RECEPTORES PARA LOS MENSAJEROS QUÍMICOS DE TIPO

RECEPTORES PARA LOS MENSAJEROS QUÍMICOS DE TIPO HIDROFÍLICO
ANÁLISIS DE SCATCHARD:
Si recordamos, estábamos hablando de la fórmula de la representación gráfica del Scatchard.
Es importante tener presente la cinética de los receptores, tenemos que partir de la situación de
equilibrio, en la cual una hormona, a la que se denomina H, se une a su receptor correspondiente,
para dar el complejo hormona-receptor.
Hay que llegar a un equilibrio, con el estudio que se hace en el laboratorio, se incuba y se llega al
equilibrio, en el cual la misma cantidad de complejo hormona-receptor que se esta formando, se
esta disociando.
La velocidad de la formación del complejo hormona-receptor es igual a una constante, que se
denomina constante de formación, por la concentración de la hormona, y la concentración del
receptor.
De la misma manera la velocidad de disociación del complejo hormona-receptor va a ser igual a
otra constante que se denomina constante reversa, porque hace el proceso reverso y esta modificado
porque depende de la concentración del complejo hormona-receptor.
Es evidente que en equilibrio la una tiene que ser igual a la otra, puesto que a la misma velocidad se
va a estar formando el complejo y destruyendo.
Después, habíamos dicho que la constante de asociación se define como la constante de formación
partido de la constante reversa y a su vez se define como la inversa de la constante de disociación.
En el numerador, iba la concentración del complejo hormona-receptor, y en el denominador, la
concentración de la hormona, por la concentración del receptor.
Podemos pasar matemáticamente de una ecuación a otra. Por eso si definimos la ka es igual a kf
partido de kr, lo único que tenemos que hacer es sustituir.
Las constantes dependen de la concentración del complejo hormona-receptor.
A este desarrollo habíamos llegado el día anterior, y podíamos aceptar que la Ka es igual a la
fracción unida, partido de la fracción libre y multiplicado por el número total de receptores menos
la fracción unida. Es necesario ponerlo como aparece porque en el laboratorio podemos medir la
fracción unida y la libre, pero no podemos medir el número de receptores, lo tenemos que deducir o
calcular.
De una formula multiplicando Ka por n menos B que es lo mismo que la otra fórmula que aparece.
Podemos observar en la imagen la representación, en la cual tenemos la fracción unida partida de la
fracción libre, es decir, la relación entre lo que se une a los receptores y lo que no se une, frente a lo
que esta unido. Nos sale una recta que corta en ambos ejes y cuya pendiente es precisamente la Ka.
Cuando corta en el eje de la X, donde tenemos representada la fracción unida, sería igual a B
partido por F sería 0 y en este caso n sería el número unido.
Simplemente nos da algún detalle
más, podemos observar la unión
máxima partido por la Kl, por lo
que la pendiente sería 1 partido
por la constante de asociación o L
de ligando.
En laboratorio, se han obtenido
fentomoles (molaridades) de la
fracción unida, de la libre y la
inversa y con las relaciones entre
ellas, se puede realizar un
estudio.
Tenemos los datos y se puede
representar, lo podemos
comprobar aplicando la fórmula.
Y podemos medir en la gráfica
donde corta el numero de
receptores, que en este caso es un
poco más de 4 elevado a menos
10 molar. La fracción unida se mide en molar pero la fracción unida dividido entre libre no tiene
unidades.
Esta es la representación de Scatchard que nos
sirve para calcular el número de receptores,
constante de afinidad, de disociación, la
inversa...
Si representamos una población de receptores con esta curva, se puede realmente descomponer en
dos poblaciones, una que tiene mayor afinidad y otra que tiene mayor afinidad. Porque los
receptores no son todos iguales, hay diferentes poblaciones de receptores.
PREMISAS DEL ANÁLISIS DE SCATCHARD:
Hay una serie de premisas, que hay que aceptar para que todo el desarrollo matemático realmente
funcione.
1. La hormona marcada es biológicamente idéntica a la hormona nativa
2. La hormona marcada es homogenea
3. El receptor es homogeneo
4. El receptor actúa como una unidad
5. El receptor no está ocupado
6. La reacción esta en equilibrio.
Ambos hormona y receptor, son estables
La reacción es reversible
El equilibrio no se perturba cuando F y B se separan
7. Toda la unión específica se debe al receptor
Tenemos que ser conscientes de que estas no siempre se cumplen por completo.
La hormona marcada con un yodo 125 (isotopo radiactivo) se supone que es idéntica a la hormona
nativa, en el laboratorio podemos utilizar métodos que nos permitan acercarnos lo mas posible a
estas premisas, pero nunca estamos seguros de que sea perfecto.
