus. Las plantas se exponen preferiblemente al virus a una concentración dentro de
un intervalo en el que la velocidad de desarrollo de la enfermedad se correlaciona linealmente con la
concentración de virus. Métodos para la inoculación de virus son bien conocidos por los expertos en la
técnica y son revisados por Kado y Agrawai (1972). Uno de tales métodos incluye abradir una superficie
foliar con una suspensión acuosa que contiene un material abrasivo tal como carburo de silicio y virus o
espolvorear las hojas con tal material abrasivo y posteriormente aplicar el virus sobre la superficie foliar.
Una suspensión de virus puede inocularse directamente en venas foliares o alternativamente las plantas
pueden inocularse usando vectores de insecto. La suspensión de virus puede comprender partı́culas de
virus purificadas, o, alternativamente, puede utilizarse savia de plantas infectadas con virus. Las plantas
transformadas se evalúan a continuación con respecto a la resistencia al virus. La valoración de la resistencia o la susceptibilidad reducida puede manifestarse de diferentes modos dependiendo del tipo de virus
y el tipo de plantas particulares. Los expertos en la técnica se darán cuenta de que una comparación
del desarrollo de los sı́ntomas sobre un número de plantas transformadas inoculadas con el desarrollo
de sı́ntomas sobre plantas transformadas inoculadas de forma similar proporcionará un método preferido
para determinar los efectos de la transformación con la molécula de DNA especı́fica sobre la resistencia de
las plantas. Los sı́ntomas de infección incluyen, pero no se limitan a, moteado foliar, clorosis y grabado.
Las plantas que muestran resistencia viral incrementada pueden ser reconocidas por un retraso en la
aparición de tales sı́ntomas o una atenuación o falta total de tales sı́ntomas.
Ejemplo
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El trabajo con plantas de tabaco y el virus del grabado del tabaco (TEV) es ilustrativo de la invención.
Construcción de gen que codifica molécula de RNA intraducible de sentido positivo
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El aislado altamente transmisible por áfidos (HAT) del virus del grabado del tabaco (TEV) se obtuvo
del Dr. Tom Pirone (University of Kentucky) y se mantuvo en Nicotiana tabacum (Burley 21). El virus
se purificó de Nicotiana tabacum (Burley 21) 20 a 30 dı́as después de la inoculación. Se han descrito
procedimientos de purificación viral y aislamiento de RNA (Dougherty y Hiebert (1980a). Se sintetizó
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DNA complementario (cDNA), se convirtió en de doble hebra y se insertó en el plásmido bacteriano
pBR322 como se describe por Allison y otros (1985a, 1985b, 1986). La sı́ntesis de cDNA se efectuó como
sigue: RNA viral purificado cebado con oligo(dT12−18) servı́a como una plantilla para la sı́ntesis de cDNA
de una sola hebra mediante transcriptasa inversa. Después de la adición de zonas homopolı́meras de 5’monofosfato de desoxicitidina, la sı́ntesis de la segunda hebra, cebada con oligo(dG12−18), se completó
con DNA polimerasa I. Los conectores SalI y EcoRI se ligaron al cDNA de doble hebra y se insertaron en
el plásmido bacteriano pBR322 (Kurtz y Nicodemus 1981). Los clones de cDNA resultantes se rastrearon
mediante hibridación de colonias (Hannahan y Meselson 1980) con cDNA de TEV de una sola hebra,
marcado con 32 P, cebado con oligo(dT12−18). Se aisló DNA plasmı́dico de colonias que se hibridaban con
la sonda, y los insertos de cDNA SalI/EcoRI se clasificaron por tamaños mediante electroforesis en un
gel de agarosa al 0,8 % (p/v) usando un aparato horizontal de gel enfriado con agua.
Los insertos SalI/EcoRI de las moléculas recombinantes se aislaron de un gel de agarosa con membrana NA45 (Schleicher y Schuell, Keene, NH) de acuerdo con el procedimiento del fabricante. Se usaron
las siguientes enzimas de restricción solas o en combinación para digerir el inserto de cDNA aislado:
HindIII, XhoI, AluI, HaeIII, RsaI, Sau3A y Taq1. Los productos de digestión con enzimas de restricción
se insertaron en el DNA de un bacteriófago M13 apropiado (Messing, 1983) seleccionado con respecto
a la presencia de sitios de restricción de policonector correspondiente, y sus secuencias nucleotı́dicas se
determinaron mediante terminación de la cadena didesoxi.
El plásmido pTL 37/8595 (Carrington y Dougherty, 1987; Carrington y otros, 1987) contiene una
copia de cDNA de la secuencia genómica de TEV HAT correspondiente a los nucleótidos (nt) 1-200 y
nt 8462-9495 (figura 2). (La numeración de los nucleótidos del genoma de TEV está de acuerdo con la
presentada en Allison y otros, 1986). La secuencia nucleotı́dica y la secuencia de aminoácidos deducida
del genoma del virus del grabado del tabaco y el sistema de numeración utilizado por Allison y otros
(1986) y aquı́ se muestran en la figura 1 y la ID SEC N◦ 1 en el listado de secuencias adjunto. Los codones
primero y último de la región de codificación de la proteı́na de envuelta (CP) en el genoma de TEV son
nt 8518-8520 (que codifican el aminoácido serina) y 9307-9309 (codón de parada ópalo), respectivamente.
pTL 37/8595 se sometió a mutagénesis dirigida al sitio in vitro según se describe por Taylor y otros
(1985a, 1985b). En todos los casos, los cambios de nucleótidos se confirmaron mediante la secuenciación
de didesoxinucleótidos (Sanger y otros, 1977).
