Enfermedad de la frontera
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CAPÍTULO 2.10.5. ENFERMEDAD DE LA FRONTERA RESUMEN La enfermedad de la frontera (EF) es una enfermedad vírica de las ovejas descrita por primera vez en 1959 en la región fronteriza entre Inglaterra y Gales. El virus se distribuye por todo el mundo. Las tasas de prevalencia varían en las ovejas del 5 al 50% entre países y de región en región dentro de cada uno de ellos. Entre los signos destacan la esterilidad de las ovejas, la aparición de abortos y nacidos muertos y el nacimiento de corderos débiles de menor tamaño. Los corderos afectados pueden mostrar temblores musculares, deficiente desarrollo corporal y vellones anormalmente peludos (a los corderos se les llama “temblorosos peludos” o “de lana rizada”) y a la enfermedad se le ha denominado “enfermedad de los corderos temblorosos peludos”. La transmisión vertical juega un papel importante en la epidemiología de la enfermedad. La infección de los fetos puede provocar el nacimiento de corderos con infección persistente (IP). Estos corderos IP son virémicos, anticuerpo-negativos y excretan los virus de manera constante. El virus se propaga de oveja a oveja, y los animales PI son la fuente más potente de infección. Las ovejas también se pueden infectar después de un contacto próximo con vacas que excreten el virus estrechamente relacionado de la diarrea vírica bovina (BVDV). Es importante identificar los animales PI virémicos para que no sean utilizados con fines comerciales o de crianza. Las pruebas serológicas resultan insuficientes. Generalmente se considera que las ovejas no virémicas, sero-positivas son “seguras”, ya que no se conoce que se produzcan infecciones latentes en los animales recuperados. Identificación del agente: El virus de la EF (BDV) es un Pestivirus de la familia Flaviviridae y está estrechamente relacionado con el virus de la fiebre porcina clásica y el BVDV. Muy pocos aislados del BDV son citopatogénicos en cultivo celular. No existen serotipos definidos pero los aislados víricos exhiben una considerable diversidad antigénica, y se han identificado tres grupos antigénicos distintos. Aparentemente las ovejas IP sanas son el resultado de una infección congénita que se puede identificar mediante el aislamiento y la inmunotinción del virus no citopatogénico a partir de sangre o sueros en cultivos celulares de laboratorio. Entre los métodos directos de identificación rápida de las ovejas IP se encuentran la detección del antígeno vírico o del ARN vírico en leucocitos y la detección inmunohistoquímica del antígeno vírico en biopsias cutáneas. La detección del virus es menos fiable en corderos menores de dos meses que han recibido anticuerpos calostrales. Habitualmente la infección aguda es subclínica y la viremia es transitoria y difícil de detectar. Es difícil aislar el virus a partir de tejidos de corderos abortados o nacidos muertos, pero los tejidos de ovejas IP contienen niveles elevados del virus, lo que se puede detectar fácilmente mediante el aislamiento y varios métodos directos. Pruebas serológicas: Es preferible confirmar la infección aguda por el BDV demostrando la seroconversión con muestras pareadas o secuenciales procedentes de varios animales del grupo. Los métodos de detección de anticuerpos que se utilizan más habitualmente son el enzimoinmunoensayo y la prueba de neutralización vírica. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: No existe una vacuna estándar para el BDV, pero se ha preparado una vacuna comercial con el virus entero muerto. Lo ideal sería que dicha vacuna fuese adecuada para su administración a hembras antes de la crianza para prevenir la infección transplacentaria. Se ha recomendado el uso de las vacunas del BVDV, pero se debe tener en cuenta la diversidad antigénica de los virus de la EF. 1116 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera Los virus de la EF han contaminado diversas vacunas vivas modificadas de uso veterinario producidas en células de oveja o que contienen suero de oveja. Los fabricantes de los materiales biológicos deberían considerar este riesgo potencial. A. INTRODUCCIÓN El virus de la enfermedad de la frontera (BDV) es un Pestivirus de la familia Flaviviridae y está estrechamente relacionado con el virus de la fiebre porcina clásica (CSFV) y el virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) (21). Aunque se han propuesto seis especies de Pestivirus, existen cuatro especies reconocidas, a saber: CSFV, BVDV tipo 1 y 2 y BDV (1). Mientras que los CSFV se restringen principalmente a cerdos, se han recuperado a partir de ovejas ejemplos de cualquiera de las otras tres especies, siendo los aislados mayoritarios virus de la EF (27). Casi todos los aislados víricos del BDV son no citopatogénicos, aunque se han aislado virus citopáticos ocasionales (23). El BDV se propaga de forma natural entre las ovejas a través de la vía oro-nasal y por transmisión vertical. Principalmente en ovejas y cabras es causa de enfermedad congénita, pero también puede provocar infecciones agudas y persistentes. Las ovejas se pueden infectar a partir de las vacas (6). Asimismo, los cerdos pueden resultar infectados y los anticuerpos frente al BDV en cerdos pueden interferir en las pruebas de diagnóstico de la enfermedad debida al CSFV (15). Este capitulo describe la infección por el BDV en ovejas. a) Infecciones agudas Las ovejas adultas y recién nacidas sanas expuestas al BDV tan sólo experimentan una enfermedad leve o inapreciable. Aparece una fiebre ligera y una leucopenia leve que se asocian con una viremia de vida corta que se detecta entre los días 4 y 11 posteriores a la infección, después de la cual aparecen anticuerpos neutralizantes del virus en el suero (19). En las pruebas serológicas se diagnostican mejor las infecciones agudas empleando sueros pareados procedentes de un número significativo de ovejas. Se ha demostrado que algunos aislados del BDV ocasionales provocan fiebre elevada, leucopenia profunda y prolongada, anorexia, conjuntivitis, descarga nasal, disnea y diarrea y el 50% de mortalidad en los corderos jóvenes. Uno de estos aislados se recuperó a partir de una epidemia severa de la EF que afectó a ovejas lecheras en 1984 (7). Un segundo