MANUAL DE DIAGNOSTICO PARA LA IDENTIFICACIÓN

MANUAL DE DIAGNOSTICO PARA LA IDENTIFICACIÓN MICROSCOPICA Y LA DETECCIÓN
MOLECULAR DE Puccinia kuehnii, CAUSANTE DE ROYA NARANJA EN CULTIVOS DE CAÑA
DE AZÚCAR
RED MEXICANA DE VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA FITOSANITARIA (REMAVEF)
Dra. Ma. Carmen Calderón Ezquerro
M. en C. Erika Arroyo Vázquez
M. en C. Hilda Adriana Guerrero Parra
2012
1
INDICE
2
I. INTRODUCCIÓN
3
II. OBJETIVOS
5
2.1 De la actividad
5
2.2 Del manual
5
III: MÉTODOS
5
Trampa de Esporas tipo Hirst (TEH)
5
3.1.1 Retiro de la cinta de celofán Melinex del tambor de la TEH
6
3.2 Trampa Pasiva de Esporas (TPE) (Pennstate/UNAM)
6
3.2.1 Retiro de la cinta de celofán Melinex del portaobjeto de la TPE
6
3.3. Montaje de las cintas de celofán Melinex impactadas con la TEH y la
TPE para observación directa al microscopio y método de conteo.
3.3.1 Identificación de urediniosporas
6
7
3.3.2 Cuantificación de urediniosporas
8
3.3.3
8
Expresión de los resultados.
3.3.4 Base de datos Aerobiológicos
8
3.4
Detección molecular de ADN de urediniosporas de P. kuehnii
colectadas con la Trampa de Esporas Tipo Hirst y con la Trampa Pasiva de
Esporas.
3.4.1 Rompimiento de esporas y extracción del ADN
8
9
3.4.2
Detección con PCR:
10
3.4.3
Detección con PCR en tiempo real (QPCR)
10
IV. REFERENCIAS
12
2
I.
INTRODUCCIÓN
La detección temprana y la diagnosis de patógenos de plantas pueden predecir con
mayor exactitud el daño o la enfermedad y mejorar la precisión en la aplicación de
plaguicidas. Por lo tanto, es de primordial importancia desarrollar estrategias de control
basadas en monitoreos ambientales y en valoración de riesgo de enfermedades (Sweet et
al., 1992).
Para llevar a cabo la vigilancia aerobiológica de plagas, se realiza el seguimiento
fitosanitario de la propagación y dispersión de las plagas por regiones agroecológicas
mediante el monitoreo del aire, a través de la implementación de la red aerobiológica
llamada Red Mexicana de Aerobiología para la Vigilancia Epidemiológica Fitosanitaria
(REMAVEF). En este manual se presenta el sistema de diagnóstico para la identificación y
detección de las esporas colectadas del aire mediante los muestreos aerobiológicos
realizados durante la vigilancia epidemiológica de la roya naranja de la caña de azúcar.
La roya naranja de la caña de azúcar es causada por el hongo Puccinia kuehnii ((W.
Krüger) E.J. Butler), el cual ocasiona pérdidas severas por la disminución del follaje, del
crecimiento de la raíz y de la productividad de las plantas al disminuir la tasa fotosintética
(Agrios, 2007). A nivel mundial se encuentra distribuida en Asia, África, América y Oceanía.
En México se considera una plaga de importancia económica y tiene una distribución
restringida ya que solo se tiene reportes en algunas áreas específicas, en el Estado de
Chiapas, en Quintana Roo en Veracruz en 2010 y en El Higo en Veracruz; y San Vicente
Tancuayala en San Luis Potosí (NAPPO, 2011; SCOPE, 2011, SPVE 2011). En total, son 13
municipios en cuatro estados donde se ha detectado roya naranja.
El principal hospedante es la caña de azúcar (Saccharum officinarum) como
hospedantes silvestres S. edule y S. spontaneum y otros hospedantes que se reportan S.
arundinaceum, Sclerostachya fusca (SIAP, 2009).
