Curso Práctico de Genética - Sección Genética Evolutiva

Sección Genética Evolutiva
Departamento de Biología Animal
Instituto de Biología
Facultad de Ciencias
Curso Práctico de Genética
2010
Coordinadores
Ruben Pérez y Adriana Parodi
Esta guía fue elaborada por los docentes de la Sección Genética Evolutiva.
ANÁLISIS INFORMÁTICO DE SECUENCIAS DE ADN
El objetivo de este práctico es introducir al estudiante al análisis de secuencias de
ADN mediante la utilización de programas informáticos. Para esto utilizaremos bases de datos
de secuencias y programas. Lea la información detalladamente y conteste a las preguntas
propuestas.
Las bases de datos contienen las secuencias que obtienen los investigadores de todas
partes del mundo. Estas bases de datos son accesibles a todo el mundo y contienen
información sobre secuencias de ácidos nucleicos o secuencias proteicas. Las secuencias de
ácidos nucleicos se mantienen en tres grandes bases de datos que sirven a la comunidad
científica: EMBL (European Molecular Biology Laboratory), GeneBank (the NIH genetic
sequence database) y DDBJ (DNA Database of Japan). Cuando un laboratorio envía una
secuencia, se crea una ficha con datos específicos que facilitan su organización. Un
investigador puede comparar las secuencias que ha obtenido para establecer si existe
similaridad con alguna secuencia ya existente en la base de datos.
Ejercicio 1.
De una biblioteca genómica humana se obtuvo la siguiente secuencia (Secuencia 1).
a) Analice esta secuencia para encontrar homología con alguna secuencia ya descrita
utilizando la base de datos del GeneBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Seleccione la
opción BLAST, luego Nucleotide blast e introduzca la secuencia 1 (utilice cortar y
pegar). Seleccione la base de datos (database): Others Nucleotide collection (nr etc.).
Puede limitar su búsqueda a humanos en la opción: Organism.
SECUENCIA 1
AGGCCGCGCCCCGGGCTCCGCGCCAGCCAATGAGCGCCGCCCGGCCGGGCGTGCCCCCGCGCCCCAAGCATAAAC
CCTGGCGCGCTCGCGGCCCGGCACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACCATGGTGCTGTCTCCTG
CCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGG
AGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCC
TGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGA
CCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAAGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGC
TGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGC
TTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCT
TCCTCTCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCGCGGCTTGGGCCGCACTGAC
CCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCACCCC
TGCGGTGCACGCTTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAAGCTGG
AGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCGGCCCTTCCT
GGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCAGCCTGTGTGTGCCTGGGTTCTCTCTGTCCCGGAATGTGCCAACAA
TGGAGGTGTTTACCTGTCTCAGACCAAGGACCTCTCTGCAGCTGCATGGGGCTGGGGAGGGAGAACTGCAGGGAG
TATGGGAGGGGAAGCTGAGGTGGGCCTGCTCAAGAGAAGGTGCTGAACCATCCCCTGTCCTGAGAGGTGCCAGCC
TGCAGGCAGTGGC
b) Obtenga información adicional sobre esta secuencia utilizando el link de Gene info (G).
Realice un pequeño resumen de la información obtenida indicando en qué cromosoma se
encuentra el gen y cómo está organizado el cluster que lo contiene.
c) Analice esta secuencia utilizando la herramienta BLAST como procedió en a)
SECUENCIA 2
ACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACCATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGC
CGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGATGTTCCTGTCCTTCCC
CACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGT
GGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCA
CGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCA
CCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGAC
CTCCAAATACCGTTAAGCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCC
CTCCTTGCACCGGCCCTTCCTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC
d) Compare (alinear) ambas secuencias utilizando la opción Align two sequences using
BLAST (bl2seq) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/bl2seq/wblast2.cgi) localizada en la página del
Blast/ Specialized BLAST.
¿Qué conclusiones puede obtener de su análisis? Realice un esquema comparando ambas
secuencias
e) Indique los sitios de inicio y finalización de la traducción. Para esto establezca el marco
abierto de lectura del gen a partir de la secuencia 2. Utilice la herramienta ORF finder
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html). Puede acceder a partir página principal del
NCBI: Sequence análisis/Tools/Open Reading Frame Finder (ORF Finder). Indique el tamaño
(en aminoácidos) de la proteína codificada.
Ejercicio 2
Analice la siguiente secuencia aminoacídica y establezca que dominio conservado
presenta. Para hacerlo seleccione la opción Protein blast del BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). La primera ventana que aparece presenta el
dominio y su localización en forma gráfica. Haga clic en el recuadro rojo que representa el
dominio para obtener información adicional.
MTDFFQISQKKCFRLKNPLKHQTQRANTRFRRSHPSSIDTFSNCSDFKSKFYYASMKFQSFLSNRTFSLKVNNTI
SPLKHPIPSGVPQGTVSGPLLFILFINDVLLKIPPSVQVSCYADDIKIYGPSASDLQSTIDQIATWSKRNHLPLA
PAKTSLLHLGPLNKLHSFTVDNIPVLPSSSVRDLGLLTDDKLTFKSHINRISSLALLRSKQILKSFSSTSPEFYV
NLYKLYVSPILEYCSVVFSPPPNSKLAKTLESPLQYYSKRALQRCNIKYNSKSTVNNTSNYSQSYLNRIQILNIQ
TARSLRLKAQLLLLYNILTGTAYFPDINDFVVFVSSNRRPMLLINRHPKVRNFFSQVVPIWNSIVHNSPEFLPPS
SFSLLIESNICKF
Obtenga información sobre las secuencias que presentan este dominio utilizando la base de
datos del pubmed: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed
Escriba en español el título o tema de dos trabajos encontrados en la base de datos acerca de
este tema.
Ejercicio 3
La siguiente secuencia corresponde a una retrotranscriptasa de Mepraia spinolai
(Hemiptera-Reduviddae). Realice un BLAST con ella y observe las similitudes que presenta
con otras secuencias. Utilice primero la opción nucleotide blast y luego la opción blastx.
¿Por qué existen diferencias en los resultados obtenidos?
AGCATATCGTCGACGTAGTGGTTTGAGTTTCCTGTGATTTTTCGTTTCTAAGATATTTTGTACACACA
CACATTTATATTTTGCGGTAATTTAGAATCTCAAGAAACCCTTTTAATTTATAATTGTATCACTAACT
ACAATGCAGTACCGTACCAGTAACGTGTCAATACAGTCTGTAGAGCTCATATCCCATGCGACTGGAAG
AAGTCAGAAATCGCTCCCATACTGAAGAAAGATAAATCCTCAAATATTCCGGAGAGTTATCGACCTAT
AGCTCCTACAAGCATGTTCTCTAAGCTTTACGAGAGAATGCTCCTTGATCGCCTTCAGATATACTTAG
ACAAAATGGATCTGATTTCAAACAAGCAAGCTGGTTTCAGAAAACACAGAAATACAGTTGAGCAGGCC
GCCTTCCTGTCACAGGAAATAAGGAACGGTTTCAATAGGAAGCAAAGTACCCTTGCCGTCTTTATAGA
TTTAAAGGCTGCGTTAGACAGAGTTTGGAGGGAGAGGCTGCTGGAAATATAGGCATCATACGTAACTT
GTaCAAAAGCATGAACTCGCTCCTAGCGCTAACACTCATCAGAGTAAAGTaCAACAATGTGTTCTCCC
CGTGCAAAAAAGCTGTA
OTRAS UTILIDADES DE LA BASE DE DATOS DEL NCBI.Buscador taxonómico
Esta utilidad permite establecer las secuencias existentes para determinada especie.
Diríjase a la página taxonómica del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/).
Utilice la utilidad para establecer la clasificación correcta de los siguientes organismos y
obtener información sobre las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas disponibles.
a) Caenorhabditis elegans, b) Arabidopsis thaliana, c) Schizosaccharomyces pombe
Cuantas secuencias nucleotídicas de Arabidopsis thaliana existen en el GeneBank?
VecScreen
La secuencia que obtenemos puede presentar contaminación del vector en la que fue
clonada. Esta utilidad (special/vecscreen) permite identificar y eliminar secuencias del vector
para obtener la secuencia de interés totalmente “limpia”. Puede ingresar a esta utilidad desde
la
página
central
del
NCBI
o
utilizando
este
link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html. Establezca la presencia de
secuencias del vector en la siguiente secuencia. Realice un esquema indicando el tamaño de
las regiones de esta secuencia que pertenecen al vector.
GTGAGTCGTATTAATTTCGATAAGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTT
TGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGA
GCGGATGTCAGGGCGGGGGAAGGGAGGCAAGGGATTGGGAAAGGGAGGCGCCAAGCGTCACCGTAAGG
TGCTTCGCGATAACATTCAGGGTATCACAAAGCCAGCAATCCGGCGTTTGGCTCGTAGAGGTGGAGTC
AAGCGTATCAGTGGCTTGATCTACGAGGAGACACGTGGCGTCCTGAAGATATTCTTGGAGAACGTCAT
CCGTGACGCCGTGACCTACACTGAGCACGCCAGGAGAAAGACCGTGACCGCGATGGACGTCGTTTACG
CTCTCAAGAGGCAGGGCAGGACTCTTTATGGATTTGGGGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACG
GTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGA
ACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGC
ALGUNAS HERRAMIENTAS PARA EL ANÁLISIS DEL ADN
TÉCNICAS DE ADN RECOMBINANTE
Enzimas de restricción
Las enzimas o endonucleasas de restricción son proteínas que reconocen secuencias
particulares del ADN, uniéndose a ellas y cortando en sitios específicos. A partir de su
descubrimiento este grupo de enzimas es empleado en el laboratorio para cortar moléculas
de ADN. Las secuencias reconocidas por las enzimas de restricción son generalmente de
cuatro o seis pares de bases y palindrómicas, es decir que la secuencia de bases leída de 5’ a
3’ en ambas hebras es la misma (fig.1). Las enzimas de restricción de tipo II cortan en una
posición específica del ADN dentro de su secuencia de reconocimiento, denominada sitio de
restricción.
EcoRI
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
HindIII
5’ AAGCTT 3’
3’ TTCGAA 5’
BamHI
5’ GGATCC 3’
3’ CCTAGG5’
SmaI
5’ CCCGGG 3’
3’ GGGCCC 5’
Figura 1. Algunos ejemplos de enzimas de restricción empleadas en el laboratorio. Las flechas indican
los sitios de corte.
Algunas enzimas de restricción cortan cada cadena del ADN en diferente sitio, dando lugar a
extremos “pegajosos”, mientras otras cortan en el mismo sitio ambas cadenas, dando lugar
a extremos romos (fig.1). Cada enzima trabaja bajo condiciones apropiadas de concentración
salina, pH y temperatura.
Una molécula de ADN cortada por una determinada enzima de restricción originará una serie
de fragmentos cuyo número y tamaño dependerá de la cantidad y la localización de los sitios
de reconocimiento que existan para esa enzima en esa molécula de ADN. Los fragmentos
generados por la digestión con enzimas de restricción pueden unirse por la acción de una
enzima, denominada ADN ligasa, que forma enlaces fosfodiester entre extremos 5’ y 3’ de
los nucleótidos. De esta forma, los extremos romos pueden unirse independientemente de la
secuencia que contengan, mientras que los extremos “pegajosos” sólo se unirán si existe
complementariedad entre las porciones de simple cadena. Las enzimas de restricción y las
ADN ligasas son herramientas claves para la clonación de ADN. Esto significa que cualquier
fragmento de ADN (por ejemplo un gen que codifica para una proteína) puede obtenerse
tras digestión con enzimas de restricción y agregarse a un plásmido o cualquier otro vector.
Este vector es introducido en una célula huésped y dentro de ésta, la molécula de ADN
recombinante puede replicarse y expresarse.
Mapas de restricción
Los fragmentos de ADN, resultantes de una digestión con enzimas de restricción, pueden
ser separados por electroforesis en geles de agarosa. Este método consiste en aplicar una
corriente eléctrica a través del gel, de modo que el ADN que tiene carga negativa migre
hacia el electrodo positivo. La velocidad de migración dependerá del tamaño de cada
fragmento. Para un fragmento lineal, esta será inversamente proporcional al log10 de su peso
molecular (fig.2).
Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa. El gel se coloca en una cuba de electroforesis sumergido en
el buffer de corrida. Las muestras que contienen el ADN son colocadas en pocillos en uno de los
extremos del gel. Al aplicarse una corriente eléctrica, las moléculas de ADN migrarán a través del gel
en función de su tamaño, desde el polo negativo al polo positivo.
Un factor importante en la electroforesis es la concentración de la agarosa en el gel. Cuanto
mayor es la concentración más retrasa el movimiento de todos los fragmentos. Así, se
recomiendan concentraciones altas de agarosa para ver y separar fragmentos pequeños de
ADN, mientras que será mejor emplear concentraciones bajas de agarosa cuando se trate de
separar fragmentos grandes (tabla 1).
Tabla 1
% de agarosa en el gel Rango de separación eficiente
de moléculas de ADN lineal (kb)
0,3
60-5
0,6
20-1
0,9
7-0,5
1,5
4-0,2
2,0
3-0,1
Tras la corrida electroforética, los distintos fragmentos de ADN así separados son
visualizados por tinción. Uno de los métodos de tinción más empleados es el bromuro de
etidio el cual se intercala entre las bases del ADN y fluoresce bajo la luz ultravioleta.
La combinación de digestión con enzimas de restricción y electroforesis en gel se llama
análisis de restricción. La representación de una molécula de ADN, ya sea circular o lineal,
donde se indiquen los sitios de restricción que poseen, se denomina mapa de restricción (fig.
3).
EcoRI 1/5.541
HindIII 32
PvuII 4.916
EagI 942
YIP5
5.541
ApaI 2.035
PvuII 3.247
SmaI 2.540
Figura 3. Mapa de restricción del plásmido YIP5 de 5.541 pb. Los números indicados después de cada
enzima de restricción indican las posiciones de los sitios de corte.
Ejercicio 1
Indica los tamaños de los fragmentos que obtendrías tras la digestión del plásmido YIP5 con
EcoRI, con EcoRI y EagI, con HindIII y ApaI, con HindIII, ApaI y PvuII.
Análisis por hibridación
Para conocer si está presente una determinada secuencia de ADN (por ejemplo la
correspondiente a un determinado gen) en una muestra se realiza un análisis por
hibridación. Este implica separar (desnaturalizar) las moléculas de ADN de la muestra a
analizar y mezclarlas con moléculas de ADN (o ARN) de cadena simple con homología con
toda o parte de la secuencia que queremos buscar. Esta molécula se denomina sonda y se
marca con isótopos radiactivos u otro tipo de marcaje para poder ser detectada. En
condiciones apropiadas la sonda formará puentes de hidrógeno (hibridizará) con una
secuencia complementaria a ella si se encuentra presente en la muestra, formando una
molécula de doble cadena. Si la secuencia complementaria no se encuentra en dicha
muestra, la sonda no hibridizará. Tras el período de hibridización, la muestra se lava para
remover la sonda no hibridada, y la presencia de la secuencia de interés se pone de
manifiesto gracias a la sonda hibridada.
La desnaturalización de una molécula de ADN se lleva a cabo por métodos físicos, como el
calor, o por métodos químicos, como el tratamiento con una base. Las condiciones
dependerán del tamaño y de la composición de bases del ADN. La temperatura necesaria
para desnaturalizar en un 50 % una molécula determinada de ADN se denomina
temperatura de desnaturalización o “melting”. Si una muestra de ADN se hierve se
desnaturalizará, es decir, sus cadenas se separarán. Si la muestra se enfría las cadenas
volverán a hibridizar. Las moléculas complementarias cortas tenderán a hibridizar más rápido
que las moléculas largas.
Las sondas empleadas en experimentos de hibridación son de largo variable, desde cortos
oligonucleótidos de 15 a 30 bases de largo, hasta cadenas de miles de bases. Las sondas se
marcan por varios métodos. Algunos consisten en sintetizar la sonda en presencia de un
nucleótido radiactivo. También existen métodos de marcaje no radiactivos que consisten en
nucleótidos con modificaciones químicas que resultan en un producto coloreado o
luminiscente luego de una reacción de detección.
Southern blotting
Para hacer más facil la hibridización y posterior detección de la sonda, el ADN a ser analizado
se transfiere a una membrana mediante un método llamado Southern blotting. Este método,
junto con el análisis por hibridización, permite detectar los fragmentos de restricción que
contienen una determinada secuencia de ADN.
Primero la muestra de ADN a analizar se digiere con enzimas de restricción y los productos
se separan por electroforesis en gel de agarosa. Una vez separados estos fragmentos son
transferidos a membranas de nylon o nitrocelulosa. Para ello el gel se sumerge en una base
para desnaturalizar los fragmentos de ADN y luego se coloca sobre una pieza de papel cuyos
extremos se suspenden en un reservorio con una solución salina. La membrana se coloca
encima del gel y encima de esta se colocan servilletas absorbentes (fig.4). Se crea así un
fluido por acción capilar desde el reservorio y que atraviesa el gel arrastrando los fragmentos
de ADN que entonces son transferidos a la membrana. La membrana entonces contiene el
patrón de fragmentos exacto que se encontraba en el gel. Una vez transferido el ADN a la
membrana, éste se fija a la membrana por calor o por exposición a UV. La membrana así
preparada está pronta para someterla a hibridación con una sonda.
Figura 4. Southern blotting. El ADN es cortado con enzimas de restricción y los fragmentos se separan
por electroforesis en gel de agarosa. Tras la corrida, los fragmentos de ADN son transferidos a una
membrana de nylon o nitrocelulosa, mediante el proceso denominado Southern blotting. La
membrana resultante puede hibridarse con sondas radiactivas específicas para reconocer un ADN
homólogo presente en dicha membrana que será revelado posteriormente por autorradiografía (ver
más adelante).
Ejercicio 2
Se muestran los mapas de restricción para las enzimas EcoRI y BamHI del ADN de un virus
X. Los tamaños de los fragmentos están en kilobases (kb).
Mapa EcoRI
9
5,5
4
2
6
Mapa BamHI
3
7,5
10,5
5,5
Imagina que has digerido este ADN con estas dos enzimas de restricción por separado y con
ambas al mismo tiempo. Realiza el análisis de los productos de digestión tras una corrida de
electroforesis y tinción del gel con bromuro de etidio. En el esquema del gel mostrado a
continuación (a la izquierda), indica en cada carril las bandas que esperas obtener para cada
muestra.
Gel de electroforesis teñido
EcoRI
BamHI
Membrana de hibridación
EcoRI/BamHI
EcoRI
BamHI
EcoRI/BamHI
kb
10
8
6
4
2
1
Dicho gel fue posteriormente transferido a una membrana de nylon y el ADN fue fijado. Esta
membrana fue hibridada con una sonda específica que reconoce el ADN. El esquema de la
derecha representa el resultado de la hibridación donde se muestran las bandas que son
reconocidas por la sonda. A partir de este resultado determina la posición que ocupa el
segmento empleado como sonda en los mapas de restricción.
Ejercicio 3
Aquí se representan los mapas de restricción del ADN del bacteriófago lambda para tres
enzimas. Dibuja las bandas que se obtendrían tras digerir con las enzimas BamHI y HindIII
dicho ADN y las bandas que se visualizarían tras la hibridación con la sonda que está
señalada en el mapa para EcoRI.
Mapa BamHI
5,5
16,8
5,6
6,5
7,2
6,7
Mapa HindIII
23,1
2 2,3
9,4
6,5
4,4
0,6 0,1
Mapa EcoRI
Sonda
21,2
4,9
5,6
7,4
5,8
3,5
Gel teñido
kb
BamHI
HindIII
Membrana hibridada
BamHI
HindIII
24
16
8
4
2
CONSTRUCCIÓN DE LIBRERÍAS
Vectores y Clonación
Los plásmidos son capaces de albergar trozos extras de ADN, por lo que se abre la
posibilidad de poner una secuencia de ADN determinada (por ejemplo, un gen) en un
plásmido circular, generando un ADN recombinante. En estas circunstancias el plásmido está
funcionando como un “vector”: es capaz de llevar el trozo de ADN (que denominamos
inserto) manteniéndolo mediante la replicación, ya que posee un origen de replicación. Los
plásmidos contienen además genes para la resistencia a antibióticos (fig. 5). Por lo tanto
bacterias que contengan un plásmido que confiere resistencia a un determinado antibiótico,
serán ellas también resistentes a dicho antibiótico. Esta característica es utilizada para
seleccionar bacterias que contengan plásmidos frente a otras que no los contengan.
