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Introducción a la Secuenciación Masiva y a la Bioinformática
Dietmar Fernández Orth, PhD
24 de Abril de 2014
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•El DNA (Ácido desoxirribonucleico) contiene la
información genética usada en el desarrollo y
funcionamiento de los organismos vivos. Se
presenta en forma de una cadena doble de
nucleótidos unidos por puentes de hidrógeno.
•Tiene la información codificada en forma de GENES.
Es como si fuese un libro escrito en un idioma de 4
letras (los nucleótidos A, C, G, T) y cada capítulo
(gen) diese la información para una función.
• En el genoma humano tiene unos 20,000-25,000
genes y su genoma tiene aproximadamente 3000
Mb.
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El RNA es un filamento de una sola cadena,
no forma doble hélice que resulta de la
transcripción del DNA.
El RNA mensajero, es el portador de la
información genética que será transcrita a
partir del DNA del núcleo a los ribosomas
que
serán
los
que
darán
lugar
a
la
producción de proteínas.
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El RNA es estructuralmente similar al DNA.
Los nucleótidos de DNA y RNA tienen
estructuras similares
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Las variantes comunes no han sido capaces de explicar por si solas las
enfermedades genéticas complejas variantes raras pueden estar
afectando
Entre estas pueden destacarse variantes de un solo nucleótido (SNV),
estructurales, inserciones o deleciones.
Al principio se pensaba que la secuenciación de a que la
secuenciación de los ácidos nucleicos era mucho más
difícil que la de las proteínas por lo que hasta 1960 fue
de escaso objeto de estudio.
‡
En cualquier caso, el hecho de existir solo 4 tipos de
nucleótidos llevo a pensar que el análisis sería más
sencillo.
‡
Actualmente la secuenciación de ácidos nucleicos es más
rápida y sencilla que la secuenciación de proteínas.
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
La secuenciación es un conjunto de métodos y técnicas
bioquímicas que nos van a permitir determinar el orden de
los nucleótidos en un fragmento de ácido nucléico.
Secuenciación de Maxam and Gilbert (1977)
Secuenciación de Sanger
Secuenciación automática
Secuenciación Masiva
Illumina
Applied
Roche
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Problemas
Elevada complejidad técnica
Uso extensivo de productos químicos peligrosos.
Los reactivos no se pueden adaptar para utilizarse en un kit
biológico
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Fragmentos de 80 bases
aproximadamente
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La fluorescencia permite la automatización.
La detección de fluorescencia se realiza al mismo tiempo que la
electroforesis. Lo que permite eliminar los fragmentos ya
secuenciados.
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Ventajas secuenciador automático
Al no utilizar radioactividad la contaminación es menor.
Comodidad. No hace falta leer una autorradiografía.
Más secuencia. 700-800 nucleótidos frente a 300 nucleótidos en cada
una.
Rapidez. Los secuenciadores capilares pueden llegar a analizar 96
carreras en menos de dos horas.
Es más barato. Fuerte inversión inicial.
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Los procedimientos explicados hasta ahora actuales solo pueden
secuenciar directamente fragmentos relativamente cortos (de entre 3001000 nucleótidos de longitud) en una sola reacción.
El principal obstáculo para secuenciar fragmentos de DNA de una
longitud superior a este límite es la capacidad insuficiente de separación
para resolver grandes fragmentos de DNA cuyo tamaño difiere en un sólo
nucleótido.
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Ficheros fastq
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
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
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El DNA se parte en fragmentos de 300-800 pb y se
dejan extremos
“polished” eliminando bases no
pareadas en los extremos.
Adición de los adaptadores en extremos.
DNA se pasa a hebra sencilla.
Un adaptador contiene biotina que se unirá a las
esferas de estreptavidina. Un solo DNA por esfera.
Se añade aceite y se forma la emulsión. Se hace la PCR
para cada esfera tener 106 copias.
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


Se elimina a continuación el aceite y las
esferas se introducen una por pocillo en
placas
Las enzimas de pirosecuenciación están
adheridas a otras esferas más pequeñas y
se añaden a los pocillos
La placa se va lavando en una serie de
ciclos con los 4 dNTPs.
La placa tiene acoplada una camara que
va captando la luminiscencia emitida en
cada pocillo.
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Aplicaciones en Secuenciación


Secuenciación de novo Consiste en la secuenciación de
un genoma sin tener ningún tipo de referencia sobre la
que construir los contigs. Requiere una mayor cobertura
para poder garantizar la calidad de cada una de las
bases determinadas.
Resecuenciación Consiste en la secuenciación de un
genoma sobre una referencia. Existen diversas
posibilidades:
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Resecuenciación
 Genomas completos
 Resecuenciación dirigida Consiste en el aislamiento,
enriquecimiento
y
secuenciación
de
regiones
específicas del genoma. Permite la detección
sistemática tanto de variantes comunes como variantes
raras o poco frecuentes.
 Exoma Permite la captura, el enriquecimiento y la
secuenciación de regiones genómicas codificantes en
eucariotas.
 Customizada Permite el estudio de regiones específicas
del genoma mediante el diseño de sondas
customizadas
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Transcriptómica
 RNA - Seq - Transcriptoma completo
Información global sobre el contenido de RNA de una
muestra, incluyendo mRNAs, rRNAs, tRNAs etc.
Análisis cualitativo = diversidad de transcritos
Análisis cuantitativo =abundancia de transcritos
Permite medir niveles de expresión génica, identificar
eventos de splicing alternativo, identificar eventos de
fusión génica e identificar SNVs.
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Transcriptómica
SmallRNAs RNAs no codificantes de pequeño tamaño
que incluyen un gran número de moléculas con
funciones y estructuras muy diversas (miRNAs,
snoRNAs, piRNAs, etc).
Chip-Seq Combina el método de inmunoprecipitación
de la cromatina con la secuenciación masiva
permitiendo la identificación de las zonas de
interacción entre la proteína y el DNA (cistroma).
Metilación Estudia los patrones de metilación del DNA
implicados por ejemplo en procesos de diferenciación
celular
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

Según el estado de degradación de la muestra  secuenciación del DNA
mitocondrial
Genomas nucleares de especies extinttas: mamut, Neanderthal
Problemas: contaminación…
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

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Nos permite caracterizar la biodiversidad del planeta
El aumento de los genomas secuenciados permite la interpretación
parcial del ambiente a partir del muestreo de nichos específicos.
Ejemplo: océano, minas acidas, suelos, arrecifes de coral,
microbioma que pueda variar en función de la salud del individuo.
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Control de calidad
Tratar
de
eliminar
aquellas
posiciones con una baja calidad de
secuenciación.
Alineamiento
Si se parte de un organismo
conocido,
alineamiento
de
las
secuencias en base a la secuencia de
referencia.
Si es desconocido, se realiza el
ensamblado de las secuencias en
contigs.
Detección de variantes y anotación.
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Control de calidad
Tratar
de
eliminar
aquellas
posiciones con una baja calidad de
secuenciación.
Alineamiento
Si se parte de un organismo
conocido,
alineamiento
de
las
secuencias en base a la secuencia de
referencia.
Si es desconocido, se realiza el
ensamblado de las secuencias en
contigs.
Detección de variantes y anotación.
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Gracias por vuestra atención
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