citocinas como ayuda diagnostica en aborto espontaneo recurrente

CITOCINAS COMO AYUDA DIAGNOSTICA EN ABORTO ESPONTANEO
RECURRENTE DE CAUSA INMUNOLOGICA
YOLIMA IBETH GALEANO SANCHEZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
ESPECIALIZACION EN INMUNOLOGIA CLINICA
BOGOTA
2005
1
CITOCINAS COMO AYUDA DIAGNOSTICA EN ABORTO ESPONTANEO
RECURRENTE DE CAUSA INMUNOLOGICA
YOLIMA IBETH GALEANO SANCHEZ
MONOGRAFIA
DIRECTOR:
ELSA CRISTINA GOMEZ S.
BACTERIOLOGA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
ESPECIALIZACION EN INMUNOLOGIA CLINICA
BOGOTA
2005
2
Firma de aceptación:
_________________________________________
Bogotá 11 de Noviembre 2005
3
DEDICATORIA
A Dios por ayudarme en cada momento de mi existencia y por permitirme
alcanzar una nueva meta.
A mis padres por su comprensión
e incansable dedicación, esfuerzo y
tolerancia para el éxito de una etapa más de mi vida
A mi esposo y mi hijo por su comprensión y por ser el soporte de un triunfo
más en mi vida.
4
AGRADECIMIENTOS
A medida que se fue elaborando el presente trabajo, surgieron innumerables
inquietudes, dudas y satisfacciones, cada una de ellas con diferente grado de
importancia, por eso de manera muy especial un sincero agradecimiento a
ELSA CRISTINA GOMEZ por su orientación, objetividad, por sus valiosos
aportes, por su tiempo y por la confianza depositada.
5
CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCION
10
1.
RESUMEN
12
2
PROBLEMA
13
3
JUSTIFICACION
14
4
OBJETIVOS
15
4.1
OBJETIVO GENERAL
15
4.2
OBJETIVOS ESPECIFICOS
15
5
MARCO TEORICO
16
5.1
GENERALIDADES
16
5.1.1
Respuesta inmune y células CD4+
16
5.1.2
Células Presentadoras de Antígeno
17
5.2
CITOCINAS
19
5.2.1
Historia de las citocinas
19
5.2.2
Citocinas involucradas en la polarizaciòn de la respuesta del 20
linfocito CD4+
5.2.3
Patron de citocinas Th1 y Th2
22
5.3
ABORT0 RECURRENTE
23
5.4
INMUNOLOGÌA EN EL EMBARAZO
25
5.4.1
Mecanismo de inmunoregulación durante el embarazo
25
5.4.2
Células inmunes
25
5.4.3
Interacción entre el feto y la madre
26
5.4.4
Paradigma Th1-Th2 en el embarazo
27
5.4.5
Citocinas pro inflamatorias
36
5.4.6
Producción de citocinas en la decidua
37
5.4.7
Polimorfismo del gen de las citocinas
37
5.4.8
Otras citocinas
38
5.5
MOLECULAS CMH
38
5.5.1
Expresión de HLA en células del trofoblasto
39
5.6
POSIBLES
MECANISMOS
EN
6
EL
FRACASO
DEL 40
EMBARAZO
5.6.1
Activación de células Natural Killer
5.6.2
Efecto directo de las citocinas
40
en el crecimiento y función 41
celular del trofoblasto
5.6.3
La activación de eventos trombòticos
42
5.7
FALLA EN LA IMPLANTACIÓN Y AUMENTO DE Th1
42
5.8
DIAGNOSTICO DE CITOCINAS
43
6
CONCLUSIONES
45
7
RECOMENDACIONES
46
BIBLIOGRAFIA
47
7
LISTA DE FIGURAS
pág.
Figura 1a
Concentración
estimulación
de
citocinas
Th2
producida
por
de células mononucleares de sangre
periférica a las 24 horas de cultivo
Figura 1b
Concentración
estimulación
de
citocinas
30
Th2
producida
por
de células mononucleares de sangre
periférica a las 96 horas de cultivo.
Figura 1c
Concentración
estimulación
de
citocinas
31
Th1
producida
por
de células mononucleares de sangre
periférica a las 24 horas de cultivo.
Figura 1d
Concentración
estimulación
de
citocinas
31
Th1
producida
por
de células mononucleares de sangre
periférica a las 96 horas de cultivo
8
32
LISTA DE TABLAS
pág.
