El gen de las sombras

Tomate de árbol (Solanum betaceum (Cav.) Sendtn.), especie frutal nativa de los Andes americanos.
Fotografía: Laura Pulido - Área de Comunicaciones, Gimnasio Campestre.
6
El gen
de las sombras
El Astrolabio
7
ARTÍCULO
oRIGINAL
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE
LA REGIÓN 3’
DE UN GEN QUE CODIFICA UNA POLIFENOL OXIDASA
(PPO) EN TOMATE DE ÁRBOL
(Solanum betaceum (Cav.) Sendtn.)
Roberto Carlos Lenis Posada 1 y Mauricio Pulido Jiménez
2
1. Estudiante 11º grado - Investigador CEBM, Gimnasio Campestre. 2. Director CEBM, Gimnasio Campestre.
Correspondencia para el autor: [email protected]
RESUMEN
Recibido: 16 de abril de 2012
Aceptado: 18 de mayo de 2012
SUMMARY
Se aisló un fragmento de DNA genómico
correspondiente a la región 3’ de un
gen que codifica una polifenol oxidasa
(PPO) de hojas de tomate de árbol, y se
determinó su secuencia de nucleótidos.
El contenido de guaninas-citosinas del
fragmento es de 45,16%, valor que se
encuentra dentro del rango que ha
sido determinado para los genes ppo
de otras solanáceas. Un fragmento de
proteína de 213 aminoácidos se dedujo
a partir de la secuencia nucleotídica
determinada. La secuencia caracterizada
muestra similitudes superiores a 78% y
72% a nivel de nucleótidos y aminoácidos
respectivamente con genes y proteínas
PPO de berenjena, papa, tomate, lulo y
tabaco.
A fragment of genome DNA corresponding
to the 3’ gene region which encodes a
polyphenol oxidase (PPO) from the leaves
of tree tomato was isolated and their
nucleotide sequence was determined.
The guanine-citosine fragment content
is 45.16%, a value found within the rank
determined for other solanaceae ppo
genes. A protein fragment of 213 amino
acids was deduced from the nucleotide
sequence. The characterized sequence
shows similarities higher than to 78%
and 72% at nucleotide and amino acid
levels respectively, with genes and PPO
proteins from eggplant, potato, tomato,
lulo and tobacco.
Palabras clave: pardeamiento
enzimático, polifenol oxidasa,
Solanum betaceum, silenciamiento
de genes, RNA antisentido.
Key words: enzymatic browning,
polyphenol oxidase, Solanum
betaceum, gene silencing, antisense
RNA.
Investigación y Ciencia del Gimnasio Campestre
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INTRODUCCIÓN
El tomate de árbol (Solanum betaceum
(Cav.) Sendtn.), perteneciente a la familia Solanaceae al igual que la papa,
el tomate, el tabaco y la uchuva, es una
especie frutal originaria de los Andes de
Colombia, Perú y Ecuador (Heiser, 1985),
que comenzó a ser considerada como
promisoria para la exportación a los mercados de Europa y Estados Unidos a partir
de la década de los 70. Sin embargo, en
Colombia la productividad del cultivo
alcanza niveles que están por debajo
del rendimiento potencial, debido a la
baja oferta tecnológica disponible para
la especie y a que los esfuerzos de investigación y fomento se han canalizado
hacia cultivos tradicionales relacionados
con la seguridad alimentaria del país,
la industria y la generación de divisas.
En el 2010 la superficie cultivada con
tomate de árbol en Colombia fue de
7.504 hectáreas, con una producción de
122.519 toneladas y un rendimiento de
16,3 toneladas/hectárea. Actualmente
el área cultivada y la producción crecen
a una tasa promedio anual de 2,9% y 3%
respectivamente. Excluyendo plátano y
banano, en el 2010 el tomate de árbol
se constituyó en el quinto producto
frutícola colombiano de exportación (297
toneladas) después de la uchuva (4.254
ton.), el banano bocadillo (3.855 ton.),
la granadilla (706 ton.) y la pitahaya (326
ton.) (Agronet, 2012).