de tales aislados fue un BDV contaminante de una vacuna viva del CSFV (29). b) Infección fetal Los principales signos clínicos de la EF se observan después de la infección de ovejas gestantes. Mientras que la infección materna inicial es leve y subclínica, las consecuencias en el feto son graves. Puede provocar la muerte del feto en cualquier etapa de gestación, pero es más común en los fetos infectados durante la etapa temprana. Es posible que se produzca la reabsorción de los fetos pequeños muertos o que pueda pasar desapercibido su aborto ya que las ovejas continúan alimentándose de forma correcta y no muestran signos de malestar. Cuando se aproxima el momento de los partos, se observará el aborto de fetos mayores, nacidos muertos y el nacimiento prematuro de corderos pequeños y débiles. Frecuentemente, es difícil establecer la confirmación de que un aborto o un nacido muerto se deben al BDV, pero en algunos casos es posible aislar el virus a partir de los tejidos fetales. En los fetos abortados, también se puede detectar el virus mediante inmunohistoquímica del cerebro, tiroides y otros tejidos (20). Se debería comprobar la presencia de anticuerpos dirigidos contra el BDV en muestras de fluidos fetales o de suero. Durante el tiempo de los partos, aparecerá una cantidad excesiva de ovejas estériles, pero son los corderos vivos enfermos los que presentan los rasgos clínicos principales y característicos de la EF. Son muy variados los signos clínicos que exhiben los corderos con la EF y dependen de la raza de oveja, la virulencia del virus y el momento en el que se produce la infección en el rebaño. Habitualmente, los corderos afectados son pequeños y débiles, y muchos son incapaces de permanecer incorporados. Con frecuencia aparecen signos nerviosos y cambios de vellón. Los signos nerviosos de la EF son los rasgos más característicos. Los temblores pueden variar desde contracciones rítmicas violentas de los músculos de las patas traseras y de la espalda, a un fino temblor apenas indetectable de la cabeza, orejas y rabo. Las anormalidades del vellón son más obvias en las razas de lana suave, que desarrollan vellones peludos, especialmente en el cuello y la espalda. En los corderos afectados por la EF también se puede observar una pigmentación anormal negra o marrón del vellón. Se debe analizar la presencia del BDV y/o de anticuerpos dirigidos contra él en muestras de sangre que se deberían recoger en anticoagulante procedentes de corderos sospechosos antes de que reciban el calostro. Una vez que lo han ingerido, es difícil detectar el virus hasta que tienen 2 meses y han descendido los niveles de anticuerpos maternos. Sin embargo, durante este periodo de tiempo, es posible detectar el antígeno vírico en biopsias cutáneas, mediante inmunohistoquímica y en los leucocitos. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 1117 Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera Es posible criar algunos corderos con la EF con tratamiento médico, aunque pueden tener lugar muertes en cualquier momento. Los signos nerviosos se reducen de forma gradual y pueden haber desaparecido a los 3–6 meses de vida. En los momentos de estrés puede reaparecer un andar tambaleante con debilidad y oscilación de los cuartos traseros junto con un temblor ligero de la cabeza. Frecuentemente los corderos afectados crecen con lentitud y en condiciones normales de campo, muchos morirán antes o durante el tiempo del destete. En los casos en los que las pérdidas han sido bajas y no han nacido corderos con signos evidentes de la EF, éste puede ser el primer signo que presenten de la enfermedad. Algunas infecciones fetales que se producen en la etapa media de la gestación pueden provocar signos nerviosos graves en los corderos, problemas locomotores y esqueletos anormales. Estos corderos presentan lesiones de hipoplasia cerebelar y displasia, hidronencefalia y porencefalia (NOTA DEL TRADUCTOR: he buscado el significado de porencefalia en diccionarios medicos ingleses y españoles y no aparece) como resultado de una inflamación necrotizante. Las lesiones destructivas graves parecen estar mediadas por anticuerpos, y con frecuencia los corderos con tales lesiones presentan concentraciones elevadas de anticuerpos en el suero dirigidos contra el BDV. La mayoría de los corderos infectados en la etapa final de gestación son normales y están sanos y nacen libres del virus pero presentan anticuerpos frente al BDV. Algunos de estos corderos pueden estar débiles y es posible que mueran tempranamente (2). c) Viremia persistente Cuando los fetos sufren una infección que se produce antes del inicio de la inmunocompetencia, nacen con una viremia persistente. El feto ovino puede responder por primera vez a un estímulo antigénico aproximadamente entre los días 60 y 85 de su periodo de gestación de 150 días. En los fetos afectados antes del inicio de la inmunocompetencia, se produce una replicación vírica incontrolada y es común la muerte del 50% de los fetos. En los corderos que sobreviven a la infección producida en la etapa temprana de gestación, el virus se propaga a todos los órganos. Estos corderos parecen ser tolerantes al virus y presentan una infección persistente, normalmente de por vida. Una muestra de sangre precalostral será virus-positiva y anticuerpo-negativa. Típicamente, no existe reacción inflamatoria y los cambios patológicos más característicos se aprecian en el sistema nervioso central (CNS) y en la piel. Existe una deficiencia de mielína en todo el CNS lo que provoca los signos nerviosos. En la piel, los folículos primarios de lana aumentan de tamaño y decrece el número de folículos secundarios de lana, lo que causa el vellón peludo o hirsuto. Las ovejas con viremia persistente se pueden diagnosticar mediante el aislamiento/detección del virus en muestras de sangre. La viremia es detectable fácilmente en cualquier momento excepto durante los primeros 2 meses de vida, cuando el virus está enmascarado por los anticuerpos calostrales (sin embargo, durante este periodo el virus se puede identificar en leucocitos lavados), y en animales mayores de 4 años, algunos de los cuales desarrollan niveles reducidos de anticuerpos anti-BDV (13). Aunque resulta difícil la detección vírica en