La roya naranja aparece en verano y otoño y se ve favorecida por las condiciones
templadas húmedas. La producción de urediniosporas continúa por más de 23 días
después de la formación de los uredinios. El número total de urediniosporas producidas
por uredinio para P. kuehnii es de 4.7 x 103. La severidad de la roya se incrementa de
forma exponencial con el tiempo. Éste es el motivo por el que aparecen de manera
repentina durante condiciones ambientales favorables. La germinación de las esporas
ocurre dentro del intervalo de 17-34 °C de temperatura, pero la óptima es de 18 °C y 97 %
de humedad relativa. El proceso de infección requiere de humedad, que puede provenir
de la lluvia o el rocío. La infección puede presentarse aproximadamente en cuatro horas
3
en condiciones idóneas para su desarrollo. La dispersión de las urediniosporas a las hojas
superiores y campos adyacentes se ve favorecida por un ambiente seco y por el viento
(Infante, et al., 2009).
La dispersión de la enfermedad se da de forma natural, principalmente por el
acarreo de las urediniosporas por el viento a distancias de hasta 2000 km (CABI, 2010).
Otra vía es que las urediniosporas vayan adheridas a la ropa o zapatos de la gente
procedente de países con presencia de la roya naranja. No hay reportes de que se
transmita por semilla o insectos.
El método de monitoreo del aire es utilizado para determinar la presencia o
ausencia de esporas de hongos patógenos de plantas, para colectar las urediniosporas de
Puccinia kuehnii dispersas en la atmósfera de cultivos de caña de azúcar infectados o en
riesgo de infección se utilizan Trampas Pasivas de Esporas (TPE) y Trampas de Esporas
tipo Hirst (TEH) (Hirst, 1952).
La roya naranja producida por Puccinia kuehnii había sido registrada por largo
tiempo como una enfermedad de menor importancia en los países donde se encontraba
presente. Sin embargo, en el año 2000 ésta roya devastó la variedad Q124 la cual
representaba el 45% del cultivo de caña de azúcar en Australia, causando pérdidas por
150 millones de dólares. Se cree que ésto se debió a la aparición de una nueva variedad o
que llegó del exterior.
Reportes en la literatura mencionan que la variedad CP 72- 2086, segunda variedad
comercial cultivada en México fue probada en condiciones naturales, mostrando
susceptibilidad a la roya naranja, así como la variedad Mex. 79-431, la cual presentó
síntomas de la enfermedad, por lo que es necesario determinar en qué estados de la
República se siembran, así como la superficie cultivada de las mismas (Ovalle, et al., 2008).
Las pérdidas económicas en México en caña de azúcar por ser un cultivo de
importancia económica del país, podrían representar cerca de 18, 212,734 de pesos en
48,764, 224 de toneladas (SIAP, 2009).
4
La ubicación taxonómica de Puccinia kuehnii se presenta a continuación.
Ubicación taxonómica de Puccinia
kuehnii
Reino: Fungi
Phylum: Basidiomycota
Clase: Urediniomycetes
Orden: Uredinales
Familia: Pucciniaceae
Género: Puccinia
Especie: P. kuehnii
(CABI, 2011)
II. OBJETIVOS
2.1. De la actividad
a. Determinar la presencia en el aire de las urediniosporas de Puccinia kuehnii
mediante la vigilancia aerobiológica y el seguimiento fitosanitario en cultivos de
caña de azúcar en riesgo de infección.
2.2. Del manual
Estandarizar los procedimientos y métodos para la identificación microscópica y
detección molecular de las urediniosporas colectadas del aire de cultivos de caña de
azúcar mediante muestreos aerobiológicos.
III: MÉTODOS
IDENTIFICACIÓN Y CONTEO DE UREDINIOSPORAS DE Puccinia kuehnii COLECTADAS DEL
AIRE.
3.1 Trampa de Esporas tipo Hirst (TEH)
5
La TEH funciona durante 7 días continuos (figura 1; anexo 1), el tambor con la muestra es
guardado en una caja metálica (Burkard Manufacturing CO. UK) para su transporte al
laboratorio (figura 2; anexo 1).
3.1.1 Retiro de la cinta de celofán Melinex del tambor de la TEH
El tambor es sacado del porta-tambor sujetándolo por la parte de arriba y evitando tocar
la superficie de la cinta de celofan Melinex. Posteriormente, es colocado en el rodatambor para retirar la cinta completa del tambor (figura 3; anexo 1) y colocarla sobre la
regla de metacrilato que permite dividirla en 7 segmentos de 48 mm de longitud los
cuales corresponden a cada día de la semana (un segmento por día) (figura 4; anexo 1).