Tabla No.1
Proporción de citocinas Th1:Th2 producidas por
células
mononucleares
de
sangre
periférica
estimuladas con mitògenos
Tabla No.2
33
Proporción de citocina Th1:Th2 en el primer trimestre
de embarazo normal y en mujeres con aborto
recurrente inexplicable
9
34
INTRODUCCION
El aborto espontáneo es la complicación más común del embarazo. Los
abortos espontáneos recurrente ( AER ) se definen como la perdida de tres o
mas embarazos antes de la semana 20 de gestación y ocurre en 3 de 1000
mujeres con embarazo. La etiología de abortos espontáneos recurrentes puede
ser
debida
a
anormalidades
genéticas,
anatómicas,
endocrinas
e
inmunológicas. (Catarina, 2001)
Recientes estudios han demostrado que factores inmunológicos juegan un
papel importante en el establecimiento de un embarazo exitoso. Se piensa que
la inmunología de la reproducción esta activa durante el reconocimiento del
embarazo por el sistema inmune materno, que permite una respuesta celular,
de anticuerpos o citocinas que protegen el autoinjerto fetal (Prigoshin ,2004)
Existen muchas evidencias que las citocinas son un importante mediador
bidireccional entre el sistema inmune materno y el sistema reproductivo durante
el
embarazo, las citocinas pueden
facilitar o impedir el establecimiento y
mantenimiento del embarazo normal
por modulación del sistema inmune.
(Makhseed, 2000) (Prigoshin ,2004)
El estudio de las citocinas en la interfase materno fetal muestran que citocinas
pro inflamatorias Th1 pueden ser perjudiciales para el embarazo, mientras que
citocinas Th2 parecen ser beneficiosas frente a la protección del feto,
(Prigoshin, 2004) en esta revisión se busca conocer cuales citocinas están
implicadas en la perdida del embarazo y su ayuda diagnóstica
EL inmunoensayo enzimático (ELISA) de captura, ha sido utilizado para la
detección de citocinas en suero, sugiriendo la estandarización en cada
10
laboratorio con el uso de estándares de concentraciones conocidas, de manera
que cada investigador puede determinar los valores normales en la población
escogida y en la muestra biológica utilizada, en este caso el suero.
Las citocinas que se encuentran principalmente alteradas en AER, son el INFγ,
FNT α, IL-2, IL-4, IL-6 e IL-10. Sería entonces de gran importancia comparar
los perfiles de citocinas Th1 y Th2, en grupos de personas con embarazo
normal y abortadoras recurrentes.
11
1. RESUMEN
El aborto recurrente es definido como la pérdida de tres o más
embarazos
consecutivos durante el primer trimestre de embarazo, se ha sugerido que la
pérdida repetida del embarazo es multifactorial, y puede dividirse en causas
embriológicas ( debido principalmente a un cariotipo embrionario anormal)
causas maternas , que afectan el endometrio y/o desarrollo de la placenta,
causa hormonales y en la mayoría de casos a causas desconocidas.
Se ha sugerido que esta proporción de pérdidas del embarazo pueden ser
debidas a
causas inmunes. Para determinar esta causa se han realizado
estudios en mujeres no embarazadas, en mujeres con embarazo normal y
mujeres con abortos recurrentes para determinar la si la causa podría ser
debido a alteraciones en la producción de citocinas
La supervivencia del feto parece depender significativamente de la modulación
de la respuesta inmune para evitar que ocúrrale rechazo, si se tienen en cuenta
que una apropiada reacción inmune puede también afectar el desarrollo de el
limite fetoplacental. Previamente ha sido demostrado que la producción de un
perfil de citocinas Th1 esta relacionado con pérdida del embarazo y las
citocinas Th2,
están asociadas con el desarrollo de un embarazo normal,
determinando así que la producción de citocinas durante el embarazo pueden
predecir el éxito o la perdida del embarazo.