Cuando nosotros introducimos un isótopo radiactivo a una molécula, podemos estar por los mismos
métodos de la reacción, podemos estar dañando esta molécula, y que no sean idénticas desde el
punto de vista biológico a la no marcada, es decir, no podemos tener certeza de que esas fracciones
unida y libre sean idénticas.
Que la hormona marcada sea homogénea, para ello haríamos una cromatografia y separaríamos las
fracciones, una vez que hemos marcado la hormona, y podemos separar fracciones en las que
tengamos la seguridad de que solo tenemos un tipo de molécula. Puede haber también ciertas
diferencias.
Es posible en la tercera premisa, que el receptor ya tenga su ligando unido, si no son homogéneos,
hay diferentes poblaciones.
Que el receptor actúe como una unidad, que no este ocupado. Evidentemente en este análisis, se
supone que todos los receptores están vacíos, actúan en una sola molécula, y cuando se les enfrente
a su ligando marcado y no marcado va a tener la misma probabilidad de unirse a ambos ligando, si
estuviera ocupado ya no se podría unir.
Es importante también que la reacción este en equilibrio, hay que incubar los tubos en los que
hacemos los análisis, durante un tiempo suficientemente grande como para permitir que se alcance
el equilibrio.
Hay que controlar que estas moléculas no vayan a degradarse. Hay hormonas que se rompen muy
fácilmente incluso a temperatura ambiente durante bastante tiempo.
Se necesita un soporte físico donde se puedan unir los reactivos y además toda la unión específica
se debe al receptor.
Efectivamente hay que medir la unión específica para poderlo calcular.
Son premisas que tenemos que intentar lo máximo posible en la práctica para que los cálculos sean
fiables.
SÍNTESIS DE RECEPTORES
A nivel transcripcional:
- Receptor de insulina
A nivel traduccional:
- Inserción en la membrana de RE
- Glicosilación en dominio extracelular de los receptores
A nivel postraduccional:
- Palmitoilación
Hemos hablado de algunas características del proceso de biosíntesis de algunos receptores.
Los receptores son proteínas y se van a sintetizar como cualquier otra proteína, pero se han visto
algunos casos en los que hay algunas diferencias.
Puede haber algunas diferencias a nivel traduccional, a nivel transcripcional y a nivel post
traduccional. En todos los niveles se puede ver alguna característica.
Por ejemplo a nivel transcripcional con el receptor de la insulina. Además a nivel traduccional es
muy importante que se puedan insertar en la membrana del retículo endoplásmico.
Estas moléculas proteicas que van a formar parte de la estructura de la célula tienen que tener una
secuencia consenso que les permita anclar a una de las membranas del aparato de golgi y trasladarse
hasta la membrana del RE e insertarse, para trasladarse a través del Golgi y luego del citoplasma
para fundirse con la membrana plasmática en la posición correcta.
La glicosilación siempre va a encontrarse en el dominio extracelular, es decir, que estas proteínas
que van a sufrir como un proceso post traducional, estas reacciones de glicosilación siempre van a
suceder en el dominio extracelular; nunca nos vamos a encontrar restos de azúcar en el dominio
intracelular, sino en la superficie.
A nivel postraduccional podemos encontrar procesos de palmitoilación, es decir, de la unión de un
resto de ácido palmítico, que va a permitir que estas moléculas tengan una cierta función en la
activación y desactivación de estos receptores.
Además hay otras modificaciones post-traduccionales.
RECEPTOR DE INSULINA:
En el caso del receptor de insulina, a nivel transcripcional.
En la imagen podemos ver el RNA m del receptor de insulina, un exón identificado con el número
11, ese exón en unos tejidos se va a expresar y en otros no. Va ha dar lugar a 12 aa que estarían
situados en el punto que sale señalado.
Lo que se representa es una de las subunidades del receptor de insulina (esta formado por dos
subunidades que es una cadena polipeptídica, desde el extremo N terminal al C terminal, y unidas
las dos cadenas de forma permanente). Hacia el extremo C-terminal de la cadena que se denomina
alfa (podemos ver además los puntos de unión de la insulina, una hélice alfa que atraviesa la
membrana plasmática y ancla el receptor a la membrana y la cadena beta), ese exón 11 va a dar
lugar a 12 aa.
Se ha visto que los tejidos que están alejados del sitio de producción de la insulina, es decir, tejidos
alejados del páncreas, no existen estos 12 aa, y sin embargo en tejidos más cercanos al páncreas si
existen, y curiosamente la parte acortada de este receptor se une con mayor actividad a la insulina,
que los que tienen los 12 aa.
Es decir, existen dos formas del receptor, y desde el punto de vista estructural se diferencian en que
a uno de ellos le faltan 12 aa.