3.2 Trampa Pasiva de Esporas (TPE) (Pennstate/UNAM)
El funcionamiento de la TPE de esporas es muy sencillo, ya que solo se coloca un
portaobjetos con un adhesivo para la impactación de las aeropartículas en el soporte
desmontable. La laminilla está dirigida hacia el frente del sistema tubular, quedando por
detrás la veleta, por lo que siempre estará expuesta a las corrientes de aire que acarrean
las partículas, impactándose éstas sobre el portaobjetos. La trampa se deja funcionando,
es decir, girando con la fuerza del viento durante 7 días (figura 5; anexo 1).
3.2.1 Retiro de la cinta de celofán Melinex del portaobjeto de la TPE
Los laminillas se desmontan de la TPE tomando el portaobjetos por los lados, evitando
tocar la superficie en la que se impactaron las aeropartículas y se colocan en la caja para
guardar y transportar los portaobjetos al laboratorio para su proceso y análisis (figura 6;
anexo 1).
3.3. Montaje de las cintas de celofán Melinex impactadas con la TEH y la TPE para
observación directa al microscopiom y método de conteo.
La cinta de celofán Melinex de la TEH correspondiente a cada día es colocada sobre
una regla de de metacrilato para dividirla en 7 segmentos que corresponden a cada día de
la semana (figuras 4; anexo1)
Cada segmento de la cinta, ya sea de la TEH o de la TPE, es montado de manera
permanente sobre un portaobjetos con alcohol polivinilico, para que éste sea analizado
bajo el microscopio de campo claro (figura 7; anexo 1).
6
Se utiliza un microscopio óptico para determinar el número de esporas de interés
impactadas en las cintas por día (Galán et al., 2007). Las observaciones se llevan a cabo de
dos maneras (figura 8; anexo 1):
A) Si la época temporal de infección (conocida o registrada para P. kuehnii aún no se
ha iniciado, está por iniciarse o se sospecha de su inicio, y por ello no se visualizan
urediniosporas impactadas en las cintas o sus concentraciones son muy bajas, se
recomienda que toda la cinta sea revisada bajo el microscopio para detectar su
presencia, por mínima que ésta sea (figura 8A; anexo 1).
B) Si la época temporal de infección ya inició (conocimiento por registros anuales
previos) y las plantas aún no presentan los primeros signos de enfermedad, pero
las urediniosporas impactadas sobre las cintas son muy abundantes, se
recomienda revisar 4 barridos longitudinales de cada cinta evaluada, con una
magnificación de 40x10 aumentos (figura 8B; anexo 1).
El método de recuento de las muestras según el método de la REA (Red Española de
Aerobiología, Galán et al., 2007) recomienda cuatro barridos horizontales continuos
equidistantes entre si y del borde de la preparación. Esto representa una sub-muestra
analizada del 12-13% de superficie total, dependiendo de la dimensión del campo de
microscopio analizado a estos aumentos, que puede variar en los distintos modelos.
A lo largo de cada uno de estos barridos se va contando el número de
urediniosporas de P. kuehnii de forma que se obtiene información sobre su concentración
presente en el aire a lo largo del día. Se recomienda utilizar para la realización de las
divisiones transversales rotulador de tinta indeleble de color azul y punta superfina, ya
que es el que ofrece una mayor refracción al paso de luz. Se coloca la reglilla debajo del
portaobjetos, situando la primera línea azul al inicio de la cinta muestreada sujetándola
con la ayuda de una cinta adhesiva. El portaobjetos es colocado en la platina del
microscopio y se inicia la identifcación y el conteo (figura 8B; anexo 1).
3.3.1 Identificación de urediniosporas
Para la identificación se utilizan tanto documentos bibliográficos (libros,
claves, etc.), como muestras de urediniosporas tomadas directamente de hojas de caña de
azúcar infectadas con roya naranja y colocadas sobre portaobjetos para ser procesadas
como material permanente, para quedar registrados como referencia. En la tabla 1; anexo
2, se muestran las principales características para identificar las urediniosporas de P.
kuehnii, así como las de P. melanocephala (roya café). La figura 9; anexo 2 se muestra
7
hojas de caña de azúcar infectadas con roya naranja y roya café y las figuras 10 a 16, del
mismo anexo presentan estructuras de ambas royas.