la sangre durante una infección aguda, se debería confirmar la viremia persistente volviendo a realizar pruebas a los animales después de un intervalo de al menos 3 semanas. Algunas ovejas virémicas sobreviven a la madurez sexual y se utilizan para la crianza. Los corderos nacidos de estas hembras progenitoras infectadas son siempre virémicos persistentes. Las ovejas virémicas persistentes constituyen una fuente continua de virus infecciosos para otros animales y su identificación es un factor primordial en cualquier programa de control. Las ovejas que van a ser comercializadas deben ser examinadas para garantizar la ausencia de viremia del BDV. Habitualmente, los carneros infectados de manera persistente (PI) tienen un semen de baja calidad altamente infectivo y presentan una fertilidad reducida. Todos los carneros utilizados para la crianza deberían ser examinados para descartar una infección persistente del BDV en muestras de sangre. También se pueden examinan las muestras de semen, pero el aislamiento vírico es mucho menos satisfactorio que el obtenido a partir de sangre debido a la toxicidad del semen para los cultivos celulares. Puede ser justificable la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa de trascripción inversa (RT-PCR) para detectar el ácido nucleico del pestivirus en el semen procedente de algunos carneros. d) Inicio tardío de la enfermedad en ovejas con viremia persistente Algunas ovejas IP alojadas separadamente de otros animales desarrollan de forma espontánea descargas nasales y oculares excesivas, debilitantes e incurables, a veces con dificultad respiratoria. En la necropsia estas ovejas tienen un serio engrosamiento del íleo distal, ciego y colon resultado de una enteropatía hiperplástica focal. El BDV citopático se puede recuperar a partir del intestino de estos corderos. Al no existir una fuente externa obvia del virus citopático, lo más probable es que tales virus se originen a partir de los virus propios del cordero. Otras ovejas IP del grupo no desarrollan la enfermedad. Este síndrome, que también se ha reconocido en brotes de campo ocasionales de la EF, presenta varias similitudes con la enfermedad mucosal bovina (13). 1118 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1. Identificación del agente (prueba prescrita para el comercio internacional) No existe un laboratorio de referencia de la OIE designado para el BDV, pero los laboratorios de referencia para el BVDV o para el CSFV podrán aconsejar de forma adecuada (véase Cuadro de la Parte 3 de este Manual sobre animales terrestres). Uno de los métodos que se ha comprobado que es más sensible para identificar el BDV sigue siendo el aislamiento vírico. También son métodos adecuados para identificar animales infectados por el BDV las técnicas de inmunofluorescencia directa u otras inmunohistoquímicas que emplean secciones congeladas de tejidos así como la RT-PCR y el enzimoinmunoensayo (ELISA) para detectar el antígeno. a) Aislamiento vírico Es esencial que los laboratorios que realicen el aislamiento del virus tengan un suministro garantizado de células susceptibles y suero bovino fetal (FBS), o equivalente, libres de pestivirus, que no contengan actividad anti-pestivirus ni contaminación vírica. Es importante que se siga un programa que garantice la calidad del laboratorio. Se puede aislar el virus en distintos cultivos celulares primarios o secundarios (p.ej. riñón, testículo, pulmón). Son raras las líneas celulares ovinas para la replicación del BDV. Pueden ser útiles las líneas celulares semicontinuas derivadas de músculo de cordero fetal (FLM), embriones completos (19) o plexo coroideo de oveja, pero las diferentes líneas varían de manera considerable en su susceptibilidad frente al virus. Se han utilizado con éxito células ovinas para el aislamiento y replicación de los virus de la EF y del BVDV de los tipos 1 y 2 a partir de ovejas. En las regiones en las que las ovejas pueden infectarse con los BVDVs a partir de vacas, lo más adecuado sería utilizar un sistema de aislamiento vírico con células tanto ovinas como bovinas. Se pueden sugerir diversos cultivos celulares bovinos, entre los cuales están las células de cornete nasal, traqueales embrionarias o testiculares, o bien una línea celular continua susceptible de riñón. Sin embargo, las células bovinas son insensibles para el aislamiento primario y la multiplicación de algunos virus de la EF, por lo que se desaconseja la dependencia exclusiva de células bovinas. A partir de los animales vivos, se puede analizar el suero para detectar la presencia del virus infeccioso, pero la forma más sensible para confirmar una viremia de pestivirus consiste en lavar leucocitos repetidamente (al menos tres veces) con el medio de cultivo antes de co-cultivarlos con las células susceptibles durante 5–7 días. Las células se congelan y descongelan una vez y se pasa una alícuota a células susceptibles posteriores crecidas en un cubreobjetos. Las células se tiñen, tres días más tarde, para detectar la presencia de pestivirus utilizando una prueba de inmunofluorescencia o de inmunoperoxidasa. Se deberían recoger los tejidos a partir de los animales muertos en un medio de transporte vírico (10% [w/v]). En el laboratorio, los tejidos se trituran, se centrifugan para eliminar los residuos y el sobrenadante se pasa a través de filtros de 0,45 µm. Las lesiones de bazo, tiroides, timo, riñón, cerebro, ganglios linfáticos e intestino son las mejores para el aislamiento vírico. Se puede examinar el semen para determinar la presencia del BDV, pero el semen sin tratar es fuertemente citotóxico y se debe diluir, normalmente se diluye 1/10 como mínimo en el medio de cultivo. Como la principal fuente de semen infectado por el BDV procede de carneros IP, para identificar estos animales es más fiable la sangre que el semen como muestra clínica. Existen muchas variaciones en los procedimientos de aislamiento vírico. Se deberían optimizar todos ellos para alcanzar la máxima sensibilidad utilizando una preparación vírica estándar de referencia y, cuando sea posible, aislados recientes de campo del BDV. A continuación se describe un procedimiento práctico para el aislamiento en tubo: i) Los cultivos de los tubos de ensayo con monocapas subconfluentes