El que esta acortado esta en tejidos periféricos y es más sensible a la insulina.
El más largo, con los 12 aa, esta cercano al páncreas y no es tan sensible a la insulina.
El hecho de que sea más sensible en los tejidos periféricos se debe a que hay menos insulina
circulante que cerca de donde se ha producido la insulina, por tanto es una forma de repartir la
insulina por los tejidos periféricos de forma más eficiente.
MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE LAS PROTEÍNAS:
En cuanto a las modificaciones post-traduccionales, se producen en muchas proteínas, que tienen
que ver con la transducción de señales no solo con los receptores, tenemos por un lado la
miristoilación de una proteína.
Grupos que se unen a determinados aa de las proteínas, muchas veces tiene que haber una
determinada secuencia consenso, para que se pueda realizar la unión, es una modificación
covalente, a veces es permanente y a veces no.
Al estudiar proteínas como las G veremos que algunas van a estar miristoiladas en el extremo Nterminal, tiene la función muchas veces de unirse a otras proteínas o a la membrana.
La palmitoilación es la unión de un grupo palmitoilo. Es reversible, y es importante en los
receptores beta adrenérgicos, que van a poder unir o desunir este grupo palmitoilo, lo cual va ha
tener una influencia en la activación o desactivación del receptor.
(es importante).
Aunque la estructura básica es la misma, la diferencia es que uno lleva 15 C y el otro 20.
ambos son derivados del isopreno, y ambos irían al extremo C-terminal de una proteína. La
diferencia esta en el número de C, es decir, en las unidades de isoprenilos que se van a unir para dar
lugar a las modificaciones.
En ambos la modificación es irreversible.
La modificación de la palmitoilación es reversible y tiene una función temporal, cuando esta va a
permitir que las proteínas tengan una situación en las células, o se activen o se desactiven en el caso
de los receptores.
En estas últimas proteínas es irreversible y una vez que están ya no van a separarse.
MIRISTOILACIÓN DEL EXTREMO AMINO DE UNA PROTEÍNA:
Veríamos la fórmula del ac. Mirístico, que se une a una glicina de tal manera que tenemos un Nmiristil-glicina, y se une a un grupo amino.
Para que esto suceda tiene que haber una secuencia consenso en la que tengamos una glicina y 3 aa
que pueden ser cualesquiera, después tiene que haber una serina o treonina, y dos aa básicos. Esta
secuencia es necesaria para que pueda producirse la reacción de miristoilación y se pueda unir el
residuo de ac. Mirístico al extremo N-terminal.
Hay una enzima que va a catalizar esta reacción que se denomian N-miristil transferasa.
Y un donador de grupos acilo que es el miristil-CoA.
MODIFICACIÓN COVALENTE DE PROTEÍNAS RECEPTORAS:
Cuando tenemos una palmitoilación que se hace de forma post-traduccional, vamos a ver que es un
enlace tio-ester a la cisteina.
Vamos a ver que el grupo palmitoil tiene 16 C y no tiene ningún enlace doble.
Se produce tanto en el golgi como en el citosol, y lo que hace es que sitúa a la proteína que esta
palmitoilada debajo justamente de la membrana plasmática por la cara interior de la célula, y hace
que se ancle al fondo, donde tiene que tener su función.
Como no es una modificación covalente permanente si no que se hace y se desace se dice que tiene
una alta tasa de recambio o turnover, alta velocidad de formación y separación de este ácido
palmítico.
Cuando el receptor tiene ese ac. Palmítico unido, este hace como un bucle que se une a la
membrana, y tiene una función de desensibilizar el receptor, este receptor no puede funcionar
correctamente cuando tiene ese ácido palmítico unido.
Aquí tendríamos una proteína, un resto de cisteína, el resto del ácido palmítico...
la enzima es la PALMITOIL TRANSFERASA.
Otra vez el donador de los grupos palmitoilo es el S-palmitoil-CoA.
Siguen el mismo patrón que en el caso del ácido mirístico, solo que aquí tenemos 16 C.
RECEPTOR B-ADRENÉRGICO:
En este caso, tenemos también una molécula proteíca. En la imagen vemos representadas hélices
transmembranas, y justamente en el extremo C-terminal existe una zona donde puede unirse el
ácido palmítico, esta zona queda dentro de la célula, y cuando tiene ese ácido palmítico, este se
engancha a la membrana y hace un bucle. Veremos que todo lo de las hélices transmembrana va
hacer que el receptor entre o salga de la célula, lo que va hacer que haya una serie de bucles.
Si esta unido daría lugar a un bucle más, y al aparecer ese bucle el receptor se desensibiliza.
Hay ciertas regiones que se conocen que son ricas en serina o en treonina. Grupos de fosforilación,
bien sea por protein kinasa A o por la C.