3.3.2 Cuantificación de urediniosporas
El número de urediniosporas contadas en la laminilla se anota en una hoja de registro de
datos. Las hojas se utilizan tanto para el registro de las urediniosporas contadas en toda la
laminilla (más de 4 transectos), como las contadas en solo 4 transectos o barridos
horizontales (figura 17; anexo 2).
3.3.3 Expresión de los resultados.
La concentración debe expresarse como una media diaria de esporas por metro
cúbico de aire. De esta forma, los datos obtenidos son comparables con los
proporcionados por otros lugares. Para ello, se debe multiplicar el número de esporas
contabilizados por un factor que tendrá en cuenta el volumen de succión de aire
muestreado (10 litros/minuto), y la superficie del campo del microscopio que se esté
utilizando (40x10 aumentos). Este factor variará dependiendo de la marca del microscopio
a utilizar. El cálculo del factor de corrección se indica con un caso práctico en la figura 18;
anexo 2.
3.3.4 Base de datos Aerobiológicos
Una vez que se ha obtenido el número de esporas por metro cúbico de aire,
durante los siete días de la semana, se procede a su registro en las hojas de datos
semanales estandarizadas. Esta hoja de anotación facilita la incorporación de los datos
resultantes en la base de datos informatizada en programa de Excel (figura 19; anexo 2).
3.4
Detección molecular de ADN de urediniosporas de P. kuehnii colectadas con la
Trampa de Esporas Tipo Hirst y con la Trampa Pasiva de Esporas.
La detección de las urediniosporas de Puccinia kuehnii se realiza mediante el análisis
molecular de las cintas muestreadas. La cinta correspondiente a cada día, es procesada
para la extracción del ADN de las urediniosporas y su detección mediante la prueba de
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR en punto final) la cual permite identificar la
presencia de P. kuehnii en la muestra y la PCR en tiempo real (QPCR) que además de
identificar al patógeno en las muestras permite determinar su concentración en el aire,
ambas pruebas utilizan oligonucleótidos específicos para P. kuehnii (Glynn et al., 2010).
8
Para la detección con la prueba de PCR en punto final y PCR en tiempo real (QPCR), las
cintas tanto de la TEH como de la TPE impactadas con las esporas de hongos colectadas
del aire son removidas y cortadas en secciones de 24mm, representando periodos de 12
horas de exposición. Cada sección se corta por la mitad de manera transversal, una mitad
es montada de manera permanentemente sobre un portaobjetos, utilizando alcohol
polivinílico y la otra es utilizada para la detección molecular.
Cada portaobjetos es examinado bajo el microscopio de campo claro para determinar la
presencia o ausencia de urediniosporas, las cuales son contadas para determinar su
concentración en el aire. La otra mitad de cada sección es colocada dentro de un tubo
Eppendorf de 1.5 ml para la extracción de ADN y su posterior análisis en PCR y en PCR en
tiempo real (QPCR).
3.4.1 Rompimiento de esporas y extracción del ADN
El método utilizado para la extracción del ADN de las urediniosporas impactadas en la
cinta de celofán de la trampa de esporas tipo Hirst, es tomado de Lee y Taylor (1990) y
Williams et al., (2001) y Calderón (2002a y b) y modificado para la detección de P. kuehnii
utilizando el Kit DNeasy Plant Mini (Qiagen GmbH Hilden, Germany).
La cinta es cortada en piezas de 10 mm de ancho x 24 mm de largo y colocada
dentro de tubos Eppendorf de 1.5 ml con 0.2 g de perlas de vidrio de 400 a 455 µm de
diámetro (Jencons-PLS, Leighton Buzzard, UK) y lavadas con ácido clorhídrico, las cuales
son utilizadas para remover las partículas impactadas sobre la cinta de celofán Melinex
para romper la pared de las esporas (figura 20; anexo 3). A cada tubo se le adicionan
400µl de amortiguador AP1 y es agitado en el equipo FastPrep (Thermo Savant
Instruments, Holbrook, Nueva York, EUA) por dos periodos de 40s a una velocidad de 6
m/s Entre ambos periodos los tubos son colocados en hielo por 2 min. Posteriormente, a
cada tubo se le adiciona 4µl de RNAsa (100 mg/ml), se agita vigorosamente en el vórtex y
la mezcla se incuba por 10 min a 65°C, mezclando suavemente por inversión de 2 a 3
veces. Transcurrido el tiempo de incubación se adicionan 130 l del amortiguador AP2 y
se incuba por 5 min en hielo. Se transfieren 450 μl del lisado a la columna QIAshreder
sostenida en un tubo colector de 2 ml para centrifugarse a 14000 rpm por 2 min. Al
sobrenadante obtenido en el tubo colector se le adiciona 1½ volúmenes del amortiguador
AP3/E mezclando rápidamente con ayuda de una micropipeta. Se transfieren 650 μl de la
mezcla anterior a la columna DNeasy mini sostenida en un tubo colector de 2 ml y se
centrifuga durante 1min a 9000 rpm, se desecha el sobrenadante obtenido, y se repite
este paso hasta acabar el volumen.