o casi confluentes de células ovinas susceptibles se lavan al menos dos veces con solución salina balanceada de Hanks para eliminar el medio de cultivo antes de inocularlos con 0,2 ml de muestra y conseguir la adsorción durante 2 horas a 37°C. ii) Se lavan los cultivos con 2 ml de medio. Se elimina y se añade 1 ml de medio de cultivo de mantenimiento. iii) Los cultivos se incuban durante 5–7 días a 37°C. Se examinan al microscopio diariamente y se registra la evidencia de efecto citopático (ECP). iv) Los tubos se congelan a –70°C, y posteriormente se descongelan, como antes y se pasan a cultivos frescos en tubo que contengan células creciendo sobre cubreobjetos. v) Se sacan los cubreobjetos 3–4 días más tarde, se fijan con acetona fría durante 15 minutos y se tiñen empleando un método de inmunofluorescencia directa o indirecta. Los controles esenciales deben Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 1119 Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera incluir células negativas conocidas y células creciendo con cepas estándares citopáticas y no citopáticas del BDV. vi) Los cubreobjetos se examinan con un microscopio UV para detectar fluorescencia citoplásmica difusa que es característica de los pestivirus. Alternativamente se pueden añadir cultivos congelados y descongelados a células que crezcan sobre portas compartimentalizados y teñirlos mediante una prueba de inmunofluorescencia directa como se ha indicado más arriba. Así mismo, se puede utilizar una tinción de inmunoperoxidasa sobre cubreobjetos o portas compartimentalizados así como placas de microtitulación (véase el método de la prueba de neutralización vírica [NV] más abajo). También se pueden ensayar cultivos congelados y descongelados mediante un sistema ELISA para la detección antigénica. b) Immunohistoquímica Es posible la detección de la presencia del antígeno vírico en la mayoría de los tejidos de los animales IP (4, 20). Esto se debería realizar con secciones de tejido congeladas y fijadas con acetona (secciones criostáticas) empleando los anticuerpos apropiados. Los tejidos con una cantidad elevada de antígeno vírico son el cerebro, la glándula tiroides y la mucosa oral. Se ha demostrado que las biopsias cutáneas son útiles para el diagnóstico in vivo de la infección persistente del BDV c) Enzimoinmunoensayo para la detección antigénica El primer ELISA para la detección antigénica de pestivirus se describió con el fin de detectar ovejas virémicas. En la actualidad se ha convertido en un ELISA de captura con sistema doble de anticuerpos monoclonales (MAbs) para utilizarlo en ovejas y vacas. Se unen dos MAbs de captura a los pocillos de las placas de microtitulación, y otros dos MAbs, conjugados con peroxidasa, sirven para detectar los primeros MAbs (9). Esta prueba es la más empleada para identificar ovejas virémicas IP utilizando leucocitos sanguíneos lisados con detergente y lavados. La sensibilidad es parecida a la obtenida mediante el aislamiento vírico y es un método práctico para la detección del virus en un gran número de muestras de sangre. Como en el aislamiento vírico, los niveles elevados de anticuerpos calostrales pueden enmascarar una viremia persistente. El ELISA es más efectivo que el aislamiento vírico en presencia de anticuerpos, pero puede dar resultados falsos negativos en corderos virémicos menores de 2 meses de edad. Habitualmente el ELISA no es suficientemente sensible para detectar infecciones agudas del BDV en muestras de sangre. Al igual que para la prueba con leucocitos, también se puede emplear el ELISA para detectar el antígeno en suspensiones de tejidos, especialmente de bazo, procedentes de ovejas sospechosas IP, como una alternativa a los métodos de inmunofluorescencia y de inmunoperoxidasa, en cultivos celulares. Se han publicado diversos métodos ELISA para pestivirus y en la actualidad se dispone de kits comerciales para detectar el BDV. La validación de estos kits está en proceso. d) Métodos de reconocimiento de los ácidos nucleicos Se han determinado las secuencias genómicas completas de dos virus de la EF y se han comparado con las de otros pestivirus (3, 17). El análisis filogenético demuestra que los virus de la EF están más estrechamente relacionados con el CSFV que con el BVDV (1, 22, 27). En la actualidad se utiliza ampliamente la RT-PCR para el diagnóstico de la infección por pestivirus. Un protocolo básico de una RTPCR mixta comprende las etapas siguientes: i) El ARN total se aísla mediante fenol-cloroformo, TRIZOL, isotiocianato de guanidina (GITC), o un método de paso por columna y centrifugación. ii) El ADNc se sintetiza mediante cebadores antisentido o hexámeros aleatorios. iii) Empleando cebadores pan-pestivirus a partir de la región no codificadora 5´ la PCR mixta utiliza aproximadamente 25 ciclos en la primera amplificación y 30–35 en la segunda. iv) Se utiliza el sistema TaqMan o cualquier otro sistema de sondeo para identificar el producto del pestivirus. La elección de cebadores es fundamental. Los cebadores pan-pestivirus son adecuados para detectar y tipificar todas las especies de Pestivirus (18, 26). También se han descrito cebadores específicos para un reconocimiento rápido de los virus de la EF (11, 28). Utilizando un único tubo cerrado en la RT-PCR con sondas fluorescentes se reduce la potencial contaminación cruzada de las muestras de diagnóstico (12). Algunas aplicaciones importantes son la detección de ARN vírico en tejidos fetales y en constituyentes de cultivos celulares o en vacunas (25); la validación de la RT-PCR se encuentra en proceso. También se observa que es válida para detectar el virus cuando están presentes los anticuerpos específicos del BDV. Las precauciones que se deben tomar con la RT-PCR están contempladas en el Capítulo I.1.4. Validación y Control de Calidad de los Métodos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa utilizados para el Diagnóstico de las Enfermedades Infecciosas. 