Los plásmidos no son los únicos vectores empleados en clonación. A menudo se requiere
clonar trozos de ADN mayores a los soportados por los plásmidos. Así, se emplean también
los bacteriófagos (virus que infectan bacterias) y también se han desarrollado otros vectores
que son combinaciones de plásmido, de bacteriófago, de cromosoma de levadura, etc. Así
surgieron por ejemplo los BACs (“bacterial artificial chromosome”).
Figura 5. Clonación de ADN.
Se pueden transformar bacterias con plásmidos que llevan un
determinado inserto (señalado en rojo). Una vez dentro de la
bacteria, el plásmido se replica con ella. Así se consigue que el
trozo de ADN además de estar aislado, sea amplificado y se
obtienen rápidamente muchas copias idénticas. Las bacterias que
contienen el plásmido son seleccionadas por crecer en presencia
de un antibiótico, ya que el plásmido lleva un gen que codifica
para un producto que confiere resistencia a ese antibiótico
(señalado en negro).
Ejercicio 4
¿Cuáles vectores pueden llevar el inserto más grande? ¿Qué ventajas tienen los YACs con
respecto a los otros tres?
a. Fagos
b. Plásmidos
c. Cósmidos
d. YACs
Ejercicio 5
Un fragmento de ADN de 1, 5 kb es clonado en el sitio EcoRI de un vector plasmídico de 5,5
kb de tamaño. Dicho vector es luego usado para transformar bacterias competentes. El ADN
plasmídico extraído de una única colonia bacteriana, es digerido con la enzima de restricción
EcoRI.
a) ¿Qué productos de digestión se producirán si el plásmido contiene el inserto?
b) ¿Y si no lo contiene?
Construcción y rastreo de librerías
Cuando el genoma entero de un organismo es cortado en trozos y clonado en un
determinado vector se construye una genoteca o una biblioteca o librería genómica. Esto es
posible por ejemplo si se corta dicho genoma con una enzima de restricción y todos los
fragmentos resultantes se insertan en plásmidos que han sido previamente digeridos con
esta misma enzima de restricción. Como resultado se obtienen una serie de plásmidos que
contienen distintos trozos de ADN correspondientes a ese genoma. Esta es una librería
genómica (fig. 6). También existen bibliotecas de ADN complementario o copia (ADNc), las
cuales son construidas a partir de la población total de ARNm de un organismo, de un tejido
o tipo celular particular o de una etapa del desarrollo particular. Representa en este caso al
conjunto de genes que están siendo expresados por esas células o por ese estadío. Para
construir una librería de ADNc, es necesario extraer el conjunto de ARNm y sintetizar
moléculas de ADN complementarias a esos ARNm. Esto se realiza gracias a la acción de una
enzima denominada transcriptasa inversa. Una vez sintetizada la cadena de ADN, la molécula
híbrida ADN-ARN es tratada con RNasa para degradar las moléculas de ARN y las cadenas
simples de ADN son utilizadas como molde para la síntesis de ADN de doble cadena por una
polimerasa. Las secuencias resultantes son entonces insertadas en un vector para generar la
librería de ADNc.
Figura 6. Esquema de la construcción de una librería
genómica humana en un vector plasmídico. El ADN
genómico humano es digerido con enzima de restricción y
los fragmentos resultantes son clonados en un vector
plasmídico. Los plásmidos recombinantes son luego
introducidos en una bacteria huésped mediante
transformación. La librería genómica se puede guardar como
un stock bacteriano y plaquearse en medio sólido o crecer
en medio líquido cuando va a ser utilizada.
Si utilizamos plásmidos que contienen una librería para
transformar bacterias, como Escherichia coli, y
plaqueamos los transformantes sobre un medio sólido
que contenga un antibiótico de selección, obtendremos
colonias individuales donde cada una contiene un
plásmido recombinante en particular. Las placas
conteniendo estas colonias pueden ser transferidas a
membranas. Una vez transferidas, las bacterias son
lisadas para exponer su ADN y el ADN se
desnaturaliza. Tras fijar el ADN a la membrana por
calor o por exposición a UV, estas membranas pueden
ser hibridizadas con una sonda específica.
Si se coloca encima de ellas un film fotográfico que
luego es revelado,
la colonia que contiene un
plásmido con una secuencia de ADN complementaria a la sonda, se evidenciará como una
mancha negra en el film. Este proceso de exposición se denomina autorradiografía (fig. 7).
El autorradiograma resultante puede ser comparado con la placa de agar que contiene las
colonias bacterianas, para localizar la colonia que contiene el plásmido con la secuencia de
interés. Esta colonia luego es sometida a un proceso de verificación, es decir se aísla, se replaquea y se vuelve a hibridar con la sonda y/o se secuencia para confirmar la presencia del
gen de interés.
Hibridización,
lavado y
autorradiografía
Transferencia
Colonias sobre una
placa de agar
Membrana
Autorradiograma
Figura 7. Rastreo de una librería genómica construida en plásmidos. Para garantizar que la sonda
“encuentre” su secuencia complementaria, es necesario plaquear la librería de manera que resulte un
número suficiente de colonias individuales, tomando en cuenta que existirán colonias “repetidas”.
Ejercicio 6
El plásmido pUC18 lleva el gen que confiere resistencia a ampicilina y lleva un fragmento del
gen lacZ que confiere la capacidad de convertir el compuesto X-gal sin color a un compuesto
de color azul. Si un fragmento de ADN es clonado interrumpiendo esta última región,
a) ¿De qué color serán las colonias que lleven plásmidos con el inserto de ADN si dichas
colonias son plaqueadas en un medio conteniendo ampicilina y X-gal?
b) ¿De qué color serán las colonias plaqueadas en el mismo medio si contienen
plásmidos que no llevan inserto de ADN?
c) ¿Por qué es necesario que el medio de cultivo contenga ampicilina? ¿Qué colonias
espera que crezcan en ausencia de este antibiótico?
Ejercicio 7
Un plásmido resistente a ampicilina y a tetraciclina pBR322, se corta con la enzima de
restricción PstI que corta dentro del gen de resistencia a ampicilina. El plásmido cortado se
liga con un DNA de Drosophila digerido con PstI para preparar una biblioteca genómica y la
mezcla se utiliza para transformar E. coli K12.
a) ¿Qué antibióticos deben añadirse al medio de cultivo para obtener colonias con
plásmidos que contengan insertos de Drosophila?
b) ¿Cómo se puede explicar la presencia de colonias que sean resistentes a ambos
antibióticos?
Secuenciación del ADN
Los métodos más comunes para secuenciar el ADN utilizan compuestos llamados
terminadores de cadena (método de Sanger). Se trata de dideoxinucleótidos (ddNTPs) que al
incorporarse a una cadena que se está sintetizando, son capaces de detener la elongación
llevada a cabo por la ADN polimerasa. Los ddNTPs son moléculas parecidas a los nucleótidos
normales excepto que carecen del grupo 3’ hidroxilo (OH). La ADN polimerasa agrega este
nucleótido a una cadena de ADN en crecimiento mediante la formación de un enlace entre el
grupo 5’ fosfato del nuevo nucleótido y el grupo 3’ OH del nucleótido previo. Seguidamente
la enzima no podrá agregar más nucleótidos debido a la ausencia del grupo 3’ OH.
Para una reacción de secuenciación se debe mezclar la molécula de ADN molde con
cebadores o “primers” requeridos por la ADN polimerasa para iniciar la síntesis y
deoxinucleótidos (dNTPs) normales. Esta mezcla es dividida en cuatro tubos y a cada tubo se
le agrega un ddNTPs (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP) diferente. Por último se agrega la ADN
polimerasa que comienza la reacción de síntesis. Durante la reacción de polimerización, la
incorporación al azar de un ddNTP en competición con el dNTP normal correspondiente,
llevará a la formación de una mezcla de cadenas de distintas longitudes, todas ellas
empezando en el extremo 5’ y terminando en todas las diferentes posiciones posibles donde
un ddNTP puede incorporarse en lugar de un dNTP. Completada la reacción, en el tubo que
contiene por ejemplo ddA, las nuevas moléculas sintetizadas contendrán ddA en cada sitio
correspondiente a T en el molde. Como resultado se han generado una serie de moléculas
que terminan en las distintas T del molde. La sustitución de uno de los dNTPs por el mismo
nucleótido marcado permite la visualización posterior. Esta se hacía clásicamente por
electroforesis en geles de poliacrilamida. cargadas en distintos pocillos del gel de Las
moléculas sintetizadas se separarán de acuerdo a su tamaño y podrán visualizarse por
exposición del gel a un film fotográfico y posterior revelado (fig. 8).
Figura 8. Autorradiografía obtenida a partir de un gel de secuencia
desnaturalizante de acrilamida-bisacrilamida. Tras la corrida electroforética,
los fragmentos de ADN de simple cadena que difieren en un nucleótido de
longitud, se separan en el gel. Dichos fragmentos son visualizados luego
de secar el gel y exponerlo sobre un film de autorradiografía ya que uno de
los dNTPs utilizados en la reacción de secuenciación es radiactivo.
G
A
T
C
Ejercicio 8
¿Puedes leer la secuencia de la figura?
Al final de la década de 1980 aparecen equipos de secuenciación automática los cuales,
basados en el mismo principio de terminación de cadena, emplean dideoxinucleótidos
modificados que llevan un grupo fluorescente (distinto para cada ddNTP) o bien a cada una
de las cuatro reacciones se le añade el cebador marcado en 5’ con una sonda fluorescente
distinta. Los productos de reacción se detectan directamente durante la electroforesis al
pasar por delante de un láser que al excitar los fluoróforos permite detectar la fluorescencia
emitida (fig. 9). Con estos instrumentos las lecturas de secuencia se transforman en
cromatogramas de picos de cuatro colores.
Figura 9. Secuenciación
automática
utilizando
terminadores fluorescentes.
La reacción se lleva a cabo
en un solo tubo. Cada
terminador
fluorescente
emite a una determinada
longitud de onda generando
un electroferograma.
Existen instrumentos de electroforesis capilar como alternativa al sistema basado en geles de
poliacrilamida, donde se utiliza un polímero que se inyecta de forma automática en un
capilar antes de cargar la mezcla de secuenciación y que va resolviendo los fragmentos de
ADN que se diferencian en una única base (fig. 10). Estos instrumentos permiten la total
automatización del proceso así como una mayor rapidez. Con estos métodos ha sido posible
encarar estrategias de secuenciación de gran escala como han sido los proyectos de
secuenciación de genomas completos de organismos.
En muchas enfermedades genéticas humanas, una copia cromosómica contiene una o una
bases cambiadas en determinada posición dentro del gen. Cuando se obtienen los datos de
la secuencia de ese ADN se observan dos bases diferentes en la misma posición. En el
contexto de la secuenciación automática se detectan dos picos superpuestos en la misma
posición.
Figura 10. Secuenciación automática
capilar. El equipo funciona de forma
automática inyectando las muestras en un
capilar previamente cargado con un
polímero que funciona como matriz como
lo hace la matriz de acrilamidabisacrilamida-urea de los geles de
secuencia. Una vez desarrollada la
electroforesis de la primera muestra, el
capilar se vacía rellenándose nuevamente
con polímero fresco y se inyecta una
segunda muestra.
Ejercicio 9
Escribe la secuencia correspondiente al siguiente cromatograma. El código de colores es: G,
negro – C, azul – T, rojo – A, verde
A pesar de que el método automático de Sanger fue el método de secuenciación dominante
durante casi 2 décadas, en los últimos 4 años las estrategias de secuenciación cambiaron
drásticamente, dando lugar a nuevos y revolucionarios métodos referidos como “next
generation methods” (NGS). Estos métodos tienen la capacidad de producir un enorme
volumen de datos de secuencias. Estas nuevas tecnologías permiten una secuenciación más
barata y eficiente, a pesar de obtener fragmentos (reads) de menor tamaño. Las secuencias
aisladas obtenidas requieren el empleo de potentes herramientas informáticas para su
ensamblaje.
Distintas empresas han desarrollado distintos métodos tales como son el método 454 de
Roche, Solexa de Illumina y SOLiD de Applied Biosystems. Aunque entre ellos difieren en la
forma de preparación del ADN molde a secuenciar, todos se basan en la inmovilización del
molde a una superficie sólida o soporte. La mayoría de los métodos utilizan un paso con
clonación in vitro para generar muchas copias de cada molécula individual, ya que los
métodos de detección molecular frecuentemente no son lo suficientemente sensibles para la
secuenciación de una sola molécula. Uno de los métodos es la PCR de emulsión, en la que se
aíslan las moléculas individuales de ADN junto con microesferas. Luego, mediante una
reacción de PCR se recubre cada microesfera con copias clonales de la biblioteca de
moléculas aisladas y seguidamente se inmovilizan ocupando cada microesfera una
localización fija para ser más tarde secuenciadas.
En algunos de los métodos, la secuenciación de estas moléculas molde se basa en la
incorporación, gracias a la ADN polimerasa de nucleótidos fluorescentes, y en la lectura
basada en la microscopía de fluorescencia. Durante la polimerización del ADN se incorpora
un nucleótido marcado con fluorescencia y que está protegido en la cadena naciente por lo
que impide que ésta siga creciendo. Tras detectar la señal fluorescente, se elimina el grupo
fluorescente protector, regenerando un extremo 3´OH libre, y se puede incorporar otro
nucleótido marcado, con lo que se empieza nuevamente el ciclo.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Es una técnica muy rápida que permite, a partir de una sola copia de una molécula de ADN,
obtener muchas copias de dicho ADN. Por lo tanto resulta ser una técnica muy útil en
estrategias de clonación y también de detección, cuando la cantidad de material es limitante,
como en el área forense y de identificación humana, así como en genética de poblaciones.
Esta técnica aprovecha las características de la replicación del ADN, es decir que a partir de
un pequeño cebador la polimerasa puede proseguir la síntesis de una cadena. Se debe
contar con dos cebadores adecuados, uno para cada cadena (fig.11). Por la posición de
estos cebadores, al cabo de una serie de rondas de replicación, se obtiene la amplificación
de una molécula de ADN correspondiente al tramo que va desde uno de los cebadores al
otro. Por lo tanto, se obtienen muchas moléculas idénticas. Los cebadores suelen ser cortos
de 15-20 bases y en la reacción se mezclan con la muestra de ADN a ser amplificada. Al
comenzar la reacción, la muestra de ADN de doble cadena debe ser desnaturalizada
calentándola a 95ºC y luego enfriada para permitir la hibridación con los cebadores. La
siguiente etapa consiste en la síntesis a partir de los cebadores de cada una de las cadenas
de ADN por la polimerasa utilizando nucleótidos agregados a la mezcla de reacción. Este
ciclo de desnaturalización, hibridización y síntesis o extensión se repite muchas veces y por
tanto se amplifica, puesto que en cada nuevo ciclo se dispone de más cantidad de ADN
molde. Como el ADN tiene que ser desnaturalizado por calor para iniciar cada nuevo ciclo, se
emplea una polimerasa que resiste el calor (denominada Taq polimerasa, aislada de la
bacteria de aguas termales Thermus aquaticus).
La reacción de PCR se lleva a cabo en un aparato
denominado termociclador, capaz de realizar
cambios muy rápidos de temperatura. Así, la mezcla
de reacción es colocada en el termociclador
estableciéndose las condiciones de incubación. En
primer lugar se establece el número de ciclos, que
puede variar, oscilando generalmente alrededor de
los 30 ciclos. Posteriormente se determinan las
condiciones de cada ciclo. Este último se divide en
una etapa de desnaturalización, que se lleva a cabo
a 95ºC durante 10-60 segundos, una etapa de
hibridización de 30-60 segundos a una temperatura
que
dependerá
de
la
temperatura
de
desnaturalización de los oligonucleótidos utilizados
como cebadores, y por ultimo una etapa de
extensión que se realiza también durante un tiempo
variable, generalmente a 72ºC o a la temperatura
que sea óptima para la polimerasa que se emplea.
Figura 11. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Esta reacción se realiza en un aparato denominado
termociclador. Con dicho aparato es posible programar la
cantidad de ciclos así como las temperaturas y tiempos
deseados para cada etapa
Gran parte del éxito de una reacción de PCR depende de la correcta elección de los
cebadores que aseguran la amplificación adecuada y al mismo tiempo la especificidad de la
reacción. Por esta razón tanto si se diseñan manualmente como con la ayuda de programas
adecuados, deben tratar de considerarse varios factores.
1) Los cebadores deben elegirse abarcando el tramo que se desea amplificar
2) Cada uno de ellos deberá unirse a una de las dos hebras de una secuencia de ADN
desnaturalizada. Por lo tanto si estamos trabajando sobre una secuencia que
representa una de las dos hebras, uno de los cebadores será igual a un tramo de
esta secuencia, y el otro será complementario.
3) Se intentará que estos cebadores cumplan con la mayor parte de los siguientes
requisitos:
a)
Longitud: entre 18 y 25 pares de bases
b)
Contenido en GC. Un porcentaje
en el entorno de 50%. Pues esta
composición está en relación con
la temperatura de hibridación de
estos oligonucleótidos con el
ADN molde como se observa en
la gráfica.
c)
En relación con lo anterior, debe
intentarse que los cebadores
tengan una temperatura de
desnaturalización
(Tm)
relativamente alta para asegurar
la
especificidad
de
la
amplificación, y que las Tms de
ambos cebadores del par sean
similares, para así definir la
temperatura de hibridización que se usará en la reacción.
d)
Consideraciones sobre las bases en determinadas posiciones, como por
ejemplo evitar que el extremo 3´sea A o T, evitar tramos de más de tres
bases iguales, etc.
e)
Evitar que los cebadores diseñados formen estructuras secundarias,
homodímeros o heterodímeros, o que éstos, de existir sean lo menos
estables posibles. Esto implica por ejemplo que no existan tramos con
complementariedad entre dos regiones de un cebador o con el otro o
estructuras palindrómicas
Ejercicio 10
Dispones del ADN correspondiente a la secuencia que se anota a continuación. Quieres
realizar una reacción de amplificación por PCR de una porción de dicho ADN.
a) Diseña los cebadores necesarios para dicha reacción. Ten en cuenta que su longitud
debe ser de 15-18 nucleótidos.
b) Calcula las temperaturas de desnaturalización (Tm) de estos cebadores tomando en
cuenta la siguiente fórmula (para oligonucleótidos de hasta 18 nt):
(A + T) x 2º + (G + C) x 4º
c) Establece las condiciones de amplificación.
ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCACC
60
TGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAG
120
TTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGCTGTTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTG
180
AGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTC
240
ATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGG
300
GCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACT
360
TCAGGGTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCA
420
CCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCC
480
ACAAGTATCACTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCC
540
CTAAGTCCA
549
Ejercicio 11
Te propones obtener la secuencia del gen que codifica para la proteína HP1 de un insecto
cuyo genoma no es conocido.
a) ¿Cómo procederías si cuentas con una biblioteca de ADNc de ese insecto construida
en un vector plasmídico y con un plámido que contiene el gen que codifica para la
proteína HP1 de Drosophila?
b) ¿Podrías obtenerlo sin tener una biblioteca de ADNc? ¿Qué estrategia emplearías?
c) Una vez completada la obtención de este ADNc se establece que consta de 1650
pares de bases. ¿Cómo puedes obtener la secuencia genómica correspondiente?
¿Cómo explicas que una vez obtenida, la misma tenga 19500 pares de bases?
IDENTIFICACIÓN CROMOSÓMICA
I.
INTRODUCCIÓN
I.1. GENERALIDADES DEL CROMOSOMA EUCARIOTA
Los cromosomas son estructuras discretas que se encuentran en las células ecuariotas,
encargadas del almacenamiento y transmisión de la información hereditaria. El término
CROMOSOMA se refiere a cromosomas metafásicos en mitosis, cuando la cromatina alcanza su
máximo grado de condensación. Cada cromosoma está formado por dos CROMÁTIDAS hermanas,
cada una de ellas constituida por una única molécula de ADN.
El cromosoma eucariota requiere de ciertas estructuras para llevar a cabo su función: dos
telómeros, un centrómero y varios orígenes de replicación por cromátida. Los extremos de las
cromátidas se denominan TELÓMEROS y confieren estabilidad a cada unidad hereditaria.
La
CONSTRICCIÓN
PRIMARIA
o
CENTRÓMERO es el sitio de ensamblaje de una
estructura proteica llamada CINETOCORO, a la cual
se asocian los microtúbulos del huso metafásico.
Según la posición que ocupe el centrómero podemos
clasificar a los cromosomas como metacéntricos,
submetacéntricos y telocéntricos (algunos autores
agregan una cuarta categoría denominada
acrocéntricos o subtelocéntricos).