Posteriormente, se cambia el tubo colector, se adicionan 500 μl del amortiguador AW y se
centrifuga por 1 min a 9000 rpm. Por último, la columna se coloca en un nuevo tubo
9
Eppendorf de 1.5 ml adicionándole a la membrana 100 μl de agua Mili Q, se deja incubar
por 5 min a temperatura ambiente y se centrifuga por 1 min a 9000 rpm para eluir. La
concentración final es determinada comparando con diferentes concentraciones del fago
 (20, 40 y 60 ng) mediante electroforesis en gel de agarosa al 0.8% (GIBCO BRL®, US). La
suspensión de ADN es almacenada a 4 °C hasta su uso para PCR y QPCR. En el diagrama
de flujo 1; anexo 3, se muestra el proceso de rompimiento y extracción del ADN de las
urediniosporas colectadas del aire.
Detección del ADN mediante las pruebas de PCR y PCR en tiempo real (QPCR) utilizando
oligonucleótidos específicos para la detección de Puccinia kuehnii.
3.4.2 Detección con PCR:
La detección de ADN se lleva a cabo con olognucleótidos específicos de Puccinia kuehnii
utilizando la sonda PK1F (PK1F-aagagtgcacttaattgtggctc) y PK1R (PK1Rcaggtaacaccttccttgatgtg) que generan un producto de 527 pb (Glynn et al., 2010).
Las reacciones de PCR en punto final se realizan en un termociclador marca Mastercycler
Eppendorf. La prueba de PCR se lleva a cabo en un volumen total de 50 µl conteniendo
2.5 mM MgCl2, 0.25 mM dNTPs, 0.5 µM de cada sonda Ppa1 y Ppa2 y 2.5 unidades de Taq
DNA Polimerasa (Applied Biosystems) y su respectivo buffer. Las condiciones del ciclo son
94°C por 5 min, seguidos por 35 ciclos de temperatura de desnaturalización de 94 °C por
30s, temperatura de apareamiento de 56°C por 30s, temperatura de polimerización de
72°C por 30 s y una extensión final de 72 °C por 7 min. Los productos de PCR son
visualizados en geles de agarosa al 2% y el ADN teñido con bromuro de etidio.
En las figuras 21 y 22; anexo 3, se muestran ejemplos de la detección del ADN de
urediniosporas de P. kuehnii colectadas de hojas de caña de azúcar de cultivos infectados
Othón P. Blanco, Quintana Roo y en San Luis Potosí, respectivamente.
3.4.3 Detección con PCR en tiempo real (QPCR)
Para la detección de ADN de P. kuehnii se utilizan los oligonucleótidos específicos
Pk2F (PK2F- gGgaaAcctcatTattaac) y PK2R (PK2R-gcctagagatcCattgtta) que generan un
producto de 142 pb y la sonda PK2p (Pk2p-tataaCATTatCCCC) La sonda fue dual, marcada
con 6FAM (5´) y BHQ1 (3´) (Glyn et al., 2010). Algunos ejemplos de este método se
muestran en Rogers et al., (2009), Calderón et al., (en prensa).
Las reacciones de PCR en tiempo real se realizan en un termociclador marca Biorad
(Hércules, CA). La prueba de QPCR. La prueba de QPCR se lleva a cabo en un volumen total
de 20 µL de reactivos para QPCR, conteniendo 0.5 µM de oligonucleótidos específicos y
10
0.1 µM de sonda. Las condiciones óptimas para la reacción son: 98 °C por 5 min, seguidos
por 45 ciclos de temperatura de desnaturalización de 95 °C por 30s, temperatura de
alineación de 60°C por 30s, seguidos por temperatura de polimerización de 72°C por 30s
(Glynn et al., 2010).
11
IV. REFERENCIAS
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