1120 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera 2. Pruebas serológicas Normalmente, los anticuerpos dirigidos contra el BDV se detectan en los sueros de oveja utilizando las pruebas de neutralización vírica (NV) o ELISA. También se puede emplear la prueba de inmunodifusión en gel de agar (IGDA) que es menos sensible. En cada prueba se deben incluir sueros de referencia control positivo y negativo. Para ser considerados válidos, éstos deberían dar resultados dentro de los límites predeterminados para la prueba. Se pueden probar sueros individuales para determinar la prevalencia del BDV en un rebaño, región o país. Sin embargo, para el diagnóstico, los sueros de la etapa aguda y convaleciente son las muestras más adecuadas para confirmar una infección aguda por el BDV. Siempre se deberían probar las muestras repetidas de suero procedente de cada animal, una junto a la otra en la misma placa. a) Prueba de neutralización vírica Para la prueba de NV se puede utilizar una cepa citopática estándar del BDV (p.ej. la cepa Moredun) con células semicontinuas como las de FLM). Más abajo se indica un protocolo resumido. i) Los sueros control y problema se inactivan por calor durante 30 minutos a 56°C. ii) Partiendo de una dilución 1/4 del suero, se preparan diluciones seriadas al doble de los sueros problema en el medio de crecimiento del cultivo celular en una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano para cultivos celulares. Para cada muestra se utilizan dos o cuatro pocillos de cada dilución dependiendo de la precisión requerida. El rango de diluciones también puede variar. Es habitual ensayar los sueros inicialmente a la dilución 1/4 y titular los sueros positivos. Para titular los sueros se necesita un mínimo de cuatro pocillos. El volumen estándar de trabajo es 25 µl: a cada pocillo se añaden 25 µl del suero diluido; se añaden 25 µl de medio a cada uno de los dos pocillos control inferiores y 25 µl de medio que contenga 100 DICT50 (dosis infectiva 50% en cultivo de tejido) del virus se añaden a cada uno de los dos pocillos problema superiores. En cada prueba se incluyen una titulación del virus y sueros control positivo y negativo. iii) Las placas se sellan con un sellador de placas no tóxico o una tapa, y se incuban a 37°C durante 1 hora. iv) A cada pocillo se añaden 100 µl de una suspensión celular con una concentración de 2 × 105 células/ml. El FBS o el suero equivalente para el crecimiento de las células deben estar libres de anticuerpos frente al BDV. v) Se sella la placa o se incuba en una cámara húmeda con CO2 al 5% durante 4 días a 37°C. vi) Los pocillos se examinan al microscopio para detectar posibles efectos citopáticos (ECPs). En los pocillos control de los sueros problema, los ECPs serán debidos a la toxicidad. Se puede intentar la dilución posterior de los sueros tóxicos, pero es posible que no se obtengan resultados fiables con sueros ocasionales. El título de NV para cada suero es la dilución a la cual se consigue neutralizar al virus en el 50% de los pocillos. Se puede calcular mediante el método de Spearman–Kärber. Un animal seronegativo no mostrará neutralización a la dilución más baja (p.ej. 1/4). Es difícil la elección del virus de prueba debido a la diversidad antigénica entre los pestivirus (8, 14). Se pueden utilizar cepas estándares de los BVDV citopáticos y células bovinas. Los resultados con la cepa Oregon C24V se correlacionan mejor con el BDV Modedun que los resultados con la cepa NADL. Ninguna cepa individual es ideal. Debería emplearse una cepa local que proporcione el título mayor de anticuerpos con un rango de sueros positivos de oveja. También se puede utilizar la prueba de NV con virus no citopáticos cuando se emplee el sistema de tinción de inmunoperoxidasa después de la etapa v) indicada más arriba. Este sistema de tinción consiste en: i) Se elimina el medio de cultivo y las células se lavan suavemente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) templada, se secan al aire y se enfrían a 4°C. ii) Las células se fijan rápidamente añadiendo a todos los pocillos acetona al 95% (en agua) previamente enfriada a –20°C. Las placas se mantienen a –20°C durante 30 minutos y no se deberían apilar o permitir que se calienten porque el plástico se puede deteriorar. iii) Se elimina la acetona y las placas se secan rápidamente en un ambiente fresco. iv) A todos los pocillos se les añaden 50 µl de antisuero frente al BDV a una dilución predeterminada en PBS con Tween 80 al 1% (PBST). Las placas se incuban a 37°C durante 30 minutos en una atmósfera húmeda. v) Las placas se vacían y lavan tres veces con PBST. vi) Los pocillos se vacían y se les añade un suero apropiado anti-especie conjugado a peroxidasa a una dilución predeterminada y las placas se dejan durante 30 minutos a 37°C en una atmósfera húmeda. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 1121 Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera vii) Las placas se vacían y lavan tres veces con PBST. viii) Los pocillos de las placas se vacían y se les añaden 50 µl de sustrato activado, p.ej. 3-amino-9etilcarbazol (AEC). La solución de base AEC es: AEC (0,1 g) disuelto en dimetil formamida (15 ml). Para utilizar se añade la solución de base (0,3 ml) a 0,05 M tampón acetato pH 5,0, filtrado a través de membrana (4,7 ml), y posteriormente se añade H2O2 al 30% (5 µl). NB: esta solución es tóxica y se debería manejar con las precauciones adecuadas. ix) Las placas se incuban a temperatura ambiente y se observan con detalle los pocillos control viruspositivos conocidos para detectar el desarrollo de la tinción citoplásmica específica roja-marrón. Cuando la tinción es completa se elimina el sustrato cuidadosamente y se lavan a fondo los pocillos con agua corriente. Se deja el agua corriente en los pocillos y las placas se examinan al microscopio para observar los pocillos que contengan el virus. x) El título de NV se calcula como se ha indicado más arriba utilizando el método de Spearman–Kärber. xi) Alternativamente, la prueba se puede llevar a cabo empleando la tinción directa con el conjugado de isotiocianato de fluoresceína. En ocasiones puede ser necesario determinar si el anticuerpo en el rebaño está dirigido contra un virus perteneciente a un serogrupo particular de Pestivirus. Se puede utilizar una prueba diferencial de NV en la que los sueros se titulan contra virus representativos de cada uno de los grupos de Pestivirus, i.e. el BDV, los tipos 1 y 2 del BVDV y el CSFV. El título máximo identificará al serotipo infectante y también se