En algunos cromosomas aparece otra constricción
llamada CONSTRICCIÓN SECUNDARIA.
Algunos segmentos cromosómicos localizados entre
la constricción secundaria y el telómero se llaman
SATÉLITES.
Aunque muchas veces el significado funcional de las
constricciones secundarias permanece incierto, en
algunas de ellas se localiza el cluster 45S de genes
ribosomales, a partir del cual se organiza el nucleolo.
Por
esta
razón
se
denomina
REGIÓN
ORGANIZADORA DEL NUCLEOLO (NOR), y
puede visualizarse al microscopio óptico mediante
técnicas de impregnación con plata.
Clasificación de los cromosomas según la posición del
centrómero;
Metacéntrico: Cromosoma cuyo centrómero se
encuentra en la mitad del cromosoma, dando lugar a dos
brazos de igual longitud (p y q).
Submetacéntricos: Cromosoma en el cual el
centrómero se ubica de tal manera que un brazo es
ligeramente más corto que el otro.
Telocéntrico: Cromosoma en el cual el centrómero
está localizado en un extremo del mismo
(telómero), por lo que el cromosoma posee sólo un
brazo.
Acrocéntrico o Subtelocéntrico: Cromosoma en el
cual el centrómero se encuentra más cercano a uno
de los telómeros, dando como resultado un brazo
muy corto (p) y el otro largo (q).
I.2. CROMOSOMAS POLITÉNICOS DE LAS GLÁNDULAS SALIVALES
Las glándulas salivales y otros tejidos blandos de los Dípteros tienen núcleos en interfase
permanente. Durante el crecimiento y desarrollo de las larvas, la división celular se suspende en ciertos
tejidos pero las células continúan su crecimiento por incremento de tamaño. Este proceso ocurre en los
tubos de Malpighi, las células del cuerpo graso, las células nutricias de los ovarios, el epitelio intestinal
y en las células de las glándulas salivales. En estos tejidos, los cromosomas sufren rondas de
duplicaciones repetidas pero sin separarse, proceso conocido como endomitosis. Esto lleva a la
producción de un haz cromatínico de varios cientos o miles de hebras. Durante este proceso de
politenización o politenia, los “cromosomas” incrementan su largo y su diámetro. El número de
réplicas de ADN sin separación de los cromosomas hijos es de 10, de lo que resultan 1024 (210) hebras
cromatínicas alineadas lado a lado. Además los cromosomas politénicos presentan los cromosomas
homólogos asociados a lo largo de toda su longitud. Esta condición es un ejemplo extremo de un
fenómeno más general denominado “apareamiento somático” el cual ocurre en el ciclo mitótico de la
mayoría de los Dípteros.
A su vez, los cromosomas muestran un patrón peculiar de bandeo transversal que consiste en
zonas cromáticas oscuras (llamadas bandas), y zonas acromáticas claras (interbandas), visibles al
microscopio óptico (ver figuras). Este bandeo es reproducible de núcleo a núcleo, formando un patrón
específico para cada especie, de tal manera que los cromosomas pueden ser identificados y mapeados
en todo su largo, constituyendo un mapa citológico. Hay aproximadamente 5000 bandas y 5000
interbandas en total en el genoma de Drosophila melanogaster. Debido a que el patrón de bandeo que
presentan los cromosomas politénicos es un reflejo constante de las secuencias de ADN, las bandas
sirven como marcadores para localizar varias características genéticas (áreas con gran concentración de
genes, o cambios en el genoma debido a reordenamientos cromosómicos, por ejemplo deleciones,
duplicaciones, translocaciones, etc.).
En D. melanogaster el patrón de bandeo no está presente en las regiones heterocromáticas
centroméricas de todos los cromosomas. Las regiones heterocromáticas están asociadas formando un
cromocentro.
FIGURAS: Cromosomas politénicos teñidos con orceína (izquierda) y Giemsa (derecha). La imagen
ampliada (b) muestra las bandas y las interbandas con mayor detalle.
.
I.3. CARIOTIPO: CONCEPTO Y REPRESENTACIÓN
El conjunto ordenado de todos los cromosomas de una especie es conocido como CARIOTIPO.
El análisis del cariotipo es de fundamental importancia para comparar especies o para estudiar la
variación dentro de una misma especie. En el hombre además se ha utilizado para correlacionar
determinadas patologías con alteraciones del cariotipo normal.
Los parámetros utilizados para la elaboración del cariotipo de una especie son: tamaño de los
cromosomas; posición del centrómero; patrón de bandas (C, G, Q, T, etc.); posición de las
constricciones secundarias u otros marcadores.
Izquierda: Metafase mitótica humana (Tinción standard con Giemsa)
Derecha: Cariotipo humano. Los cromosomas se ordenan por tamaño y posición del centrómero.
I.4. BANDEOS CROMOSÓMICOS
A pesar de la aparente homogeneidad estructural de los brazos cromosómicos observable en las
preparaciones convencionales, existen técnicas que revelan bandas o regiones con tinción diferencial a
lo largo de los brazos cromosómicos. Estas bandas ponen de manifiesto la diferenciación longitudinal
de los cromosomas, la cual representa diferencias en su compleja organización a nivel molecular. Una
de las aplicaciones más importantes de las técnicas de bandeo es la identificación inequívoca de los
cromosomas de un cariotipo. El poder de resolución de estas técnicas permite no sólo la identificación
de cromosomas enteros sino también el estudio detallado de reordenamientos cromosómicos. Las
técnicas de bandeo cromosómico pueden agruparse en técnicas de bandeo morfológico y de bandeo
dinámico.
Bandeos morfológicos
Los bandeos morfológicos son inherentes a la heterogeneidad de la cromatina, relacionados a
proteínas e interacciones ADN-proteínas y a la composición de bases del ADN. Pueden clasificarse, a
su vez, en:
a. técnicas de tinción diferencial, como las bandas G (Giemsa) y las bandas R (Reverse). Este tipo
de bandeo revela un patrón de bandas longitudinales pero sólo en los cromosomas de aves y
mamíferos.
b. métodos de tinción selectiva, como las bandas C (tiñen la heterocromatina constitutiva), bandas
NOR (tiñen los organizadores nucleolares) y bandas T (tiñen los telómeros).
c. coloraciones con fluorocromos específicos aislados o combinados con colorantes no
fluorescentes (DAPI, Cromomicina A3, etc). Estos fluorocromos pueden teñir regiones ricas en
pares de bases AT o CG.
d.
bandeos con endonucleasas de restricción.
Bandeos dinámicos
Determinadas regiones cromosómicas inician y terminan la duplicación del ADN durante una
pequeña fracción de la fase S constituyendo por lo tanto una unidad de replicación. Los bandeos de
replicación involucran la incorporación selectiva de análogos de bases, como por ejemplo la 5bromodeoxiuridina (BrdUrd). El tránsito de la célula a través de la fase S puede ser detenido mediante
el empleo de altas concentraciones del mencionado análogo de base. Esto permite identificar las
regiones que se replican sincrónicamente en los distintos momentos de la fase S.
Metafase mitótica con la técnica de
Bandeo G. Esta técnica implica el
tratamiento de los cromosomas con una
enzima proteolítica (tripsina) y su
posterior tinción con el colorante
Giemsa.
Metafase mitótica humana con técnica de Bandeo C. Está técnica implica el tratamiento con
diferentes sustancias y su posterior tinción con el colorante Giemsa.
II. OBJETIVOS
II.1. Introducir al estudiante en la variabilidad y diversidad cromosómica de los seres vivos mediante
la observación de preparaciones de células CHO, Homo sapiens y cromosomas politénicos en D.
melanogaster.
II. 2. Familiarizar al estudiante con el área de la citogenética mediante la observación al microscopio
de preparaciones citológicas con técnicas de tinción clásicas y de bandeo cromosómico.
III. ACTIVIDADES
III.1. Observación al microscopio de preparaciones citológicas de:
células CHO (línea celular de hámster chino).
cromosomas politénicos de Drosophila
Homo sapiens
a. ¿Qué técnica de tinción cree que se utilizó en cada una de las preparaciones que observó y porqué?
b. ¿Qué morfología cromosómica puede distinguir en las preparaciones de células CHO?
c. Realice un dibujo de lo que observa en las preparaciones de cromosomas politénicos.
¿Cómo explicaría la presencia de 5 brazos emanado del cromocentro?
Recuerde que D. melanogaster presenta un 2n= 8 con dos pares cromosómicos metacéntricos (II y III)
y dos pares acrocéntricos (X o I y IV) y un cromosoma submetacéntrico (Y) en el caso de los
machos. El par cromosómico IV es muy pequeño y totalmente heterocromático.
d. ¿Qué diferencias encuentra entre estos cromosomas y los de CHO u Homo sapiens? A qué cree que
son debidas?
III.2. Observación de láminas
Lámina A
a. Indiqué número cromosómico de la especie (2n),
número de moléculas de ADN y número de
cromátidas.
b. ¿Se trata de una célula animal masculina o
femenina? Justifique.
Lámina B
¿Qué particularidad observa en la estructura cromosómica (compare con la lámina B) y que
técnica de bandeo se aplicó?
III. 3. Observación al microscopio de preparaciones de H. sapiens con distintas técnicas de bandeo.
¿Qué técnicas de bandeo observó y qué parámetros lo llevaron a identificarlas?
CICLO CELULAR MITÓTICO
I. INTRODUCCIÓN
El ciclo celular es el período comprendido entre la formación de una célula, por división de otra
precedente, y el momento en que ella misma se divide para originar dos células hijas. Durante el ciclo
toda la célula eucariota (núcleo y citoplasma) está sometida a una gran reestructuración. El ciclo
celular se puede dividir en dos grandes períodos: interfase y mitosis, cada uno de los cuales se
subdivide en varias fases o etapas. La interfase se encuentra subdividida en 3 etapas:
a) Período G1: comienza la síntesis de ARN y proteínas, las cuales perduran durante toda la interfase.
b) Período S: ocurre la duplicación del ADN dando lugar a la formación de las cromátidas hermanas.
c) Período G2: fase post-sintética que va desde el final de S hasta el comienzo de la mitosis o división
celular.
En la mitosis ocurren 2 procesos altamente sincronizados: la cariocinesis (división del núcleo) y
la citocinesis (división del citoplasma). En la cariocinesis se reconocen distintas fases: profase,
metafase, anafase y telofase. Algunos autores reconocen a la prometafase como un estadio entre
profase y metafase. La mitosis finaliza con la citocinesis, la cual es diferente en células animales y
vegetales.
(A)
INTERFASE: Núcleos en interfase. La cromatina aparece bastante homogénea, a excepción de zonas
más claras que corresponden a los nucleolos.
(B)
PROFASE: La cromatina comienza a condensarse. A medida que avanza este estadio desaparece el
nucleolo. Los “cromosomas” aparecen como filamentos delgados.
(C)
METAFASE: Cada cromosoma, integrado por dos cromátidas hermanas, se dispone con su centrómero
en el plano ecuatorial.
(D-E) ANAFASE: Las cromátidas hermanas se separan y comienzan a migrar hacia los polos opuestos de la
célula. Ahora los cromosomas se observan formados por una sola cromátida, con los centrómeros
dispuestos hacia los polos y los telómeros hacia el centro de la célula.
(F)
TELOFASE: No es posible individualizar los cromosomas. La cromatina comienza a descondensarse
en ambos núcleos hijos.
TÉCNICAS ESTÁNDAR E INMUNOCITOQUÍMCA UTILIZADAS EN EL ESTUDIO DEL
CICLO CELULAR
La obtención de preparaciones para el análisis del ciclo celular se realiza a partir de tejidos
proliferantes mediante diversas técnicas como el aplastado o la dispersión celular. Estas técnicas
generalmente presentan las siguientes etapas:
a. Obtención del material y Pretratamiento: muchos tejidos requieren el uso de soluciones que permitan
dispersar o separar los cromosomas. En animales se usan soluciones salinas (Cloruro de Potasio,
Citrato de Sodio, Cloruro de Sodio) o agua destilada, provocando un choque hipotónico a la célula.
Para estudiar las características de los cromosomas de una especie, o para comparar especies distintas,
se pueden utilizar agentes antimitóticos (colchicina, colcemida, hidroxiquinoleína, etc.) que actúan
como inhibidores de la formación del huso mitótico. De esta manera se incrementa de forma
significativa el número de metafases.
b. Fijación: tiene por finalidad preservar las estructuras celulares que nos interesan. El líquido fijador
varía según la técnica a utilizar. El fijador más utilizado para técnicas con tinción estándar es el
llamado 3:1 (metanol o etanol: ácido acético). Para la realización de técnicas inmunocitoquímicas en
general se utilizan fijadores del tipo de los glutaraldehidos o metanoles.
c. Coloración: en las técnicas estándar se usan varios colorantes tales como: orceína, hematoxilina
acética, Feulgen y Giemsa. La elección del colorante depende de los fines perseguidos. En
inmunocitoquímica se utilizan fluorocromos con el fin de colorear la cromatina (DAPI, Hoechst,
Ioduro de propidio).
d. Montaje: esta etapa consiste en preservar el preparado colocando un cubreobjeto y sellándolo con
parafina líquida, esmalte de uñas, bálsamo de Canadá o resinas sintéticas.
II. OBJETIVOS
Reconocer las diferentes etapas del ciclo celular mitótico.
Realizar preparaciones citológicas de Allium cepa (cebolla).
III. ACTIVIDADES
III.1. Observación al microscopio de preparaciones citológicas de A. cepa fijadas en 3:1 y coloreadas
con Feulgen/verde luz.
a. Dibuje e identifique las principales etapas del ciclo celular. ¿Qué parámetros utilizó para
identificarlas?
b. El número cromosómico de A. cepa es 2n=16. ¿Cuántos cromosomas, cromátidas y moléculas de
ADN encuentra en la placa metafásica? ¿Cual es el valor C en cada una de las etapas del ciclo
celular?
III.2. Observación al microscopio de preparaciones citológicas de A. cepa con tinción argéntica.
a. ¿Qué estructura se observa con esta metodología?
b. Analice el comportamiento de esta estructura durante el ciclo celular.
III.3. Observación de una lámina de células en cultivo de mamíferos tratadas con la técnica de
inmunocitoquímica.
a. ¿Qué estructura observa en color verde y cuál en azul?
b. Identifique y ordene las principales etapas del ciclo celular. ¿Qué parámetros utilizó para ello?
III.4. Realización de preparaciones de meristemo de A. cepa y observación de las mismas.
PROTOCOLO PARA LA REALIZACIÓN DE LAS PREPARACIONES DE ALLIUM CEPA
Obtención del material: Cinco o seis días antes de la realización de las preparaciones, se escoge una
cebolla fresca y se coloca en un recipiente con agua, con el bulbo sumergido. Se cambia el agua
diariamente.
Fijación del material: Cuando las raíces nuevas alcanzan 3 cm de longitud, se extrae la cebolla del
recipiente y se corta el último centímetro de la punta. Se depositan estas raíces en la solución fijadora
denominada 3:1 (3 partes de etanol absoluto: 1 parte de ácido acético glacial) durante 2 o tres días.
Realización de las preparaciones por el método de aplastado y
coloración.
En células vegetales, después de la fijación, se requiere de un
tratamiento para romper la pared celular.
Traslade las raíces fijadas a un recipiente que contiene ácido
clorhídrico 5 N durante 15 minutos. Coloque las raíces en un
recipiente con agua y lávelas por cinco minutos. Corte el
extremo del meristemo y póngalo en un portaobjetos. Triture
levemente el material. Deje caer sobre el material una gota de
orceína acético-láctica y espere 5-10 minutos para que coloree.
Luego coloque un cubre objeto y con un lápiz disperse y
aplaste el material. Observe al microscopio si el aplastado es
suficiente y en tal caso selle con esmalte la preparación.
MEIOSIS
INTRODUCCIÓN
La MITOSIS es el único tipo de división celular existente en algunas especies de protozoarios,
algas y hongos. Pero muchos organismos simples y casi todos los complejos, pueden también dividir
sus células por MEIOSIS. Este tipo de división genera células esencialmente diferentes de las
progenitoras en cuanto a las combinaciones de su material hereditario, su número cromosómico y su
cantidad de ADN.
Esquemas comparativo entre los ciclos celulares meiótico y mitótico.
La MEIOSIS consta de dos divisiones precedidas por un único período S de duplicación del
ADN. Como consecuencia, a partir de una única célula, se originan cuatro células distintas con un solo
set o conjunto cromosómico (denominado haploide o “n”) y con una carga de ADN equivalente a “C”.
El estado diploide (2n) se restaura mediante la fusión de dos células haploides, proceso conocido como
fertilización. La combinación de la meiosis y la fertilización en el ciclo vital de un organismo es lo que
se conoce como reproducción sexual.
Esquemas en los que se comparan el ciclo celular en células somáticas y la meiosis en células de la línea
germinal. Se han relacionado la cantidad de ADN de las células (C) y el grado de ploidía celular (n =
haploide, 2n = diploide) para las distintas etapas.
En animales superiores, la meiosis tiene lugar en los órganos sexuales, tanto masculinos como
femeninos, dentro de un proceso general que se denomina respectivamente espermatogénesis y
ovogénesis. Estos procesos producen células genéticamente diferentes y equilibradas con una
reducción a la mitad del número de cromosomas. Estas células presentan además las modificaciones
necesarias para la fecundación.
ESPERMATOGÉNESIS
Definición de Espermatogénesis: Conjunto de cambios que experimenta una célula
prácticamente indiferenciada: la ESPERMATOGONIA, para originar células altamente especializadas,
con un complemento haploide de cromosomas recombinados y capaz de fecundar: el
ESPERMATOZOIDE.
Teniendo en cuenta los cambios que se producen en la espermatogonia, y por tanto los nuevos
tipos celulares y los procesos en los que participan, podemos dividir a la espermatogénesis en las
siguientes etapas:
PROLIFERACIÓN
MEIOSIS
ESPERMIOGÉNESIS O HISTODIFERENCIACIÓN
A) PROLIFERACIÓN. Este período comprende el desarrollo de las espermatogonias, las cuales se
dividen mitóticamente para aumentar la población celular. En esta etapa de divisiones rápidas y
continuas se puede observar el número y morfología cromosómica en las metafases mitóticas.
ESPERMATOGONIAS
Fotografía (A) y esquema (B) de una sección
de un túbulo seminífero de saltamontes en los
que se observa la disposición secuencial de
las células que cursan la espermatogénesis.
B) MEIOSIS.
La profase de la primera división meiótica es extremadamente larga pudiendo durar desde días
(en machos) hasta años (generalmente en hembras). Durante la profase I se produce el apareamiento de
los cromosomas homólogos y la recombinación entre cromátidas homólogas. Para su estudio, se ha
dividido esta profase I en varias etapas: LEPTOTENO, ZIGOTENO, PAQUITENO, DIPLOTENO Y
DIACINESIS.
En la metafase I los cromosomas homólogos apareados (bivalentes) se disponen en el plano
ecuatorial. En la primera anafase meiótica los cromosomas homólogos, previamente recombinados,
migran a polos opuestos. Tras una interfase muy corta (intercinesis), y a veces inexistente, se efectúa
la segunda división meiótica. En esta división cada célula posee solamente un cromosoma del par
homólogo ya recombinado. Además los cromosomas en metafase II poseen sus cromátidas unidas
únicamente a nivel del centrómero, ya que la adhesividad a nivel de brazos se perdió en la anafase I.
Por cada célula que entra en meiosis se obtienen cuatro células haploides y con una carga "C"
de ADN: las ESPERMÁTIDAS.
C) ESPERMIOGÉNESIS. Se conoce con este nombre a toda la serie de cambios tanto citoplásmicos
como nucleares que experimentan las espermátidas hasta transformarse en espermatozoides. Estos
cambios son muy variables y dependen de la especie estudiada. No obstante, y como rasgos generales,
podemos decir que se centran en la compactación de la cromatina en el núcleo, la pérdida de casi la
totalidad del citoplasma y la adquisición de un aparato locomotor por parte de la célula.
II) OBJETIVOS DEL PRÁCTICO
a) Analizar la meiosis y la espermatogénesis en preparaciones de una especie de ortóptero
(Locusta migratoria).
III) CARACTERÍSTICAS DEL MATERIAL Y METODOLOGÍA
Los ortópteros suelen emplearse para los estudios cromosómicos por su fácil obtención y
manejo en el laboratorio. Presentan además un número reducido de cromosomas de gran tamaño y una
meiosis fácilmente observable en su totalidad. En el túbulo seminífero de ortópteros las células que
cursan la espermatogénesis se encuentran en grupos denominados CISTOS. Todas las células que
componen un mismo cisto son sincrónicas, es decir, están en el mismo estadio de la meiosis por lo que
resulta relativamente fácil visualizar las distintas etapas meióticas en una misma preparación.
