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Aislamiento y tipificación de levaduras en relación con
Gingivitis Marginal Crónica y la respuesta inmune.
González, María M. - Mangiaterra, Magdalena - Paniagua, Sandra
Facultad de Odontología - UNNE.
Campus Universitario - Av. Libertad 5450 - (3400) Corrientes - Argentina.
Teléfono/Fax: +54 (3783) 457992 / 457990
Cátedra de Microbiología - Instituto de Medicina Regional - UNNE.
ANTECEDENTES
Los hongos pueden presentar dos tipos de organización celular: filamentosa o levaduriforme. En la forma
levaduriforme la estructura básica es unicelular ( levaduras ), constituídas por células ovales o esféricas aunque
pueden formar un seudomicelio y a veces incluso desarrollar una hifa verdadera.1 La presencia de las levaduras
es común en la cavidad de individuos sanos.2,3 Existen varios géneros, los más frecuentes pertenecen al género
Cándida.
Cándida y sus especies no son patógenas por naturaleza, se encuentran como comensales y necesitan que se
produzcan alteraciones en el equilibrio, tanto en las defensas celulares, en la fisiología o en la flora normal para
poder colonizar infectar y producir enfermedad2, de modo que son considerados como patógenos potenciales.
Estas levaduras pueden encontrarse formando parte de la microbiota normal de la cavidad bucal (lengua,
paladar, mucosa bucal). Se sabe que pueden aislarse en el 53 % de los individuos normales a partir de la
mucosa bucal1 y en un 25 % se aíslan levaduras de la cavidad bucal con un predominio importante de la especie
albicans.4
Las infecciones por Cándida son de nominadas Candidiasis o Candidosis, pueden cursar en forma aguda o
crónica y ser superficiales o profundas ; son frecuentes en personas de cualquier edad aunque se observan
comúnmente en lactantes, ancianos y personas con factores predisponentes generales y locales.5
Cándida albicans es la especie frecuentemente aislada tanto en pacientes inmunocompetentes como
inmunocomprometidos. Existe en todos los casos de infecciones por levaduras en la boca y generalmente en
asociación con otras especies de Cándida, lo que explica las diferentes respuestas frente a los antifúngicos.
Los factores de virulencia están codificados por genes, entre ellos se han descriptos el gen de la
hexosaminidasa, genes de proteínas aspárticas ( SAP1, SAP2, SAP3, SAP4) y un gen que le confiere capacidad
de formar tubos germinativos y aumentar se adhesión ( INT - 1).6,7,8
La Gingivitis marginal Crónica no causa dolor y puede permanecer estacionaria por tiempo indefinido o
preceder a la destrucción de las estructuras de soporte de la pieza dentaria ( Periodontitis). Clínicamente se la
llama Marginal porque afecta al margen gingival y según su evolución : localizada o generalizada. El
diagnóstico clínico de la Candidiasis bucal debe ser corroborado con la observación microscópica y por su
aislamiento en los cultivos, caso contrario no se confirma el diagnóstico.9,10
Los OBJETIVOS GENERALES del presente trabajo son los siguientes :
• Determinar la presencia de levaduras en los pacientes que presentan Gingivitis Marginal Crónica.
• Realizar la tipificación de las levaduras y su relación con Gingivitis Marginal Crónica.
• Determinar la sensibilidad a los antifúngicos.
OBJETIVOS PARTICULARES :
• Identificar el / los tipos de levaduras que más frecuentemente aparecen en las Gingivitis Marginal Crónica.
• Evaluar mediante métodos específicos de coloración y de cultivos la presencia de levaduras.
• Determinar niveles de Inmunoglobulinas A secretorio en líquido crevicular y en saliva.
MATERIALES Y METODOS
Este trabajo se lleva a cabo en la Facultad de Odontología en la Cátedra de Microbiología con la colaboración
de las Cátedras de Clínica Estomatológica, Periodoncia e Introducción a la Odontología y el Instituto de
Medicina Regional de la U.N.N.E.
