AMI-184

2º Congreso Nacional AMICA 2015
ESTUDIO DE LA CORRELACIÓN ENTRE ACTIVIDADADES
ENZIMATICAS DE LACASA Y MANGANESO PEROXIDASA CON LA
REMOCIÓN DE FÁRMACOS
Fuad Ale Enriqueza Dante Camarillo Raveloa, Octavio Loera Corralb, Ignacio González
Martínezc, Wilberth Chan Cupuld, Celestino Odín Rodríguez Navaa
a
Departamento de Ingeniería en Sistemas Ambientales, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto
Politécnico Nacional, Gustavo A. Madero, Distrito Federal 07738
b
Departamento de Biotecnología y c Departamento de Química. Universidad Autónoma Metropolitana, Iztapalapa,
Distrito Federal 09340
d
. Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Colima, autopistas Colima-Manzanillo km 40,
C.P. 28100, Tecomán, Colima, México
[email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected],
[email protected]
Resumen
En la actualidad la presencia de fármacos en el ambiente
ha preocupado a la comunidad científica por su baja
degradación en plantas de tratamiento de aguas residuales,
además por su efecto tóxico hacia especies bioindicadoras. En
el presente trabajo se evaluó la remoción de los fármacos
bezafibrato,
diclofenaco,
gemfibrozil,
indometacina,
sulfametoxazol con una concentración inicial de 2 mg/L por
enzimas lignolíticas (manganeso peroxidasa y lacasa)
producidas por los hongos Trametes maxima, Pleurotus sp. y
Pycnoporus sanguineus. Los resultados mostraron que existe
una relación de la oxidación de los fármacos por la actividad
de la enzima manganeso peroxidasa y la remoción (%) de los
fármacos. En el experimento con Trametes maxima, se obtuvo
la mayor actividad específica (365.89 U/mg de proteína) y
remoción de los fármacos estudiados (bezafibrato 32.59 %,
diclofenaco 90.20 %, gemfibrozil 43.39 %, indometacina
60.76 %, sulfametoxazol 72.62 %), seguido por Pleurotus sp.
con una actividad de 49.77 U/mg de proteína con 89.47 % de
remoción de diclofenaco, 46.61 % de gemfibrozil y 73% de
indometacina; por último Pycnoporus sanguineus presentó la
menor actividad de manganeso peroxidasa (20.25 U/mg de
proteína) y la más baja degradación de fármacos
(indometacina 10.59 % y sulfametoxazol 42.08 %). Los
fármacos más persistentes fueron bezafibrato y gemfibrozil.
Palabras clave
Actividad enzimática, hongos ligninolíticos, contaminante
emergente,compuestos farmacéuticos, electroforesis capilar.
Introducción
Los fármacos representan un riesgo para el ambiente,
debido a su toxicidad en especies bioindicadoras (Santos et al.
2010), lo que pone en riego la cadena trófica en un
ecosistema, además son persistentes en plantas de tratamiento
de aguas residuales (Miège et al. 2009). Dentro de los
fármacos de uso común, que tienen un efecto significativo al
ambiente
se
encuentran
bezafibrato,
gemfibrozil,
indometacina, sulfametoxazol y diclofenaco (López-Doval et
al. 2012; Quinn, et al. 2008; Raldúa et al. 2008). Para
disminuir este riesgo, se han propuesto diferentes tecnologías
para la remoción de los fármacos en el ambiente como
electrooxidación (Sirés y Brillas, 2012), procesos combinados
de oxidación avanzada y biológicos (Ganzenko et al. 2014),
entre otros. Otra alternativa es el uso enzimas
ligninoperoxidasas en la degradación de fármacos (Haroune et
al. 2014). Dentro de los trabajos que se has realizado en la
degradación de fármacos con enzimas ligninolíticas se
encuentra el realizado por Urrea et al. (2009), donde
degradaron ibuprofeno, ácido clofíbrico y carbamezapina,
utilizando hongos como Trametes versicolor, Irpex lacteus,
Ganoderma lucidum y Phanerochaete chrysosporium;
después de 7 días de incubación, el ibuprofeno fue degradado
por las cuatro cepas. Trametes versicolor fue el único hongo
capaz de degradar el ácido clofíbrico con remoción cercana al
97% con una concentración inicial de 5 mg/L de éste
compuesto. La carbamezapina fue degrada ligeramente por
Trametes versicolor (56%), pero cuando se agregó en forma
de pellet éste hongo, la degradación de éste compuesto fue
cercana al 70 %. Utilizando la misma cepa de Trametes
versicolor, Auriol et al. (2008), probaron dos enzimas,
peroxidasa de rábano (HRP) y lacasa para remover estrógenos
de efluentes de plantas de tratamientos sintéticos y reales,
encontrando que se necesita una dosis de HRP de 8-10 U/mL
para remover completamente los estrógenos del agua residual
real en un periodo de una hora; mientras que para el agua
sintética sólo ser requirió 0.032 U/mL. Para eliminar los
estrógenos utilizando lacasa, se requirió de una dosis de 20
U/mL para removerlos completamente; este sistema se
comportó de manera similar para el agua sintética y real.
