Código Genético y Traducción

Facultad de Química, UNAM
1630 Genética y Biología Molecular
Código Genético y Traducción
Unidad 7
Dogma Central de la Biología Molecular.
Flujo de la Información Genética
Replicación
Transcripción.
Síntesis de RNA
Traducción
Síntesis de
Proteínas
1
Comparación de la expresión génica entre eucariontes y procariontes
Eucariontes
Procariontes
Núcleo
Transcripción
Traducción
Transcripción
Traducción
Código genético:
DNA
-------Æ
Bases
RNAm
-------Æ
Bases
Proteína
-------Æ
Aminoácidos
En DNA y RNA hay 4 bases pero en proteínas:
20 aminoácidos
Combinaciones de bases para determinar un
aminoácido:
Combinaciones de 2 bases: 42 = 16 (no alcanzan!!)
Combinaciones de 3 bases: 43 = 64 !! (ahora sobran!!)
Codón: Secuencia de tres bases en el RNAm que
especifica un aminoácido en la secuencia de la
proteína o causa la terminación de la traducción.
2
Nirenberg y Matthaei descifraron el código genético usando un lisado de
E. coli para sintetizar proteínas in vitro al cual le agregaban RNAm
sintético poli-U, poli-A, poli-CA.....
RNA
Proteína
Solamente 61 de las 64 combinaciones posibles codifican para
aminoácidos
Código Genético
61 codones determinan aminoácidos 3
codones son “non-sense” y funcionan
como señales de término (stop) de la
traducción
Segunda posición
Primera
posición
18 de los 20 aminoácidos están determinados por más de un
codón. El código genético es redundante.
3
Solamente Met y Trp están determinados por un codón.
Codones sinónimos:
Para muchos aminoácidos determinados por mas de un codón, las
2 primeras bases no varían y solamente hay cambio en la 3a
posición.
¿Qué característica común tiene esa 3a base en los aminoácidos
determinados por dos codones?
Esta propiedad minimiza los efectos de alguna mutación.
Sustitución por transición en el que hay un cambio de una
purina por otra purina.
AAG -Æ AAA
El código genético está altamente conservado
filogenéticamente.
De hecho, por muchos años, se consideró que era UNIVERSAL,
hasta que se encontraron las excepciones que son mínimas.
La mayor parte de estas excepciones se identificaron en los
genomas mitocondriales y en algunos protozuarios.
Codón
Código
genético
Excepción
Genoma
AGA/ AGG
Arg
Ser
Mitocondria animal
CGG
Arg
Trp
Mitocondria plantas
UAA/ UAG
Término
Glu
Nuclear protozuarios
UGA
Término
Trp
Micoplasma
4
Para los aminoácidos determinados por mas de un codón, estos no son
usados con la misma frecuencia.
Para los aminoácidos determinados por mas de un codón, estos no son
usados con la misma frecuencia.
5
En el proceso de traducción participan los RNAt, RNAr y RNAm.
Estructura de un RNAm maduro.
UAA
UAG
AUG
Codones de
término
UGA
Región codificante
Cola de Poli-A
CAP
Región 5’ no traducida
Región 3’ no traducida
5’-UTR
3’-UTR
Marco de lectura abierto (Open Reading Frame)
Marco de Lectura 1
La misma
secuencia de
RNAm.
Marco de Lectura 2
Tres secuencias de
polipéptidos
distintas!!!
Marco de Lectura 3
Solamente uno de los marcos de lectura es el correcto para la
traducción.
¿Cómo es reconocido este marco por el aparáto traduccional?
6
Los RNAt son las moléculas adaptadoras (traductoras) que
decodifican la información en el RNAm acarreando al
aminoácido correspondiente.
Estructura y Función del RNAt
Los RNAt son las moléculas adaptadoras (traductoras) que
decodifican la información en el RNAm acarreando al
aminoácido correspondiente.
Los RNAt se sintetizan como precursores que son procesados
para generar moléculas de 75 a 80 nts de longitud.
Generalmente tienen bases modificadas como:
Ribotimidina
Dihidrouridina
Pseudouridina
Inosina
Inosina
7
Estructura Secundaria
del RNAt
Asa D – Brazo D
* El brazo variable (3- 21
nts) puede formar un tallo de
hasta 7 pb.
Brazo T. Tallo de 4-5 pb
*
Función de los RNAt
RNAt + Aminoácido --Æ Aminoacil RNAt
La reacción ocurre en dos etapas:
1. Activación del aminoácido: Formación del aminoacil adenilato
Aminoácido + ATP Æ Aminoácido-AMP + PPi
R
Se forma el aminoacil adenilato que tiene un enlace de alta energía.
La hidrólisis del pirofosfato inorgánico que se produce genera energía
para la reacción.
