Muestra 2 - PROCEDIMIENTOSMICROBIOLOGICOS

Objetivo
Realizaremos un urocultivo para la determinación de los diferentes tipos de microorganismos
presentes en dos muestras de orina. Realizando las diferentes pruebas para el diagnostico de
las posibles enfermedades o infecciones urinarias.
Fundamento
El urocultivo se basa en la identificación del número y de los tipos de bacterias presentes en la
orina. Es necesario que el método de recogida sea el adecuado siguiendo unos protocolos de
higiene evitando así posibles contaminaciones de la muestra.
Para la identificación del número de bacterias, realizaremos un recuento bacteriano (Hygicult
TPC) y para la identificación de los tipos de bacterias presentes en la orina y sus patologias, se
realizara una siembra en medios de cultivo diferentes con la técnica de siembra comúnmente
utilizado en el urocultivo, según el tipo de microorganismo comúnmente encontrado en la
muestra.
Los diferentes cultivos que vamos a utilizar serán:
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CLED, Agar: Es un medio de cultivo diferencial para aislar y contar las bacterias
presentes en la orina. También se utiliza para la diferenciación de bacterias
fermentadoras de la lactosa o las no fermentadoras. Es comúnmente utilizado para el
crecimiento de enterobacterias y bacilos Gram – presentes en las orinas patológicas.
CPS3: se utiliza para el aislamiento, recuento e identificación directa de Escherichia
coli, Proteus y Enterococcus.
CNA: es un medio selectivo para el aislamiento y permite el crecimiento de bacterias
Gram positivas, aunque en ocasiones puede haber crecimiento de alguna Gram
negativas.
Agar nutritivo: medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus
requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. En
nuestro caso será utilizado para el cultivo de Cándida albicans y Streptococcus.
Por otro lado utilizaremos el kit Urin system, panel utilizado para el contaje, identificación
presuntiva y susceptibilidad antibiótica de microorganismos presentes en infecciones urinarias.
Este consta de 24 pocillos los cuales se dividen en 2 pocillos para el recuento, 7 pocillos de
cultivo para la identificación y 15 para las pruebas de sensibilidad (antibiograma).
También se realizará un examen macroscópico y microscópico de la muestra y del cultivo. En el
examen macroscópico de la muestra se deberá observar el color, olor, la densidad, turbidez,
volumen, la química seca (tiras reactivas) y el diagnostico del pH y el examen microscópico en
fresco de la orina. En el examen macroscópico del cultivo ha de visualizarse la forma, color,
forma de sus bordes y la superficie de las colonias. Y en el examen microscópico del cultivo la
diferenciación de las bacterias Gram positivas de gram negativas y las diferentes formas que
presenten (coco, bacilo, estafilococos…)
Materiales
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Asas de siembra desechables
Portaobjetos
Placas de Petri
Mechero
Pinzas
Papel platina
Papel de filtro
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Vasos de muestra
Pipeta
Microscopio
Tubos de ensayo
Gradilla
Jeringa
Suero fisiológico
Reactivos
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Urin system plus (kit de recuento, identificación y sensibilidad)
Hygicult tpc (recuento)
Tiras reactivas
Kit de gram
Medios de cultivo
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CLED Agar, CNA, Agar nutritivo, CPS3.
Muestra
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Muestra 1
Muestra 2
Procedimientos
Recogida de muestra:
Se utilizará un recipiente de muestra desechable. La orina que se recogerá será la primera
orina de la mañana, por ser una orina más concentrada.
Para su recogida se lavara cuidadosamente la zona genital, con agua y jabón y se secara con
una gasa estéril o una toalla limpia. Hay que recoger la porción de orina que corresponda a la
mitad de la micción, desechando la porción inicial y final de la micción y recogiendo el resto en
el frasco estéril. Por último se tapa bien el frasco y se procederá a su análisis.
Análisis de la muestra:
Ante todo realizaremos los siguientes medos de cultivo: Cled agar, CPS3 y CNA, y mientras se
van auto clavando procederemos a la observación macroscópica de la muestra, para ello
observaremos el volumen, la densidad, la turbidez, mediremos el PH y utilizaremos las tiras
reactivas para conocer si existe presencia de sangre, de nitritos, de cetonas, de acido
ascórbico, también para conocer la cantidad de proteínas y de leucocitos.
Para realizar esta prueba vamos a introducir la tira reactiva dentro del recipiente con la ayuda
de unas pinzas. Luego la tira la depositaremos sobre un papel de filtro y procederemos
rápidamente a su lectura, comparando los colores con los del bote.