• Se trabaja con pacientes, de ambos sexos, de raza blanca, edad promedio de 17 a 30 años, estudiantes de la
Carrera de Odontología, que son informados sobre el proyecto y luego firman su consentimiento y
compromiso de participación en el proyecto.
• Se confeccionan historias clínicas completas.
• Protocolos de laboratorio.
• Instrumental necesario para trabajar en Microbiología : - Estufas. - Material de vidrio. - Medios de cultivos.
- Colorantes especiales. - Antifúngicos.
La metodología empleada con los pacientes en la Clínica Estomatológica y en Periodoncia es la confección
de historias clínicas, realizándose el diagnóstico de Gingivitis Marginal Crónica para realizar luego el
correspondiente estudio micológico.
Se trabaja con una muestra de 40 (cuarenta) pacientes, un primer grupo de 20 (veinte) pacientes que
presenten Gingivitis Marginal crónica como unidad experimental y un segundo grupo de 20 (veinte) pacientes
que no presenten Gingivitis Marginal Crónica como grupo testigo.
Posteriormente a los pacientes se los cita por separado en horario y fecha determinada con el objeto de
efectuarles la toma de muestra según las siguientes normas :
• Concurrir de mañana a las 08,00 horas, en ayunas (se puede realizar un enjuague con agua). Se llena el
protocolo y luego se procede a tomar las muestras para los estudios micológicos e inmunológicos.
• Una vez obtenida las muestras del surco gingival con hisopos de algodón estériles, se efectúan los :
1.- Estudios de Microscopía : tanto en examen al estado fresco y con coloraciones de Gram , coloración
Giemsa.
2.- Posteriormente las muestras se toman con hisopos en medio Infusión cerebro-corazón (BHI), con el
agregado de glucosa, durante 24 horas a 4ºC.
3.- Se realizan cultivos : se siembran en agar miel (AM) con antibióticos (ATB) como cloramfenicol y
rifampicina. La siembra se realiza en 4 (cuatro) tubos de agar miel. Se incuban 2 (dos) tubos a 37ºC y 2 (dos)
tubos a 28ºC durante 48 horas. La purificación de las cepas : los microorganismos obtenidos son sembrados por
duplicado en medio de Soboureaud (SB) / ATB y en agar malta y se incuban 2 (dos) tubos a 28ºC y 2 (dos)
tubos a 37ºC durante 48 horas.
4.- Se realiza a continuación la identificación de Levaduras, se seguirá la metodología utilizada por Kreeger
Van-Rij 5.
a.- Caracteres morfológicos de las colonias.
b.- Caracteres micromorfológicos de las colonias : micelios (reproducción vegetativa). Formación de ascos y
ascosporos (sembrados en medios de Goroscowa).
c.- Prueba de tubos germinativos y formación de Clamidosporos (medio de Negroni).
d.- Caracteres fisiológicos : - Zimograma : Fermentación de azúcares : glucosa, sacarosa, lactosa, rafinosa,
maltosa y trehalosa. - Auxonograma : Asimilación de compuestos nitrogenados y carbonados (20 compuestos).
- Producción de Ureasa.
5.- Sensibilidad a Antifúngicos : Pruebas de sensibilidad in vitro : se emplea el Micrométodo de referencia
M27-P estandarizado por el National Committee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS) Subcommittee on
Antifungical Suceptibility Testing, en medio líquido para pruebas de sensibilidad de levaduras frente a
antifúngicos.6
a.- Antifúngicos : se ensaya la actividad de Anfotericina B (AMB) (Fungizone Gibco), Flucitosina (5FC),
Fluconazol (FCZ), Ketoconazol (KTZ), Miconazol (MCZ) e Itraconazol (ITZ). (Janssen Research Fundation
Argentina).