Además en este estudio se determinó la cinética enzimática
encontrando que la lacasa y HRP tienen la misma afinidad por
el sustrato.
Zhang y Geiβen (2010) experimentaron con la enzima
lignina peroxidasa producida por el hongo Phanerochaete
chrysosporium, a diferentes condiciones ambientales, tales
como pH y el efecto de la presencia H2O2, sobre la actividad
enzimática en la degradación de los fármacos carbamazepina y
diclofenaco. El valor de pH y concentración de peróxido de
hidrógeno presentaron una fuerte influencia en la degradación
de estos dos fármacos por la lignina peroxidasa. La
degradación completa del diclofenaco se logró a un valor de
pH de 3-4.5, con una concentración de 24 ppm de H2O2;
mientras que en la degradación de la carbamazepina fue
menor al 10% y se incrementó ligeramente en un 15% al
agregar peróxido de hidrógeno. Sin embargo, la adición de
alcohol veratrílico a una temperatura de 30°C no aumentó la
degradación de carbamazepina y no se encontraron efectos
negativos en la degradación del diclofenaco.
2º Congreso Nacional AMICA 2015
Considerando estos antecedentes en el presente trabajo se
evalúa la capacidad de las enzimas mangeneso peróxidas y
lacasa por los hongos: Trametes maxima, Pleurotus sp. y
Pycnoporus sanguineus en la degradación los fármacos
bezafibrato, diclofenaco, gemfibrozil, indometacina y
sulfametoxazol, además se evaluó la correlación entre las
actividades enzimáticas y la remoción de los fármacos.
Metodología
Se colectaron cuerpos fructíferos de los hongos
macroscópicos: Trametes maxima, Pleurotus sp. y Pycnoporus
sanguineus en el Estado de Veracruz, México. Se identificaron
las especies y se cultivaron por separado y selectivamente en
medio de cultivo papa-dextrosa agar como lo indica ChanCupul et al. (2014).
En matraces de 250 mL conteniendo 125 mL de medio de
cultivo líquido Sivakumar et al. (2010) modificado (ver Tabla
1), previamente esterilizado, se inocularon separadamente y
por triplicado los hongos Trametes maxima, Pleurotus sp. y
Pycnoporus sanguineus, se incubaron durante 9 días (25ºC,
120 rpm). La inoculación se llevó a cabo adicionando cuatro
discos de miscelio agar (papa-dextrosa agar) del cultivo
específico de cada hongo en los matraces correspondientes. Se
elaboraron dos blancos con medio de cultivo líquido sin
inoculación de hongos.
Tabla 1 Composición del medio de cultivo Sivakumar et al. (2010)
modificado
Componente del medio de cultivo
D-glucosa (anhidro) granulado
Extracto de levadura
KH2PO4
(NH4)2SO4
CaCl2
MgSO4
FeSO4
MnSO4
ZnSO4
CuSO4
Concentración (mg/L)
20000
2500
1000
50
10
500
10
1
1
2
Una vez pasado los nueve días de cultivo, el medio
nutritivo se filtró con membranas de fibra de vidrio con 2 µm
de tamaño de poro, para separar la biomasa del extracto
enzimático, a este extracto se le agregó los fármacos elegidos
para llevar a cabo el presente estudio para tener una
concentración final de 2 mg/L. Las actividades enzimáticas
fueron determinadas espectrofotométricamente utilizando el
espectrofotómetro Lambda 3ª UV/VIS a temperatura de 2527ºC.