A la baja tasa de productividad del cultivo se suma que la comercialización de
aproximadamente el 50% de la producción nacional se ve considerablemente
afectada por los daños ocasionados por
un fenómeno cuyas características son
muy similares a las del pardeamiento
El Astrolabio
enzimático. Este evento bioquímico,
también conocido como oxidación biológica, es el principal causante del
deterioro de características como color,
sabor y aroma en la gran mayoría de
frutas y verduras de importancia agrícola y económica, hecho que limita de
manera significativa la posibilidad de
comercialización del producto, ya sea
para el consumo en fresco o para el procesamiento industrial (McEvily, Iyengar,
& Otwell, 1992). El fenómeno es provocado por la actividad de una familia de
enzimas denominadas polifenol oxidasas
(PPO), que están confinadas dentro de
los plastidios de las células vegetales y
se liberan al citoplasma una vez se ha
producido daño en la estructura celular
de los tejidos como consecuencia del
impacto mecánico, ocasionado durante
la recolección de la cosecha y la manipulación poscosecha de los frutos (Vaughn &
Duke, 1981; Vaughn, Lax, & Duke, 1988).
El método más utilizado para controlar
el pardeamiento enzimático es la adición
de agentes químicos antioxidantes tales
como los sulfitos (Martínez & Whitaker,
1995). Sin embargo, recientes estudios
efectuados por la Administración de
Drogas y Alimentos de los Estados Unidos
han demostrado que dichas sustancias
representan un riesgo considerable para
la salud humana (Timbo, Koehler, Wolyniak, & Klontz, 2004). Por tal razón, la
búsqueda de alternativas de naturaleza
biotecnológica a este problema ha cobrado gran importancia a nivel mundial.
Para implementar una de tales opciones
conocida como silenciamiento de genes
mediante RNA antisentido, se requiere
aislar un gen o parte de un gen ppo.
Puesto que en las especies vegetales
económicamente importantes, en las
9
que se observa este hecho, se han encontrado genes que codifican proteínas
PPO (Newman, Eannetta, Yu, Prince, de
Vicente, Tanksley, & Steffens, 1993; Thygesen, Dry, & Robinson, 1995; Goldman,
Seurinck, Marins, Goldman, & Mariani,
1998), se presume que la alteración anteriormente referida en tomate de árbol es
pardeamiento enzimático. Sin embargo,
hasta hace muy poco tiempo no se tenía
ninguna evidencia de la presencia de este
tipo de genes en la especie. Ortegón y
Pulido (2011) identificaron el extremo 5’
de uno de tales genes. En este trabajo se
reporta el aislamiento y caracterización
molecular del extremo 3’ del gen anteriormente encontrado.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal: El tejido empleado en
el estudio se obtuvo de plantas de tomate de árbol (Solanum betaceum (Cav.)
Sendtn.) y papa (Solanum tuberosum
L., var. Millenia). Semillas de tomate de
árbol provenientes de los bancos de germoplasma de CORPOICA se sembraron en
macetas con turba como sustrato; tanto
la germinación de las semillas como el
desarrollo de las plántulas se dieron bajo
condiciones de invernadero. El material
vegetal de papa se colectó de plantas
pertenecientes a la Colección Central
Colombiana encontradas en el campo.
Cultivo de Escherichia coli cepa DH5α:
La bacteria se cultivó en medio LuriaBertani (LB) líquido a 37 oC y agitación
(250 r.p.m.) durante 8 horas.
Extracción y purificación de DNA genómico de tomate de árbol, papa y E. coli:
El DNA genómico de tomate de árbol y
papa se aisló a partir de hojas jóvenes,
empleando el protocolo reportado por
Doyle y Doyle (1990). El DNA genómico de
E. coli se extrajo utilizando el procedimiento reportado por Chen y Kuo (1993).
Evaluación de la integridad y cuantificación de los DNAs genómicos: Alícuotas
de los DNAs y del marcador de masa molecular High DNA Mass Ladder (Invitrogen,
USA) fueron sometidas a electroforesis
en gel de agarosa 1%. El gel se fotografió
y la imagen se analizó con el programa
GeneTools (Syngene, USA).