Luego, otros sitio de unión de otras proteínas que ya veremos.
En cuanto a la farnesilación y la geranilgeranilación, podemos observar el grupo prenilo o
isoprenilo, y es lo que da una unidad.
Dependiendo de las unidades tenemos el farnesilo que tendría 15 C y que se uniría a un átomo de
azufre, con la secuencia consenso que aparece.
La cisteina que lleva el átomo de azufre, más dos aminoácidos alifaticos, más otro aminoácido.
La enzima sería la farnesil transferasa.
Este sería el caso de 15 C, y en caso de los 20 sería paralelo, lo único que la cadena sería más larga.
Tenemos farnesil, una
cisteina, tiene que haber
una proteólisis y una
metilación, para dar
lugar a la proteína
farnesilada en su
extremo C-terminal.
Es necesario recordar
cual es la secuencia
consenso, las enzimas
involucradas...
TIPOS DE RECEPTORES DE MEMBRANA:
CLASES:
1. Forman canales iónicos
2. Interaccionan con proteínas quinasas solubles
3. Con actividad enzimática intrínseca
4. Con siete hélices alfa transmembranales
5. Otros receptores
Los que tiene 7 hélices transmembrana también se denominan de tipo serpentina, por la forma en la
que entran y salen de la molécula, o también acoplados a proteínas G, porque son especificamente
los que van a traducir la señal.
Hay muchos que no podremos ver.
Vamos a ver la estructura de los más abundantes en la transducción de la señal.
Los que forman canales iónicos, simplemente
son como poros en la membrana.
Habitualmente están cerrados y cuando se les
une su ligando específico se abren esos poros y
permiten el paso de iones a su a través, forman
como un canal iónico.
La estructura es algo más complicada y aquí
podemos observar la estructura del receptor de
GABA a:
Es un receptor que va ha permitir el paso de cloro a través de la membrana.
Esta formado por una serie de subunidades, que se denominan alfa, beta y gamma, y suele haber dos
alfa, dos betta, y una gamma.
Podemos observar en la imagen otros ligandos que también pueden unirse.
Cada una de estas subunidades va ha tener unas funciones concretas.
Por ejemplo en el caso del receptor nicotínico de acetilcolina nACh:
es un receptor del tipo canal iónico, existen también 5 subunidades, que atraviesan la membrana, y
son alfa, beta, gamma y delta, y tiene distintas funciones.
Las subunidades alfa van a unir la acetilcolina, van a unir el ligando específico.
La subunidad beta tiene que ver con los receptores, después de que se haya unido el ligando
específico, los receptores van a involucionar dentro de la célula.
La subunidad gamma sirve para desensibilizar al receptor, porque gamma funciona y
posteriormente deja de funcionar.
La delta sirve para cerrar y regular ese receptor.
Cada una de las subunidades que están representadas, es una cadena polipeptídica, con un extremo
N-terminal, y un extremo C-terminal.
El N-terminal siempre que atraviesa la membrana plasmática se produciría una hélice alfa
anfipática.
El extremo C-terminal se ve también en el exterior, lo oscuro es lo que pasa a través de la
membrana.
Podemos ver también una serie de bucles que se encuentran en la parte interior o en la parte
exterior.
Es un esquema parecido.
Se ve que tiene una serie de anillos, en los cuales se sitúan unos determinados aa. Aquí tenemos
unos aminoácidos con carga negativa, una zona distinta, y otra serie de aminoácidos con carga
negativa. En la imagen podemos ver como se vería desde la parte de arriba.
Tenemos los anillos, cargas negativas, positivas en los lados cercanos a la flexura tanto hacia fuera
como hacia dentro, y sirven para seleccionar los iones.
Después tienen un entorno hidrofóbico, con residuos de valina y de leucina (aquí sería serina e
treonina), el entorno hidrofóbico va a impedir la pérdida de iones, en entorno de serina y treonina va
a unir iones, transportarlos y selecionarlos, y los que tengan cargas negativas también van a
selecionar los iones. La composición en este caso sería dos alfa, beta gamma y delta.
Podemos observar un dibujo, que sería de la forma en la que se vería a través de la membrana. Con
los puntos de unión de la acetilcolina en las subunidades alfa.
Y esta imagen sería un poco el funcionamiento:
Tenemos un terminal nervioso, hay un canal de calcio, activado por voltaje, canal de sodio activado
por la acetilcolina.
El activado por voltaje al llegar un impulso nervioso se libera la acetilcolina, que es captada por el
receptor.
El receptor al captarla, se abre y permite el paso de sodio, y hay otro movimiento de iones.
En este caso la célula es muscular, y es una unión neuromuscular.