La actividad de la enzima lacasa se determinó mediante
ensayos enzimáticos utilizando 0.5 mM de ABTS [ácido 2,2'azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sinfónico)] como sustrato
(100 µL) a 420nm (ε=3.6x104 M-1 cm-1). con buffer de acetatos
100 mM (800 µL – pH 4.5) y el extracto enzimático (100 µL)
en una mezcla de reacción de 1 mL y 5 minutos de monitoreo.
Una unidad de actividad de lacasa fue definida como 1 µmol
de ABTS oxidado por minuto por mg de proteína bajo las
condiciones del ensayo enzimático (Chan-Cupul et al. 2014).
La actividad de manganeso peroxidasa fue determinada a
610 nm (ε=4460 M-1 cm-1). La mezcla de reacción contuvo:
extracto enzimático (700 µL), rojo fenol 0.2% (50 µL), lactato
de sodio 0.5 mM (50 mL), albúmina de huevo 0.1%, sulfato
de manganeso (II) 2 mM (50 µL) y peróxido de hidrogeno 2
mM (50 µL). La reacción se llevó a cabo en buffer de
succinato de sodio 20 mM a pH 4.5 (50 µL) durante 5 min y
se detuvo adicionando NaOH2N (50 µL). Una unidad de
actividad de manganeso peroxidasa fue definida como 1 µmol
de producto formado por minuto por mg de proteína bajo las
condiciones del ensayo enzimático (Chan-Cupul et al. 2014).
Se agregaron a cada extracto enzimático (filtrado)
obtenido de la exposición a cada hongo y al blanco, los
fármacos bezafibrato, diclofenaco, gemfibrozil, indometacina
y sulfametoxazol para tener una concentración final de 2 mg/L
de cada fármaco en un volumen de 100 mL; se estableció un
tiempo de reacción de 1 h y una temperatura de 23-25ºC.
Se realizó la purificación de los fármacos mediante
extracción en fase sólida (fase reversa) con cartuchos C18
conforme al método EPA 1694 (U.S. Environmental
Protection Agency , 2007). La técnica de electroforesis capilar
de zona fue utilizada para la cuantificación de bezafibrato,
diclofenaco, gemfibrozil, indometacina y sulfametoxazol, se
utilizó un equipo de la marca Beckman Coulter modelo MDQ,
con una columna de sílice fundida de 50 cm de longitud, con
un diámetro interno de 75µm, el electrolito soporte utilizado
fue de buffer de fosfatos (30 mM a pH 8). Se inyectó la
muestra durante 5 s a una presión de 0.5 psi. Para el cálculo de
remoción de los fármacos analizados, se consideró el área
obtenida de cada pico en los electroferogramas para cada
fármacos con respecto al tratamiento control.
Resultados
Las actividades enzimáticas de lacasa y manganeso
peroxidasa se determinaron espectrofotométricamente sobre
los extractos enzimáticos obtenidos después de 9 días (tiempo
donde se obtuvo la mayor actividad enzimática de los hongos
estudiados) de cultivo de los hongos Trametes maxima,
Pleurotus sp. y Pycnoporus sanguineus en el medio líquido
Sivakumar et al. (2010) modificado (ver tabla 1). Los
resultados obtenidos de dichos ensayos enzimáticos se
muestran en la figura 1.
Figura 1. Actividades enzimáticas de lacasa y manganeso
peroxidasa (MnP) determinadas después de 9 días de cultivo de
los hongos.
2º Congreso Nacional AMICA 2015
Tabla 2 Remoción de los fármacos utilizados para cada
extracto enzimático
Remoción de fármacos (%)
Bezafibrato
Diclofenaco
Gemfibrozil
Indometacina
Sulfametoxazol
Pleurotus
sp.