Los nt 9312-317 de TEV se mutaron en primer lugar (figura 2) para generar un sitio de restricción
BamHI (GGATCC). Los nt 8516-8521 de TEV se alteraron a continuación para generar un sitio NcoI
(CCATGG), cambiando el primer codón de la región de codificación CP de TEV desde ATG (Ser) hasta
ATG (Met). Se usó a continuación un solo oligonucleótido para mutar los nt 133-138 de TEV hasta un
sitio de restricción de BamHI (GGATCC), los nt 143-148 hasta un sitio de restricción NcoI (CCATGG) y
el nt 142 hasta un residuo de desoxiadenilato. Estas mutaciones generaban un sitio NcoI centrado sobre
el primer codón del ORF de TEV y en un buen contexto de iniciación de la traducción según se describı́a
por Kozak (1984). La digestión del plásmido resultante con la enzima de restricción NcoI, retirando los
nt de TEV N◦ 143-200/8462-8516, y la religación generaban el plásmido pTC:FL. pTC:FL contenı́a sólo
el gen CP de TEV flanqueado por sitios de restricción BamHI y secuencias no traducidas 5’ y 3’ de TEV
(véase la figura 2). La secuencia nucleotı́dica del gen CP de TEV en pTC:FL producida mediante este
esquema de mutagénesis se muestra en la ID SEC N◦ 2 en el listado de secuencias adjunto.
El plásmido pTC:RC (control de RNA, produciendo RNA intraducible de sentido positivo) se generó
mediante la inserción de un solo residuo de desoxitimilidato después del nt 8529 de TEV, y los puntos
de mutación de los nt de TEV 8522 (G por C), 8534 (C por A), 8542 (G por A) y 8543 (A por G)
para crear una mutación de cambio del marco inmediatamente seguida por tres codones de parada. Se
generó simultáneamente un sitio de restricción NheI (GCTAGC), con propósitos de rastreo, en los nt
8539-8544. La secuencia nucleotı́dica del gen CP de TEV en pTC:RC producida mediante este esquema
de mutagénesis se muestra en la ID SEC N◦ 3 en el listado de secuencias adjunto.
Todos los plásmidos descritos anteriormente se linealizaron con HindIII, se transcribieron con RNA polimerasa de T7 (Melton y otros, 1984) y se tradujeron en un lisado de reticulocitos de conejo que contenı́a
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S-metionina (Dougherty y Hiebert, 1980a). Los productos de traducción radiomarcados se analizaron
mediante separación electroforética en un gel de acrilamida al 12,5 % que contiene SDS (Laemmli, 1970)
y se detectaron mediante autorradiografı́a. Los transcritos del plásmido pTC:RC no producı́an productos proteı́nicos detectables, mientras que los transcritos de pTC:FL producı́an proteı́nas de los tamaños
esperados.
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Las diversas formas de la secuencia nucleotı́dica de CP se insertaron a continuación como casetes de
BamHI en el vector de expresión de planta pPEV (véase posteriormente y la figura 3).
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El marco de lectura abierto de CP de TEV de longitud completa de pTC:FL se insertó en la orientación inversa para formar el constructo de antisentido (AS) pTC:AS. La secuencia nucleotı́dica del gen
CP de TEV en pTC:AS se muestra en la ID SEC N◦ 4 en el listado de secuencias adjunto.
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Construcción de Vectores de Transformación
Construcción de pPEV. El vector pPEV es parte de un sistema de vector binario para transformación
de células de planta mediada por Agrobacterium tumefaciens. El plásmido pPEV se construyó a partir de
los plásmidos pCGN 2113 (Calgene), pCIB 710 y pCIB 200 (Ciba Geigy Corp.) pCGN 2113 contiene el
promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (secuencias de CaMV -941 a 90/-363 a +2, relativas al sitio de inicio de la transcripción) “estimulado” en una cadena principal plasmı́dica derivada de
pUC. pCIB 710 se ha descrito (Rothstein y otros, 1987) y pCIB 200 es un derivado del plásmido de amplia
gama de huéspedes pTJS 75 (Schmidhauser y Helinski, 1985) que contiene lı́mites izquierdo y derecho
de DNA de A. tumefaciens T37, el gen quimérico NOS/NPT II seleccionable en plantas del plásmido
Bin 6 (Bevan, 1984) y parte de un policonector pUC. El fragmento de DNA pequeño EcoRI/EcoRV de
pCIB 710 (Rothstein y otros, 1987) se ligó en pCGN 2113 digerido con EcoRI/EcoRV. Esto generaba el
promotor 35S de CaMV estimulado (Kay y otros, 1987) de pCGN 2113 e introducı́a las secuencias no
traducidas 5’ y 3’ de 35S de CaMV en pCGN 2113. El casete promotor-terminador de 35S de CaMV
del plásmido resultante se aisló como un fragmento de DNA EcoRI-XbaI y se ligó en pCIB 200 digerido
con EcoRI-XbaI para generar pPEV. Las secuencias nucleotı́dicas de CP de pTC:FL, pTC:RC y pTC:AS
se clonaron como casetes de BamHI en pPEC digerido con BamHI y la orientación de los insertos se
confirmó mediante digestión con endonucleasas de restricción apropiadas.