8
2. Formación del aminoacil-RNAt
Aminoacil adenilato + RNAt Æ Aminoacil-RNAt
+ AMP
El aminoácido se une al extremo 3’-OH
del RNAt. En el brazo aceptor.
Aminoacil RNAt sintetasas
A pesar de que catalizan la misma reacción, estas enzimas
pueden ser muy diferentes.
Algunas son monómeros, dímeros y tetrámeros.
La misma enzima
realiza los dos pasos
de la reacción.
Tiene sitios de unión
para:
• el aminoácido
• ATP
• RNAt
9
Aminoacil RNAt
sintetasas.
Reconocen secuencias en la
región interna del RNAt.
Tienen muy alta especificidad
pues distinguen entre 40 RNAt
que tienen una estructura similar,
solamente con algunos cambios
en la secuencia de bases.
Reconocen elementos de
identidad en el RNAt que
incluyen:
• Región anticodón
• Pares de bases en el tallo
aceptor.
El codón del RNAm es reconocido por la secuencia
anticodón del RNAt
5’
C
G
C
3’
RNAm
La interacción ocurre por apareamiento de bases complementarias.
Las dos moléculas de RNA son antiparalelas.
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Hipótesis del “bamboleo” (wobble)
Debido a que el código genético es redundante:
• Algunos aminoácidos están determinados por 6 codones
• Algunos aminoácidos están determinados por 4 codones
• Algunos aminoácidos están determinados por 3 codones
• Algunos aminoácidos están determinados por 2 codones
Algunos codones que determinan al mismo aminoácido son
reconocidos por el mismo RNAt
Esto implica que hay
apareamientos de bases tipo
Watson-Crick para las dos
primeras posiciones del codón,
pero no para la tercera.
Hipótesis del “bamboleo” (wobble)
La inosina es
una purina
que forma
interacciones
débiles con
C, U, A
5’
C
G
I/U
C
3’
RNAm
Muchos RNAt tienen inosina en la posición 5’ del anticodón
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La síntesis de proteínas se lleva a cabo en los
ribosomas
2.76 x 106 Da
El ribosoma procarionte se puede disociar en dos subunidades.
Cada una de éstas se compone de RNAr y muchas proteínas
Estructura de los Ribosomas
Subunidad Pequeña 30S
Lectura de los codones
21 proteínas + RNAr 16S
Subunidad Grande 50S
Polimerización de
Aminoácidos
31 proteínas + RNAr 23S y 5S
12
Sitio de unión al ribosoma
En los RNAm procariontes hay una secuencia altamente
conservada que está entre 8 y 13 nts del codón de inicio.
Esta secuencia es rica en purinas y el consenso es:
5’-AGGAGGU-3’
Esta secuencia se aparea por interacciones de puentes de
hidrógeno con la secuencia 3’-UCCUCCA-5’ que se encuentra
en el RNAr 16S de la subunidad pequeña del ribosoma.
Se llama Secuencia de Shine-Dalgarno o sitio de unión al
ribosoma. Sirve para posicionar de manera correcta al RNAm
en el ribosoma con respecto al codón de incio.
El codón que marca el inicio de la traducción es AUG que codifica
para el aminoácido metionina
5’- UTR
5’
En procariontes, el codón de
inicio AUG codifica para
formil metionina:
En eucariontes, el codón de
inicio AUG codifica para
metionina:
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Formación del complejo de iniciación
• Ensamblaje del ribosoma en el RNAm
• Se requiere de:
–
–
–
–
–
Subunidad pequeña del ribosoma
Subunidad grande del ribosoma
RNAm
Aminoacil-RNAt (formil-Met)
Factores de iniciación (IF)
• IF1 e IF3 => se unen a la subunidad 30S y
previenen la unión de 50S en ausencia de
RNAm
• IF2-GTP ayudan a la unión del aminoacil-RNAt
de iniciación
Formación del complejo de
Iniciación.
Los factores IF1 e IF3 se unen a la
subunidad 30S del ribosoma y previenen
la unión de la subunidad 50S
En procariontes, el
codón de inicio es
reconocido por un
aminoacil-RNAt que
acarrea formil-Met
RNAt
El grupo formilo se añade después de la carga del RNAt, por una
enzima (transformilasa) que usa formiltetrahidrofolato.
Solamente el RNAtf-Met se usa para formar el complejo de iniciación.
Todos los demás aminoacil-RNAt requieren que el ribosoma esté
completamente ensamblado.
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Formación del complejo
de Iniciación.
La unión de AA-RNAt(fMet) al codón de
inicio es un proceso dependiente de la
hidrólisis de GTP. El IF2 se une a GTP
acompaña al AA-RNAtf-Met
Al disociarse IF1, se une la subunidad
50S del ribosoma.