TINCIÓN CON FEULGEN Y APLASTADO
Los testículos de langosta se fijan en una mezcla de ácido acético y etanol en proporción 3:1 al
menos una semana antes. Para realizar la tinción de Feulgen este material es tratado con HCl 5N
durante 1 hora y teñido con reactivo de Schiff durante 3 horas. Posteriormente se coloca sobre una
porción del testículo (1 o 2 túbulos) un cubreobjetos y se dispersa y aplasta el material.
ACTIVIDADES A REALIZAR
b) Observar las preparaciones de Locusta migratoria y determinar el número diploide y las
características de su cariotipo (morfología de los cromosomas y sistema de determinación
sexual). Realizar un esquema de las diferentes etapas de la meiosis.
c) Observar los distintos estadios de la espermatogénesis.
d) Comparar el cariotipo de L. migratoria con el de Chorthippus jucundus (especie de la cual se
obtuvieron las planchas de este repartido).
e) Realizar un esquema de la meiosis de un individuo 2n=4 con cromosomas submetacéntricos y
telocéntricos.
IMÁGENES DE LA ESPERMATOGÉNESIS EN Chorthippus jucundus
Células del testículo de Chorthippus jucundus obtenidas mediante la técnica de aplastado y teñidas con orceína
acético-láctica. El cromosoma sexual X ha sido señalado con una X.
A.- Núcleo de espermatogonia en interfase (ciclo mitótico).
B.- Metafase mitótica (espermatogonial). Cada cromosoma está integrado por dos (2) cromátidas. Vista polar.
C.-Comienzo de la Meiosis. Núcleo prepaquiténico, Lepto/Zigoteno. En leptoteno los cromosomas homólogos
no se encuentran apareados y se observan como fibras simples. Zigoteno, comienza el apareamiento de
homólogos, se observan fibras dobles (cromosomas apareados) y fibras simples (sin aparear)
D.- Paquiteno medio. E.- Paquiteno tardío. Los cromosomas homólogos se encuentran totalmente apareados
F.- Diploteno. Con flechas se señala la posición de los quiasmas en los bivalentes (constituidos por 4
cromátidas). M7 = bivalente monoquiasmático. M4= bivalente con 2 quiasmas. L1= Bivalente con 4
quiasmas. El cromosoma X, telocéntrico, aparece claramente formado por 2 cromátidas.
Células del testículo de Chorthippus jucundus obtenidas mediante la técnica de aplastado y teñidas con orceína
acético-láctica.
A. Diploteno tardío-diacinesis. Aumenta la condensación de la cromatina.
B. Metafase I. Vista lateral. Se aprecian los bivalentes con quiasmas, co-orientados en el eje ecuatorial de la
célula.
C. Anafase I. Segregan los cromosomas homólogos. El cromosoma sexual X migra completo (con sus dos
cromátidas) al polo superior de la célula. El polo inferior carecerá de cromosoma X.
D. Telofase I. Finaliza con la formación de dos células haploides pero con 2C de contenido de ADN por célula.
E. Intercinesis/Profase-II (dos células). La célula de la parte superior de la fotografía posee el cromosoma X,
mientras que la de la parte inferior carece de él.
Células del testículo de Chorthippus jucundus obtenidas mediante la técnica de aplastado y teñidas con orceína
acético-láctica.
A. Metafase-II. Se observa la disposición radial de los cromosomas característica de una vista polar. Cada
cromosoma (o diada) está integrado por 2 cromátidas.
B. Anafase-II temprana. Las 2 cromátidas de cada cromosoma comienzan a segregar.
C. Anafase-II tardía. Continúa la migración de las cromátidas a polos opuestos.
D. Telofase-II.
E. Espermátidas tempranas. Dos de las que aparecen en la fotografía poseen el cromosoma sexual (X), mientras
que la situada en parte central carece de él.
F-G. Espermátidas en diferentes estados de maduración (redondeadas y fusiformes).
PROBLEMAS SOBRE MECANISMOS DE LA HERENCIA
PROBLEMAS RELACIONADOS CON LAS LEYES DE MENDEL
1) La descendencia (F1) de un cruzamiento entre dos cerdos, una hembra de color blanco y
un macho de color negro, fue toda de color negro.
a) Diagramar un cruzamiento simple mostrando los posibles genotipos y fenotipos de los
parentales y su descendencia.
b) Si se realizan cruzamientos entre individuos de la F1. En cada uno de ellos se obtiene
aproximadamente un 25% de individuos blancos y un 75% negros. Indique los
genotipos de los parentales y descendientes.
c) Dos diferentes cruzamientos fueron hechos entre individuos negros de la F2 con los
resultados que se muestran en la tabla. Diagrame cada uno de los cruzamientos.
Cruzamientos
Cruz. 1
Cruz. 2
Fenotipos de la Progenie
Todos negros
¾ negros; ¼ blancos
2) Si se conoce una serie de 4 alelos en el locus para color de ojos en Drosophila:
Cuántos alelos
a) hay en un cromosoma para este locus?
b) podrían haber en un par de cromosomas?
c) Podrían haber una célula somática de un individuo miembro de esta especie?
d) Sobre esta misma base, cuántas combinaciones diferentes se esperaría encontrar en
toda la población?
3) La talasemia es una enfermedad hereditaria de la sangre en los seres humanos, que
produce anemia. La anemia severa (talasemia mayor) es encontrada en los homocigotas
(TN TN) y un tipo más benigno de anemia (talasemia menor) en los heterocigotas (TM TN).
Los individuos normales son homocigotas (TM TM). Si todos los individuos con talasemia
mayor mueren antes de la madurez sexual:
a) ¿Qué proporción de F1 adultos, producidos de matrimonios entre talasémicos menores
con normales puede esperarse que sea normal?
b) ¿Qué fracción de adultos F1 descendientes de matrimonios entre talasémicos menores
podemos esperar que sean anémicos?
c) ¿Qué probabilidad hay que de un cruzamiento entre dos talasémicos menores se obtenga
primero un hijo talasémico menor, después un talasémico mayor y por último uno
normal?
d) ¿Qué probabilidad hay que de un cruzamiento como el anterior nazcan dos hijos
normales y un talasémico menor, sin importar el orden?
4) El color del pelaje de los conejos está determinado genéticamente por una serie de alelos
múltiples con la siguiente jerarquía de dominancia:
C (gris típico) > cch (chinchilla) > ch (himalayo) > c (albino)
Se cruza una hembra gris con un macho chinchilla y se obtiene una progenie que consta de
conejos grises, chinchilla e himalayos. Al año siguiente la hembra se aparea con un macho
himalayo y produce una progenie gris, himalaya y albina.
a) Determinar los genotipos de todos los animales mencionados.
b) ¿Cuál es la probabilidad de que la primera cruza origine dos hembras, una chinchilla y
una himalaya y un macho gris en un orden dado?
5) En la tabla que se ilustra a continuación se detallan los fenotipos de cinco madres (A-E).
Cada madre tiene un hijo cuyo fenotipo también se describe. De los cinco hombres cuyo
genotipo está determinado seleccione al padre que corresponde a cada uno de los hijos.
Madre
A
B
C
D
E
fenotipo
A M Rh+
B N RhO M RhA N Rh+
AB MN Rh-
fenotipo del hijo
O M Rh+
O N RhA MN Rh+
AB MN Rh+
AB M Rh-
genotipo de posibles padres
IAi LMLM rr
IBi LMLN RR
ii LNLN rr
ii LMLM rr
IAIA LMLN RR
6) En Drosophila el color ébano del cuerpo se debe a un gen recesivo e y el tipo silvestre
+
(gris), a su alelo dominante e . Las alas vestigiales se producen por un gen recesivo (vg);
+
las alas de tamaño normal (tipo silvestre) las determina el alelo dominante vg .
a) Si se cruzan moscas dihíbridas tipo silvestre y producen una progenie de 256
individuos, ¿cuántas moscas de éstas se espera que haya para cada clase fenotípica?
b) ¿Qué cruza realizaría para conocer el genotipo de una mosca de fenotipo salvaje de la
F1?
c) Si obtuviera 139 moscas de fenotipo salvaje, 50 de color ébano, 45 de alas vestigiales y
22 ébano de alas vestigiales, ¿podría considerar de todas formas que el mecanismo de
herencia es el propuesto?
Contrastación de hipótesis (Test de Χ2)
7) La condición heterocigótica llamada “creeper” en las gallinas, produce patas y alas
deformadas. Cruzamientos entre “creeper” produjeron 785 gallinas “creeper” y 378
normales.
a) ¿Es aceptable la hipótesis de una proporción 3:1?
b) ¿Se ajustará mejor la de 2:1?
c) ¿Qué fenotipo producirá el gen “creeper” cuando está en la condición
homocigótica?
8) Las flores de ciertas plantas pueden ser rojas, rosas o blancas. Las flores rojas cruzadas
con las blancas producen solo flores rosas. Cuando plantas con flores rosas fueron
cruzadas, produjeron 113 rojas, 129 blancas y 242 rosas.
a) Proponga una hipótesis
b) Aplique el test de chi cuadrado para ver si esta hipótesis es aceptable.
Deducción de genotipo
9) En los perros el color oscuro del pelo es dominante sobre el albino y el pelo corto es
dominante sobre el largo. Si estos efectos son causados por dos pares de genes que
segregan independientemente, escriba los genotipos más probables de los progenitores de
cada uno de los siguientes cruzamientos, utilizando los símbolos A y a para los alelos para
el color oscuro y albino del pelo, y L y l para los alelos que rigen el pelo corto y largo
respectivamente.
oscuro corto
Fenotipos de la descendencia
oscuro largo albino corto
albino largo
Fenotipos paternos
a) oscuro corto x oscuro corto
89
31
29
11
b) oscuro corto x oscuro largo
18
19
0
0
c) oscuro corto x albino corto
20
0
21
0
d) albino corto x albino corto
0
0
28
9
e) oscuro largo x oscuro largo
0
32
0
10
f) oscuro corto x oscuro corto
46
16
0
0
g) oscuro corto x oscuro largo
29
31
9
11
Genética del sexo
10) En Drosophila, se identifica una mutación que produce márgenes irregulares en las
alas (scalloped, sc).
a) Cuando se cruza una hembra normal con un macho mutante de cepa pura, toda la
descendencia es de fenotipo salvaje. ¿Qué puede deducir acerca de la mutación?
b) Cuando se realiza la cruza recíproca a la anterior, se obtienen hembras salvajes y
machos con alas de márgenes irregulares. ¿Qué más deduciría ahora acerca de la ubicación
del locus mutante?
Describa los genotipos y los cruzamientos descritos en las partes a) y b)
11) Se realizó un cruzamiento entre una hembra de Drosophila heterocigótica respecto a
los genes recesivos c (que determina alas cortadas) y s (que determina ojos color sepia) y
un macho de alas normales y ojos color sepia, obteniéndose la siguiente progenie:
hembras 1/2 alas largas, ojos rojos
1/2 alas largas, ojos sepia
machos 1/4 alas largas, ojos rojos
1/4 alas cortas, ojos rojos
1/4 alas largas, ojos sepia
1/4 alas cortas, ojos sepia
Explique el modo de herencia de estos rasgos. Indique el genotipo de los padres y de los
descendientes.*
*Considere que del cruzamiento de machos con ojos color rojo y hembras con ojos color
sepia (ambas cepas puras) toda la descendencia obtenida tiene ojos rojos.
12) La calvicie es un carácter hereditario influido por el sexo, dominante en los hombres y
recesivo en las mujeres. Si C1 es el alelo determinante de la calvicie y C2 el de la no
calvicie, determine el genotipo de un hombre calvo cuyo padre no lo era, el de su esposa,
que no es calva, pero su madre sí lo era, y el de sus futuros hijos.
PROBLEMAS RELACIONADOS CON LIGAMIENTO Y MAPEO
13) Un individuo homocigota para los genes recesivos a y b se cruza con el tipo salvaje
AABB. Con los individuos de la F1 se hace una retrocruza con el doble recesivo. El
aspecto de la descendencia es el siguiente:
AB
903
Ab
98
aB
102
ab
897
a) Explique estos resultados, dando el porcentaje de recombinación entre los genes A
y B.
b) Si la transmisión de A y B fuese de forma independiente, cuáles serían los
resultados aproximados de este cruzamiento?
14) En el tomate, la forma del fruto depende de los loci P, p (P, liso p, rugoso) y R, r
(R, redondo r, alargado). La F1 de un cruzamiento entre homocigotos lisos y alargados
por rugosos y redondos se cruzó por el doble recesivo, obteniéndose los siguientes
resultados:
liso y redondo 45
rugoso y redondo 91
liso y alargado 86
rugoso y alargado 39
a) Describa los genotipos de los individuos indicando la posición de ambos loci.
b) Determine el porcentaje de recombinación y la distancia genética entre estos loci.
c) Si analizásemos 3000 células madres del polen, ¿En cuántas se esperaría observar al
menos un quiasma entre los loci considerados?
15) En una determinada planta diploide, tres loci determinan los siguientes caracteres de
las hojas:
L,l
hojas opacas, hojas lustrosas
R,r
hojas con bordes lisos, hojas con bordes rugosos
A,a
hojas amplias, hojas angostas
Estos loci están ligados del modo siguiente:
L,l
R,r
A,a
³------10 cM ---------³---------20 cM --------³
a) ¿Qué gametos formaría una planta trihíbrida de genotipo LrA/lRa?
b) Si esta planta trihíbrida se cruza con una planta homocigota recesiva, ¿cuáles
serán las proporciones fenotípicas esperadas?
16) A los ojos en forma de riñón los produce un gen recesivo k en el tercer cromosoma de
Drosophila. Los ojos color naranja, llamados cardenales son producidos por el gen
recesivo cd en el mismo cromosoma. Entre estos dos loci, hay un tercer locus con un alelo
recesivo e que produce color de cuerpo ébano. Hembras homocigotas con ojos arriñonados
y de color cardenal se cruzan con machos homocigotas con cuerpo color ébano. Se hace
luego una cruza de prueba con las hembras F1 trihíbridas para producir la F2. Entre la
progenie F2 de 4000 se encontró lo siguiente:
1761
1773
97
89
128
138
6
8
arriñonado, cardenal
ébano
arriñonado
ébano, cardenal
arriñonado, ébano
cardenal
arriñonado, ébano,cardenal
tipo silvestre
a) Determine las relaciones de ligamiento en los progenitores y de la F1
b) Estime las distancias de mapa
c) Determine el coeficiente de coincidencia
17) El trihíbrido AaBbCc es cruzado con el homocigota aabbcc, obteniéndose los
siguientes resultados:
ABc
aBC
Abc
abC
1060
1050
1060
1055
AbC
abc
aBc
ABC
128
130
130
128
a) ¿Cuál es la relación de ligamiento en el trihíbrido?
b) Construya un mapa cromosómico para estos tres loci
c) ¿Cuál es el porcentaje de recombinación entre los genes?
d) ¿Para cuál o cuáles de estos genes se cumplen las leyes de Mendel?
18) En la especie humana el alelo autosómico N provoca anormalidades en uñas y rótula,
rasgos conocidos como síndrome uña-rótula. Considere los matrimonios en los que uno de
los individuos padece el síndrome uña-rótula y es de grupo sanguíneo A y el otro individuo
es de grupo sanguíneo O y no padece el síndrome. Estos matrimonios tienen algunos hijos
que son de grupo sanguíneo A y padecen el síndrome uña rótula. Suponga que hijos de ese
grupo fenotípico, se cruzan con individuos de grupo sanguíneo O y sin el síndrome. Entre
los descendientes se observan cuatro fenotipos distintos en las proporciones siguientes:
síndrome uña-rótula, grupo sanguíneo A
sin síndrome uña-rótula, grupo sanguíneo A
síndrome uña-rótula, grupo sanguíneo O
sin síndrome uña-rótula, grupo sanguíneo O
42%
8%
10%
40%
Dado que el locus que define el grupo sanguíneo ABO ya ha sido localizado en el genoma
humano en el cromosoma 9 ¿qué puede decir de la localización del locus responsable del
síndrome uña-rótula?
PROBLEMAS RELACIONADOS CON INTERACCIÓN GÉNICA
19) El pigmento de los ratones es producido sólo cuando el alelo C está presente.
Individuos del genotipo cc no tienen color. Si el color está presente, éste puede ser
determinado por los alelos A, a. Los genotipos AA o Aa dan lugar al color gris (agoutí)
mientras que aa da lugar al pelaje negro.
a) ¿Cuáles son las proporciones fenotípicas y genotípicas de la F1 y la F2 del cruzamiento
entre ratones AACC x aacc?
b) Las proporciones fenotípicas obtenidas de tres cruzamientos entre hembras grises de
genotipo desconocido con machos de genotipo aacc, son las siguientes:
(1)
8 grises
8 sin color
(2)
9 grises
10 negros
(3)
4 grises
5 negros
10 sin color
¿Cuál es el genotipo de cada una de esas tres hembras?
20) Al cruzar entre sí varias cepas de la calabaza de verano, Sinnott y Dunn encontraron
que las líneas de plantas de frutos blancos podían dar lugar ocasionalmente a plantas
verdes o amarillas y que las líneas de plantas amarillas producen ocasionalmente plantas
verdes. Después de realizar cruzamientos consanguíneos en las distintas líneas hasta que
fuesen completamente homocigóticas y constituyesen líneas puras, se realizaron
cruzamientos entre las distintas líneas y entonces se cruzaron entre sí los productos de la
F1 (F1 x F1) dando los siguientes resultados:
Cruzamientos Progenitores
F1
F2
a) verde x amarillo
amarillo
81 amarillo
29 verde
b) blanco x amarillo
blanco
155 blanco
40 amarillo
10 verde
Dé símbolos a los genes implicados y explique dichos resultados.
21) En Drosophila el gen dominante S produce una condición peculiar del ojo llamado
estrella (Star). Su alelo recesivo s origina el ojo normal. La expresión de S puede ser
suprimida por el alelo dominante Su (supresor de S) en otro locus. El alelo recesivo de este
locus (su) no tiene efecto sobre s.
a) ¿Qué tipo de mecanismo está actuando?
b) Cuando un macho con ojos normales de genotipo SuSuSS es cruzado con una hembra
con ojos normales de genotipo sususs, ¿qué proporción fenotípica se puede esperar en
F1 y F2?
c) ¿Qué porcentaje de F2 de tipo normal es probable que sea portadora del gen dominante
para el tipo Star?
PROBLEMAS RELACIONADOS CON HERENCIA CUANTITATIVA
22) En el estudio de la herencia del carácter altura de la planta del tomate, se construyó el
siguiente cuadro con la información obtenida de los siguientes cruzamientos:
Cruzas
rango de altura (cm)
Media
varianza
P1 (línea pura)
20-30
25
6,5
P2 (línea pura)
60-80
75
6,8
F1 (P1 X P2)
30-60
50
6,2
F2 (F1 X F1)
20-76
50
10,6
a) ¿A qué atribuye el valor de la varianza observado en P1 y P2?
b) ¿Cómo explica el valor de la varianza en la F2?
c) ¿Cuál es la varianza genética de F1?
d) Teniendo en cuenta que los individuos de 20 cm de altura aparecen en la F2 con una
frecuencia de 0,0156, indique cuántos alelos como mínimo están determinando esta
característica.
e) ¿Cuál es la contribución que realiza cada alelo a la altura final?
23) La producción anual de leche de las vacas de un tambo es de 18.000 lts. La producción
promedio de leche de los individuos seleccionados para ser los progenitores de la siguiente
generación es de 20.000 lts. La producción de leche promedio de la primera generación es
de 18.440 lts.
a) calcule la heredabilidad de la producción de leche de esa población.
b) si la varianza fenotípica de esa población es de 4.000.000 lts2, calcule la varianza
genotípica.
c) ¿entre qué valores se encontraría el 68% de la población original?
PROBLEMAS
RELACIONADOS
HEREDITARIOS
CON
DIVERSOS
MECANISMOS
24) En una familia, cierta afección se transmite de la forma representada en la siguiente
genealogía:
?
?
a) Tras el análisis, ¿qué conclusiones puede sacar acerca del modo de herencia de
esta afección?
b) ¿Qué fenotipo presentarán los dos posibles hijos (representados por el símbolo ?)
de la pareja II4 y II5 si nacen una mujer y un varón?
c) ¿Qué explicación puede proporcionar en el caso de que nazca de dicha pareja una
mujer afectada?