Transformación y Regeneración de Tabaco
Plásmidos pPEV que contienen ORFs de CP de TEV se movilizaron a partir de E. coli HB101 en
A. tumefaciens A136 que contiene el plásmido pCIB 542 (Ciba Geigy), usando el plásmido auxiliar pRK
2013 en E. coli HB101 y el sistema de apareamiento triparental de Ditta y otros (1980). El plásmido
pCIB 42 suministraba funciones vir necesarias para la transferencia de T-DNA.
Discos foliares de Nicotiana tabacum variedad de cultivo Burley 49 se transformaron y se regeneraron plantas enteras de acuerdo con Horsch y otros (1985). Se seleccionó tejido transformado cultivando
callos sobre placas MS (Murashige y Skoog, 1962) que contenı́an 1 µg/ml de 6-bencilaminopurina (Sigma
Corp.), 0,1 µg/ml de ácido α-naftalenoacético (Sigma Corp.), 500 µg/ml de carbenicilina y 100 µg/ml
de sulfato de kanamicina (Sigma Corp.). Los vástagos se arraigaron sobre placas MS que contenı́an 500
µg/ml de carbenicilina y 100 µg/ml de sulfato de kanamicina y las plántulas se transplantaron a suelo y
se transfirieron directamente al invernadero aproximadamente 2-3 semanas después del enraizamiento.
Plantas de generación R0, R1 y R2 se rastrearon mediante análisis de transferencia Western y/o Northern. Las semillas R2 (alrededor de 100 semillas por planta R2) se rastrearon con respecto al fenotipo
resistente a la kanamicina (kanr ) esterilizando superficialmente las semillas en lejı́a al 10 % durante 5
minutos, lavando dos veces en agua estéril y germinando sobre placas MS que contenı́an 100 µg/ml de
sulfato de kanamicina. Las lı́neas de semillas R2 que eran 100 % resistentes a la kanamicina se rastrearon
mediante análisis de transferencia Western para la expresión de proteı́na de envuelta de TEV. Las lı́neas
de plantas transgénicas generadas y su nomenclatura se presentan en la figura 3.
Análisis Moleculares de Plantas Transgénicas
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Se analizaron plantas de tabaco transgénicas mediante análisis de transferencia Western y Northern
para determinar la naturaleza de los productos de proteı́na y RNA producidos, respectivamente. Muestras de RNA total aisladas de las diversas lı́neas transgénicas se analizaron en estudios de hibridación
por transferencia Northern. Los ácidos nucleicos totales se aislaron del tejido y el RNA se precipitó con
LiCl según se describe por Verwoerd y otros (1989). Los RNAs se separaron electroforéticamente sobre
geles de agarosa al 1,2 % que contenı́an 6 % (v/v) de formaldehı́do y se transfirieron a nitrocelulosa. Las
condiciones de prehibridación e hibridación eran como las descritas en Sambrook y otros (1989). Se generaron ribosondas especı́ficas para una hebra a partir de reacciones de transcripción de RNA polimerasa
dependiente de DNA de SP6 o T7 de pTL 37/8595 linealizado con las enzimas de restricción Asp718
(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) o HindIII, respectivamente, usando ribonucleótido 32 P-CTP
marcado en α y los procedimientos sugeridos (Promega, Madison, WI).
Se esperaba un transcrito de RNA de aproximadamente 1.000 nt con todas las lı́neas de plantas
transgénicas. Tal transcrito de CP de TEV se detectó en lı́neas de plantas que expresaban CP usando
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una ribosonda de sentido negativo que contenı́a la secuencia de CP de TEV. Un transcrito similar se
detectó en plantas AS usando una ribosonda de sentido positivo que contenı́a la secuencia de CP de
TEV. El transcrito en la lı́nea RC, aunque se detectó con una ribosonda de sentido negativo, puede haber
migrado como una especie de RNA ligeramente más grande (alrededor de 1.100-1.200 nt), posiblemente
debido a la terminación en un sitio seleccionado alternativamente y/o una cola de poli-A más larga en el
transcrito. Se observaron niveles diferentes de acumulación de transcrito de CP entre diferentes lı́neas de
plantas transgénicas.
Se identificaron lı́neas de plantas transgénicas que expresaban la proteı́na de envuelta de TEV mediante análisis de transferencia Western usando antisueros policlonales para CP de TEV. Muestras de
tejidos de plantas regeneradas se trituraron en 10 volúmenes de 2X tampón de recorrido de Laemmli
(Tris-glicina) (Laemmli, 1970) y se clarificaron mediante centrifugación en una microcentrı́fuga durante
10 minutos a 10.000xg. La concentración de proteı́na se estimó mediante el procedimiento de unión a
colorante de Bradford (1976) usando BSA como un patrón. Las muestras de proteı́na (50 µg de proteı́na
total) se separaron en un gel de poliacrilamida al 12,5 % que contenı́a SDS y se sometieron a los procedimientos de inmunotransferencia descritos por Towbin y otros (1979). Se usaron anticuerpos primarios
policlonales anti-(proteı́na de envuelta de TEV), anticuerpos secundarios conjugados a fosfatasa alcalina
y los sustratos cromogénicos NBT (cloruro de para-nitro-azul tetrazolio) y BCIP (sal de para-toluidina
de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indoı́lo) para detectar el antı́geno unido.