revelará el espectro de reacción cruzada con los restantes serotipos. b) Enzimoinmunoensayo Se ha descrito un ELISA de captura con MAbs para medir los anticuerpos frente al VDV. Se emplean dos MAbs de pan-pestivirus que detectan epítopos diferentes de la proteína no estructural inmunodominante NS 2/3 que capturan el antígeno crecido en cultivo celular y lisado con detergente. Los resultados se correlacionan cualitativamente con la prueba de NV (10). El antígeno se prepara como se indica a continuación: Se utilizan ocho frascos de 225 cm2 de células FLM recientemente confluentes; cuatro frascos actuarán de controles y cuatro se infectarán. Los frascos se lavan y se infectan cuatro con 0,01–0.1 m.o.i. (multiplicidad de infección) del BDV citopático Moredun. El virus se adsorbe durante 2 horas a 37°C. Se añade medio de mantenimiento que contiene FBS al 2% (libre de anticuerpos frente al BDV) y los cultivos se incuban durante 4–5 días hasta que se evidencian ECPs. Se juntan los sobrenadantes de los cuatro frascos controles y por separado los sobrenadantes de los cuatro frascos infectados. Se centrifugan a 3.000 g durante 15 minutos para precipitar las células. Se eliminan los sobrenadantes. Se retienen los precipitados celulares. Se lavan los frascos con 50 ml de PBS y se repite la etapa de centrifugación como se ha indicado más arriba. Se juntan todos los precipitados controles en 8 ml de PBS que contenga Nonidet P40 al 1% y se devuelven 2 ml a cada frasco control para lisar las células que han permanecido fijadas. Se repite lo mismo para el caso de las células infectadas. Se mantienen los frascos a 4°C durante al menos 2 horas agitando vigorosamente el volumen escaso de líquido en las células durante 30 minutos para asegurar la separación completa de las células. Se centrifuga el antígeno control y el infectado a 12.000 g durante 5 minutos para extraer los residuos celulares. Los sobrenadantes antigénicos se conservan a –70°C en alícuotas pequeñas. • Procedimiento de la prueba i) Los dos MAbs se diluyen a una dilución predeterminada (normalmente 1/4000) en 0,05 M tampón bicarbonato, pH 9,6. Todos los pocillos de una placa de microtitulación adecuada para la prueba ELISA (p.ej. Nunc maxisorb, Greiner 129b) se cubren toda la noche con estos anticuerpos a 4°C. ii) Después de lavar tres veces con PBST, a todos los pocillos se les añade una solución de bloqueo de PBST que contenga suero de caballo al 10% (PBSTH), y se incuban a 37°C durante 1 hora. iii) El antígeno se diluye a una dilución predeterminada con PBSTH y se antigenan filas alternas de pocillos con los antígenos víricos y controles durante 1 hora a 37°C. Posteriormente, las placas se lavan tres veces con PBST antes de añadirles los sueros problema. iv) Los sueros problema se diluyen 1/50 en PBSTH y se añaden a los pocillos víricos duplicados y controles duplicados durante 1 hora a 37°C. Posteriormente, las placas se lavan tres veces con PBST. v) Se diluye la IgG anti-ovina conjugada a peroxidasa a una dilución predeterminada en PBSTH y se añade a todos los pocillos durante 1 hora a 37°C. Las placas se lavan tres veces con PBST. vi) Se añade un sustrato enzimático activado adecuado, tal como orto-fenilendiamina (OPD) o tetrametil azul (TMB) teniendo en cuenta las advertencias del fabricante acerca de su toxicidad. Después de el desarrollo de color, la reacción se para con ácido sulfúrico y la absorbancia se lee con un lector de placas ELISA. El valor medio de los dos pocillos controles se sustrae de los valores medios de los dos 1122 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera pocillos víricos para obtener la absorbancia corregida para cada suero. Los resultados se expresan como absorbancia corregida con respecto a la correspondiente de sueros conocidos positivos y negativos. Alternativamente, se pueden extrapolar los títulos de ELISA a partir de una curva estándar de diluciones seriadas de un suero positivo conocido de referencia Si se pueden preparar antígenos de suficiente potencia se puede omitir la etapa de captura con MAbs. En este caso filas alternas de los pocillos se cubren con el antígeno vírico y control diluidos a una dilución predeterminada (normalmente 1/100) en 0,05 M tampón bicarbonato, pH 9,6, toda la noche a +4°C. Las placas se lavan y bloquean como en la etapa ii indicada más arriba. Después de lavar, se añaden los sueros problema diluidos y la prueba sigue adelante a partir de la etapa iv) como se indica más arriba. c) Prueba de inmunodifusión en gel de agar La prueba de IGDA se utilizó por primera vez para demostrar la relación inmunológica entre los BDV, BVDV y CSFV. La cepa Oregon C24V del BVDV crecida en células de testículo de ternero se ha utilizado para detectar los anticuerpos en ovejas. Se puede preparar un antígeno adecuado empleando el medio recogido procedente de células que muestren tempranamente ECPs. Se necesita concentrar el medio aproximadamente 100 veces mediante diálisis contra polietilenglicol (PEG). Alternativamente, se puede añadir PEG 6000 para sonicar suspensiones virus/células en una proporción del 8% (w/v). Después de agitar constantemente durante toda la noche a 4°C, se elimina el precipitado por centrifugación a 1.800 g durante 1 hora. Se decanta por completo el sobrenadante y se resuspende el precipitado hasta el 1% del volumen de cultivo original virus/células en agua destilada. El precipitado resuspendido se centrifuga a 286.000 g durante 2 horas y se recoge el sobrenadante para ser utilizado como antígeno. El precipitado se elimina. C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Para considerar útil una vacuna del BDV debería ser efectiva al administrarla a las ovejas hembras antes del periodo de crianza con el fin de prevenir la infección transplacentaria. En Europa se han preparado vacunas con el virus BDV entero inactivado con fines experimentales y comerciales (5, 24). Se han encontrado pestivirus contaminantes de vacunas de virus vivos modificados que provocan enfermedades graves después de ser administradas a cerdos, vacas, ovejas y cabras. Entre las vacunas contaminadas están las utilizadas para el control de la enfermedad de Aujeszky, del CSFV, de rotavirus, de coronavirus, de la peste bovina, de la viruela ovina y de la dermatitis pustular contagiosa. La capacidad insidiosa de los pestivirus para atravesar la placenta y de este modo establecer los animales IP, les proporciona la potencialidad de contaminar vacunas a través de las células, el suero empleado como suplemento en los medios o el virus utilizado como base de inóculo. Como casi todos los aislados de los pestivirus son no citopáticos, permanecerán sin ser detectados a menos que se lleven a cabo pruebas específicas. 