25) Los gatos caseros machos pueden ser negros o amarillos. Las hembras pueden ser
negras, moriscas o amarillas.
a) ¿Cómo pueden explicarse estos resultados?
b) Utilizando símbolos apropiados determine los fenotipos esperados en la
descendencia de la cruza de una hembra amarilla con un macho negro.
c) Hágase lo mismo para la cruza recíproca de la parte b)
d) Cierto tipo de combinación produce hembras, la mitad moriscas y la otra mitad
negras; la mitad de los machos son amarillos y la otra mitad son negros. ¿Cuáles
son los colores de los precursores en esta cruza?
e) Otro tipo de combinación produce descendencia, la cuarta parte son machos
amarillos, otra cuarta parte hembras amarillas, otra cuarta parte machos negros y
otra cuarta parte hembras moriscas. ¿Cuáles son los colores de los precursores?
26) Una condición mutante ligada al sexo denominada "muesca" (M) es letal en
Drosophila cuando se presenta en los machos hemicigóticos y en las hembras
homocigóticas. Las hembras heterocigóticas (XMXm) tienen pequeñas muescas en las
puntas de sus alas. Las hembras homocigóticas recesivas (XmXm) y los machos
hemicigóticos (XmY) tienen alas normales (tipo común).
a) Calcule las proporciones fenotípicas viables esperadas en F1 sin considerar el sexo,
cuando se cruzan machos de tipo común con hembras con muescas.
b) ¿Cuál es la proporción de machos viables: hembras viables en F1?
c) ¿Cuál es la proporción de animales viables con muesca: tipo común en F1?
27) Un investigador posee 6 plantas de una especie en la que quiere estudiar la herencia del
tipo de inflorescencia. Para ello realizó algunos cruzamientos entre ellas, cuyos resultados
se dan a continuación:
a) planta inflor. sencilla x planta inflor. compuesta
Progenie: 27 plantas inflor. sencilla; 24 plantas inflor. compuesta
b) planta inflor. sencilla x planta inflor. sencilla
Progenie: 53 plantas inflor. sencilla
c) planta inflor. compuesta x planta inflor. compuesta
Progenie: 37 plantas inflor. compuesta
I)
II)
III)
¿Qué conclusiones y/o suposiciones le permiten sacar los resultados de
estos cruzamientos?
En base a esas suposiciones elabore dos hipótesis que puedan explicar
estos resultados. Para cada hipótesis indique los genotipos de todas las
plantas y sus descendientes posibles.
Plantee un cruzamiento entre dos plantas de la descendencia del
cruzamiento a) de manera que sus resultados le permitan descartar una
de las dos hipótesis elaboradas.
28) El árbol genealógico siguiente corresponde a una familia en que existe la afección
“albinismo” causada por un alelo recesivo autosómico.
Los individuos II1 y II5 son albinos. Se admitirá que los sujetos II2, III1 y III4 son
homocigotas para el alelo normal.
I
II
III
IV
a) sea “a” el alelo para albinismo y “A" su
alelo normal, dar los genotipos de los
individuos hasta donde sea posible.
b) ¿Cuál es la probabilidad de que II3 sea
heterocigota para ese gen?
c) IV1 y IV2 desean tener un hijo. ¿Cuál es
la probabilidad de que se presente la
afección en la descendencia?
29) En un centro de investigación que trabaja con Drosophila melanogaster se detecta y
aísla un mutante recesivo (lob) que modifica la forma de los ojos del insecto, que aparecen
con un contorno lobulado. Posteriormente se aísla otro mutante recesivo (es) que también
afecta a la forma del ojo, teniendo ahora un contorno estrellado. ¿Cómo se puede saber si
los mutantes lob y es son alelos de una serie alélica?
30) En Drosophila se identificaron dos cepas puras que difieren de la cepa salvaje por el
color de los ojos. Una es bermellón claro "ber", la otra es rubí "rub".
a) Si el cruzamiento de hembras "rub" x machos "ber" da una F1 toda salvaje, ¿cómo
explicaría Ud. que ninguno de los colores mutantes aparezca en la descendencia?
b) El cruzamiento hembras "ber" x machos "rub" da en la F1 hembras salvajes y machos
"ber". ¿Cómo explica la aparición del fenotipo "ber" en los machos?
c) ¿Están estos genes implicados en el mismo cromosoma?
d) F1 x F1 del cruzamiento b) da una descendencia con cuatro fenotipos diferentes: "+",
"ber", "rub" y "orange". ¿Qué hipótesis simple explica la aparición del fenotipo
"orange"?
e) Según esta hipótesis, cuáles son las proporciones esperadas para cada fenotipo?
MARCADORES CITOGENÉTICOS Y MOLECULARES
31) Hembras de Drosophila homocigotas para el gen ligado al X carnation (ojos rubí,
recesivo) se cruzan con machos salvajes que tienen cromosomas X de tamaño mayor al
normal como consecuencia de la adición de un fragmento
Marcador
del cromosoma Y. Las hembras descendientes de este
cromosómico
cruzamiento se cruzan con machos carnation. De los
Locus
individuos que llevan el marcador cromosómico, 1% son
carnation
carnation.
Indique la distancia genética del locus carnation con
respecto al marcador cromosómico.
32) La siguiente genealogía corresponde a una familia que presenta una patología
conocida como eliptocitosis u ovalocitosis. El gen causante de esta enfermedad se halla
ligado al gen que determina el sistema de grupos sanguíneo Rh. El porcentaje de
recombinación entre ambos genes es del 3%. Si el individuo IV8 tiene un hijo del grupo
sanguíneo R1r, ¿cuál es la probabilidad de que éste tenga eliptocitosis?
33) De la siguiente genealogía el individuo I3 y su hijo II2 desarrollaron, después de los
50 años, la enfermedad de Huntington. Esta enfermedad, de herencia monogénica y
dominante, ha sido diagnosticada gracias a la presencia de un marcador de tipo VNTR
que se comporta ligado al locus responsable de la enfermedad.
Con estos antecedentes, la mujer III 7 consulta por la posibilidad de tener un hijo que
lleve el alelo afectado, por lo cual se analiza esta familia en cuanto a su genotipo para el
marcador molecular. Este marcador, en la familia en cuestión, presenta 4 alelos
identificables por su migración diferencial en gel, como se observa en el southern blot
de la figura.
En base a la genealogía y el southern blot, ¿qué probabilidad tiene esta mujer, casada
con un hombre sin antecedentes de enfermedad de Huntington, de tener un hijo
afectado?
Drosophila melanogaster
UN MODELO BIOLÓGICO PARA EL ESTUDIO DE LOS
CARACTERES HEREDITARIOS
Cronograma
23/09
Clase 1
Introducción a la biología y genética de D. melanogaster. Observación
del ciclo de vida y dimorfismo sexual. Identificación del fenotipo
salvaje y de las mutaciones incógnitas. Planteo de hipótesis para
investigar el modo de herencia de las mutaciones.
28/09
Clase 2
Discusión de las hipótesis planteadas con los estudiantes. Realización
de los cruzamientos.
12/10
Clase 3
Análisis de la progenie F1. Planteo de hipótesis para determinar el
grupo de ligamiento de las mutaciones, empleo de los “cromosomas
balanceadores”. Planteo del test de alelismo.
14/10
Clase 4
Discusión de las hipótesis planteadas. Realización de cruzamientos
para el análisis de ligamiento. Realización de cruzamientos para el
test de alelismo.
28/10
Clase 5
Continuación de los cruzamientos realizados en la clase anterior.
Análisis de ligamiento: análisis de la progenie F1 y segundo
cruzamiento. Test de alelismo: análisis de la progenie F1. Discusión
de los resultados observados.
11/11
Clase 6
Análisis de la progenie F2 y determinación del grupo de ligamiento.
Discusión de los cruzamientos para realizar el análisis de las
frecuencias de recombinación entre dos loci (uno de ellos incógnita).
16/11
Clase 7
Discusión de las hipótesis planteadas. Análisis de la progenie y
análisis de la frecuencia de recombinación. Cálculo de las distancias
génicas y discusión de los resultados.
La mosca del vinagre, Drosophila melanogaster, es un organismo eucariota empleado
como modelo de experimentación en Genética. Tiene las siguientes ventajas: 1) un ciclo
vital relativamente corto a temperatura ambiente, entre 10-14 días; 2) es fácil de criar
en botellas o tubos de vidrio con un medio de cultivo barato y sencillo de preparar; 3)
una gran productividad, una pareja produce varios cientos de descendientes; 4) un
número cromosómico bajo, 4 pares de cromosomas; y 5) un gran número de caracteres
heredables que afectan la morfología del adulto. Como resultado de la larga trayectoria
en la investigación en genética, se han descubierto un gran número de mutaciones y se
ha logrado un vasto conocimiento de su genoma.
Objetivos
•
Introducir al estudiante en el ciclo de vida de la mosca Drosophila, el
reconocimiento de los sexos y de los fenotipos mutantes, y la nomenclatura.
•
Estimular el planteo de hipótesis y su contrastación mediante el desarrollo de
cruzamientos experimentales.
•
Determinar el modo de herencia y el grupo de ligamiento de tres mutaciones
incógnita empleadas en el práctico, incluyendo la prueba de alelismo.
•
Calcular la distancia genética de las mutaciones incógnita respecto a un locus
conocido. Determinar la posición e identidad de la mutación estudiada.
Clase 1
Introducción a la biología y genética de D. melanogaster. Observación del ciclo de
vida y dimorfismo sexual. Identificación del fenotipo salvaje y de las mutaciones
incógnita. Planteo de hipótesis para investigar el modo de herencia de las
mutaciones.
Materiales:
Lupa, Lámpara, Tablilla, Paletita, Tubo anestesiador, Almohadilla
Cepas: salvaje y cepas mutantes: m1, m2 y m3
Ciclo de vida: placas de petri con huevos. Tubos de cultivo con diferentes estadios de
larva y pupa.
D. melanogaster (Clase: Insecta; Orden: Diptera) es un insecto holometábolo, cuyo
ciclo vital consta de cuatro estadios: huevo, larva, pupa y adulto (o imago) (Figura 1).
Las hembras comienzan a depositar los huevos alrededor del tercer día de vida del
imago y continúan hasta su muerte. A simple vista los huevos se ven como un objeto
pequeño, blanco y oblongo, con un par de filamentos anteriores. El desarrollo del huevo
comienza con la fecundación y consta principalmente de la formación de los tejidos
larvales. Después de un día o dos, las larvas emergen de los huevos. Como la cutícula
de los insectos no es elástica, la larva muda periódicamente. Existen tres estadios
larvales, separados por las mudas correspondientes. Durante el tercer estadio larval, la
larva se alimenta hasta estar pronta para pupar. Durante el estadio pupal ocurre la
metamorfosis y a los 4 días emerge el adulto de la cubierta pupal.
Las moscas se pueden cultivar en un medio compuesto por agar, levadura, harina de
maíz, glucosa, un antimicótico y un bactericida. Este medio se dosifica en tubos o
botellas de vidrio o plástico. En buenas condiciones de cultivo y a 25°C transcurren
alrededor de 10 días desde la puesta de los huevos hasta la emergencia del imago. Si la
temperatura permanece entre 22°C y 26°C, se producirá una nueva generación de
moscas en aproximadamente 2 semanas, por ello el práctico se realiza cada 14 días. Los
huevos son puestos en la superficie del alimento (o medio de cultivo). Cuando la larva 1
emerge del huevo, comienza a alimentarse e introducirse en el medio de cultivo. Las
larvas en movimiento se detectan por el movimiento de las mandíbulas quitinosas de
color oscuro. La larva 3 se mueve fuera del medio hacia un lugar seco donde se detiene
a pupar.
EL GENOMA de D. melanogaster
D. melanogaster presenta un número cromosómico 2n=8. Los pares cromosómicos se
numeran del I al IV, siendo el I el cromosoma X, y del II al IV los pares autosómicos. El
par sexual en las hembras es XX y en el macho es XY. El cromosoma IV (o”dot”) es el
más pequeño.
El genoma de D. melanogaster ha sido completamente secuenciado. Mide alrededor de
165 millones de bases y se estima que contiene 14.000 genes. La posición de muchos
genes a lo largo de los cromosomas ha sido identificada.
Similitud con los humanos: a nivel genético, la gente y las moscas somos muy
similares. Cerca del 61% de las enfermedades conocidas en los humanos tienen un
reflejo reconocible en el genoma de las moscas y el 50% de las secuencia de proteínas
de las moscas tienen un análogo en los mamíferos. Es por ello que Drosophila es
utilizada como modelo genético en varias enfermedades de los humanos, incluyendo las
enfermedades denominadas Parkinson y Huntington.
NOMENCLATURA
¿Cómo designar el genotipo?
Los nombres de los genes son designados en base a los alelos recesivos, los cuales se
designan con letra minúscula y los alelos dominantes con letra mayúscula.
La convención para escribir un genotipo es la siguiente: X/Y; 2nd/2nd; 3rd/3rd.
La barra “/” se usa para : separar los cromosomas homólogos.
El punto y coma “;” se usa para separar diferentes pares de cromosomas.
El símbolo + es usado para describir el fenotipo tipo salvaje y los alelos que dan el
fenotipo normal, y también al genoma entero o un gen en particular. Para designar el
alelo salvaje (es decir el más frecuente) de un determinado gen, se utiliza este símbolo
(como un superíndice).
Si un individuo (o cepa) se designa solamente por símbolos mutantes, ej.: dp, ec, ey, se
asume que es cepa pura, homocigota para los alelos mutantes que porta.
Si el individuo (o cepa) es heterocigota para uno o más genes, el genotipo puede
describirse así:
Genes ubicados en el mismo cromosoma:
dp + bwV
_______________
o así:
dp + bwV/+ cn +
+ cn +
También es válido: dp cn+ bwV/dp+ cn bwV+
Actividad 1. Observación del ciclo de vida
Se le proporcionarán tubos de cultivo con los estadios larvales, pupas, y placas de Petri
con huevos.
Actividad 2. Anestesiado de las moscas
Proceda de la siguiente manera:
1) Transfiera las moscas de cepa salvaje a un tubo anestesiador, tape el mismo con un
tapón de polifom y dosifique vapores de trietilamina dentro de dicho tubo por el orificio
del tapón.
2) Una vez que todas las moscas estén inmovilizadas, deposítelas sobre una tablilla. Las
moscas permanecerán anestesiadas por 45 minutos. La exposición prolongada a la
trietilamina puede matar a las moscas, presentándose con alas y patas extendidas en
ángulo recto al cuerpo y con ojos oscurecidos y deformados. En tal caso descarte las
moscas muertas.
3) Observe los caracteres de la mosca salvaje. Ajuste la lupa al MENOR aumento y
haga foco. Si es necesario, observe a mayor aumento. No coloque la luz muy cerca de
las moscas, o el calor excesivo las deshidratará y acabará matándolas.
Actividad 3. Identificación de los sexos (Figuras 2 y 3)
1. Tamaño del adulto. La hembra es generalmente más grande que el macho.
2. Forma del abdomen. El abdomen de la hembra se curva y termina en punta; el
abdomen del macho es redondeado y más corto.
3. Marcas en el abdomen. Bandas claras y oscuras se alternan en la porción posterior de
la hembra; mientras que en el macho están fusionadas y forman una banda oscura.
4. Presencia de peine sexual. En los machos existe un pequeño penacho de setas en el
segmento basal del tarso en el primer par de patas llamado “peine sexual”. Este es el
único carácter sexual secundario que diferencia los machos jóvenes de las hembras.
5. Genitalia externa. La genitalia es un carácter sexual primario. En las hembras se
encuentra el ovipositor en la punta del abdomen, mientras que en el macho existen
ganchos pigmentados, ordenados en forma circular y localizados en el extremo caudal.
Actividad 4. Observación de los mutantes
Recibirá tres cepas, cada una con una mutación diferente que afecta solamente un
carácter. Determine el fenotipo mutante comparándolo con el fenotipo salvaje. Describa
el fenotipo de cada mutación incógnita y el número correspondiente en sus apuntes,
designe un “nombre” que sea representativo del carácter mutante, si lo desea.
Actividad 5 (domiciliaria). Planteo de hipótesis
Diseñe los cruzamientos y plantee los resultados esperados que le permitan determinar:
a) el modo de herencia de cada mutación incógnita (tres en total) (autosómica vs ligada
al sexo).
b) la naturaleza del alelo mutante (recesivo vs dominante respecto al salvaje).
Los cruzamientos e hipótesis serán puestos en común y discutidos en la Clase 2.
Clase 2
Discusión de las hipótesis planteadas con los estudiantes. Realización de los
cruzamientos.
Materiales:
Lupas,etc.
Tubos con medio de cultivo para los cruzamientos.
Cepas de las mutaciones m1, m2 y m3 y de la cepa salvaje
Vírgenes de la(s) cepa(s)....
Actividad 1. Discusión de las hipótesis. Propuesta de cruzamientos y discusión de los
resultados esperados
Los estudiantes integrantes de cada grupo llevarán a cabo en forma conjunta todas las
actividades del práctico de Drosophila. Deberán elaborar hipótesis de los cruzamientos
indicados para investigar la naturaleza y herencia de las mutaciones. Dicho planteo será
discutido con el docente.
Describa los cruzamientos propuestos en sus notas.
Actividad 2. Realización de cruzamientos. Metodología utilizada a lo largo del
práctico .
En cada cruzamiento utilice alrededor de 10-12 hembras vírgenes y de 5 a 8 machos.
El docente le proveerá de las hembras vírgenes. Ud. deberá seleccionar los machos,
previa anestesia de la cepa correspondiente.
Previo a la realización del cruzamiento confirme con el docente el sexo y fenotipo de las
moscas seleccionadas.
Coloque los tubos con las moscas anestesiadas en forma horizontal. Señale en cada tubo
el TIPO DE CRUZAMIENTO (genotipos de machos y de hembras), el NÚMERO DE
LA MUTACIÓN, la FECHA y el NOMBRE DE SU GRUPO para luego identificar los
tubos en la próxima clase.
Actividad 3 (domiciliaria). Planteo de los resultados esperados
Plantee los resultados esperados de cada cruzamiento según cada hipótesis. Plantee los
genotipos y fenotipos esperados. Si lo desea, puede utilizar la tabla que se ejemplifica a
continuación:
Tabla de los fenotipos esperados de cada cruzamiento (complete las proporciones
esperadas en cada cuadrado)
Hipótesis #
.:
Cruzamiento:
[m]
[+]
♀♀
♂♂
Utilice una Tabla similar para indicar el número de individuos observados (progenie) de
cada cruzamiento que realice en el práctico. Indique también el porcentaje o fracción en
cada clase fenotípica y los totales.
Clase 3
Análisis de la progenie F1. Planteo de hipótesis para determinar el grupo de ligamiento
de las mutaciones, introducción al empleo de los “cromosomas balanceadores”. Test de
alelismo.
Materiales:
Lupas,etc.
Cruzamientos realizados en clase anterior.
Cepas balanceadoras: Cy/bwv, y Ly Sb/In(3)LVM
Actividad 1. Análisis de la progenie
Observe la progenie (F1) de cada cruzamiento realizado en la clase anterior.
Trabaje de forma ordenada, analice un tubo por vez.
Describa los resultados obtenidos en tablas.
Compare los datos obtenidos con los esperados según cada hipótesis. ¿A qué
conclusiones ha llegado?
Consulte con el docente sus resultados y conclusiones.
Actividad 2. Planteo de nuevas hipótesis para la determinación del grupo de
ligamiento de las mutaciones autosómicas. Empleo de cromosomas balanceadores.
Si alguna de las mutaciones presenta herencia autosómica deberá investigar a qué
cromosoma está ligada (consideraremos sólo los cromosoma 2 ó 3).
Para determinar el grupo de ligamiento, se utilizarán cepas que portan cromosomas
balanceadores. Ello permitirá determinar, mediante cruzamientos, si su mutación se
segrega o no de forma independiente del cromosoma balanceador.
¿Qué son los “cromosomas balanceadores”?