Los productos de proteı́na de envuelta producidos en plantas FL eran estables y se acumulaban hasta
diferentes niveles en lı́neas de plantas transgénicas individuales. Se estimó mediante análisis de transferencia Western que entre 0,01 % y 0,001 % de proteı́na extraı́da total era CP de TEV.
Determinación de la Resistencia a TEV
Plantas R1 y R2 de ocho semanas de edad (alrededor de 15 cm de alto) fueron inoculadas con preparaciones de virus purificado o savia de plantas infectadas. El inóculo se aplicó con torundas de algodón
prehumedecidas estériles. El inóculo de savia de planta infectada se preparó triturando tejido de 21 hojas
de N. tabacum Burley infectado con TEV (2 semanas después de la inoculación) en carburo de silicio y
tampón de fosfato sódico 50 mM (pH 7,8) a una relación de 1 g:0,2 g:10 ml, respectivamente, y filtrando
el homogenado a través de gasa. Los viriones de TEV se purificaron como se describe en Dougherty y
Hiebert (1980b). Una hoja por planta se espolvoreó ligeramente con carburo de silicio (grano 320) y se
inoculó en dos posiciones intervenales con 50 µl (totales) de inóculo. Las plantas inoculadas se examinaron diariamente y se registró la apariencia y la gravedad de los sı́ntomas sistémicos. Se consideró que los
sı́ntomas en cualquier hoja por encima de la hoja inoculada eran sistémicos.
Tı́picamente, la inoculación de plantas Burley 49 con TEV (virus purificado o savia de planta) daba
como resultado clorosis y mosaico y moteado severos sobre hojas infectadas sistémicamente aproximadamente 6-7 dı́as después de la inoculación. Seguı́a el grabado intenso de las hojas después de unos pocos
dı́as. Se observó que las plantas transgénicas que contenı́an sólo el promotor de CaMV y secuencias no
traducidas (es decir, lı́nea de planta 35S) respondı́an a la inoculación de estı́mulo de una manera similar
a Burley 49 de tipo silvestre, desarrollando clorosis y grabado intensivos a la misma velocidad (figura 4).
Las lı́neas de plantas que expresaban CP de TEV FL mostraban poco o ningún retraso en la aparición de
sı́ntomas cuando se inoculaban con savia de plantas infectadas. Sin embargo, las plantas transgénicas FL
mostraban una ligera atenuación de los sı́ntomas y finalmente (2-4 semanas después de la aparición inicial
de sı́ntomas) el tejido foliar más joven emergı́a libre de sı́ntomas y virus según se demostraba mediante
nuevos experimentos de inoculación. Tı́picamente, la clorosis y el grabado sobre hojas sistémicas más
viejas se limitaba.
Se obtuvieron diez lı́neas RC transformadas independientemente y siete lı́neas AS transformadas independientemente. La progenie de tres de las lı́neas RC, incluyendo la lı́nea RC N◦ 5, y de una de las lı́neas
AS, incluyendo AS N◦ 3, mostraba una respuesta alterada a la infección viral con relación a las plantas
de control. Se verificó que todas estas lı́neas estaban transformadas y estaban produciendo productos
de RNA esperados. Una posible explicación para la variación en el fenotipo observado es el “efecto de
posición” previamente apuntado, por el que la expresión de los genes de secuencias de DNA idénticas
integradas en diferentes posiciones dentro del genoma muestra modelos variables de especificidad para
los tejidos.
Se inocularon diez plantas que expresan R2 de la lı́nea que expresa FL con savia de plantas infectadas,
y 20 plantas R1 de las lı́neas AS N◦ 3 y RC N◦ 5 se inocularon con 50 µg de una solución de 5 µg/ml
de TEV purificado. Se obtuvieron resultados idénticos a los obtenidos mediante inoculación de TEV
purificado cuando se inoculaban plantas R1 AS N◦ 3 y RC N◦ 5 con savia de plantas infectadas con TEV,
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como se describe anteriormente.
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Las lı́neas de plantas transgénicas Burley 49 AS N◦ 3 y RC N◦ 5, que expresan sólo secuencias de
RNA relacionadas con CP de TEV, mostraban un retraso en la aparición de sı́ntomas y una modificación
de los sı́ntomas cuando se inoculaban con TEV (figura 4B). Puesto que las 20 plantas R1 no se rastreaban
con respecto a la expresión de RNA de CP antes de la inoculación, algunas de las plantas sintomáticas
representaban plantas sin expresión en las que el gen de interés se habı́a perdido durante la segregación
mendeliana. Los sı́ntomas modificados sobre plantas AS N◦ 3 aparecı́an como pequeñas lesiones cloróticas
a menudo asociadas con una vena. La mayorı́a de las hojas carecı́an de sı́ntomas y virus (determinado
mediante nuevos experimentos de inoculación). Aproximadamente 15 % de plantas RC N◦ 5 mostraban
sı́ntomas que eran idénticos a los de Burley 49 infectadas. Sin embargo, las restantes plantas RC N◦ 5
eran completamente asintomáticas, y no se detectaba virus en nuevos estudios de inoculación.