Después vamos a realizar un examen microscópico. Para ello vamos a utilizar la técnica de la
tinción de Gram para conocer la presencia de bacterias Gram + y Gram-.
Una vez se hallan autoclavado los medios, los dejaremos solidificar y realizaremos la siembra
con asas desechables en los correspondientes medios de cultivo. Luego los rotulamos con la
fecha y el número de la muestra (en este caso 1 ó 2) y los incubamos a 37ºC durante 24 horas.
Por otra parte utilizaremos la técnica hygicult tpc para obtener el recuento de bacterias que
aproximadamente hay en la orina, para ello, impregnamos el cultivo específico, colocado en
forma de gel, dentro de la muestra y lo ponemos a cultivar de 18-24 horas.
La otra prueba que realizaremos será la URIN SYSTEM PLUS que consiste en realizar dos
suspensiones. Una suspensión A (donde cogeremos 0’5ml de muestra con una pipeta y 1´5ml
de suero salino) y otra B (donde tomaremos 0’2ml de la suspensión A mas suero médium del
kit). Procedemos a añadir a cada pocillo 0’2ml con la pipeta de las dos suspensiones hasta los
pocillos 9 con la suspensión A y el resto con la suspensión B. Ponemos a cultivar 24 horas y
leemos resultados.
Pasadas las 24 horas observaremos el crecimiento obtenido:
Con respecto a los medios de cultivo de cada muestra, realizaremos un examen macroscópico
de las colonias, observando sus bordes, sus tamaños, su forma y su superficie.
Con lo observado anteriormente iremos buscando posibles microorganismos teniendo siempre
en cuenta las características de los medios. Luego haremos la tinción de Gram para comparar y
descartar las cuestiones antes analizadas.
Realizaremos un inoculo por cada muestra, luego realizaremos las extensiones necesarias y
teñiremos con Gram. Por último observamos al microscopio y copiamos los resultados para
luego compararlos con los posibles resultados de las colonias observadas.
Con respecto a la lectura de la técnica hygicult TPC utilizaremos unas pinzas para sujetar los
geles de cultivo y colocarlos en un portaobjetos, para así observar mejor el crecimiento y
apuntar los resultados obtenidos de la concentración bacteriana.
En cuanto a la los resultados de la prueba URIN SYSTEM PLUS observamos los cambios de
colores y anotamos la presencia de microorganismos comparando con la hoja de resultados
que posee el kit.
Resultados
Examen macroscópico de la orina
Muestra 1: presenta un olor característico a café. Con un color amarillento fuerte y con
presencia de sedimentos en el fondo del recipiente. Con una densidad normal y una ligera
turbidez. El pH que obtuvimos ha sido 7.5. El resultado de las tiras reactivas ha sido el
siguiente: bilirrubina negativa, Urobilinógeno normal, cetonas normal, ácido ascórbico
negativo, glucosa normal, proteínas negativo, sangre negativo, pH 7.5, nitritos negativo,
leucocitos negativo y una densidad de 1,015.
Muestra 2: presenta un olor característico, con un color amarillo claro, sin presencia de
sedimentos ni turbidez con una densidad normal. El pH ha sido 5. El resultado de las tiras
reactivas ha sido: bilirrubina negativa, Urobilinógeno normal, cetonas normal, ácido ascórbico
negativo, glucosa normal, proteínas negativo, sangre negativo, pH 5, nitritos positivos,
leucocitos negativo y una densidad de 1,020.
Examen microscópico de la orina en fresco
Muestra 1: presencia de cocos, bacilos, células epiteliales.
Muestra 2: presencia de cocos, bacilos, células epiteliales y cristales.
Examen macroscópico de los medios de cultivo
Muestra 1:
-
Cled agar: presencia de colonias de color amarillo, de tamaño grande, con bordes
circulares y superficie convexa.
-
CPS3: presencia de diferentes colonias:
o Colonias de color marrón oscuro, de grandes tamaño y medianas, bordes
circulares, superficie elevada y se encuentran en gran cantidad.
o Colonias de color verde, de pequeños tamaños, bordes circulares, se
encuentra en poca cantidad.
o Colonias blancuzcas, de diminuto tamaño, céricas y brillantes.
-
CNA: presencia de dos tipos de colonias:
o
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Colonias con halo: las colonias son de color blanco, mientras que el halo es
amarillento, su forma es circular, sus bordes regulares y presentan superficie
cóncava.
o Colonias sin halo: forma circular y bordes regulares.