Se utilizan soluciones madres en agua para AMB y 5FC y en Dimetilsulfóxido para FCZ, ITZ, KTZ y MCZ.7
b.- Medio de cultivo : RPMI 1640 10X (flow) tamponado con buffer MOPS (ácido morfopropilen sulfónico)
1,65 M pH 7,2 adicionado con L-glutamina 200 nM y glucosa al 18 %.
c.- Micrométodo : se emplean microplacas de cultivos de tejidos estériles (96 celdas) de fondo plano, cargadas
con las distintas concentraciones de antifúngicos y sembradas con el medio de cultivo inoculado.
d.- Lectura : las microplacas se leen en forma automatizada en un lector de Elisa a 405 nanómetros,
considerando para cada aislamiento el 100 % de crecimiento a la absorvancia media de las celdas control sin
droga y la CIM a la concentración de cada droga que determina el 80 % de inhibición de crecimiento.
6.- Dosaje de Ig. A Secretoria : se realizan mediante Inmunodifusión radial, según técnica de Mancini en
líquido crevicular y saliva.
Los datos obtenidos son evaluados mediante análisis estadísticos.
RESULTADOS
Los resultados parciales muestran que de los 18 pacientes examinados repartidos en 9 con diagnóstico clínico
de Gingivitis Marginal Crónica y 9 pacientes tomados como grupo testigo ( salud gingival) una vez realizado el
proceso de aislamiento se observó que : a) en la G.M.C. localizada : en dos pacientes fueron aislados levaduras
sp. En dos pacientes Cándida especie albicans (por la prueba de filamentización) ; hubo cultivo negativo, es
decir no se aislaron elementos micológicos en un paciente. Total de pacientes con diagnóstico de G.M.C.
localizada = 5 (56 % ) Gráfico 1.
b) en la G.M.C. generalizada : en un paciente fueron aislados levaduras sp. Entres pacientes fueron aislados
Cándida albicans. No se observaron cultivos negativos. Total de pacientes con diagnóstico de G.M.C. = 4 ( 44
% ) Gráfico 2
c) Del total de paciente tomados como grupo testigo : en tres paciente fueron aislados levaduras sp. En seis
pacientes no hubo desarrollo de elementos micológicos en los medios de cultivo. Gráfico 3.
Gráfico 1-
Gingivitis Marginal Crónica
localizada.
20%
40%
Levaduras
Candidas
Cultivos(-)
40%
Gráfico 2-
Gingivitis Marginal Crónica
Generalizada
0%
75%
25%
Levaduras
Cándidas
Cultivos(-)
Gráfico 3-
Grupo control o Grupo testigo
67%
0%
33%
Levaduras
Cándidas
Cultivos(-)
BIBLIOGRAFIA
• 1.- Stenderup, A. Oral Micology. Acta Odont. Scand. 1990 1990, Feb.48(1):3-10.
• 2.- Quindós, G; Pontón, J. Candidiasis de la Cavidad Oral: Etiología, Patogenia y Diagnóstico de
Laboratorio. Rev. Medicina Oral. 1996; 1: 85-95.
• 3.- Cannon, R.D; Holmes, A.R. y otros. Oral Cándida: Clearence, colonization or Candidiasisi? J Dent. Res.
1995 1995; 74: 1152-1161.
• 4.- Hostetter, M.K. Adhesion and morphogenesisi in Candida albicans. Pedietr. Res. 1996, 39:569-573.
• 5.- Cuttler, J.E. Putative virulence factors of Cándida albicans. Ann.Ref. Microbiol.1991; 45:187-218.
• 6.- Odds, F.C. Cándida species and virulence.ASM NEWS.1994; 60:313-318.
• 7.- Carranza, F.A. Periodontolología Clínica de Glickman. Sexta edición. Edit. Interamericana.1986.
Pp.113-115/740.
• 8.- Quindós, G; Lipperheide, V. y otros. Evaluation of two commercialized systems for the rapid
identification of medically important yeast. Mycoses. 1993;36:299-303.
• 9.- Bascones Martinez, A.; Manso Platero, F.J.; Infecciones Orofaciales. Diagnóstico y Tratamiento. Edic.
Avances Médico-dentales, SL.1994 Pp.47-58.
• 10.- Koneman, E.W.; Roberts, G.D.; Micología. Práctica de Laboratorio. Tercera edic. Edit. Médico
Panamericano. 1994. Pp:60-61/175-195.