Las plantas de las lı́neas AS y RC resistentes a TEV no mostraban resistencia incrementada, con
relación a controles no transformados, a la infección mediante otros dos miembros de la familia de los
potivirus, a saber virus de moteado de las venas del tabaco y virus de patata Y.
La generación R2 de plantas derivadas de plantas RC resistentes a TEV mostraba el modelo mendeliano esperado de herencia en el fenotipo resistente a TEV.
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Análisis de la Replicación de TEV en Protoplastos Derivados de Lı́neas de Plantas Transgénicas
En un intento de explicar los resultados obtenidos cuando se estimulaban plantas transgénicas AS y
RC con TEV, se buscaba determinar si todas las lı́neas de plantas transgénicas soportarı́an replicación
de virus a un nivel comparable con Burley 49. La acumulación de proteı́nas codificadas por virus se
usó como un indicador indirecto de la replicación viral. Los protoplastos se derivaron de tejido foliar
de plantas homocigóticas que expresan CP y se sometieron a electroporación de acuerdo con el procedimiento de Luciano y otros (1987) con RNA de TEV. Los protoplastos se prepararon a partir de plantas
transgénicas y se sometieron a electroporación de acuerdo con el procedimiento de Luciano y otros (1987).
Los protoplastos (1 x 106 ) se resuspendieron en 450 µl de tampón de electroporación (manitol 330 mM,
KPO4 1 mM, pH 7,0, KCl 150 mM) y se sometieron a electroporación usando un BTX Transfector 300
(BTX San Diego, CA) (950 microfaradios, amplitud de impulso 130 voltios, espacio entre electrodos 3,5
mm) en presencia o ausencia de 6 µg de RNA de TEV purificado. Después de la electroporación, los
protoplastos se incubaron durante 96 horas en medio de incubación según se describe en Luciano y otros
(1987). Los protoplastos se extrajeron en 2X tampón de recorrido de Laemmli (Tris-glicina), y 5 x 104
protoplastos extraı́dos se sometieron a continuación a análisis de transferencia Western como se describe
anteriormente. La viabilidad de los protoplastos se midió mediante exclusión con colorante como se describe en Luciano y otros (1987). Todas las muestras de protoplastos sometidas a electroporación tenı́an
conteos de viabilidad equivalentes. Los resultados indicaban que los protoplastos de todas las lı́neas de
plantas FL soportaban replicación de virus a niveles comparables con protoplastos de Burley 49 de tipo
silvestre. Plantas transgénicas R1 de las lı́neas AS N◦ 3 y RC N◦ 5 se rastrearon inicialmente mediante
análisis Northern, y las hojas de expresores positivos se usaron en la producción de protoplastos. Los
protoplastos transfectados derivados de plantas AS N◦ 3 soportaban replicación de TEV, aunque a un
nivel reducido. Los protoplastos derivados de tejido foliar de plantas transgénicas RC N◦ 5 no soportaban
la replicación de TEV a un nivel detectable. Estos resultados, y los presentados en la serie de inoculación
de plantas enteras, sugerı́an que las plantas AS y RC interferı́an con la replicación de TEV.
Análisis de Datos
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El ejemplo anterior indica que pueden alcanzarse grados variables de protección de la infección por
TEV mediante la sobreexpresión de proteı́na de envuelta y mediante la expresión de un RNA antisentido.
Esta invención, que comprende la expresión de una molécula de RNA intraducible de sentido positivo,
proporciona protección contra infección por TEV que es más eficaz que cualquiera de estos dos métodos.
Plantas de la lı́nea RC N◦ 5, transformadas con la molécula de DNA descrita que codifica un RNA
intraducible de sentido positivo derivado del gen de proteı́na de envuelta de TEV, eran asintomáticas y
parecı́an estar completamente protegidas de la infección por virus. La infección descrita representa por
lo tanto un modo nuevo y eficaz para generar germoplasma resistente a potivirus.
Protoplastos de tabaco derivados de plantas que expresan el RNA antisentido soportaban un nivel
reducido de replicación de TEV en comparación con células de control derivadas de plantas no transformadas. En contraste, los protoplastos de tabaco derivados de plantas de la lı́nea RC N◦ 5, que expresan
el RNA intraducible de sentido positivo, no soportaban replicación de TEV detectable. Esto sugiere que
el RNA intraducible de sentido positivo era más eficaz para bloquear la replicación de TEV en las células
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de las plantas transformadas probadas.
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Se propone que el RNA intraducible de sentido positivo inhibe la replicación viral hibridándose a la
plantilla replicativa de RNA de sentido negativo de TEV. El hallazgo de que las plantas que expresan
RNA intraducible de sentido positivo derivado del gen de proteı́na de envuelta de TEV no están protegidas de la infección por virus de la patata Y o virus del moteado de las venas del tabaco se explica por
lo tanto por la divergencia de secuencia de aminoácidos de alrededor de 40-50 % entre las proteı́nas de
envuelta de estos virus y TEV (Allison y otros, 1986; Robaglia y otros, 1989; Domier y otros, 1986).