Agar nutritivo: observación de dos tipos de colonias.
o Colonias de color blanco: de pequeño tamaño, brillantes, redondeadas.
o Colonias de color naranjadas: con bordes redondeados y de tamaño normal.
Muestra 2:
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Cled agar: presencia de colonias de color amarillo, con bordes circulares y presentes en
poca cantidad.
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CPS3: presencia de diferentes colonias:
o Colonias de color verde, de grandes tamaño, bordes circulares y están
presentes en mayor proporción
o Colonias de color blanco, de pequeños tamaños,
-
CNA: presencia de dos tipos de colonias:
o Colonias con halo: las colonias son blancas y sus halos amarillos, tienen forma
circular, sus bordes son regulares y tienen una superficie elevada.
o Colonias sin halo: son de color blanco, su forma es circular.
Examen microscópico de los medios de cultivo
Muestra 1: tinción de gram, observación por colonias y medios.
-
Cled agar:
Colonias amarillas: E.coli se observan bacilos cortos de color rosa (presenta una leve
acidificación del medio, estando este de color amarillo) y Enterococcus se observan diplococos
gram positivos.
-
CPS3:
Colonias marrones: E.coli, bacilos cortos gram negativos, se observan de color rosados.
Colonias verdes: Enterococci, con forma cocobacilar de color rosa.
Colonias blancas: Candida albicans, son levaduras, se observan con presencia de algunas
esporas, hifas.
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CNA:
Colonias blancas: E.coli, se observan bacilos cortos de color rosa.
Colonias blancas con halos: P.vulgaris, bacilos de color rosa y con pilis.
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Agar nutritivo:
Streptococcus: de color azul.
Muestra 2: tinción de gram, observación por colonias y medios.
-
Cled agar:
Colonias amarillas: E.coli se observan bacilos cortos de color rosa (presenta una leve
acidificación del medio, estando este de color amarillo) y Enterococcus se observan diplococos
gram positivos.
-
CPS3:
Colonias marrones: E.coli, bacilos cortos gram negativos, se observan de color rosados.
Colonias verdes: Enterococci, con forma cocobacilar de color rosa.
Colonias blancas: Candida albicans, son levaduras, se observan con presencia de algunas
esporas, hifas.
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CNA:
Colonias blancas: E.coli, se observan bacilos cortos de color rosa.
Colonias blancas con halos: P.vulgaris, bacilos de color rosa y con pilis.
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Agar nutritivo
Presencia de Streptococcus, bacilos cortos, diplococos, cocos, cocobacilos.
Resultados de la técnica hygicult tpc
En la muestra 1 obtuvimos una concentración bacteriana de 106 bact/ml y en la muestra 2 la
concentración bacteriana obtenida fue de 105 bact/ml.
Resultados de la prueba URIN SYSTEM PLUS
Muestra 1:
Bacteriuria: CFU/ml > 106
E.coli: positivo
Proteus: positivo
Pseudomonas spp: negativo
Klebsiella: negativo
Enterococcus spp: positivo
Staphylococcus spp: negativo
Candida albicans: positivo
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA)
No es susceptible a TZP, FOS, AMS, AUG y C.
Resistente frente a CAZ y SXT.
No han sido concluyentes: AK, CN, TOB, CFP, CTX, NA, CIP, LEV.
Muestra 2:
Bacteriuria: CFU/ml > 105
E.coli: positivo
Proteus: positivo
Pseudomonas spp: negativo
Klebsiella: negativo
Enterococcus spp: positivo
Staphylococcus spp: negativo
Candida albicans: positivo
PRUEBAS DE SENCIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA)
No es susceptible a TZP, FOS, AMS, AUG y C.
Resistente frente a CAZ y SXT.
No han sido concluyentes: AK, CN, TOB, CFP, CTX, NA, CIP, LEV.
Conclusión
Cada una de las anteriores pruebas han sido realizadas con un propósito y para corroborar que
nuestras sospechas tras la observación del cultivo es cierta. Para ello tras la observación de la
siembra y el cultivo, al observar las colonias, decidimos realizas las observaciones
microscópicas con la elaboración de la tinción de gram, para verificar que, cada una de esas
colonias se corresponde con la forma que debe de presentar cada bacteria de estas.
Tras la realización de cada una de las pruebas nombradas con anterioridad durante todo el
desarrollo hemos podido llegar a la conclusión que, ambas muestra presentan E.coli y Proteus
vulgaris, Enterococcus, Streptococcus y Candida albicans. Ambas muestras poseen un alto
número de bacterias, presentan una alta bacteriuria. En la química seca poseen unos valores
normales.