1. Control del inóculo a) Caracterización del inóculo Una vacuna ideal debería contener una cepa o cepas del virus que proporcionen protección frente a todos los pestivirus ovinos. Recientemente, se ha demostrado que existen tres grupos de pestivirus antigénicos distintos que infectan ovejas. Un grupo es el representado por la cepa de referencia del BDV Moredun; el segundo grupo contiene los virus similares a la mayoría de las cepas del BVDV bovino (BVDV tipo 1); y el tercer grupo engloba las cepas menos comunes del BVDV (tipo 2) (30). Hacen falta estudios posteriores de protección cruzada para determinar el significado de estos descubrimientos. No obstante, parece lógico que cualquier vacuna del BDV debería contener al menos un representante de los grupos BDV y BVDV (tipo 1). La caracterización de los virus de las vacunas clonadas biológicamente debería comprender la tipificación con MAbs y la genotipificación (16). b) Cultivo Se puede utilizar una variedad de cultivos celulares de rumiantes. Los rendimientos óptimos dependen del tipo celular y aislado empleados. Existe una vacuna comercial del BDV que contiene dos cepas del virus y que se prepara en líneas celulares ovinas (5). Las células se deberían preparar de acuerdo con el sistema de lotes del inóculo procedente de un virus del inóculo original (MCS) que se haya demostrado que está libre de microorganismos contaminantes. Sólo se debería preparar la vacuna en células con menos de 20 pases a partir del MCS. Se debería comprobar que no existe contaminación debida a pestivirus en células control procedentes de cada pase. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 1123 Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera c) Validación como vacuna Todas las vacunas deberían pasar las pruebas estándar de inocuidad y eficacia. La prueba de inocuidad de las vacunas inactivadas del BDV debería suponer el control de todos los componentes de las vacunas para detectar los posibles pestivirus contaminantes. Las pruebas de eficacia de las vacunas del BDV deberían demostrar su capacidad para prevenir la propagación transplacentaria del virus. Se ha logrado un desafío efectivo de las ovejas gestantes vacunadas entre los días 50–60 de gestación mediante la instalación intranasal del virus o mezclándolas con ovejas IP (5). 2. Método de producción Se han preparado vacunas inactivadas empleando técnicas de laboratorio convencionales con cultivos celulares estacionarios o en botellas rotatorias. Algunos inactivantes son la formalina y la beta-propiolactona. Los adyuvantes pueden ser hidróxido de aluminio o aceite (5, 24). 3. Control del proceso Los cultivos se deberían inspeccionar a diario para asegurar que están libres de contaminación bacteriana evidente y que cualquier ECP observado sea el apropiado al virus citopático que se esté tratando de multiplicar. No se deberían observar ECPs en cultivos que se estén utilizando para que se repliquen cepas víricas no citopáticas. 4. Control de lotes a) Esterilidad En el Capítulo I.1.5. se pueden encontrar las pruebas para determinar que los materiales biológicos están estériles y libres de contaminación. b) Inocuidad Se debería comprobar rigurosamente que las muestras procedentes de las vacunas inactivadas carecen de virus viables. Se deberían realizar varios pases con muestras del producto empleando cultivos celulares susceptibles para asegurar la ausencia del BDV vivo. Este control in vitro se puede mejorar inyectando dos ovejas BDV-seronegativas con 20 dosis de antígeno sin valorar como parte de una prueba de inocuidad estándar. La presencia del virus vivo tendrá como resultado el desarrollo de una respuesta serológica más convincente que la que se observaría utilizando el virus inactivado solo. También se pueden examinar los sueros de oveja para detectar anticuerpos dirigidos contra otros agentes conocidos. c) Potencia Asimismo, es mejor ensayar la potencia de la vacuna con ovejas seronegativas en las que se mida el desarrollo y nivel de anticuerpos. Una medida indirecta de la potencia la proporciona el nivel de infectividad vírica previa a la inactivación. El contenido antigénico después de la inactivación se puede valorar mediante un ELISA de captura con MAbs y relacionar con los resultados de potencia establecidos in vivo. Al igual que se recomienda en el caso de las pruebas de potencia de la vacuna del BVDV en vacas, se aconseja demostrar que la vacuna puede prevenir la transmisión transplacentaria del BDV en ovejas gestantes. d) Duración de la inmunidad No se dispone de información acerca de la duración de la inmunidad después de la vacunación. Es improbable que las vacunas inactivadas proporcionen niveles sostenidos de inmunidad y es probable que después de un tratamiento inicial de 2 o 3 inyecciones sean necesarias dosis anuales de refuerzo. No se dispone de información suficiente para determinar si existe una correlación entre los títulos de anticuerpos vacunales en la hembra progenitora y la protección fetal. e) Estabilidad Existe escasa información sobre la estabilidad de las vacunas del BDV. Es de suponer que las vacunas inactivadas tengan al menos un año de periodo de validez si se protegen de la luz y conservan a 4°C. f) Conservantes Se pueden añadir conservantes a los contenedores multidosis de vacunas que estarán sujetos a la aprobación de la Autoridad de Control. 1124 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera g) Precauciones (riesgos) El BDV se considera un riesgo para la salud humana. Se deberían utilizar prácticas microbiológicas adecuadas y estándares para manipular el virus. 5. Pruebas sobre el producto final a) Inocuidad Sólo pruebas in vitro. b) Potencia Pruebas in vitro del contenido antigénico REFERENCIAS 1. AVALOS-RAMIREZ R., ORLICH M., THIEL H.