A partir de los hallazgos descritos anteriormente, serı́a razonable y totalmente predecible que si las
plantas se transformaran con un gen que codifica un RNA intraducible de sentido positivo derivado de
un gen que estaba altamente conservado entre virus de la familia de los potivirus, estas plantas estarı́a
protegidas de la infección por una amplia gama de virus. Las regiones del genoma del potivirus que
están suficientemente conservadas entre tipos de potivirus que van a ser potencialmente útiles en tal
procedimiento pueden determinarse fácilmente por un experto en la técnica. Regiones altamente conservadas pueden determinarse mediante referencia a datos de secuencia publicados (Allison y otros, 1986;
Robaglia y otros, 1989; Domier y otros, 1986; Lain y otros, 1989; Maiss y otros, 1989). La utilidad de las
regiones identificadas podrı́a determinarse fácilmente usando las metodologı́as descritas anteriormente y
sustituyendo el gen de proteı́na de envuelta de TEV por la región definida.
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Regiones del genoma de los potivirus potencialmente adecuadas incluyen, pero no se limitan a, los
genes que codifican la replicasa viral y la proteinasa viral. Por otra parte, serı́a evidente para un experto
en la técnica que las porciones altamente conservadas de un gen particular también pueden servir para
este papel.
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También será evidente para un experto en la técnica que la invención descrita también puede usarse
para producir plantas resistentes a virus fuera de la familia de los potivirus en casos en los que estos virus
también producen una plantilla replicativa de RNA de sentido negativo.
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Bibliografı́a
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15
Luciano y otros, 1987. Plant Science 51:295-303.
Maiss y otros, 1989. J. Gen. Virol. 70:513-524.
20
Melton y otros, 1984. Nucl. Acids Res. 12:7145-7156.
Messing 1983. “Methods in Enzymology” (R; Wu, L. Grossman y K. Moldave, eds.). Vol. 101c, pp.
20-78. Academic Press, Nueva York.
25
Murashige y Skoog 1962. Plant Physiol. 15:473-497.
Robaglia y otros, 1989. J. Gen. Virol. 70:935-947.
Rothstein y otros, 1987. Gene 53:153-161.
30
Sambrook y otros, 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2a¯ ed. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nueva York.
Sanford y Johnston 1985. J. Theor. Biol. 113:395-405.
35
Sanger y otros, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467.
Schmidhauser y Helinski 1985. J. Bact. 164:446-455.
Stark y Beachy 1989. Bio/Technology 7:1257-1262.
40
Tabler y Tsagris 1991. Gene 100:175-183.
Taylor y otros, 1985a. Nucl. Acids Res. 13:8749-8764.
45
Taylor y otros, 1985b. Nucl. Acids Res. 13:8765-8785.
Towbin y otros, 1979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354.
Verwoerd y otros, 1989. Nucl. Acids Res. 17:2372.
50
Listado de secuencias
(1) INFORMACION GENERAL
55
(i) SOLICITANTE: William G. Dougherty y John A. Lindbo
(ii) TITULO DE LA INVENCION: Producción de Plantas que Muestran Inmunidad a Infecciones
Virales a través de la Introducción de Genes que Codifican Moléculas de RNA Intraducibles de
Sentido Positivo
60
(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 4
13
ES 2 166 361 T3
(iv) DIRECCION DE CORRESPONDENCIA:
(A) DESTINATARIO: Richard J. Polley
5
(B) CALLE: One World Trade Center 121 S.W. Salmon Street, Suite 1600
(C) CIUDAD: Portland
(D) ESTADO: Oregon
10
(E) PAIS: Estados Unidos de América
(F) ZIP: 97204
15
(v) FORMA LEIBLE POR COMPUTADORA:
(A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible
(B) COMPUTADORA: PC Compatible con IBM
20
(C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS
(D) SOPORTE LOGICO: WordPerfect 5.1
25
(vi) DATOS DE SOLICITUD PREVIOS:
(A) NUMERO DE SOLICITUD: 07/838.509
(B) FECHA DE PRESENTACION: 19 de Febrero de 1992
30
(C) CLASIFICACION: 435
(vi) DATOS DE SOLICITUD PREVIOS: Ninguno
(vii) INFORMACION DEL ABOGADO/AGENTE
35
(A) NOMBRE: Richard J. Polley, Esq.
(B) NUMERO DE REGISTRO: 28.107
40
(C) REFERENCIA/NUMERO DE EXPEDIENTE:
245-35829/RJP
(viii) INFORMACION DE TELECOMUNICACIONES:
45
(A) TELEFONO: (503) 226-7391
(B) TELEFAX: (503) 228-9446
50
(A) NUMERO DE SOLICITUD: EP 92810681.4
(B) FECHA DE PRESENTACION: 04-SEP-1992
(2) INFORMACION PARA LA ID SEC N◦ : 1:
55
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9495
60
(B) TIPO: Acido Nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: sencilla
14
ES 2 166 361 T3
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA:
5
(A) DESCRIPCION: cDNA para RNA genómico
(iii) HIPOTETICO: No
10
(iv) ANTI-SENTIDO: No
(v) TIPO DE FRAGMENTO: N/A
(vi) FUENTE ORIGINAL:
15
(A) ORGANISMO: Virus del grabado del Tabaco (TEV)
(B) CEPA: Altamente Transmitida por Afidos (HAT)
20
(vii) FUENTE INMEDIATA: TEV propagado en N. tabacum Burley 49
(viii) POSICION EN EL GENOMA: N/A
(ix) RASGO:
25
(A) NOMBRE/CLAVE: Gen de proteı́na de envuelta
(B) LOCALIZACION: Nucleótidos genómicos
30
(C) METODO DE IDENTIFICACION: –
(D) OTRA INFORMACION: La ID SEC N◦ 1 es el cDNA correspondiente al genoma del virus
del grabado del tabaco.