Diseño de los iniciadores para PCR: Las
secuencias nucleotídicas de los genes
ppo, previamente reportadas en tomate,
papa, tabaco, batata, durazno, manzana, pera y haba, se alinearon utilizando
el programa Clustal X versión 2.0.9
(Larkin, Blackshields, Brown, Chenna,
McGettigan, McWilliam, Valentin, Wallace, Wilm, López, Thompson, Gibson, &
Higgins, 2007), con el fin de identificar la
región hacia el extremo 3’ que mostrara
el mayor grado de conservación posible.
Una vez determinada dicha región, se
utilizaron el gen ppo-F de tomate (como
gen de referencia) y el programa Oligo
versión 6.71 (Rychlik & Rhoads, 1989;
Rychlik, Spencer, & Rhoads, 1990) (Molecular Biology Insights, Inc., USA) para
diseñar los iniciadores que permitieran
amplificar un fragmento de aproximadamente 950 pares de bases (pb.) a partir
de DNA genómico de tomate de árbol. La
especificidad del posicionamiento de los
iniciadores sobre la región seleccionada
se verificó analizándolos con el programa
BLAST (Altschul, Gish, Miller, Myers, &
Lipman, 1990).
Amplificación por PCR de un fragmento
del gen ppo de tomate de árbol: Para
determinar las condiciones óptimas que
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10
permitieran la amplificación de un fragmento ubicado hacia el extremo 3’ del
gen ppo de tomate de árbol, se ensayaron diversas concentraciones de iniciadores, cloruro de magnesio (MgCl2) y DNA.
De otro lado, se evaluaron programas de
amplificación con diferentes temperaturas de anillaje y períodos de extensión.
Una vez estandarizadas las condiciones
de amplificación, el producto de PCR
se sometió a electroforesis en gel de
agarosa 1% para verificar su tamaño y la
especificidad de la amplificación.
Purificación y cuantificación del fragmento amplificado: El fragmento amplificado por PCR fue purificado empleando
el sistema Wizard SV Gel and PCR CleanUp System (Promega, USA). La concentración del mismo se determinó utilizando
el método descrito anteriormente.
Secuenciación del fragmento aislado:
La secuencia de nucleótidos del fragmento aislado se obtuvo empleando el
método de terminación de cadena con
dideoxinucleótidos (Sanger, Nicklen, &
Coulson, 1977) y los mismos iniciadores
diseñados para producirlo (InfPPO-F y
PPO-Rv). El fragmento se secuenció dos
veces por cada extremo con el fin de
confirmar las secuencias logradas.
Secuencia consenso del fragmento
aislado: Las secuencias correspondientes tanto a la cadena positiva como a la
negativa del fragmento aislado fueron
alineadas empleando el programa CodonCode Aligner versión 2.0.4 (CodonCode
Corporation, USA), para generar una
secuencia consenso definitiva.
Identificación de marcos de lectura
abiertos en el fragmento secuenciado:
Para identificar los posibles marcos de
El Astrolabio
lectura abiertos en el fragmento aislado
se utilizó el programa ORF Finder (NCBI,
USA).
Análisis de similitud con genes y proteínas PPO previamente reportadas: La
secuencia de nucleótidos consenso y la
secuencia de aminoácidos, derivada de
la primera, fueron comparadas con las
bases de datos empleando el programa
BLAST, con el fin de determinar el grado
de similitud de estas respecto a los genes
y proteínas PPO, previamente reportados
en otras especies.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Iniciadores para PCR
Los trabajos sobre la estructura de los
genes ppo en papa (Hunt, Eannetta, Yu,
Newman, & Steffens, 1993) y tomate
(Newman et al., 1993) han señalado que
el tamaño de estos oscila entre 1300 y
1900 pb. y que las secuencias que flanquean los extremos 5’ y 3’ muestran un
alto grado de divergencia, incluso entre
genes pertenecientes a la misma especie.
Considerando la variabilidad existente en
los extremos de la región que se pretendía amplificar y buscando iniciadores
con características que permitieran un
posicionamiento altamente específico
en los sitios previamente determinados,
se diseñaron oligonucleótidos con degeneración en varias posiciones.