-J. & BECHER P. (2001). Evidence for the presence of two novel pestivirus species. Virology, 286, 456–465. 2. BARLOW R.M. & PATTERSON D.S.P. (1982). Border disease of sheep: a virus-induced teratogenic disorder. Adv. Vet. Med. (Suppl. J. Vet. Med.), 36, 1–87. 3. BECHER P., ORLICH M. & THIEL H.-J. (1998). Complete genomic sequence of border disease virus a pestivirus from sheep. J. Virol., 72, 5165–5173. 4. BRAUN U., HILBE M., EHRENSPERGER F., SALIS F., ALTHER P., STRASSER M., STALDER H.P. & PETERHANS E. (2002). Border Disease in einem Schafbetrieb. Schweiz. Arch. Tierheilk., 144, 419–426. 5. BRUN A., LACOSTE F., REYNAUD G., KATO F. & SAINT-MARC B. (1993). Evaluation of the potency of an inactivated vaccine against border disease pestivirus infection in sheep. En: Proceedings of the Second Symposium on Pestiviruses, Edwards S., ed. Fondation Marcel Merieux, Annecy, Francia, 1–3 Octubre 1992, 257–259 6. CARLSSON U. (1991). Border disease in sheep caused by transmission of virus from cattle persistently infected with bovine virus diarrhoea virus. Vet. Rec., 128, 145–147. 7. CHAPPUIS G., BRUN A., KATO F., DAUVERGNE M., REYNAUD G. & DURET C. (1986). Etudes serologiques et immunologiques realisees a la suite de I’isolement d’un pestivirus dans un foyer ovina chez des moutons de L’Aveyron. En: Pestiviroses des Ovins et des Bovins, Espinasse J. & Savey M. eds. Ste Francaise de Buiatrie, Paris, Francia, 55, 66. 8. DEKKER A., WENSVOORT G. & TERPSTRA C. (1995). Six antigenic groups within the genus pestivirus as identified by cross-neutralisation assays. Vet. Microbiol., 47, 317–329. 9. ENTRICAN G., DAND A. & NETTLETON P.F. (1994). A double monoclonal-antibody ELISA for detecting pestivirus antigen in the blood of viraemic cattle and sheep. Vet. Microbiol., 43, 65–74. 10. FENTON A., SINCLAIR J.A., ENTRICAN G., HERRING J.A. & NETTLETON P.F. (1991). A monoclonal antibody capture ELISA to detect antibody to border disease virus in sheep sera. Vet. Microbiol., 28, 327–333. 11. FULTON R.W., D’OFFAY J.M., SALIKI J.T., BURGE L.J., HELMAN R.G., CONFER A.W., BOLIN S.R. & RIDPATH J.F. (1999). Nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) for typing ruminant pestiviruses: bovine viral diarrhea viruses and border disease virus. Can. J. Vet. Res., 63, 276–281. 12. MCGOLDRICK A., BENSAUDE E., IBATA G., SHARP G. & PATON D.J. (1999). Closed one-tube reverse transcription nested polymerase chain reaction for the detection of pestiviral RNA with fluorescent probes. J. Virol. Methods, 79, 85–95. 13. NETTLETON P.F., GILMOUR J.S., HERRING J.A. & SINCLAIR J.A. (1992). The production and survival of lambs persistently infected with border disease virus. Comp. Immunol. Microbiol. infect. Dis., 15, 179–188. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 1125 Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera 14. NETTLETON P.F., GILRAY J.A., RUSSO P. & DLISSI E. (1998). Border disease of sheep and goats Vet. Res., 29, 327–340. 15. OGUZOGLU T.C., FLOEGEL-NIESMANN G., FREY H.R. & MOENNIG V. (2001). Differential diagnosis of classical swine fever and border disease: seroepidemiological investigation of a pestivirus infection on a mixed sheep and swine farm. Dtsch Tierarztl. Wochenschr., 108, 210–213. 16. PATON D.J., SANDS J.J., LOWINGS J.P., SMITH J.E., IBATA G. & EDWARDS S. (1995). A proposed division of the pestivirus genus into subgroups using monoclonal antibodies, supported by cross-neutralization assays and genetic sequencing. Vet. Res., 26, 92–109. 17. RIDPATH J.F. & BOLIN S.R. (1997). Comparison of the complete genomic sequence of the border disease virus, BD31, to other pestiviruses. Virus Res., 50, 237–243. 18. SANDVIK T., PATON D.J & LOWINGS P.J. (1997). Detection and identification of ruminant and porcine pestiviruses by nested amplification of the 5' untranslated cDNA region. J. Virol. Methods, 64, 43–56. 19. THABTI F., FRONZAROLI L., DLISSI E., GUIBERT J.M., HAMMAMI S., PEPIN M. & RUSSO P. (2002). Experimental model of border disease virus infection in lambs: comparative pathogenicity of pestiviruses isolated in France and Tunisia. Vet. Res., 33, 35–45. 20. THUR B., HILBE M., STRASSER M. & EHRENSPERGER F. (1997). Immunohistochemical diagnosis of pestivirus infection associated with bovine and ovine abortion and perinatal death. Am. J. Vet. Res., 58, 1371–1375. 21. VAN REGENMORTEL M.H.V., FAUQUET C.M. & BISHOP D.H.L. (2000). Virus taxonomy. En: Classification and Nomenclature of Viruses: Seventh Report of the International committee on taxonomy of viruses : Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses,. Academic Press, San Diego, CA, EE.UU., 867–872. 22. VAN RIJN P.A., VAN GENNIP H.G.P., LEENCLERSE C.H., BRUSCHKE C.J.M., PATON D.J., MOORMANN R.J.M. & VAN OIRSCHOT J.T. (1997). Subdivision of the pestivirus genus based on envelope glycoprotein E2 Virology, 237, 337–348. 23. VANTSIS J.T., BARLOW R.M., FRASER J. & MOULD D.L. (1976). Experiments in border disease VIII. Propagation and properties of a cytopathic virus. J. Comp. Pathol., 86, 111–120. 24. VANTSIS J.T., RENNIE J.C., GARDINER A.C., WELLS P.W., BARLOW R.M. & MARTIN W.B. (1980). Immunisation against Border disease. J. Comp. Path., 90, 349–354. 25. VILCEK S. (2001). Identification of pestiviruses contaminating cell lines and fetal calf sera. Acta Virol., 45, 81– 86. 26. VILCEK S., HERRING A.J., HERRING J.A., NETTLETON P.F., LOWINGS J.P.L. & PATON D.J (1994) Pestiviruses isolated from pigs, cattle and sheep can be allocated into at least three genogroups using polymerase chain reaction and restriction endonucelase analysis. Arch. Virol., 136, 309–323. 27. VILCEK S., NETTLETON P.F., PATON D.J. & BELAK S. (1997). Molecular characterization of ovine pestiviruses. J. Gen. Virol., 78, 725–735. 28. VILCEK S. & PATON D.J. (2000). A RT-PCR assay for the rapid recognition of border disease virus. Vet. Res., 31, 437–445. 29. WENSVOORT G. & TERPSTRA C. (1988). Bovine viral diarrhoea virus infection in piglets born to sows vaccinated against swine fever with contaminated virus. Res. Vet. Sci., 45, 143–148. 30. WENSVOORT G., TERPSTRA C. & DE KLUYVER E.P. (1989). Characterisation of porcine and some ruminant pestiviruses by cross-neutralisation. Vet. Microbiol., 20, 291–306. * * * 1126 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
