cultivo de hibridomas bajo condiciones controladas de co2 disuelto

XI CONGRESO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOINGENIERÍA
CULTIVO DE HIBRIDOMAS BAJO CONDICIONES CONTROLADAS DE CO2 DISUELTO:
IMPLICACIONES EN EL METABOLISMO CELULAR Y EL PATRON DE GLICOSILACION
DEL AcMo PRODUCIDO.
José Antonio Serrato, Vanessa Hernández, Octavio Tonatiuh Ramírez.
Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos, Instituto de Biotecnología, UNAM. Av. Universidad 2001 Col.
Chamilpa, Cuernavaca, Mor. C.P. 62250. Fax (777) 3138811, [email protected]
Palabras clave: Hibridomas, AcMo, N-glicosilación, dCO2, OD, metabolismo.
Resultados y discusión. En la figura 1 se muestra un
cultivo representativo de hibridomas en biorreactor a 50 %
de OD (Fig. 1A), pH 7,20 y 6 mbar de dCO2 constantes (Fig.
1B). En estas condiciones de cultivo fue posible mantener un
crecimiento exponencial con alta viabilidad (mayor a 90%)
durante aproximadamente 60 hrs, alcanzando una
concentracion celular viable máxima de 2.25 x106 cel mL-1
(Fig. 1C) y una vel. esp. de crecimiennto de 0.0365 h-1. Se
150
120
60
90
60
40
30
0
20
-30
-60
d C O2 (mbar)
0
B
40
7.3
30
7.1
20
6.9
10
6.7
0
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
pH
OD (%)
A
P o t e n c i ar e
l d o x(mV)
80
6.5
C
80
60
40
20
Viabilidad (%)
Metodología. Línea celular: hibridomas murinos BCF2
productores del AcM contra la toxina 2 del alacrán
Centruroides noxius Hoffman. Medio de cultivo: Chemicaly
Defined Hybridoma Medium (GIBCO, Carlsbad, CA)
suplementado con 25mM HEPES (Sigma) y 8 mM
glutamina (Sigma). Los cultivos se realizaron en un
biorreactor de 250 mL de volumen de trabajo, instrumentado
con sensores de pH, OD y dCO2, lo cual permitió obtener
mediciones en línea. Mediante la manipulación de los flujos
de O2, N2 y CO2 a través de un sistema computarizado y un
algoritmo de control proporcional se logró mantener el OD y
el dCO2 en los valores predeterminados. El pH se controló
mediante la adición de NaOH 0.4N al medio de cultivo. La
viabilidad y concentración celular se midieron por tinción
con azul de tripano y un contador electrónico de partículas,
respectivamente. La glucosa, glutamina y lactato se midieron
mediante un multianalizador enzimático. El AcMo se
purificó por cromatografía de afinidad en un FPLC. La
determinación de los patrones de glicosilación del AcM se
realizaron mediante electroforesis capilar.
presentará el efecto del dCO2 sobre el perfil de glicosilación
del AcMo así como sobre los principales parámetros
cinéticos indicadores del desempeño del cultivo.
Conc. cel. (cel mL- 1 x106)
Introducción. Debido a la fragilidad celular que caracteriza
a las células animales, muy bajas velocidades de agitación y
aireación son empleadas en cultivo, lo que ocasiona la
formación de heterogeneidades ambientales que afectan el
rendimiento y la productividad de los cultivos industriales.
Entre estas, la acumulación de CO2 disuelto (dCO2) en el
medio de cultivo representa uno de los principales
problemas. No obstante, escasa o nula información existe en
la literatura con respecto al cultivo de células animales bajo
condiciones controladas de dCO2 en el medio de cultivo, así
como las implicaciones que ésto puede tener en el
metabolismo celular, la producción de AcMo y su perfil de
glicosilación.
En el presente trabajo evaluamos el crecimiento de
hibridomas murinos así como la producción y perfil de
glicosilación de los AcMo producidos, durante cultivos en
biorreactor bajo condiciones controladas de dCO2.
0
0
24
48
72
96
t (h)
Fig. 1. Cinética de crecimiento y parámetros de control de un
cultivo de hibridomas en biorreactor a dCO2, OD y pH constantes.
A. OD y potencial redox., B. dCO2 y pH., C. Cinética de
crecimiento; Viabilidad s., Conc. cel. total u., Conc cel. viable n.
Conclusiones. Mediante una estrategia de control de pH con
adición de NaOH y de control de OD y dCO2 manipulando
la presión parcial de O2, N2 y CO2 en la fase gaseosa, es
posible realizar cultivos a diferentes niveles constantes de
dCO2 manteniendo el OD y pH constantes, con la finalidad
de conocer el efecto del dCO2 en el metabolismo de
hibridomas y en el patrón de glicosilación del AcMo
producido.
Agradecimientos. Al proyecto DGAPA IX-254404.
Bibliografía.
1. Andersen, D. and Goochee, C. (1994) The effect of cell-culture
conditions on the oligosaccharide structures of secreted glycoproteins.
Curr. Opin. Biotechnol. 5, 546-549.
2. Serrato, A., Palomares, L., Meneses-Acosta, A. y Ramírez, OT.
(2004).Heterogeneous conditions in dissolved oxygen affect Nglycosylation but not productivity of a monoclonal antibody in hybridoma
cultures. Biotechnol. Bioeng. Vol(88):177-188.