Queda formado el complejo de iniciación.
Fase de elongación
• Factores de elongación EF
– EF-Tu / EF-Ts/ EF-G
• Aminoacil-RNAt del resto de los aminoácidos.
• GTP
• Complejo de Iniciación
La fase de elongación se divide en tres etapas
¾ Ocupación del sitio aminoacil
¾ Formación del enlace peptídico
¾ Translocación
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En el ribosoma se pueden distinguir tres sitios E, P y A, de los
cuales el sitio P y A pueden ser ocupados por AA-RNAt
Sitio P (Peptidil) del
ribosoma
Sitio A (Aminoacil) del
ribosoma
El AA-RNAtf-Met ocupa el sitio Peptidil en el ribosoma.
FASE DE ELONGACION
Ocupación del sitio Aminoacil por el siguiente AA-RNAt
EF-Tu
GTP
GDP
5'
3'
P
Sitio P (Peptidil)
A
Sitio A (Aminoacil)
EF-Ts
EF-Ts regenera el GTP
16
FASE DE ELONGACION
Formación del enlace peptídico
El grupo amino del AA-RNAt
del sitio A está bien
posicionado para atacar el
enlace éster entre el RNAt
que ocupa el sitio P y el
aminoácido.
5'
3'
P
A
Mecanismo de Formación del Enlace Peptídico
El grupo amino del AA-RNAt del sitio A está bien posicionado
para atacar el enlace éster entre el RNAt que ocupa el sitio P el
aminoácido que acarrea.
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Mecanismo de Formación del Enlace Peptídico
Se forma un intermediario
tetraédrico que es estabilizado
por la peptidil transferasa.
Intermediario tetraédrico
Mecanismo de Formación del Enlace Peptídico
El intermediario se cierra para
formar el enlace peptídico y liberar
al RNAt que está ocupando el sitio P
18
5'
3'
P
A
El sitio P queda vacío.
La actividad de peptidil
transferasa se encuentra en
el RNA ribosomal 23S con
participación de algunas
proteínas de la subunidad
grande del ribosoma.
El centro catalítico
responsable de la
actividad de la peptidil
transferasa se
encuentra altamente
conservado
filogenéticamente.
19
Elongación
Translocación
EF-G
5'
3'
A
P
La translocación es mediada por el factor EF-G, guíado por la
hidrólisis de GTP
Elongación
Translocación
EF-G
5'
3'
P
A
El RNAt que acarrea a la cadena polipeptídica creciente ahora ocupa el
sitio P. El sitio A queda desocupado para el siguiente AA-RNAt según el
codón que está posicionado en el sitio A.
20
Terminación.
El ribosoma llega al codón de término del
marco de lectura del RNAm
Ruptura del enlace
éster
Los codones UAA, UAG y UGA
no son reconocidos por ningún
RNAt
Factor de liberación o de
terminación (RF)
UAA (codón de término)
“STOP”
RF1=> UAA y UAG / RF2 => UAA y UGA
El mecanismo que se ha propuesto para la liberación se basa en la
semejanza estructural entre un AA-RNAt y los factores de liberación.
El factor de liberación se une al sitio A del ribosoma y acarrea una
molécula de agua a la región de elongación de la cadena
polipeptídica.
H
O
La actividad de peptidil transferasa emplea
esa molécula de agua para romper el enlace
éster y liberar al polipéptido.
H
21
Polisomas. Un solo RNAm puede ser traducido por varios
ribosomas de manera simultánea.
Varios inhibidores de la síntesis de proteínas se han usado como
antibióticos:
ANTIBIÓTICO
ACCIÓN
Estreptomicina
Inhibe la iniciación y causa una lectura incorrecta
del RNAm (Procariontes)
Tetraciclina
Se une a la subunidad 30S del ribosoma e inhibe
la unión del aminoacil-RNAt (Procariontes)
Cloramfenicol
Inhibe a la peptidil transferasa (Procariontes)
Eritromicina
Se une a la subunidad 50S e inhibe la
translocación (Procariontes)
Puromicina
Causa terminación prematura de la traducción.
Actúa como análogo estructural del aminoacilRNAt
Cicloheximida
Inhibe a la peptidil transferasa (Eucariontes)
22
Traducción en Eucariontes.
Los ribosomas en
eucariontes son más
grandes y están
formados por un número
mayor de proteínas que
los ribosomas
procariontes.
La principal diferencia en la traducción entre procariontes y
eucariontes radica en la fase de iniciación.
Los RNAm eucariontes carecen de una secuencia consenso de
unión al ribosoma (Shine-Dalgarno).
Hipótesis del “scanning” o barrido.