0.00
89.47
47.61
73.00
0.00
Pycnoporus
sanguineus
0.00
0.00
0.00
10.59
42.08
Trametes
maxima
32.59
90.20
43.39
60.76
72.62
Este resultado es consistente con lo obtenido por Urrea et
al. (2009) donde degradó fármacos utilizando el hongo
Trametes versicolor.
Las actividades enzimáticas de manganeso peroxidasa
reportadas en la figura 1, muestran que Trametes maxima es
un organismo capaz de producir el extracto enzimático más
activo en oxidación de Mn2+de los tres hongos (365.89 U/mg),
seguido por Pleurotussp. (49.77 U/mg) y después por P.
sanguineus (20.25 U/mg); se sabe que estas enzimas tienen
baja especificidad sobre un sustrato en particular, (ChanCupul et al. 2014), lo que favoreció la degradación de los
fármacos en el presente estudio
En la figura 2 se muestra el promedio de las áreas
obtenidas en los electroferogramas de los fármacos estudiados
con el hongo Pleurotus sp. con respecto al tratamiento blanco
(medio de cultivo adicionado con fármacos sin inóculo), de la
misma manera en la figura 3 se muestran los resultados con
Pycnoporus sanguineus y en la figura 4 los resultados
obtenidos utilizando el hongo Trametes máxima. A partir de
las áreas obtenidas en los electroferogramas, se obtuvo la
remoción (%) de los fármacos con respecto al blanco para
cada extracto enzimático, correspondiente a cada especie de
hongo (Tabla 2).
Discusión
Trametes maxima presentó resultados sobresalientes en la
remoción de diclofenaco (90%), indometacina (61%),
paracetamol (80%) y sulfametoxazol (73%). Para Pleurotus
sp. se obtuvieron remociones importantes en diclofenaco
(89%), indometacina (73%) y gemfibrozil (48%). En el caso
de Pycnoporus sanguineus solo se obtuvo remoción en los
fármacos indometacina (10.59 %) y sulfametoxazol (42%)
siendo el organismo con menor capacidad de remoción. En
estudios previos (Chan-Cupul et al. 2014) muestran que
Trametes maxima tiene actividades enzimáticas importantes.
En este trabajo las enzimas producidas con este hongo logró
degradar en más del 60% cuatro de los siete fármacos
utilizados.
Figura 3. Presencia de fármacos (BZF, bezafibrato; DCF,
diclofenaco; GBF, gemfibrozil; IND, indometacina; SMX,
sulfametoxazol) antes y después del tratamiento con Pycnoporus
sanguineus
Es preciso observar que bezafibrato y gemfibrozil fueron
compuestos con baja remoción con todos los hongos utilizados
en este trabajo.
Figura 4 Presencia de fármacos (BZF, bezafibrato; DCF,
diclofenaco; GBF, gemfibrozil; IND, indometacina; SMX,
sulfametoxazol) antes y después del tratamiento con Trametes
máxima.
Figura 2. Presencia de fármacos (BZF, bezafibrato; DCF,
diclofenaco; GBF, gemfibrozil; IND, indometacina; SMX,
sulfametoxazol) antes y después del tratamiento con Pleurotus sp.
Relacionando la tendencia observada en los datos de
actividades enzimáticas obtenidos (Figura 1) y las eficiencias
de remoción de fármacos (Tabla 2), de las tres especies de
hongos, se aprecia una relación directa entre la actividad de
manganeso peroxidasa con el porcentaje de remoción de los
2º Congreso Nacional AMICA 2015
fármacos y no con la actividad de la lacasa, es decir en el
experimento donde se obtuvo mayor actividad de managaneso
peroxidasa y por ciento de remoción fue con Trametes
Maxima, seguido por Pleurotus sp. y por último con
Pycnoporus sanguineus. Cuando se compara la actividad de
la lacasa con los porciento de remoción de los fármacos no
existe una tendencia, lo que sugiere que la enzima que
interviene directamente en el proceso de oxidación de los
fármacos es la manganeso peroxidasa.