Para amplificar por PCR el fragmento de
DNA, localizado hacia el extremo 3’ del
gen ppo de tomate de árbol, se diseñaron los iniciadores InfPPO-F (directo) (5’
CAAWTGRTNACTAAKGCTCC 3’) y PPO-Rv
(reverso) (5’ TTAACAATCCKCAAGCTTGAT
3’). Las características de los iniciadores
diseñados se muestran en la tabla 1.
11
El análisis BLAST hecho para los dos iniciadores diseñados permitió determinar
las posiciones en las que estos se ubican
en los genes ppo de otras especies y el
tamaño del producto de PCR que permiten obtener (tabla 2).
Los resultados del anterior análisis demuestran que los sitios en los cuales
se posicionan los dos iniciadores varían
incluso en los genes ppo de la misma
especie; ello implica que la longitud de
los fragmentos que se pueden amplificar
con estos iniciadores también presenta
diferencias. Aunque el tamaño de los
genes ppo oscila entre 1300 y 1900 pb. y
muestran un nivel considerable de divergencia en la secuencia de la región 3’, el
análisis muestra que también presentan
variaciones en otras regiones. De otro
Iniciador
InfPPO-F
PPO-Rv
Longitud (pb.)
20
21
lado, el hecho de que los iniciadores diseñados para este estudio encuentren en el
DNA de tomate, papa y tabaco secuencias
pertenecientes a genes ppo, sobre las
que puedan posicionarse de manera muy
específica, demuestra que el método
utilizado para el diseño de estos es muy
efectivo. De todo lo anterior, se deriva
que el uso de esta pareja de iniciadores
sobre los genomas de tomate de árbol
y otras especies vegetales garantiza la
amplificación exclusiva de fragmentos
correspondientes a genes ppo.
Amplificación del fragmento correspondiente al gen ppo de tomate de árbol
Los análisis de PCR virtual, realizados
con el programa Oligo 6.71, permitieron
establecer que el tamaño del producto
Posición degenerada
nucleótidos 4, 7, 9 y 15
nucleótido 11
% G-C
36,4
38,0
Tm (oC)
63,5
67,0
Tabla 1. Características de los iniciadores diseñados para amplificar un fragmento ubicado hacia el extremo 3’ del gen ppo de
tomate de árbol.
Especie
Gen
Tamaño gen
(pb.)
Lugar posicionamiento
iniciadores
Tamaño producto PCR (pb.)
Tomate
ppo-A
1893
881 - 1762
901
Tomate
ppo-B
1791
884 - 1771
908
Tomate
ppo-C
1881
869 - 1750
901
Tomate
ppo-D
1776
869 - 1756
908
Tomate
ppo-E
1764
878 - 1744
887
Tomate
ppo-F
1758
878 - 1738
881
Papa
ppo-POT 32
1794
887 - 1774
908
Papa
ppo-POT 33
1800
893 - 1780
908
Papa
ppo-A
1752
866 - 1732
887
Papa
ppo-B
1767
881 - 1747
887
Tabaco
ppo
1781
886 - 1761
896
Tabla 2. Sitios de posicionamiento de los iniciadores diseñados para este estudio sobre genes ppo de diferentes especies y
tamaño de los productos de PCR que permiten generar.
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12
de amplificación debía estar entre 880 y
910 pb. Los iniciadores InfPPO-F y PPORv permitieron amplificar un fragmento
de aproximadamente 950 pb. (figura 1) a
partir de los genomas de tomate de árbol
y papa. Después de evaluar diferentes
concentraciones de magnesio, con el fin
de optimizar la amplificación del fragmento, se determinó que el valor óptimo era
4,5 mM. Los ensayos de estandarización
de la temperatura de anillaje cubrieron el
rango entre 56 y 59 oC. Los mejores resultados se obtuvieron utilizando 57 oC. Las
condiciones de reacción óptimas bajo las
cuales se logró amplificar el fragmento
se presentan en la tabla 3. El programa
de ciclaje utilizado se presenta en la
tabla 4.
Reactivo
H2O
Buffer PCR
MgCl2
dNTP’s
Iniciador SupPPO-F
Iniciador SupPPO-L
DNA (dil 1:10)
Taq Polimerasa
Volumen final
Concentración inicial
5X
25 mM
2.5 mM
10 μM
10 μM
5 U/μL
Secuencia del fragmento de gen ppo de
tomate de árbol.