H J Müller (1918) inventó la idea de los balanceadores cuando primero identificó al
cromosoma ClB por su propiedad como supresor de entrecruzamiento en el X y lo
utilizó para aislar nuevas mutaciones letales ligadas a dicho cromosoma. Desde
entonces, se han elaborado otros cromosomas conteniendo múltiples inversiones que
también tienen la propiedad de inhibir la ocurrencia de entrecruzamiento con su
cromosoma homólogo. Cuando estos cromosomas llevan además mutaciones
dominantes (y recesivas) se vuelven una herramienta muy útil para el análisis de la
segregación y la síntesis de genotipos deseados. Las condiciones que hacen a un
cromosoma balanceador son:
•
Portar inversiones (múltiples) del tipo paracéntricas y pericéntricas, las cuales
suprimen el intercambio genético en individuos heterocigotas para dichos
reordenamientos cromosómicos (Ver esquema)
•
Portar mutaciones dominantes que sirven para “marcar” fenotípicamente la
presencia de dicho cromosoma (en la progenie)
•
Tienen la habilidad, en condición heterocigota, de poder determinar los
genotipos (invisibles) y los gametos esperados con una seguridad del 100%.
•
Estos cromosomas (y las cepas que los portan) se denominan “balanceadores”
pues se mantienen en cultivo en condición heterocigota y segregan solamente
gametos no recombinantes.
•
Existen cromosomas balanceadores para el cromosoma X (denominados F por
“First”), el 2 (S por “Second”) y el 3 (T por “Third).
Consecuencia genética de las inversiones heterocigotas sobre el crossingover
Aunque las inversiones por sí mismas no tienen efecto directo sobre el fenotipo, pueden
tener consecuencias genéticas en individuos heterocigotas. En el siguiente esquema se
muestra la ocurrencia de inversiones (paracéntricas y pericéntricas) en un individuo
heterocigota, el apareamiento, la ocurrencia de crossingover y la segregación de
gametos viables e inviables (que no son integrados en el gameto femenino) en la
meiosis (ver esquema).
Utilizaremos dos cepas balanceadoras:
Balanceador del cromosoma 2: Cy/bwV (Curly sobre brown variegado):
Porta el cromosoma balanceador “SM6” (cromosoma 2) caracterizado por la
In(2LR)SM6, y las mutaciones al Cy dp cn sp.
• In (2LR) = inversión pericéntrica que ocupa el brazo izquierdo y derecho del
cromosoma 2. La inversión In(2LR) previene la recombinación entre los
homólogos del cromosoma 2.
• Cy (Curly) es una mutación dominante letal en homocigosis y los genes
recesivos al dp cn sp =: aristaless (al), dumpy (dp), cinnabar y speck (sp).
• El cromosoma SM6 está balanceado con un homólogo “bwv”, que porta la
mutación brown variegated y un gen letal.
Cy (2-6.1) (Curly; dominante) Alas curvadas hacia arriba. Rara vez se solapa con el
fenotipo salvaje a 25 C pero sí si se cultiva a 19 C. Generalmente es letal en
homocigotas, pero pueden emerger moscas homocigotas enanas mostrando el
carácter de las alas de forma más extrema. La mutación está asociada con una
inversión en el segundo cromosoma de la cual no se puede separar.
bwV (2-104.5) (Brown-Variegated; dominante). El hecho de que el símbolo bw esté en
minúscula es una excepción. Color de ojos al emerger marrón borra de vino claro,
se oscurece a granate, es manchado con máculas más oscuras que profundizan su
color con la edad. Letal en homocigotas, fértil en heterocigotas. Asociado a una
inversión en el segundo cromosoma.
Balanceador del cromosoma 3: Ly Sb/In(3)LVM (Lyra Stubble sobre la inversión 3
LVM):
Cepa que porta las mutaciones Ly (Lyra) y Sb (Stuble) en el (mismo) cromosoma 3, y la
In(3)LVM en el cromosoma homólogo. Sb, como In(3)LVM, son letales en homocigosis,
por lo que esta cepa está balanceada. La inversión In(3)LVM previene la recombinación
entre los homólogos del cromosoma 3.
Ly (3-40.5) (Lyra; dominante) Márgenes laterales de las alas recortadas de tal manera
que resultan con una forma angosta; ángulo entre las venas L2 y L5 reducido. Las
setas son cortas y retaconas, las postescutelares faltan a menudo. Ojos algo
deformados con salientes. El abdomen oscuro y angosto con los bordes de los
tergitos posteriores levantados.
Sb (3-58.2) (Stubble; dominante) Las setas del heterocigota (Sb/+) tienen menos de 1/2
de la longitud normal y son algo más gruesas que el tipo salvaje. Homocigotas
letales.
In(3)LVM: cromosoma balanceador, porta una inversión. Posee dos mutaciones que son
recesivas letales en la región invertida.
Actividad 3. Observación de cepas balanceadoras
Observe el fenotipo de cada cepa para luego reconocer las marcas (mutaciones) en la
progenie de los cruzamientos que Ud realice.
Clase 4
Discusión de las hipótesis planteadas para determinar:
(a) El grupo de ligamiento de las mutaciones autosómicas.
(b) El posible alelismo.
Materiales:
Lupas,etc.
Tubos con medio de cultivo para realizar cruzamientos.
Cepas de las mutaciones m1, m2 y m3
Cepas balanceadoras: Cy/bwv, y Ly Sb/In(3)LVM
Vírgenes de la(s) cepa(s)....
Actividad 1. Ligamiento autosómico. Discusión de hipótesis
Discuta con su grupo la serie de cruzamientos y generaciones necesarias para
determinar si la/s mutacion/es están ligadas al cromosoma 2 o al cromosoma 3. Elabore
los cruzamientos y fenotipos esperados según cada hipótesis. Elabore con su grupo el
planteo de cruzamientos necesarios a fin de poner en común con el docente previo a la
puesta en práctica de los mismos.
Actividad 2. Ligamiento autosómico. Realización de cruzamientos
Describa los cruzamientos propuestos en sus notas.
Confirme con el docente el sexo y el fenotipo de las moscas seleccionadas. Utilice la
misma metodología realizada a lo largo del práctico de Drosophila.
Actividad 3. Test de alelismo. Realización de cruzamientos
Plantee en el grupo las siguientes preguntas: ¿En qué consiste el Test de Alelismo? En
base a los resultados obtenidos en la clase anterior, ¿qué cruzamientos debería realizar
para determinar si dos mutaciones pertenecen (o no) a la serie alélica de un mismo gen?
El docente le brindará hembras vírgenes y Ud deberá seleccionar los machos. Utilice la
misma metodología realizada a lo largo del práctico de Drosophila.
Describa todos los cruzamientos realizados en esta clase y las Tablas fenotípicas que
espera llenar en la próxima clase.
Clase 5
Continuación de los cruzamientos realizados en la clase anterior.
(a) Análisis de ligamiento. Análisis de la progenie F1 y segundo cruzamiento.
(b) Test de alelismo. Análisis de la progenie F1.
Discusión de los resultados observados.
Materiales:
Lupas,etc.
Cruzamientos realizdos en la clase anterior.
Tubos con medio de cultivo para realizar nuevos cruzamientos.
Vírgenes de la(s) cepa(s)....
Actividad 1. Ligamiento cromosómico. Observación de la progenie F1. Realización de
cruzamientos.
Observe la progenie F1 de los cruzamientos realizados en la clase anterior.
Analice un tubo por vez.
Cuente los machos y las hembras, anote el fenotipo y la frecuencia de cada tipo en la
Tabla correspondiente. Trabaje de forma ordenada.
No tire las moscas de la progenie hasta que realice nuevos cruzamientos que le permitan
determinar el grupo de ligamiento de su mutación.
El docente le brindará hembras vírgenes y Ud deberá seleccionar los machos. Siga la
metodología utilizada hasta ahora.
Describa TODOS los cruzamientos realizados en esta clase y las Tablas fenotípicas que
espera llenar en la próxima clase.
Actividad 2. Test de alelismo. Observación de la progenie y discusión de los
resultados.
¿Qué evidencias tiene para rechazar o confirmar si las mutantes seleccionadas son alelos
de un mismo gen?
Clase 6
Análisis de la progenie F2 y determinación del grupo de ligamiento.
Planteo de hipótesis para la determinación de las distancias génicas en el mapa
genético. Discusión de los cruzamientos genéticos para realizar el análisis de las
frecuencias de recombinación.
Materiales:
Lupas,etc.
Cruzamientos realizados en la clase anterior.
Actividad 1. Ligamiento cromosómico. Observación de la progenie F2 y discusión de
los resultados.
Observe la progenie F2 de los cruzamientos realizados en la clase anterior. Analice un
tubo por vez. Describa los resultados obtenidos en Tablas.
Cuente los machos y las hembras, anote el fenotipo y la frecuencia de cada tipo en la
Tabla correspondiente. Trabaje de forma ordenada.
Contraste los resultados obtenidos con los esperados según cada hipótesis.
¿Qué evidencias tiene que apoyen o no que la/s mutación/es están ligadas a determinado
cromosoma? ¿y qué evidencias tiene que excluyan su ubicación en un determinado
cromosoma?
Actividad 2. Análisis de las frecuencia de recombinación. Observación de cepas
mutantes (marcadoras).
Para genes ligados al cromosoma X, utilizaremos la mutación cv ( crossveinless).
Para genes ubicados en los autosomas (cromosomas 2 ó 3) utilizaremos una de las
mutaciones dominantes empleadas anteriormente (en el análisis de ligamiento).
cv (X-13.7)
(crossveinless; recesivo) Ausencia de la vena transversal del ala presente
en moscas salvajes entre las venas longitudinales 4 y 5 (Fig. 3).
Actividad 3. Análisis de las frecuencia de recombinación. Planificación de
cruzamientos.
¿Qué fenómenos genéticos le permiten determinar la distancia entre dos genes ligados ?
Discuta con su grupo el o los cruzamiento(s) necesarios para determinar la distancia
entre dos genes. Se le proporcionará, como marcador, un gen conocido (ver actividad 2)
¿Qué condiciones genéticas son necesarias para observar crossing over? ¿Cuántas
generaciones lleva dicho análisis?
Elabore la Tabla fenotípica (y genotípica) de resultados esperados de los cruzamientos
planteados.
Clase 7
Análisis de la progenie (proporcionada por los docentes) y análisis de la frecuencia de
recombinación. Cálculo de las distancias génicas y discusión de los resultados.
Materiales:
Lupas, etc.
Cruzamientos realizados para análisis de la frecuencia de recombinación.
Actividad 1. Análisis de la progenie
Si la mutación está ligada a un autosoma, cuente los machos y las hembras; si está en el
cromosoma X cuente sólo los machos de la progenie. ¿A qué se debe esta distinción?
Determine el número de moscas de cada fenotipo. Anote el número de individuos de
cada fenotipo en una Tabla. Para facilitar este trabajo, separe las moscas por la presencia
vs ausencia del FENOTIPO (mutante) MÁS FACIL DE RECONOCER. Cuente y
clasifique la mayor cantidad de progenie posible a fin de obtener resultados más
confiables.
Describa los resultados obtenidos en Tablas.
Actividad 2. Cálculo de las distancias génicas entre loci utilizados y puesta en común
de los resultados obtenidos. Uso del mapa genético de la especie.
Calcule la distancia genética entre el marcador de posición conocida y cada mutación
incógnita. ¿Para qué es importante este dato?
De acuerdo con sus resultados determine en el mapa genético qué gen candidato podría
identificar como su mutación incógnita (Figura 4). Discuta la propuesta con el
docente. Se evaluarán los datos de los otros grupos en conjunto.
Figura 4. Mapa genético de D. melanogaster
VARIACIONES CROMOSÓMICAS
Introducción
Como regla general la constitución cromosómica de los individuos de una especie es constante en
cuanto a la morfología y número de los cromosomas. Sin embargo, pueden producirse variaciones
cromosómicas espontáneas o inducidas que afectan a su estructura u ordenación lineal de genes
(variaciones cromosómicas estructurales) o al número cromosómico (variaciones cromosómicas
númericas).
Los cambios cromosómicos constituyen un importante mecanismo en la evolución de las
especies. Sin embargo, en la mayor parte de los casos su aparición provoca severas repercusiones
fenotípicas en el organismo o en su descendencia. Es por este motivo algunos autores las denominan
aberraciones cromosómicas.
Las variaciones cromosómicas observables al microscopio óptico son el producto final de una
larga cadena de acontecimientos. Las lesiones primarias ocurren a nivel molecular y se localizan en el
ADN nuclear. Se requieren una serie de procesos celulares activos para convertirlas en cambios que
continúen presentes en las células descendientes de aquellas que recibieron el daño inicial. Las
variaciones pueden ser espontáneas o inducidas por diferentes agentes, que pueden ser de carácter
físico o químico, ya sea enzimático o no, a los cuales se denomina agentes clastogénicos. Los tipos
más comunes de agentes clastogénicos son las radiaciones ionizantes y la radiación ultravioleta, las
endonucleasas de restricción, los agentes químicos antitopoisomerasa I y II, que interactuán con
dichas enzimas evitando que actúen durante la reparación del ADN, y los agentes alquilantes.
Reordenamientos cromosómicos estructurales
Las variaciones cromosómicas estructurales generalmente provocan una reestructura de uno o
más de los cromosomas del complemento, y pueden implicar pérdida de material genético. Los tipos
más comunes de alteraciones estructurales son: duplicaciones, deleciones, inversiones,
translocaciones recíprocas, y fusiones/fisiones robertsonianas.
Reordenamientos cromosómicos numéricos
Las variaciones numéricas son aquellas que no afectan la estructura de los cromosomas ni el
ordenamiento de los genes, pero hacen que el número cromosómico de la célula que los porta difiera
del número cromosómico normal de la especie.
Existen dos tipos de variaciones numéricas: la EUPLOIDÍA, en que hay cambios en el número
de juegos completos de cromosomas, y la ANEUPLOIDÍA, en que solo varía el número de uno o
alguno de los cromosomas del complemento. Las aneuploidías se generan por no disyunción en
meiosis, proceso por el cual se gana o pierde un cromosoma (por ejemplo en la trisomía 21 que
provoca el síndrome de Down y el sindrome de Turner en el que se pierde un cromosoma X).
Las euploidías más comunes son las poliploidías, en que las células portan más de dos juegos
haploides de cromosomas. Aunque se conocen algunos poliploides animales, este fenómeno es
mucho más común en plantas. Esto se debe a que los animales suelen tener mecanismos
cromosómicos de determinación del sexo, y a que las plantas se pueden reproducir vegetativamente
(con lo que se reducen los riesgos de una incorrecta segregación durante la meiosis). Existen dos tipos
de poliploidía: la autopoliploidía, en que todos los cromosomas provienen de la misma especie, y la
alopoliploidía, que se origina con la fecundación entre dos especies diferentes.
Objetivos: Reconocer distintos tipos de variaciones cromosómicas estructurales (reordenamientos),
proponer métodos de análisis para conocer su origen y plantear las posibles consecuencias en la
meiosis.
1- Mencione y explique brevemente las técnicas citogenéticas que utilizaría para diagnosticar cada
uno de los siguientes reordenamientos cromosómicos:
a. Deleción
b. Duplicación
c. Inversión
d. Translocación recíproca
2- Dos especies de mamíferos cercanamente emparentadas tienen cariotipos idénticos, excepto por
una diferencia en el número cromosómico. La especie A tiene un par menos que la B. Los
cromosomas que difieren entre una especie y otra se muestran a continuación. ¿Qué tipo de
reordenamiento ha ocurrido durante el proceso de divergencia de estas especies?
Especie A
Especie B
3- A continuación se muestra una representación de dos cromosomas homólogos. Uno de ellos
ha sufrido un proceso de inversión.
a- Realice un esquema del apareamiento entre estos cromosomas durante el paquiteno.
b- Suponga que ocurre recombinación entre estos dos cromosomas en la región comprendida
entre los genes b y d. Esquematice los cromosomas resultantes que serán portados por los
gametos de este individuo.
c- Discuta las implicancias evolutivas de esta transformación para la especie que la porta.
4- A continuación se presenta un cariotipo humano.
a- ¿Qué técnica se utilizó para teñir estos cromosomas?
b- ¿Qué alteraciones presenta este cariotipo? Fundamente su respuesta.
5La leucemia crónica mielogénica (CML) está asociada en un 90% de los casos con una
translocación recíproca entre el cromosoma 9 y el 22, como se explica en la figura adjunta. Los
puntos de rotura de los cromosomas están ubicados en la Región del Cluster de Rotura (BCR) en el
cromosoma 22, y el gen Abl en el cromosoma 9.
A continuación se muestra una metafase de una célula normal y una metafase de un individuo
con CML, y varias células en interfase. Para obtenerlas se realizó la técnica de FISH, en la cual una
sonda marcada con un fluorocromo rojo marca el gen abl y otra sonda marcada con fluorocromo
verde marca el cluster BCR.
a- ¿Cuál de las metafases - A o B- corresponde al individuo normal y cuál al enfermo?
b- ¿A qué genotipo corresponde la imagen de interfase?
c- Fundamente su respuesta explicando las características de la técnica utilizada que le
permitieron llegar a esa conclusión.
Metafase A
Metafase B
Interfases
GENÉTICA DE POBLACIONES:
RELEVAMIENTO DE RASGOS GENÉTICOS EN
POBLACIONES HUMANAS
Ciertos rasgos genéticos, apreciables a simple vista, pueden ser analizados como si estuvieran
determinados por un solo gen que presenta dos formas alternativas.
Veamos en detalle algunos de estos rasgos:
1. Lengua enrollada o no: Algunas personas pueden enrollar la lengua formando una U
mientras que otras no pueden hacerlo.
2. Entrecruzamiento de los dedos de ambas manos: al entrecruzar los dedos, puede quedar
arriba el pulgar izquierdo o el derecho.
3. Presencia o ausencia de hoyuelo en la barbilla.
4. Lóbulo de la oreja suelto o adherido.
Pueden verse las figuras de estos rasgos en la última página.
Proponemos realizar dos actividades que contribuirán al conocimiento de la genética en el marco
del curso:
1) Realizar un relevamiento para los rasgos antes expuestos dentro de la familia y construir una
genealogía a partir de los fenotipos. Recuerda la nomenclatura utilizada en genealogías. Extrae
conclusiones acerca de la forma de herencia de dichos caracteres: para cada caso encuentra la
relación de dominancia entre los dos alelos existentes. Intenta asignar genotipos hasta donde sea
posible en la genealogía.
GENEALOGÍA:
2) Realizar un relevamiento poblacional de uno de los rasgos antes expuestos (número mínimo
de la muestra: 20). Una vez relevados los datos, en clase trabajaremos para obtener las
frecuencias génicas y genotípicas para dicho rasgo asumiendo que la población se encuentra en
equilibrio. A partir de sus resultados ¿cuántas personas posiblemente sean heterocigotas en la
muestra?
DESCRIPCIÓN FENOTIPO:
FENOTIPOS
[
]
NUMEROS
FRECUENCIAS GÉNICAS Y GENOTÍPICAS:
[
]
1) Capacidad de enrollar la lengua en U
2) Entrecruzamiento de los dedos de ambas manos
1) Barbilla con hoyuelo
2) Lóbulo suelto (A) o adherido (B)
GENÉTICA DE POBLACIONES:
MARCADORES MOLECULARES Y EQUILIBRIO HARDY-WEINBERG
MARCADORES MOLECULARES Y FACTORES DE MICROEVOLUCIÓN
Tanto la genética clásica como la genética molecular ofrecen en la actualidad una diversidad
de técnicas y aproximaciones para acceder al estudio de distintos procesos biológicos a nivel
poblacional. Estas herramientas pueden ser utilizadas para la identificación de un individuo o
para determinar su éxito reproductivo, permiten también la exclusión o asignación de
paternidad, el análisis de la estructura poblacional a diferentes niveles o de las tasas de
divergencia genética entre poblaciones.
La técnica más apropiada para responder una pregunta concreta depende de: (1) el grado de
polimorfismo genético requerido para contestar mejor la cuestión, (2) la disponibilidad de
métodos analíticos o estadísticos para la aplicación de cada una de las técnicas y (3)
cuestiones pragmáticas como tiempo y costo.
Antes del desarrollo de las técnicas de electroforesis en la década del 50, los marcadores
genéticos incluían rasgos mendelianos como el color de la flor o fruto de una planta. Es
posible hacer estudios sobre genética de las poblaciones a partir del análisis de las frecuencias
génicas y genotípicas en base a las características fenotípicas de los individuos que
comprenden dichas poblaciones.
MARCADORES FENOTÍPICOS PARA EL CÁLCULO DE FRECUENCIAS
GÉNICAS Y GENOTÍPICAS
1) El color de cierto roedor se encuentra determinado por un único gen, siendo el color negro
determinado por el genotipo AA, el gris por Aa y el blanco por aa. Una población de estos
ratones presenta las siguientes frecuencias fenotípicas: color negro = 0.9, color blanco =0.09 y
color gris = 0.01.
a) ¿Cuáles son las frecuencias de los alelos A y a?
b) ¿Cuáles son las frecuencias genotípicas esperadas con apareamiento al azar?