La subunidad 40S del ribosoma se une al extremo 5’ del RNAm
y hace un barrido hasta encontrar el codón AUG. La subunidad
40S
Este codón se debe encontrar en el contexto correcto que es:
5’-CCRCCAUGG-3’
23
En eucariontes hay varios factores de iniciación que se pueden
clasificar por su función:
eIF6, eIF3, eIF4C que se unen a las subunidades del ribosoma.
eIF4(A,B,E,F) que se unen a la estructura del cap en el extremo
5’ del RNAm
eIF2, eIF2B que acarrean al AA-RNAt iniciador
El proceso de elongación es similar a los procariontes y la
actividad de peptidil transferasa se encuentra en....
El proceso de terminación es similar al de los procariontes y se
reconocen los mismos codones de término:
UAA
UAG
UGA
24
Transporte de las proteínas en la célula.
La localización final de una proteína en la célula frecuentemente está
determinada por alguna secuencia corta de aminoácidos presente en la
proteína.
En procariontes, los destinos
posibles de una proteína:
• Secretada hacia el
exterior de la célula
• Membrana plasmática
• Citosol
Las bacterias Gramtienen varios sistemas
de secrección.
Secreción de proteínas en bacterias.
La proteína que se va a secretar
tiene una secuencia de varios
aminoácidos en N-terminal que
funciona como señal.
La proteína SecB se une a la
proteína recien sintetizada y
previene que se pliegue y
adquiera su estructura terciaria.
Las proteínas SecY y SecE son
proteínas transmembranales que
forman un poro mediante el cual
es transportada la proteína que es
secretada.
Es un proceso dependiente de la
hidrólisis de ATP
La proteína se pliega y el péptido
señal es procesado por una
proteasa.
25
En eucariontes, las proteínas pueden tener varios destinos:
Núcleo, mitocondria, peroxisomas, cloroplastos, retículo
endoplásmico, aparato de Golgi, lisosomas.
Las proteínas contienen ciertas secuencias de aminoácidos que
son reconocidas por receptores en el organelo blanco o por otras
proteínas que las transportan.
Hay dos mecanismos generales:
Direccionamiento post-traduccional: núcleo, mitocondria,
cloroplasto peroxisoma.
Direccionamiento co-traduccional: retículo endoplásmico, aparato
de Golgi, lisosomas, membrana plasmática, secreción.
Transporte de proteínas al núcleo.
Proteínas del metabolismo del
DNA y RNA requieren estar en el
núcleo. También las histonas y
otras proteínas que se unen a la
cromatina.
El transporte de proteínas hacia
adentro del núcleo ocurre por los
poros nucleares donde hay
proteínas que reconocen la
secuencia de localización nuclear
(NLS) en la proteína que se va a
internalizar. Esta NLS es una
secuencia rica en aminoácidos
básicos. -PKKKRLVHay proteínas que carecen del NLS pero son cotransportadas al núcleo
junto con otra proteína.
26
Direccionamiento cotraduccional. La vía secretora.
1. La proteína entra al RE conforme es
sintetizada en el ribosoma.
2. Las proteína sale del RE en una
vesícula
3. Las proteína viaja a través de la
cisterna del aparato de Golgi
4. La proteína entra en una vesícula
secretora que se fusiona a la membrana
plasmática.
5. Las proteína es secretada.
Degradación y reciclaje de proteínas.
Las proteínas tienen una vida media determinada por lo que son
hidrolizadas por varias vías.
Proteínas oxidadas
Proteínas mal plegadas
Proteínas que forman agregados
Proteínas de señalización o regulatorias
Degradación de proteínas por vía lisosomal que contienen
muchas proteasas.
27
Degradación y reciclaje de proteínas.
Ubiquitinación.
La ubiquitina es una proteína de 76 a.a. que se une a proteínas
que van a ser degradadas.
1.
Una enzima activadora se une al extremo C-terminal de la ubiquitina
(ATP)
2.
La ubiquitina activada es transferida a una segunda enzima que
reconoce a la proteína blanco
3.
La ubiquitina activada se une covalentemente a residuos de Lys de
la proteína blanco.
4.
La proteína “marcada” con ubiquitina es reconocida por proteasas en
el citosol que la degradan.
5.
Estas proteasas forman un complejo de unas 28 subunidades que
tiene un alto P.M. (proteasoma).
Degradación y reciclaje de proteínas.
Ubiquitinación.
La proteína “marcada”
con ubiquitina es
reconocida por
proteasas en el
citosol que la
degradan.
La ubiquitinaactivada
se une
covalentemente
a residuos de
Lys de la
proteína blanco.
Una enzima activadora se une
al extremo C-terminal
de la ubiquitina (ATP)
La ubiquitina activada es
transferida a una segunda
enzima que reconoce a la
proteína blanco
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Estas proteasas forman un complejo de unas 28 subunidades que tiene
un alto P.M. (proteasoma)
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