El método de terminación de cadena con
dideoxinucleótidos permitió determinar
una secuencia de 941 nucleótidos (figura
2). La diferencia observada entre el tamaño del fragmento amplificado por PCR
(950 pb. aprox.) y el resultado arrojado
por el procedimiento de secuenciación
(941 pb.) obedece a que la técnica no
logra resolver eficientemente los nucleótidos de los extremos de las cadenas de
DNA que se producen durante la reacción
de secuencia.
El fragmento de 941 pares de bases está
constituido por 234 adeninas (24,86%),
Concentración final
1X
4.5 mM
0.2 mM
0.25 μM
0.25 μM
-
Volumen/Reacción
9.05 μL
5.00 μL
4.50 μL
2.00 μL
0.62 μL
0.62 μL
3.00 μL
0.20 μL
25.0 μL
Tabla 3. Condiciones de reacción utilizadas en la amplificación por PCR del fragmento de 950 pb. del gen ppo a partir de DNA
genómico de tomate de árbol.
12 3 45
Etapa
950 pb.
1000 pb.
Figura 1. Productos de amplificación por PCR de 950 pb.
correspondientes a genes ppo. Línea 1: blanco; Línea 2: genoma de E. coli (control negativo); Línea 3: genoma de papa;
Línea 4: genoma de tomate de árbol; Línea 5: marcador de
peso molecular.
El Astrolabio
Denaturación Inicial
Amplificación
Denaturación
Anillaje
Extensión
Extensión final
Temperatura /
Tiempo
o
94 C X 4 min.
94 oC X 1 min.
57 oC X 45 seg.
72 oC X 75 seg.
72 oC X 7 min.
Número
de ciclos
1
45
1
Tabla 4. Programa de ciclaje utilizado en la amplificación
por PCR del fragmento de 950 pb. del gen ppo a partir de
DNA genómico de tomate de árbol.
13
GCGAGACTTCACCACCATTCTTTGGTACCAGAGTCACCGCAATAGTGTTTTCATCTTCCAGGCCAATGTCCTCCAACAGTTCAGTTATCGCCAGCTGCAAAGTAGCACTCGCAACATGATCAGAATCATTAGCTTGGTGAACATGTGGCAAGCTAGTATAGCTCCCCGCGAACTCTATCATGTCAAGCTCATCCGCTTTCACGTTCTTGTCCACGTTCAGGAACACATCGAACCTTACATATTCTCTATTATCATATTTTATGTAGTTGAATGTTAGTAACTCCTCTTGTTCATTCTTCTCCTGTTGAGTCCTCGAGGAGGCCGGCCTATTGATGGAAAACGAAATGGCTTTGTCCAGCTTAAAGATTGGGAATACCTTGCTCGCTTGCAGAAGTGAACCTGTATTCACTTTCCCATCTGCTTTCTTTTTGTTTGGCTTGAAGTTACACCATGGGGTGGGCATTGGTGCGTAATCGTACCCCATCTTCTTCGTGTCCAAACAGTCTCGTACTTTCACGAGGTAAGGATTTTTGTTTTCATCGTGGAAAAAAAATTTGGAGACCAAACAGTCTTTATGTGAAAGATTCCTTCTTTTCCCTCCGATTTGTTTCAATTCATTCGAGAATAACGCGGGGGCCATAAAAAACCAGCTGCCTCATGACTGACTCTGAGGCGCGAAAAACGTGANGATCCAACGGGATTCCATACCCTGAAACTCCATGCTGTAAACTACGTGTGCTGTATGTTGGGCAACTTAGTTGTTCAATGCCACACCTCCCGCGAGTAACCACACCATCTGTAAAATACAGACGTAACGTTGAAACTCACAGAGCTGACGGGTTGCGTCTACCCTCGTAACAACCTGACACTTTCTTTCCAAGCATGCGCAGATCCTTACAAGGCCTTGTATGCCTATGCCTGTGTCCAACTAGGGCTTTTNC
Figura 2. Secuencia de nucleótidos correspondiente al fragmento del gen ppo identificado en tomate de árbol (941 pb).