Conclusiones
Quinn, B., Gagné, F., & Blaise, C. (2008). An
investigation into the acute and chronic toxicity of eleven
pharmaceuticals (and their solvents) found in wastewater
effluent on the cnidarian, Hydra attenuata. Science of The
Total Environment , 389 (2-3), 306-314.
Raldúa, D., André, M., & Babin, P. J. (2008). Clofibrate
and gemfibrozil induce an embryonic malabsorption syndrome
in zebrafish. Toxicology and Applied Pharmacology , 228,
301-314.
Trametes máxima tiene la cualidad de producir un extracto
enzimático con la capacidad de degradar eficientemente
diclofenaco
(90.20%),
sulfametoxazol
(72.62%)
e
indometacina (60.72%) en la condiciones de cultivo
establecidas durante el desarrollo experimental de este trabajo.
Santos, L. H., Araújo, A. N., Fachini, A., Pena, A.,
Delerue-Matos, C., & Montenegro, M. C. (2010).
Ecotoxicological aspects related to the presence of
pharmaceuticals in aquatic environment. Journal of
Hazardous Materials , 175, 45-95.
El bezafibrato y gemfibrozil,
muestran mayor
recalcitrancia en la oxidación por enzimas lignolíticas.
Sirés, I., & Enric, B. (2012). Remediation of water
pollution caused by pharmaceutical residues based on
electrochemical separation and degradation technologies: A
review. Environment International , 40, 212-229.
Existe una relación entre la actividad de manganeso
peroxidasa y la remoción de bezafibrato, diclofenaco,
gemfibrozil, indometacina y sulfametoxazol en cultivos de las
especies de hongos Trametes maxima, Pleurotus sp. y
Pycnoporus sanguineusen.
U.S. Environmental Protection Agency . (2007). Method
1694: Pharmaceutical and Personal Care Products in Water,
Soil, Sediment, and Biosolids by HPLC/MS/MS. Washington
D.C.
Referencias
Chan-Cupul, W., Heredia-Abarca, G., RodríguezVazquez, R., Salmones-Blazquez, D., Gaitán-Hernández , R.,
& Alarcón-Gutiérrez, E. (2014). esponse of ligninolytic
macrofungi to the herbicide atrazine: dose-response bioassays.
Revista Argentina de Microbiología , 46 (4), 348-357.
López-Doval, J. C., Kukkonen, J. V., Rodrigo, P., &
Muñoz, I. (2012). Effects of indomethacin and propanolol on
Chironomus riparius and Physella (Costatella) acuta.
Ecotoxicology and Environmental Safety , 78, 110-115.
Auriol, M., Filali-Meknassi, Y., Adams, C., Tyagu, R.,
Noguerol, R., & Piña, B. (2008). Removal of estrogenic
activity of natural and synthetic hormones form municipal
wastewater: Efficiency of horseadish peroxidase and laccase
from Trametes versicolor. Chemosphere, 70 (3), 445-452.
Ganzenko, O., Huguenot, D., van Hullebusch, E. D.,
Esposito, G., & Oturan, M. A. (2014). Electrochemical
advanced oxidation and biological processes for wastewater
treatment: a review of the combined aproaches. Environ Sci
Pollut Res , 21, 8493-8524.
Haroune, L., Saibi, S., Bellenger, J. P., & Cabana, H.
(2014). Evaluation of the efficiency of Trametes hirsuta for
the removal of multiple pharmaceutical compounds under low
concentrations relevant to the environment. Bioresource
Technology , 171, 199-202.
Miège, C., Choubert, J., Ribeiro, L., Esusèbe, M., &
Coquery, M. (2009). Fate of pharmaceuticals and personal
care products in wastewater treatment lants – Conception of a
database and first results. Environmental Pollution , 157(5),
1721-1726.
Urrea, M., Pérez-Trujillo, M. V., & Caminal, G. (2009).
Ability of white-rot fungi to remove selected pharmaceuticals
and identification of degradation products of ibuprofen by
Trametes versicolor. Chemosphere , 74, 465-772.
Zhang, Y., & Geiβen, S. (2010). In vitro degradation of
carbazepine and diclofenac by crude lignin peroxidase.
Journal of Hazardous Materials , 176, 1089-1092.