PREPARACIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES EN CONEJO

PREPARACIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES EN CONEJO
Preparación del primer inóculo
Adyuvante de Freund completo (Sigma F5881) (FAC)
Péptido
Salino
Sonicador
1.
2.
3.
4.
Dejar sedimentar el Mycobacterium en el vial de FAC. Una vez sedimentado, eliminar la mitad superior del
volumen usando una aguja y jeringuilla (ej. En vial de 10 ml, reducir el volumen a 5ml). Esto lo llamamos FAC×2.
Resuspender la cantidad adecuada de péptido en salino 0.9% NaCl estéril (hospitalario) a 1 mg/ml. Para la 1ª
inmunización, usamos 400 µg de péptido por conejo. Mantener en frío.
En un tubo ancho (ej. 20 ml), echar 1 volumen de FAC×2 y 1 volumen de péptido en salino (ej. 1 ml de FAC×2 y
1 ml de péptido).
Sonicar, 2 ciclos de 30” con 1 min de pausa entre ciclos, manteniendo en un vasito con hielo. Se forma una
emulsión pastosa, como mayonesa, muy blanca. Usar para inocular directamente.
¡IMPORTANTE: LIMPIAR EL SONICADOR A FONDO ANTES DE PREPARAR LA EMULSIÓN!
1.
2.
3.
4.
5.
Limpiar el vástago con agua y jabón. Aclarar.
Limpiar con EtOH 70%.
Sonicar EtOH 70%, 3×30” a tope.
Lavar con salino.
Sonicar salino 2×30” a tope.
Preparación de los siguientes inóculos
Se hace igual que el primero, con dos salvedades.
- Usamos adyuvante de Freund incompleto (FAI) (Sigma F5506)
- Ponemos la mitad de péptido (péptido resuspendido a 0.5 mg/ml)
Inyección en los conejos
Se usan conejos New Zealand, de 2-3 meses (2-3 kg).
Primero, se sacan 10 ml de sangre de la oreja para usar como suero preinmune.
Preparación del suero preinmune:
1. Dejar la sangre 1h a temperatura ambiente.
2. Pasar la noche a 4ºC.
3. Centrifugar a 2200 rpm durante 10 min, a temperatura ambiente.
4. Separar el suero y mantener a -70ºC.
Se les pela el cogote con una peladora, recogiendo el pelo con una aspiradora.
Se inoculan 800 µl de mayonesa por vía intradérmica en el cogote con una aguja hipodérmica (g25), formando 5-10
“bolas” de inóculo. Se usan jeringas de 1ml pero con émbolo completo, con lo que se inyecta todo el volumen.
Se hacen 2 inmunizaciones intramusculares más usando FAI en vez de FAC y la mitad de péptido (ver arriba). Se saca
sangre y se valora el título de anticuerpo, si no han ido bien, se da una 4ª inmunización intradérmica.
Se sangran completamente o después de la 3ª o 4ª inmunización, dependiendo de los resultados de la titulación.
FICHA DE INMUNIZACIÓN (MANTENER LA CONFIDENCIALIDAD, SI SE COMPARTE ESTE PROTOCOLO FUERA DEL
LABORATORIO, BORRAR LOS DATOS)
FICHA DE INMUNIZACIÓN
ESPECIE: Conejo
USUARIO: Miguel Vicente Manzanares
Nº DE CUENTA:
TELÉFONO LAB.: 91-5202370
CEPA: New Zealand
LABORATORIO: IIS-IP / UAM
OTROS DATOS: KLH-CONFIDENCIAL
TELÉFONO PERSONAL: 677-779-483
Nº DE ANIMALES:
CLAVE DE INMUNIZACIÓN: CONFIDENCIAL
KLH-peptido
EDAD: 2 meses
Nº DE CELDA:
PAUTA DE INMUNIZACIÓN
FECHA
ANTÍGENO
NATURALEZA
25-1-2012
KLHCONFIDENCIAL
KLHCONFIDENCIAL
KLHCONFIDENCIAL
KLHCONFIDENCIAL
15-2-2012
7-3-2012
28-3-2012
VÍA / ADJUVANTE
OTROS
P-pep + KLH
DOSIS/
CONEJO
ug/ml
400/800
ID MULT/ FACx2
d0
P-pep + KLH
200/500
IM / AFI
d21
P-pep + KLH
200/500
IM / AFI
d42
P-pep + KLH
200/500
IM / AFI
d63
NO SE NECESITAN PRECAUCIONES ESPECIALES EN EL MANEJO DE LOS ANIMALES.
EXTRACCIONES
Nº DE
ANIMAL
Preinmune
1º
2º
3º
FECHA
25-1-2012
VOLUMEN
RESULTADOS
10 ml
OBSERVACIONES
FECHA DE BAJA:....................................1261 y 1262..................................
Sangría completa:
OTROS