Especie
Tom. Árbol
Tomate
Tomate
Tomate
Tomate
Tomate
Tomate
Papa
Papa
Papa
Papa
Papa
Papa
Tabaco
Batata
Batata
Durazno
Pera
Haba
Manzana
Manzana
Gen
ppo
ppo A
ppo B
ppo C
ppo D
ppo E
ppo F
pot 32
pot 33
pSP32
ppo A
ppo B
pSRP33
ppo
ppo
ppo -1
ppo
ppo
ppo -1
ppo -1
ppo -2
Tamaño gen (pb.)
941
1893
1791
1881
1776
1764
1758
1794
1800
1325
1752
1767
1315
1781
1767
1767
1794
1359
1821
1782
1782
Adenina
234
530
519
529
513
498
491
517
537
375
501
507
391
491
420
419
485
350
602
463
462
Citosina
237
379
370
365
366
379
365
366
376
251
367
367
251
409
523
525
512
351
353
462
472
Guanina
188
420
399
437
409
374
382
401
377
311
378
377
297
389
475
478
437
367
338
475
459
Timina
280
564
503
550
488
513
520
510
510
388
506
516
376
492
349
345
360
291
528
382
389
% G+C
45,16
42,20
42,94
42,63
43,64
42,69
42,49
42,75
41,83
42,41
42,52
42,10
41,67
44,80
56,48
56,76
52,90
52,83
37,94
52,58
52,24
Tabla 5. Contenido de nucleótidos y porcentaje de guaninas y citosinas (%GC) en genes ppo de especies económicamente
importantes pertenecientes a las familias Solanaceae, Rosaceae y Fabaceae.
237 citosinas (25,18%), 188 guaninas
(19,97%) y 280 timinas (29,75%). El contenido de guaninas-citosinas (%GC) de
este fragmento es 45,16%, valor que se
encuentra dentro del rango que ha sido
determinado previamente para los genes
de solanáceas como papa y tomate, que
oscila entre 40 y 45% (Rensink, Lee, Liu,
Iobst, Ouyang, & Buell, 2005). El %GC
específico para genes que codifican PPO
(tabla 5) en tomate y papa oscila entre
41,67% y 43,64%; en tabaco es 44,80%,
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14
levemente superior al mostrado en las
dos especies anteriores, y para el caso
de manzana, pera, durazno y batata -las
tres primeras pertenecientes a la familia
Rosaceae y la última a la familia Convolvulaceae- los valores se encuentran entre
52,24 y 56,48% respectivamente. El valor
más bajo encontrado en la comparación
corresponde a haba (37,94%), especie
perteneciente a la familia Fabaceae.
La comparación de la secuencia de 941
pb. encontrada en tomate de árbol con
los genes ppo de otras especies reveló valores de identidad elevados con los genes
de especies pertenecientes a la familia
Solanaceae (tabla 6). El porcentaje de
identidad que arrojó el análisis BLAST,
definido como el grado de invariabilidad
que presentan dos secuencias -de nucleótidos o proteínas- al ser comparadas,
puede ser asumido como una medida de
la similitud existente entre las mismas
(Altschul et al., 1990).
Descripción del gen
ppo-3 berenjena (Solanum melongena) ppo-2 berenjena (Solanum melongena) ppo-1 berenjena (Solanum melongena) ppo alelo pot33 papa (Solanum tuberosum)
ppo alelo pot32 papa (Solanum tuberosum)
ppo-B tomate (Solanum lycopersicum)
ppo-D tomate (Solanum lycopersicum)
ppo alelo pot72 papa (Solanum tuberosum)
ppo-C tomate (Solanum lycopersicum)
ppo-A tomate (Solanum lycopersicum)
ppo tabaco (Nicotiana tabacum)
ppo-E tomate (Solanum lycopersicum)
ppo-B papa (Solanum tuberosum)
ppo-6 berenjena (Solanum melongena) ppo-5 berenjena (Solanum melongena) ppo-A papa (Solanum tuberosum)
ppo-F tomate (Solanum lycopersicum)
ppo lulo (Solanum quitoense)
ppo caqui (Diospyros kaki) El grado de similitud existente entre
la secuencia encontrada en tomate de
árbol y los genes ppo-1, ppo-2 y ppo-3
de berenjena y los alelos pot32 y pot33
de papa (tabla 6) osciló entre 81 y 88%
mientras que con los genes ppo-A, ppo-B,
ppo-C y ppo-D de tomate y el alelo pot72
de papa fue de 80%. Con respecto a los
genes ppo de tabaco, ppo-E y ppo-F de
tomate, ppo-A y ppo-B de papa, ppo-5 y
ppo-6 de berenjena y los de lulo y caqui
(Diospyros kaki L.), especie frutal de la
familia Ebenaceae, la similitud estuvo
en el rango entre 76 y 79%.