(x) INFORMACION DE LA PUBLICACION:
35
(A) AUTORES: Allison y otros
(B) TITULO: The nucleotide sequence of the coding region on Tobacco Etch Virus Genomic
RNA: Evidence for the Synthesis of a Single Polyprotein
40
(C) REVISTA: Virology
(D) VOLUMEN: 154
45
(E) EDICION: –
(F) PAGINAS: 9-20
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: ID SEC N◦ : 1:
50
55
60
15
ES 2 166 361 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
16
ES 2 166 361 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
17
ES 2 166 361 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
18
ES 2 166 361 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
19
ES 2 166 361 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
20
ES 2 166 361 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
21
ES 2 166 361 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
22
ES 2 166 361 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
23
ES 2 166 361 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
24
ES 2 166 361 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
25
ES 2 166 361 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
26
ES 2 166 361 T3
5
10
15
(2) INFORMACION PARA LA ID SEC N◦ : 2:
20
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 792
(B) TIPO: Acido Nucleico
25
(C) TIPO DE HEBRA: Doble
(D) TOPOLOGIA: Circular
30
(ii) TIPO DE MOLECULA: cDNA para RNA genómico
(iii) HIPOTETICO: No
(iv) ANTI-SENTIDO: No
35
(v) TIPO DE FRAGMENTO: N/A
(vi) FUENTE ORIGINAL:
40
(A) ORGANISMO: Virus del grabado del Tabaco
(B) CEPA: Altamente Transmitida por Afidos
(C) AISLADO INDIVIDUAL: N/A
45
(vii) FUENTE INMEDIATA:
(A) BIBLIOTECA: No
50
(B) CLON: pTC:FL
(viii) POSICION EN EL GENOMA: N/A
(ix) RASGO:
55
60
(A) NOMBRE/CLAVE:Mutaciones (AGT→ATG) introducida en nucleótidos correspondientes
a los nucleótidos genómicos 8518-8520 de la ID SEC N◦ 1, para crear codón de metionina
de iniciación.
(B) LOCALIZACION: Nucleótidos 1-3 de la ID SEC N◦ 2
(C) METODO DE IDENTIFICACION: –
27
ES 2 166 361 T3
(D) OTRA INFORMACION: ID SEC N◦ : 2 es el gen de la proteı́na de envuelta del virus del
grabado del tabaco modificado presente en pTC:FL.
(x) INFORMACION DE LA PUBLICACION:
5
(A) AUTORES: Allison y otros
(B) TITULO: The nucleotide sequence of the coding region on Tobacco Etch Virus Genomic
RNA: Evidence for the Synthesis of a Single Polyprotein
10
(C) REVISTA: Virology
(D) VOLUMEN: 154
(E) EDICION: –
15
(F) PAGINAS: 9-20
(A) AUTORES: Lindbo y Dougherty
20
(B) TITULO: Ultranslatable Transcripts of the tobacco etch virus coat protein gene sequence
can interfere with tobacco etch virus replicatin in Transgenic Plants and Protoplasts
(C) REVISTA: Virology
(D) VOLUMEN: 189
25
(E) EDICION: –
(F) PAGINAS: 725-733
30
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: ID SEC N◦ : 2:
35
40
45
50
55
60
28
ES 2 166 361 T3
5
10
15
20
25
30
(2) INFORMACION PARA LA ID SEC N◦ : 3:
35
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 793
40
(B) TIPO: Acido Nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: Doble
(D) TOPOLOGIA: Circular
45
(ii) TIPO DE MOLECULA: cDNA para RNA genómico
(iii) HIPOTETICO: No
50
(iv) ANTI-SENTIDO: No
(v) TIPO DE FRAGMENTO: N/A
(vi) FUENTE ORIGINAL:
55
(A) ORGANISMO: Virus del grabado del Tabaco
(B) CEPA: Altamente Transmitida por Afidos
60
(C) AISLADO INDIVIDUAL: N/A
29
ES 2 166 361 T3
(vii) FUENTE INMEDIATA:
(A) BIBLIOTECA: No
5
(B) CLON: pTC:RC
(viii) POSICION EN EL GENOMA: N/A
(ix) RASGO:
10
(A) NOMBRE/CLAVE: Mutación de AGT-GGC (Ser-Gl) en ATG-GCC (Met-Ser)
(B) LOCALIZACION: Nucleótidos 1-6 de la ID SEC N◦ 3 (correspondientes a los nucleótidos
8518-8523 de la ID SEC N◦ 1)
15
(A) NOMBRE/CLAVE: Mutación por cambio del marco (inserción de T) que produce el codón
de parada
20
(B) LOCALIZACION: Nucleótidos 13 de la ID SEC N◦ 3 (correspondiente a la posición entre
los nucleótidos 8529-8530 de la ID SEC N◦ 1)
(D) OTRA INFORMACION: ID SEC N◦ : 3 es el gen de proteı́na de envuelta del virus del
grabado del tabaco modificado presente en pTC:RC.