2) Una variación genética en el hombre (no deletérea) se manifiesta en los homocigotas
recesivos. Los individuos heterocigotas presentan el fenotipo normal.
En una población humana, 1 de cada 10.000 individuos presentan dicha variación. Una mujer
fenotípicamente normal, que es hija de un individuo que presenta la variación, se casa con una
persona fenotípicamente normal. ¿Cuál es la probabilidad de que su primer hijo presente la
variación en cuestión?.
3) Un entomólogo realiza una amplia captura de mariposas y las clasifica por la coloración
que viene determinada por la pareja alélica A,a.
color negro (AA)
Nº
400
color marrón (Aa)
color amarillo (aa)
400
200
a) ¿Cuáles son las frecuencias génicas y genotípicas en esa población?
b) ¿Está en equilibrio la población?
4) El condor de California presenta condrodisplasia, una condición que resulta en una
malformación severa en los huesos largos que determina la muerte cerca del momento de
eclosión. Esta condición se debe a la presencia en homocigosis de un alelo recesivo. De 169
huevos analizados en una población de esta especie, cinco exhibieron condrodisplasia.
¿Cuáles son las frecuencias génicas y genotípicas en esa población?
MARCADORES
MOLECULARES
POLIMORFISMOS
PARA
EL
RELEVAMIENTO
DE
A continuación vamos a hacer una breve descripción de las técnicas de genética molecular
más utilizadas para el estudio de poblaciones:
Métodos basados en aloenzimas
La electroforesis de proteínas desarrollada en la década del 50, suministró una nueva fuente
de marcadores genéticos, permitiendo identificar individuos homocigotas o heterocigotas para
un locus dado. Las isoenzimas son distintas formas moleculares de una misma enzima que
presentan o muestran especificidad por el mismo sustrato. El término “aloenzima” se refiere a
diferentes formas alélicas de la codificación nuclear de una enzima. A partir de 1966 hubo una
explosión de estudios de aloenzimas. Por más de cuarenta años se ha generado una rica y basta
literatura donde se han utilizado las aloenzimas para contestar cuestiones de genética
poblacional. La técnica se basa en la purificación de la enzima activa sin desnaturalizar,
utilizando tampones específicos. Posteriormente la muestra es homogenizada y cargada en un gel
(de almidón o poliacrilamida) y separadas por tamaño, forma y/o carga a lo largo de un
gradiente eléctrico. Se utilizan tinciones histoquímicas específicas sobre el gel revelando así
bandas coloreadas que determinan las posiciones de las diferentes aloenzimas. De tal modo
que visualizando los fenogramas, es posible asignar los genotipos a cada individuo. Las
aloenzimas se comportan como marcadores co-dominantes, en la medida en que alelos con
diferentes movilidades electroforéticas pueden ser visualizados en el genotipo heterocigoto.
Métodos basados en ADN
Con el desarrollo de diversas técnicas moleculares, los biólogos de poblaciones tienen la
opción de analizar la variación en las secuencias nucleotídicas. Las diferentes regiones del
genoma experimentan distintas presiones de selección, dependiendo del producto genético y/o
la tendencia del ADN a sufrir cambios en su secuencia nucleotídica. El segmento óptimo de
ADN a utilizar en un estudio particular dependerá no solamente del grado de relacionamiento
entre los individuos estudiados, sino también por el grado de selección impuesta en las
distintas regiones del genoma.
Técnicas básicas
En primer lugar es necesario realizar la extracción de ADN. Existen distintas técnicas para
obtener este material de distintos tipos y estados de tejidos. Es posible también aislar ADN de
origen nuclear y de organelos.
RFLPs (del inglés: Restriction Fragment Length Polymorphisms, polimorfismo en el largo de
los fragmentos de restricción): Las enzimas de restricción cortan el ADN en una secuencia
específica llamado sitio de reconocimiento. La exposición del material genético a enzimas de
restricción genera fragmentos de ADN, éstos difieren en su tamaño cuando una mutación crea
o elimina un sitio de restricción. La determinación de variaciones en el tamaño de los
fragmentos es conocida como RFLPs.
La digestión enzimática de una pequeña molécula como la de ADN mitocondrial genera un
número de fragmentos de ADN suficientemente pequeño cuyo patrón de bandeo puede ser
resuelto de manera consistente luego de correrlo en una electroforesis en gel de agarosa. Las
frecuencias haplotípicas pueden ser cuantificadas por la presencia o ausencia de sitios de
restricción entre los individuos (PLANCHA Nº1).
El ADN nuclear digerido por enzimas de restricción genera un patrón en la electroforesis tipo
“chorrete” (smear). En este caso pueden reconocerse fragmentos de interés particular luego de
la electroforesis, por medio de hibridización con una sonda determinada. La presencia de la
secuencia complementaria en el ADN molde a la sonda de ADN, es detectada mediante
Southern blot y autorradiografía (PLANCHA Nº2 Y Nº3).
5) La siguiente figura muestra el diagrama de bandas con patrones de RFLPs (fragmentos de
ADN homólogos que difieren en la ubicación de los sitios de restricción). Ésta fue generada
por medio de una electroforesis del ADN, previamente expuesto a una enzima de restricción,
e hibridización con una sonda de ADN. En la parte superior se indica el número de individuos
presentando un mismo patrón de bandas.
a)
b)
c)
Realice un esquema del patrón de restricción y del sitio de unión de la sonda para
ambos alelos
Estime las frecuencias alélicas y coloque los genotipos correspondientes debajo de
cada carril.
¿Se encuentra este “locus” en equilibrio Hardy-Weinberg?
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): Esta técnica permite la amplificación de
pequeños fragmentos de ADN. En la reacción de PCR se incluye el ADN molde, la enzima
Taq polimerasa y buffer Mg 10 x así como la mezcla de los 4 nucleótidos (dNTP). La región
blanco a amplificar debe estar flanqueada por regiones de secuencia conocida a la cual se
unirán los cebadores. El producto obtenido por PCR puede ser visualizado en una
electroforesis de agarosa y tinción con bromuro de etidio.
PCR-RFLPs: Muchos estudios en poblaciones naturales se limitan a analizar los patrones de
digestión con enzimas de restricción sobre una región específica de ADN, obtenida por medio
de un PCR previo. De esta manera se pueden establecer distintos alelos en función de la
presencia o ausencia de sitios de restricción (PLANCHA Nº4).
6) Para una población de camarones Peneaus paulensis de la costa Atlántica de América del
sur se encontraron los siguientes patrones de bandas en un locus RFLP con la enzima HaeI.
En una muestra poblacional se encontraron los siguientes patrones:
a)
b)
c)
Describa en cada caso los alelos encontrados, codifíquelos según su tamaño en pares
de bases e indique la estructura genotípica de cada grupo de individuos
Estime las frecuencias alélicas
Calcule las frecuencias genotípicas esperadas en el equilibrio Hardy-Weinberg.
Amplificación al azar de ADN polimórfico: Los RAPDs (de Random Amplified
Polymorphic DNA) son marcadores producidos por PCR utilizando cebadores de secuencias
al azar. Los patrones diferenciales surgen cuando una región del genoma varía en la presencia/
ausencia de sitios complementarios de unión con los cebadores. Los cebadores son
típicamente de unas 10pb y no se necesita un conocimiento específico de la secuencia
particular de ADN que se amplificará para elegir o producir un cebador. La variación
genotípica consiste en la presencia o ausencia de productos particulares amplificados, que
luego son separados por una corrida en gel de agarosa. En ese sentido es un marcador
dominante ya que uno de los homocigotos no se distingue del heterocigoto. Esta técnica ha
sufrido fuertes críticas ya que diversos autores consideran que sus resultados no son
reproducibles, de manera que la naturaleza de la variación genética observable por esta
técnica no es absolutamente clara y por tanto la inferencia a partir de sus resultados debe ser
sumamente prudente. Esta técnica ha resultado muy útil en ausencia de informaciones
genómicas previas referidas a genomas de especies silvestres.
DNA Fingerprinting: El término (huella digital de ADN) se refiere a una serie de técnicas
donde se analizan patrones de bandas generados por electroforésis sobre marcadores genéticos
muy variables. El común denominador es que el patrón generado por el marcador elegido,
presente un grado de variabilidad tal, que permita la identificación a nivel de individuo. Estas
técnicas son de gran utilidad para determinación de paternidad, estudios forenses, asignación
de muestras a un sospechoso, etc. Los patrones de bandas que conforman el fingerprinting
pueden obtenerse por el análisis de un único locus o ser originado a partir de un estudio de
varios loci simultáneamente. Si bien puede obtenerse un fingerprinting por medio de análisis
de bandas de RFLPs y RAPDs, los más comúnmente utilizados son los que se basan en
análisis de marcadores del tipo VNTRs, ya que se caracterizan por un elevado nivel de
polimorfismo.
Número variable de repetidos en tandem (VNTRs):
Los satélites de ADN fueron identificados aproximadamente hacia 1969 existiendo dos tipos
de secuencias satélites –microsatélites y minisatélites. Los microsatélites son también
conocidos como secuencias repetidas simples (SSRs Simple Secuence Repeat) y están
formados por unidades repetidas. Cada repetido tiene un largo de entre dos y seis pares de
bases. Los minisatélites en cambio, son unidades repetidas que van desde diez a 100 pares de
base de largo. Tanto los microsatélites como los minisatélites presentan un altísimo grado de
polimorfismo, lo que los convierte en una muy buena herramienta para el análisis de
poblaciones.
a) Microsatélites de ADN: El análisis de microsatélites es extremadamente útil para el estudio
de poblaciones ya que se puede analizar un locus simple con más de 10 alelos. Estos
marcadores hipervariables se componen de repetidos en tandem de una unidad o “motivo”
compuesto por entre 2 a 6 pb (ej. CA, CAAC, o GGAACC). Los loci de microsatélite son
analizados por amplificación por PCR de una región blanco del ADN que contiene repetidos
en tandem flanqueadas por secuencias en dónde se unen los cebadores diseñados a tales
efectos. Los productos amplificados se visualizan en una electroforesis en gel de acrilamida.
Este tipo de gel permite la resolución de los alelos ya que se pueden diferenciar fragmentos
que difieren hasta tan sólo en dos pares de bases. Actualmente el tamaño de los microsatélites
también puede ser determinado utilizando la misma infraestructura que la utilizada en la
secuenciación automática. En este caso por ejemplo, puede emplearse uno de los cebadores en
el PCR el que se encuentra marcado con un determinado fluorocromo. Durante la
electroforesis en microcapilares, los fluorocromos emiten una señal lumínica (al pasar delante
de una fuente de emisión de luz láser) que sirve para determinar el tamaño exacto del
fragmento en relación con un marcador de peso molecular de referencia. (PLANCHA Nº5
Nº6 Nº7 y Nº8)
b) Minisatélites: Los minisatélites de ADN se componen de unidades repetidas en tandem 10100 bp de largo, con una extensión total que típicamente va desde 0.5-50 kb. Los
polimorfismos están dados tanto por variaciones en la cantidad de repetidos como por
cambios en la secuencia del repetido. El genotipado del minisatélite se puede establecer de
diferentes maneras: a) por medio de reacciones de PCR con cebadores universales que
hibridizan con regiones externas al minisatélite y cebadores que se unen a variantes
específicas dentro del minisatélite; b) por el reconocimiento de los minisatélites por medio de
electroforesis y exposición a una sonda de ADN con la secuencia del minisatélite (que será
detectada por hibridización en un Southern blot y autorradiografía). (PLANCHA Nº9).
Polimorfismos de un nucléotido SNP: este tipo de polimorfismo se caracteriza por
mutaciones puntuales en la secuencia de un fragmento particular de ADN. Por ejemplo,
algunas moléculas presentan el par A-T en un sitio particular y otras moléculas en la misma
población presentan el par C-G. Esta diferencia constituye un SNP. El 99 % del ADN humano
no difiere entre poblaciones, en el 1% restante se encuentran gran cantidad de SNP. Se
considera que esta variabilidad determina por ejemplo susceptibilidades a enfermedades y
tienen por tanto una gran importancia en la investigación biomédica.
Secuenciación: Incluso entre las poblaciones más homogéneas existen diferencias en la
secuencia nucleotídica entre individuos. La secuenciación se ha vuelto un procedimiento de
rutina con el desarrollo de los secuenciadores automáticos. En combinación con el PCR es
posible acceder a datos precisos sobre cortas secuencias de ADN. La comparación de distintas
secuencias dentro o entre poblaciones permite hacer inferencias sobre los procesos genéticos
de las poblaciones (PLANCHA Nº10)
TABLA1. Esquema simplificado de los patrones de bandeo para un locus (dos alelos) y los
niveles de polimorfismo que pueden detectarse con los distintos tipos de marcadores
genéticos.
Pocillos de gel
2
3
Genotipo
A1,A1 A1,A2 A2,A2





1
Aloenzima
PCR-RFLP
VNTR Micro o minisatélites de locus simple
RAPDs



(-/+ sitio de restricción)









(-/+ sitio de unión con el cebador)
Tomado de Parker PG, Snow AA, Schug MD, Booton GC & Fuerst PA (1998) What molecules can
tell us about populations: choosing and using a molecular marker. Ecology 79(2), 361–382
Cambios en las frecuencias de equilibrio
7) En los ratones, el alelo recesivo e, produce esterilidad total en estado homocigota. En una
población de ratones, la frecuencia de individuos estériles es igual a 1/10. ¿Cuál será la
frecuencia de individuos estériles 10 generaciones después?
8) En una población de afroamericanos, el 91% son Rh positivos (locus autosómico: Rh
dominante sobre rh). En otra población de orientales, el 100% son Rh positivos. A la
población afroamericana llega un grupo de la población oriental constituyendo ahora el 10%
de la población receptora.
a) ¿Cuáles serán las frecuencias génicas en la F1?
b) ¿Cuáles serán las frecuencias genotípicas de equilibrio?
PRÁCTICO DE GENÉTICA DE POBLACIONES
PROCESOS MICROEVOLUTIVOS EN
Drosophila melanogaster
Objetivo
Interpretar los factores relacionados con la variación en frecuencias génicas y genotípicas en
dos cepas de Drosophila melanogaster en cajas de cultivo.
ACTIVIDADES A DESARROLLAR
En este práctico se emplean moscas D. melanogaster de dos fenotipos distintos en el tamaño
de las alas de la mosca y que están definidos por la existencia de dos alelos en un gen
autosómico: Alas normales [+] y alas vestigiales [vg], este último constituye una mutación
recesiva en este locus.
Durante este práctico, cada mesa recibirá un tubo de moscas que han sido previamente
cultivadas conteniendo ambos fenotipos. Se partió de cepas puras: 10 machos y 10 hembras
vírgenes de cada fenotipo (generación parental) que se aparearon al azar.
1) Dados estos datos, calcular:
a) las frecuencias génicas y genotípicas de la generación parental;
b) las frecuencias génicas y genotípicas esperadas en la generación actual (F1).
2) Para contrastar las expectativas teóricas con los datos reales, se contabilizará la F1:
a) Anestesiar las moscas.
b) Contabilizar los individuos de cada fenotipo.
c) Constatar si la población se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg.
d) Llenar la tabla 1 con los resultados del tubo contabilizado, más los tubos
contabilizados por el resto del grupo.
e) Calcular los parámetros de la tabla 1 (abajo).
3) Discutir:
a) ¿Cuál es la diferencia entre las frecuencias fenotípicas observadas y las esperadas
en cada tubo?
b) ¿Cuál es la variación en frecuencias fenotípicas entre tubo y tubo?
4) Sobre la base de la discusión y lo concluido sobre el mecanismo evolutivo predominante
en este experimento, conteste las siguientes preguntas:
SELECCIÓN NATURAL
a) Calcule la eficacia biológica relativa (W) de cada uno de los fenotipos, empleando la suma
de los valores de los tubos.
b) ¿Cuáles serán las frecuencias alélicas y genotípicas esperadas después de una generación
de apareamiento al azar?
DERIVA GÉNICA
a) Calcule el desvío estándar de las frecuencias génicas entre la generación parental y la F1.
b) En el caso que se mantuviera el tamaño poblacional, ¿en el correr de cuántas generaciones
observaría la pérdida aleatoria de uno de los alelos?