En la tabla 6 se observa que los valores
E arrojados por el análisis BLAST se presentan en orden numérico ascendente
mientras que los porcentajes de identidad se muestran en orden descendente.
Ello responde a que el valor E representa
el número de alineamientos que se puede
Valor E
0.0
0.0
0.0
2e-175
1e-159
5e-158
8e-156
6e-151
1e-147
1e-147
3e-141
2e-138
2e-138
3e-135
5e-133
2e-130
1e-120
2e-118
3e-91
% Identidad
88%
84%
84%
83%
81%
80%
80%
80%
80%
80%
79%
78%
78%
78%
78%
77%
76%
76%
76%
Tabla 6. Valores de identidad entre la secuencia de 941 pb. identificada en tomate de árbol y genes ppo reportados en otras
especies.
El Astrolabio
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esperar que ocurran por azar entre la
secuencia en estudio y cualquiera otra
de las existentes en la base de datos. Por
lo tanto, entre más cercano a cero sea
el valor E, más significativo es el alineamiento entre la secuencia que se analiza
y la secuencia relacionada (Altschul, et
al., 1990). Los valores E más bajos que
arrojó la comparación de la secuencia
estudiada con la base de datos de genes
correspondieron a los alineamientos con
los genes ppo reportados en berenjena,
papa y tomate, especies emparentadas
con tomate de árbol. Sin embargo, llama
la atención que se presente un valor E
bastante bajo respecto al caqui, especie
perteneciente a una familia que hace
parte del orden de las Ericales, filogenéticamente distante de las solanáceas.
El programa ORF Finder permitió determinar que dentro de la secuencia
nucleotídica identificada hay un marco
de lectura abierto de 639 nucleótidos
en la cadena positiva, que se inicia en
la posición 2 y se extiende hasta la posición 640. La proteína deducida tiene 213
aminoácidos (figura 3).
El análisis BLAST para la secuencia de
aminoácidos deducida del fragmento de
941 pb. reveló valores de similitud que
MAPALFSNELKQIGGKRRNLSHKDCLVSKFFFHDENKNPYLVKVRDCLDTKKMGYDYAPMPTPWCNFKPNKKKADGKVNTGSLLQASKVFPIFKLDKAISFSINRPASSRTQQEKNEQEELLTFNYIKYDNREYVRFDVFLNVDKNVKADELDMIEFAGSYTSLPHVHQANDSDHVASATLQLAITELLEDIGLEDENTIAVTLVPKNGGEVS
Figura 3. Secuencia de aminoácidos de la proteína deducida a partir del fragmento de 941 pb. identificado en tomate de árbol.
Descripción de la proteína
prePPO-3 berenjena (Solanum melongena)
prePPO-1 berenjena (Solanum melongena)
prePPO-2 berenjena (Solanum melongena)
PPO-B tomate (Solanum lycopersicum)
PPO POT33 papa (Solanum tuberosum)
PPO POT72 papa (Solanum tuberosum)
PPO-E tomate (Solanum lycopersicum)
PPO tabaco (Nicotiana tabacum)
PPO-P2 tomate (Solanum lycopersicum)
prePPO-5 berenjena (Solanum melongena)
PPO POT32 papa (Solanum tuberosum)
PPO-D tomate (Solanum lycopersicum)
prePPO-B papa (Solanum tuberosum)
prePPO-6 berenjena (Solanum melongena)
PPO-F tomate (Solanum lycopersicum)
PPO-C tomate (Solanum lycopersicum)
PPO-A tomate (Solanum lycopersicum)
prePPO-A papa (Solanum tuberosum)
PPO lulo (Solanum quitoense)
PPO caqui (Diospyros kaki)
Valor E
1e-118
2e-109
8e-108
2e-106
4e-106
4e-106
2e-103
1e-102
5e-102
2e-101
5e-101
8e-101
1e-99
1e-99
5e-99
1e-98
2e-98
2e-96
3e-89
9e-73
% Identidad
84%
77%
79%
76%
77%
74%
76%
75%
75%
75%
73%
72%
74%
74%
73%
74%
74%
72%
69%
72%
Tabla 7. Valores de similitud existentes entre la proteína hipotética derivada del fragmento de 941 pb. identificado en tomate de
árbol y polifenol oxidasas reportadas en otras especies.