25
(x) INFORMACION DE LA PUBLICACION:
(A) AUTORES: J. A. Lindbo y W. G. Dougherty
30
(B) TITULO: Pathogen-Derived Resistance to a Potyvirus: Immune and Resistant Phenotypes
in Transgenic Tobacco Expressing Altered Forms of a Potyvirus Coat Protein Nucleotide
Sequence
(C) REVISTA: Molecular Plant-Microbe Interactions
35
(D) VOLUMEN: 5
(E) EDICION: 2
(F) PAGINAS: 144-153
40
(A) AUTORES: J. A. Lindbo y W. G. Dougherty
45
(B) TITULO: Ultranslatable Transcripts of the Tobacco Etch Virus Coat Protein Gene Sequence Can Interfere with Tobacco Etch Virus Replication in Transgenic Plants and Protoplasts
(C) REVISTA: Virology
(D) VOLUMEN: 189
50
(E) EDICION: –
(F) PAGINAS: 725-733
55
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: ID SEC N◦ : 3:
60
30
ES 2 166 361 T3
5
10
15
20
25
(2) INFORMACION PARA LA ID SEC N◦ : 4:
30
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 792
35
(B) TIPO: Acido Nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: Doble
(D) TOPOLOGIA: Circular
40
(ii) TIPO DE MOLECULA: cDNA para RNA genómico
(iii) HIPOTETICO: No
45
(iv) ANTI-SENTIDO: Sı́
(v) TIPO DE FRAGMENTO: N/A
(vi) FUENTE ORIGINAL:
50
(A) ORGANISMO: Virus del grabado del Tabaco
(B) CEPA: Altamente Transmitida por Afidos
55
(C) AISLADO INDIVIDUAL: N/A
(vii) FUENTE INMEDIATA:
(A) BIBLIOTECA: No
60
(B) CLON: pTC:AS
31
ES 2 166 361 T3
(viii) POSICION EN EL GENOMA: N/A
(ix) RASGO:
5
(A) NOMBRE/CLAVE: –
(B) LOCALIZACION: –
(C) METODO DE IDENTIFICACION: –
10
15
(D) OTRA INFORMACION: ID SEC N◦ : 4 es el gen de proteı́na de envuelta del virus del
grabado del tabaco modificado presente en pTC:AS. Es el complemento inverso de la ID
SEC N◦ 2.
(x) INFORMACION DE LA PUBLICACION:
(A) AUTORES: J. A. Lindbo y W. G. Dougherty
20
(B) TITULO: Ultranslatable Transcripts of the Tobacco Etch Virus Coat Protein Gene Sequence Can Interfere with Tobacco Etch Virus Replication in Transgenic Plants and Protoplasts
(C) REVISTA: Virology
25
(D) VOLUMEN: 189
(E) EDICION: –
(F) PAGINAS: 725-733
30
(A) AUTORES: J. A. Lindbo y W. G. Dougherty
35
(B) TITULO: Pathogen-Derived Resistance to a Potyvirus: Immune and Resistant Phenotypes
in Transgenic Tobacco Expressing Altered Formas of a Potyvirus Coat Protein Nucleotide
Sequence
(C) REVISTA: Molecular Plant-Microbe Interactions
(D) VOLUMEN: 5
40
(E) EDICION: 2
(F) PAGINAS: 144-153
45
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: ID SEC N◦ : 4:
50
55
60
32
ES 2 166 361 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
33
ES 2 166 361 T3
REIVINDICACIONES
1. Un método para producir una planta con una susceptibilidad reducida a la infección viral, que
comprende:
5
10
transformar células de planta con una molécula de DNA que codifica molécula de RNA viral intraducible de sentido positivo, en donde la molécula de RNA viral intraducible de sentido positivo se deriva
de la secuencia nucleotı́dica de un gen de virus de planta; y
regenerar una planta que comprende la célula de planta transformada.
2. Una planta transgénica producida de acuerdo con el método de la reivindicación 1.
15
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la molécula de RNA viral intraducible de
sentido positivo se deriva de un gen de proteı́na de envuelta viral.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la molécula de RNA viral intraducible de
sentido positivo se deriva de un potivirus.
20
25
30
5. Una molécula de DNA útil para producir plantas resistentes a los virus, que comprende un promotor
conectado operablemente a una molécula de DNA que codifica una molécula de RNA viral intraducible
de sentido positivo, derivada de la secuencia nucleotı́dica de un gen de virus de planta.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 4, en el que la molécula
de RNA viral intraducible de sentido positivo contiene al menos una mutación que hace intraducible a la
molécula de RNA, y la expresión de la molécula de RNA viral intraducible de sentido positivo dentro de
la planta reduce la susceptibilidad de la planta a la infección por virus;
y en donde el método comprende además la etapa de seleccionar una planta que muestra una susceptibilidad reducida a la infección por el virus.
35
40
45
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
34
ES 2 166 361 T3
35
ES 2 166 361 T3
36
ES 2 166 361 T3
37
ES 2 166 361 T3
38
ES 2 166 361 T3
39
ES 2 166 361 T3
40
ES 2 166 361 T3
41
ES 2 166 361 T3
42
ES 2 166 361 T3
43
ES 2 166 361 T3
44
ES 2 166 361 T3
45
ES 2 166 361 T3
46
ES 2 166 361 T3
47
ES 2 166 361 T3
48
ES 2 166 361 T3
49
ES 2 166 361 T3
50