Tabla 1: Conteo de fenotipos de la F1
TUBO
1
2
3
4
Total
Media
Desv. estándar
[+] (vg+ / vg+ y vg+ / vg)
conteo
proporción
[vg] (vg / vg)
conteo
proporción Total
FÓRMULAS ÚTILES:
Media ( X ):
Desvío estándar (s):
n
n
∑x
X =
∑(x − X )
i
2
i
i
s=
n
i
n
Supervivencia
Para cada fenotipo
Frecuencia fenotípica observada en la F1/ Frecuencia fenotípica esperada en la F1
Eficacia biológica relativa (W)
Supervivencia del fenotipo menos apto/Supervivencia del fenotipo más apto
Varianza en las frecuencias de dos alelos por efecto de muestreo
s
2
=
pq
2N
(Recuérdese que s = s 2 )
ACTUALIZACIÓN EN GENÉTICA DESARROLLO DE LA GENÉTICA MOLECULAR Y SU IMPACTO EN LA BIOTECNOLOGÍA La tecnología del ADN recombinante no sólo ha proporcionado información acerca de la estructura y función de los genes, sino que ha permitido desarrollar numerosas técnicas de análisis del genoma y su expresión. Las técnicas básicas que implican el uso de enzimas de restricción, ADN recombinante, Northern y Southern Blot, PCR y secuenciación han dado pie al desarrollo de una amplia batería de nuevas técnicas y procesos biotecnológicos. Paralelamente dispararon la capacidad de crear o modificar desde productos hasta organismos con novedades genéticas y amplió las posibilidades de diagnosticar y tratar enfermedades. Como ejemplos del impacto actual de estas tecnologías podemos citar el desarrollo de productos farmacéuticos, que tiene su precedente en 1979 cuando, con la utilización de tecnología de ADN recombinante, se sintetiza en el laboratorio la molécula de insulina. A partir de ese momento gran número de fármacos son desarrollados de este modo. La creación de organismos genéticamente modificados (OGM) o transgénicos ha tenido un impacto enorme en la economía y la sociedad. En el diagnóstico médico, la identificación y clonación de muchos genes permite detectar mutaciones causantes de enfermedades. Se logra así el diagnóstico pre‐sintomático, consejo genético y diagnóstico temprano de enfermedades. Finalmente podríamos citar la terapia génica, que implica la transferencia directa de genes para tratar enfermedades. En este práctico nos proponemos discutir someramente dos ejemplos: I) El uso de una herramienta con múltiples aplicaciones: los microarreglos (microarrays) de ADN. II) La utilización de tecnología de ADN recombinante para la producción de organismos genéticamente modificados (OGM). I) MICROARREGLOS DE ADN Los microarreglos de ADN son un soporte sólido que puede ser una lámina de vidrio, plástico o silicio en el cual se fijan en localizaciones precisas secuencias correspondientes a miles de genes diferentes. Estas secuencias pueden ser ADN, ADNc u oligonucleótidos. Estos últimos son fragmentos cortos de ADN de simple cadena de de 5 a 50 nucleótidos. La técnica consiste en la hibridización de este microarreglo con una muestra de ADN genómico o ADNc (que incorpora algún precursor luminiscente que permitirá su detección). La hibridación de la muestra estudiada es detectada por la presencia e intensidad de esta señal luminscente y cuantificada para determinar la abundancia relativa de un ARN mensajero o una variante del genoma en la muestra. Dos de los usos fundamentales de la tecnología de microarreglos de ADN son el estudio de perfiles de expresión génica y el genotipado por polimorfismos de base simple (Single Nucleotide Polymorphisms o SNPs) en el genoma completo de un individuo. I.A. El uso de microarreglos en el análisis de expresión génica Prácticamente todas las células de nuestro cuerpo contienen los mismos genes, pero no todos los genes se expresan ni lo hacen al mismo nivel en todas las células. La expresión génica diferencial está en la base de la identidad y especialización celular. Por ejemplo, las células del páncreas expresan genes relacionados con la síntesis de insulina, mientras que las neuronas expresan genes relacionados con la neurotransmisión. Los investigadores estudian la expresión génica para entender las funciones celulares y se interesan por los cambios que ocurren en dicha expresión en respuesta a una variedad de situaciones: durante el desarrollo y la diferenciación, en respuesta a estímulos concretos, en enfermedades, etc. La técnica de microarreglos de ADN permite evaluar la cantidad relativa de transcripción de los genes de un genoma en un único experimento. No permite cuantificar niveles absolutos de expresión génica, medida por ejemplo en cantidad de moléculas de ARNm producidas por célula, sino que los microarreglos de ADN permiten determinar cuánto ARNm se produce en una muestra problema en relación a la cantidad producida en otra muestra o en una muestra control. Podemos entonces comparar los ARNm sintetizados a partir de un tejido de cáncer de pulmón con respecto a los sintetizados por tejido de pulmón sano, para poder determinar si hay incremento (inducción) o disminución (represión) de la expresión génica y cuantificar esos cambios con respecto al tejido sano. Las cantidades relativas de ARNm producido por un gen particular en dos muestras, pueden expresarse como una relación o ratio que indica las diferencias en los niveles de transcripción. La tecnología de microarreglos aplicada a la expresión génica ha sido utilizada para abordar numerosos aspectos tanto del crecimiento como del desarrollo y también se ha empleado para tratar de comprender las causas genéticas de muchas enfermedades humanas. En el caso de cáncer, ha permitido categorizar los distintos tipos para alcanzar el mejor tratamiento. La metodología asociada a microarreglos de ADN requiere de varias etapas. 1. Se colocan moléculas de ADN que representan cada gen del genoma en un “spot” de un portaobjeto de vidrio o de una membrana: éste constituye el microarreglo. El microarreglo puede construirse con oligonucleótidos por ej. de 50 nucleótidos cada uno representando a un único gen. Cada “spot” conteniendo únicamente uno de estos ADN, tiene aproximadamente 100 micras de diámetro. Un conjunto de éstos son ordenados en un patrón regular. De esa manera se conoce la posición que ocupa en la matriz (portaobjeto o membrana) cada gen. La localización precisa de cada gen analizado en el microarreglo o chip es registrada por una computadora. A modo de ejemplo, un microarreglo que contenga ADNs que representen todos los genes del genoma humano (aproximadamente 25.000) constaría de 25.000 spots. 2. Se aísla el total de los ARNm de las muestras a analizar. 3. Se sintetiza el ADNc usando como molde los ARNm aislados en presencia de precursores (dNTPs) marcados con un colorante fluorescente. Se emplea un fluoróforo diferente para cada muestra (por ej. verde y rojo). 4. Se incuba el portaobjeto conteniendo el microarreglo con los ADNc marcados fluorescentemente. Aquellos ADNc que encuentran moléculas de ADN complementarias en el chip hibridizarán. Supongamos que las dos muestras de ADNc marcados corresponden a: tejido normal (rojo) y tejido canceroso (verde). Estas dos muestras las utilizamos para hibridizar un microarreglo de ADN genómico humano. Si un gen del microarreglo se expresa en tejido normal, el “spot” correspondiente a dicho gen se “teñirá” o emitirá en rojo. Si se expresa en tejido canceroso, emitirá en verde. En el caso de que este gen se encuentre expresado a iguales niveles en ambos tipos de tejidos, ambos ADNc podrán hibridizar con el spot y en este caso el “spot” emitirá en ambos colores (amarillo). Si dicho está siendo expresado en ambos tejidos pero a diferentes niveles encontraremos que el spot correspondiente presenta un color intermedio entre el verde y el rojo. 5. Por último, se analizan los datos cuantificando ambas emisiones para determinar cuáles genes se expresan en cada muestra y se obtienen valores relativos o “ratios”. La pregunta Para emprender un experimento de hibridización de microarreglos de ADN, debemos formular claramente la pregunta que queremos contestar mediante esta tecnología, por ejemplo: ¿Cómo cambia la expresión génica cuando las células son irradiadas con luz ultravioleta o expuestas a un compuesto químico tóxico? ¿Qué sucede con la actividad de varios genes de levaduras cuando éstas pasan a cultivarse de 30ºC a 42ºC? ¿Qué genes son expresados únicamente en un embrión de pez? ¿Qué genes presentan una actividad diferente en células de cáncer cuando son comparadas con células sanas? Ejercicio 1 Un investigador está interesado en estudiar los efectos de altos niveles de ozono sobre la soja. Cultiva entonces un grupo de plantas en condiciones de aire normal y otro grupo en presencia de altos niveles de ozono. Realiza el marcaje del ADNc de la soja crecida en ozono con un fluoróforo rojo y la crecida en condiciones normales con un fluoróforo verde. Los resultados obtenidos para seis genes del microarreglo son los siguientes: ¿Qué genes no muestran diferencias de expresión entre ambas condiciones de crecimiento? ¿Qué genes se elegirían para continuar estos estudios? Explique. Ejercicio 2 Coloque en orden las siguientes etapas de la tecnología de microarreglos aplicada al ejemplo previamente analizado: ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ 1. Analizar los resultados comparando los colores de los spots del microarreglo 2. Identificar genes que están expresados o reprimidos en condiciones de altos niveles de ozono. 3. Aislar ARNm de cultivos de soja crecida en condiciones normales y en altos niveles de ozono. 4. Depositar secuencias génicas de soja en el portaobjeto de vidrio 5. Sintetizar ADNc marcado fluorescentemente por transcripción reversa. 6. Crecer soja en condiciones atmosféricas normales y con altos niveles de ozono durante un mes 7. Hibridizar ADNc a secuencias génicas complementarias en el portaobjeto de vidrio. Ejercicio 3 Se dispone de un chip conteniendo ADNs que representan los genes del genoma humano. Se han extraído muestras de ARN de 5 pacientes con cáncer, las cuales se emplean para hibridizar el microarreglo. Aquí se muestra el resultado obtenido para 10 genes: En negro se representan los spots donde hubo hibridización y en blanco aquellos donde no hubo hibridización. ¿Cuáles genes se expresan siempre? ¿Cuál podría ser su función? ¿Cómo podría estudiarlos? ¿Cuáles genes nunca se expresan? ¿Cómo podría explicarlo? ¿Cuál podría ser su función? ¿De los 10 genes estudiados cuáles podrían potencialmente tener una función directa en el cáncer? ¿Cómo los estudiaría? ¿Qué similitudes ve entre pacientes? Construya una nueva tabla agrupando los genes según su patrón de expresión en los distintos pacientes. En base a los resultados obtenidos ¿Cuál puede ser la función del gen 4 en relación al cáncer? ¿Y la del gen 9? ¿Son relevantes los patrones de expresión de los genes 3, 5 y 10? ¿Qué información nueva le aportaría este análisis si incluyera los resultados de hibridización de estos 10 genes con ADNc proveniente de personas sanas? I B – El uso de microarreglos en genotipado – El uso de microarreglos en la determinación de polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) Para caracterizar a un individuo o a numerosos individuos de una población, los estudios genéticos determinan su genotipo para distintos loci. Tradicionalmente se utilizaron loci tales como grupos sanguíneos, antígenos de histocompatibilidad, etc. El desarrollo de los denominados “marcadores moleculares”, permitió de forma relativamente rápida determinar el genotipo de individuos de forma precisa y masiva. En el laboratorio, el genotipado tradicional puede limitarse en el mejor de los casos a unos cientos de marcadores, con lo cual se tiene una cobertura de resolución relativamente baja del genoma completo. Un tipo de estos marcadores son los polimorfismos de nucleótido simple (SNPs), de los cuales hay aproximadamente 10 millones en el genoma humano. La presencia de uno u otro alelo para un SNP puede rastrearse por digestión diferencial con una enzima de restricción, o por PCR. Sin embargo, el genotipado empleando microarreglos permite un aumento en la resolución, valiéndose de SNPs, y analizando un gran número de ellos simultáneamente. Utilizando segmentos del genoma, portando los sitios polimórficos, depositados en un microarreglo, se podría genotipar un individuo para todos y cada uno de los marcadores existentes. Tal resolución no se ha alcanzado aún, pero los microarreglos más utilizados son actualmente capaces de establecer el genotipo de un individuo para 500.000 marcadores, esto es en promedio un marcador cada 7 Kb en el genoma humano. Estos marcadores de tipo SNPs también pueden ser utilizados para mapeo analizando si se heredan ligados a un rasgo en estudio. En estudios en los cuales se busca la asociación de alelos específicos con rasgos complejos, esta resolución es más que suficiente considerando que 1 centimorgan en el genoma humano equivale aproximadamente a 750 Kb. Los pasos necesarios para el genotipado usando un microarreglo son los siguientes (Figura 2): 1) Digestión del genoma con una o más enzimas de restricción, generando fragmentos de tamaño diverso con extremos "pegajosos". 2) Ligado de los fragmentos con un "adaptador" de secuencia única. Esta secuencia única es complementaria con un cebador universal que se empleará en el paso siguiente. 3) Amplificación por PCR con cebador universal. Por las condiciones elegidas para la reacción, la PCR amplificará fragmentos de hasta aproximadamente 1 Kb, portando sitios polimórficos del genoma incluidos en el diseño del microarreglo. Los fragmentos de mayor tamaño no amplifican, con lo cual se reduce la complejidad de la muestra de los 10 millones de SNPs existentes a los 500.000 incluidos en el microarreglo. 4) Reducción del tamaño de los fragmentos amplificados: para aumentar la eficiencia de la hibridación, se digieren los fragmentos amplificados a aproximadamente 100 pares de bases empleando DNAsa I. 5) Se realiza la hibridización de los fragmentos portadores de SNPs, que llevan una señal luminiscente, al microarreglo. Para cada sitio polimórfico, hay cuatro oligonucleótidos presentes en el microarreglo: Dos con complementariedad perfecta (perfect match) con los alelos A y B, y dos portando diferencias de bases (mismatches) con ambos alelos, que sirven como control de hibridación inespecífica para calibrar la señal de hibridación con las sondas correctas: 6) Lectura de la señal luminiscente en cada uno de los conjuntos de oligonucleótidos y determinación del genotipo del individuo para cada SNP. Figura 2: Pasos en el genotipado usando microarreglos. Ejercicio 4 Suponga que el panel mostrado a continuación representa la lectura de un sector del microarreglo hibridado con fragmentos de ADN obtenido de un individuo para caracterizar su genotipo para numerosos SNPs. Indique el genotipo del individuo analizado para los genes que se leen en la figura. Estudios de asociación a nivel genómico Uno de los usos actuales más importantes de las plataformas de genotipado masivo es el de estudios de asociación a nivel de genoma (Genome‐Wide Association Studies o GWAS). En estos estudios, se busca la asociación positiva de ciertos alelos o genotipos con enfermedades, a través de estudios caso‐control. El o los alelos con los cuales se observa una asociación positiva pueden ser variantes que se encuentran dentro de genes, o variantes ligadas a alelos de genes candidatos a tener algún rol en el desarrollo de la enfermedad. El GWAS se basa en el genotipado masivo y comparado de grandes números de casos y controles, y al trabajar con el genoma completo, constituye un análisis exploratorio, libre de hipótesis, a partir de cuyos resultados se pueden hacer análisis más específicos. Hasta 2008 se habían identificado 100 loci asociados a 40 enfermedades comunes de características complejas. El riesgo relativo de contraer una enfermedad en presencia de una variante dada se mide empleando la relación de chances u odds ratio (OR), que se define como: OR =
p/q
p⋅s
⇒ OR =
r/s
r ⋅q
Donde: p = frecuencia de casos que tienen el factor (en este caso, el alelo) estudiado q = frecuencia de controles con el factor r = frecuencia de casos que no tienen el factor s = frecuencia de controles sin el factor Un OR de 1 implica que no hay asociación del factor con la enfermedad. Un OR mayor que 1 indica una asociación positiva, y establece una cuantificación relativa de la asociación. Por ejemplo, en 2007 un análisis en busca de polimorfismos asociados a diabetes tipo 2 halló asociación significativa entre dicha enfermedad y uno de los alelos de un SNP. Este marcador se encuentra ubicado en el cromosoma 10 y cercano al gen TCFL2 Genotipo
Fenotipo CC
TC
TT
Diabéticos 876 (35,1%)
1215 (48,6%)
408 (16.3%) No diabéticos 1417 (49,7%)
1194 (41,9%)
238 (8,4%) Puede observarse que la proporción de diabéticos que portan el alelo T en el SNP asociado a TCFL2 es mayor que la proporción de controles, por lo que el alelo T estaría asociado a la enfermedad. Ahora bien, para cuantificar hasta qué punto portar el alelo T aumenta la propensión a la diabetes, se calcula el OR de cada tipo de portador respecto a los homocigotas CC: Riesgo relativo de los heterocigotas: OR =
0,486 / 0,419 1,16
=
= 1,64 0,351 / 0,497 0,706
Riesgo relativo de los homocigotas TT: OR =
0,163 / 0,084 1,94
=
= 2,75 0,351 / 0,497 0,706
Esto implica que un heterocigota tiene una probabilidad 64% mayor de desarrollar diabetes tipo 2 que un homocigota CC. El homocigota TT tiene 175% más de probabilidad, es decir, más del doble que la probabilidad del homocigota CC. Ahora bien, en términos generales, la probabilidad que tiene el homocigota CC de volverse diabético es aproximadamente equivalente a la prevalencia de la enfermedad en la población general. Por ejemplo, en Estados Unidos se calcula que el 7,8% de la población adulta tiene diabetes tipo 2. Pero si un individuo dado porta el alelo asociado, esa probabilidad aumenta a 1,64 * 7,8 = 12.79% si es heterocigota, y 2.75 * 7,8 = 21,45% si es homocigota TT. Esta es una aproximación simplificada de los cálculos precisos, ya que en el 7,8% de individuos enfermos están presentes los tres genotipos. No obstante, sirve para dar una idea de la interpretación del Odds‐Ratio. Ha de señalarse, sin embargo, que la mayor parte de los OR de SNPs asociados a enfermedades son bastante más modestos. Ejercicio 5 Los siguientes datos relacionan, en forma estadísticamente significativa, un SNP ubicado en el cromosoma 8 con cáncer de colon. Genotipos
Alelos C T Casos 875 675 Casos
1940 Controles 1860 CC
CT
TT 250
375
150 Controles 460
940
500 a) ¿Cuál de los alelos está positivamente asociado con la enfermedad? b) Calcule el OR de los homocigotas para el alelo contra los homocigotas para el alelo alternativo, y el OR de los heterocigotas contra los homocigotas para el alelo alternativo. ¿Cuál es el aumento en las probabilidades en cada caso? II. ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS Los Organismos Genéticamente Modificados (OGM) son organismos transgénicos. Esto quiere decir que mediante procedimientos de biología molecular, se ha adicionado o introducido a su genoma uno o varios genes de una especie diferente. Normalmente estos genes son clonados en plásmidos u otros vectores de ADN y se los liga a promotores que aseguran altos niveles de expresión. En el caso de las plantas transgénicas, los intermediarios más utilizados son bacterias del género Agrobacterium, debido a que son muy eficientes introduciendo nuevos genes en un amplio rango de especies vegetales de la clase de las dicotiledóneas, aunque se utilizan también otras bacterias y virus. En la naturaleza Agrobacterium tumefaciens se adsorbe a las células de la planta e introduce un plásmido inductor tumoral (Ti). Este plásmido de ADN recombina entonces con el ADN nuclear de la célula vegetal hospedadora, generando en última instancia la formación tumoral. Los plásmidos Ti son manipulados para incorporar nuevos genes, esta metodología es la base de la mayoría de los trabajos con plantas genéticamente modificadas (ver figura). En la figura se esquematiza el proceso de generación del plásmido recombinante y posterior transformación genética de cultivos celulares vegetales, en este caso con un gen de resistencia al herbicida glifosato. Tomado de Beebee T, Rowe G (2008) An Introduction to Molecular Ecology Oxford University Press, Oxford. Los primeros organismos genéticamente modificados que se desarrollaron fueron bacterias. Así pueden crearse bacterias genéticamente modificadas para degradar sustancias contaminantes como derrames de petróleo en el mar o prevenir la acumulación de pesticidas en los suelos. En las plantas los genes introducidos son expresados en una variedad de tejidos dependiendo del objetivo del experimento. Es así como se ha desarrollado resistencia a herbicidas e insectos, aumento o alteración en la productividad de los cultivos o tolerancia a factores ambientales como puede ser la helada. En algunos casos la modificación persiste solamente por una generación ya que se incluye un factor de esterilidad que previene la reproducción, pero frecuentemente la novedad genética es heredable de la manera usual. Una gran variedad de microbios, plantas (incluyendo casi todos los cultivos) y animales han sido sujetos de modificaciones genéticas. Cada vez son más importantes los debates sobre los OGM, especialmente en plantas, y no hay duda de que esta discusión continuará en el futuro. Si bien esta discusión escapa a los cometidos del curso, los avances tecnológicos recientes han determinado que los OGM tengan un gran atractivo como un método de generar nuevas variedades de plantas económicamente más rentables. Sin embargo existen potenciales amenazas: ‐
Los OGM podrían dispersarse más allá de sus regiones de cultivo y competir con las especies silvestres no modificadas. ‐
Los nuevos genes podrían transferirse a otras especies y preocupa los efectos directos que puedan tener sobre éstas. ‐
La actividad de los genes introducidos podría afectar a especies que interaccionan con los OGM (por ej. predadores y consumidores) El hecho de que los OGM difieran de las variedades parentales solamente en uno o unos pocos genes no significa que monitorear los OGM sea algo sencillo. Es por ello que está teniendo un rol clave el desarrollo de marcadores genéticos para los estudios sobre OGM y su interacción con las comunidades naturales. Un aspecto muy relevante en relación a los OGM y su interacción con las comunidades naturales son los aspectos relacionados con el flujo génico de un OGM en relación a otros organismos. Los genes pueden moverse por transmisión normal (vertical) por hibridización de un cultivo genéticamente modificado con una planta silvestre o por transmisión horizontal. La transmisión vertical implica el proceso de división celular (en procariotas) o reproducción sexual (en eucariotas), estos mecanismos son bien conocidos y no es necesario profundizar en ellos. La transmisión horizontal es menos conocida pero potencialmente muy importante. La Transferencia Genética Horizontal (TGH) es la transmisión de información genética entre generaciones contemporáneas de organismos y puede ser intra o interespecífica. Como la TGH no requiere de un tiempo de generación puede diseminar genes muy rápidamente en el medio ambiente. Una línea de evidencia sobre la existencia de la TGH viene de la filogenética molecular, como es el hallazgo de secuencias de ADN que parecen estar fuera de lugar, por ejemplo un típico gen bacteriano que es encontrado en un eucariota o vice‐versa. El gen eucariota de la gliceraldehído 3‐fosfato deshidrogenasa (Gapdh) aparece en algunas cepas de E. coli que también hospeda a un gen reconocible como procariota para la Gapdh. El análisis genómico de E. coli sugiere que al menos el 17 por ciento de sus genes han sido adquiridos por THG en más de 200 eventos independientes. Entonces, si bien la frecuencia de la THG difiere entre distintas clases de organismos, la evidencia actual sugiere un patrón complejo donde las bacterias tienen un rol protagónico. Sin embargo, hasta el momento, el análisis del genoma humano sugiere que por lo menos para esta clase de organismos eucariotas superiores la transferencia de genes por medio de la THG es probablemente muy rara. La existencia de OGM mediante técnicas de ADN recombinante plantea el riesgo de la dispersión de la cepa modificada más allá del control humano, mediante alguna de estas formas de transferencia genética. Ejercicio 6 Usted es designado por un agricultor orgánico para determinar si un cultivo de frutillas está sufriendo contaminación genética. La preocupación surge porque en el área circundante al agricultor existen establecimientos donde crecen frutillas modificadas por la adición de un gen único, que produce un aumento en la tolerancia a la helada. Esquematice los pasos a seguir para investigar este problema, asumiendo la cooperación del productor de frutillas genéticamente modificadas. Ejercicio 7 A partir de la lectura de ”Maíz transgénico en Uruguay” páginas 26‐36, responda grupalmente las siguientes preguntas: ¿Qué eventos de maíz transgénico se autorizaron en Uruguay y qué genes contienen? ¿Cuáles son las condiciones para su uso y por qué éstas son difíciles de cumplir por los productores hortícolas? ¿Qué se propone la nueva Ley de Bioseguridad de OGM? ¿Qué es la contaminación genética y cómo se intenta evitarla? Bibliografía consultada y material complementario Beebee T, Rowe G (2008) An Introduction to Molecular Ecology. Oxford University Press, Oxford Campbell AM, Zanta CA, Heyer LJ, Kittinger B, Gabric KM, Adler L, Schulz B (2006) DNA microarray wet lab simulation brings genomics into the high school curriculum. CBE Life Sci Educ 5(4):332‐339 Material de apoyo a organismos genéticamente modificados: http://cls.casa.colostate.edu/CultivosTransgenicos