Investigación y Ciencia del Gimnasio Campestre
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oscilan entre 72 y 84% con la gran mayoría
de proteínas PPO de berenjena, tomate,
papa y tabaco (tabla 7). Tal como en el
análisis de la secuencia de nucleótidos,
el fragmento de proteína hipotética de
tomate de árbol muestra los niveles de
similitud más bajos respecto a las PPO
de lulo y caqui. La semejanza entre el
fragmento de proteína deducido de la
secuencia encontrada en tomate de árbol
y la PPO de caqui, una especie de la familia Ebenaceae que a su vez pertenece
al orden Ericales, puede ser el reflejo de
la relativa proximidad filogenética de los
órdenes Ericales y Solanales. Contrario a
lo observado en la región N-terminal analizada por Ortegón y Pulido (2011), esta
región de la proteína no presenta niveles
significativos de similitud con PPOs de
especies pertenecientes a las familias
Rosaceae, Fabaceae y Salicaceae.
Aunque especies como tomate de árbol,
papa, berenjena, tomate común y lulo
pertenecen al género Solanum, y el tabaco al género Nicotiana, ambos de la
familia Solanaceae, la PPO de tomate de
árbol es levemente más parecida a la PPO
de tabaco que a algunas de las presentes
en otros miembros del género Solanum.
CONCLUSIONES
Aunque una de las características que
distingue a todos los genes ppo conocidos
es la divergencia en la secuencia de su
extremo 3’, los iniciadores utilizados en
este estudio permitieron evidenciar que
existen variaciones a lo largo de toda la
secuencia de los genes ppo encontrados
en las especies de la familia Solanaceae.
Los análisis BLAST demuestran que el
diseño de los iniciadores les confiere la
El Astrolabio
capacidad de amplificar exclusivamente
genes ppo, hecho que abre la posibilidad
de que sean utilizados para estudios
similares en otras especies. La elevada
similitud del fragmento identificado,
tanto a nivel de nucleótidos como de
aminoácidos, con los genes y proteínas
PPO de berenjena, tomate, papa, lulo y
tabaco, junto con un %GC situado dentro
del rango esperado para los genes de
solanáceas, se constituyen en evidencia
de que el fragmento de DNA identificado corresponde a un gen ppo. De otro
lado, los porcentajes de similitud entre
la secuencia encontrada en tomate de
árbol y las secuencias homólogas en otras
especies (a nivel de nucleótidos o de
aminoácidos) reflejan de manera clara la
distancia filogenética existente entre los
individuos comparados. El análisis conjunto de las regiones 5’ y 3’ encontradas
en el genoma de la especie estudiada
permitirá hacer algunas predicciones
sobre las características estructurales
y funcionales de la proteína derivada
del fragmento de DNA caracterizado y
sobre los patrones de expresión de este
candidato a gen ppo. Si bien el examen
de un fragmento de DNA en términos de
su secuencia de nucleótidos, el nivel de
homología respecto a otros genes y la
existencia de secuencias que codifiquen
algún tipo de proteína pueden aportar
información valiosa, la prueba definitiva de la existencia de proteínas PPO en
tomate de árbol consiste en expresar el
gen aislado, purificar la proteína obtenida y evaluar su actividad sobre sustratos
específicos (Cary, Lax, & Flurkey, 1992;
Eicken, Zippel, Buldt-Karentzopoulos, &
Krebs, 1998), con el fin de determinar su
capacidad para catalizar las reacciones
de oxidación de orto-difenoles a ortodiquinonas.
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