12
2. PROBLEMA
El embarazo ha sido referido como el único alotransplante natural. En las
placentas de mamíferos, el embarazo involucra la asociación estrecha de
tejidos desde dos individuos genéticamente diferentes, madre y feto. ( Kelvin,
2000)
El aborto ha sido descrito como la complicación más común que afecta el
embarazo. Ha sido estimado que cerca del 60% de todas las concepciones
fallan y un 15% de ellas fallan antes de la semana doce ( Kelvin, 2000;
Hayakawa, 2000)
Es reconocido que la modulación del sistema inmune materno es requerido
para establecer y mantener el embarazo.( Hayakawa, 2000)
Existen estudios que han sugerido que durante el embarazo normal la
respuesta inmune materna se polariza de una respuesta Th1 a una respuesta
Th2; por lo tanto un aumento en la respuesta Th1 es asociada con la pérdida
del embarazo por causa inmunológica. (Hayakawa, 2000)
13
3. JUSTIFICACION
El sistema inmune materno presenta ciertos mecanismos para mantener la
tolerancia materna frente al feto, y así permitir el desarrollo normal del
embarazo. Uno de los mecanismos es el predominio
de una respuesta
humoral y no celular. ( Hayakawa, 2000; Bulla, 2004)
Los linfocitos T CD4+ se subdividen en dos clases, linfocitos T ayudadores
(Th1 y Th2), basados en la secreción de citocinas. Las células Th1 producen
interleucina 2 (IL-2) Interferón gama ( IFN- γ), factor de necrosis tumoral (TNF)
y linfoquinas que inducen una citotoxicidad severa y una reacción inflamatoria
(Hayakawa, 2000)
Las células Th2 secretan IL-4, IL-5, IL-6, e Il10 y promueven la `producción de
anticuerpos por los linfocitos B. ( Hayakawa, 2000)
Se ha propuesto que un embarazo normal de mamíferos es considerado un
fenómeno dominante por Th2, que entre otras cosas fomenta la vascularización
uterina y el apropiado flujo sanguíneo para una adecuada función placentaria,
mientras que la respuesta Th1 es considerada que produce una reacción de
rechazo contra el aloinjerto ( Kelvin, 2000)
Teniendo en cuenta la asociación de aumento en la respuesta Th1 y la pérdida
del embarazo por causa inmunológica, en esta revisión se pretende determinar
cuales son las citocinas mas involucradas que promueven abortos espontáneos
y su posible ayuda diagnóstica. ( Kelvin, 2000)
14
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Determinar cuales son las citocinas que se aumentan en mujeres con aborto
espontáneo recurrente de causa inmunológica y su utilización como ayuda
diagnóstica
4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
- Conocer el perfil de citocinas producido en mujeres con embarazo normal y
mujeres con abortos espontáneos recurrentes
- Conocer cuales son las citocinas aumentadas en abortos recurrentes, el
método de detección y su aplicación clínica.
15
5. MARCO TEORICO
5.1 GENERALIDADES
El sistema inmune es altamente complejo y ha evolucionado para proteger al
huésped contra muchas formas de enfermedad por medio de una respuesta
protectora apropiada que limita el daño potencial hacia el huésped. La teoría
del reconocimiento de lo propio y lo extraño ha sido modificada ya que el
rechazo a transplantes de órganos ataca la hipótesis de lo propio, esta teoría
en su forma más simple no explica el fenómeno de rechazo de un transplante
natural como es el caso del embarazo,
esta teoría
llego a tener algunas
modificaciones que requerían la explicación de la falla del embarazo o rechazo
inmunológico dirigido contra el feto que expresa los genes paternos que llegan
a ser extraños para la madre. ( Entrican, E., 2002).
Varias posibles aclaraciones fueron propuestas: un privilegio inmunológico en
el útero, inmadurez antigénica del feto, inmunosupresiòn materna durante el
embarazo, diversidad genética de la población, estas también han sido
reevaluados entre el contexto de el modelo de “lo propio” que se amplia con el
conocimiento sobre las citocinas, actividad de las células natural killer (NK) y
los mecanismos de tolerancia periférica de células T (Entrican, E., 2002)
5.1.1 Respuesta inmune y células CD4+ En la repuesta inmune participan
gran variedad de células y componentes del sistema inmune. En la respuesta
inmune adaptativa los linfocitos CD4+ son críticos para determinar el tipo de
respuesta que se genera. (Rugeles, 2004)
Estudios realizados en modelos murinos han identificado distintos subgrupos
de clonas de linfocitos T CD4+, con respuestas funcionales diferentes y un
perfil particular de producción de citocinas. Estas clonas representan las
16
células efectoras terminales diferenciadas conocidas como células Th1 Y Th2,
durante la respuesta a un tipo particular de antígeno se inicia una serie de
eventos que conducen a la polarización de la respuesta, hacia un patrón de
respuesta tipo Th1 o Th2, lo cual dependerá de la vía de ingreso y localización
de dicho antìgeno. (Rugeles, 2004)
Estudios realizados para determinar el mecanismo de inducción de un patrón
Th1 o Th2 son contradictorios, algunos sugieren que dosis altas de Ag
favorecen respuestas Th2, mientras que dosis bajas favorecen una respuesta
Th1. Otros estudios encontraron que la diferencia podría radicarse en el tipo
de Ag, la mayoría de reportes en los cuales dosis bajas de Ag inducen una
respuesta Th1 utiliza Ag particulados como inmunògeno, mientras que bajas
dosis de proteínas solubles parecen inducir una respuesta Th2 (Rugeles, 2004)
El TCR reconoce péptidos unidos al Complejo Mayor de Histocompatibilidad
(CMH), lo cual desencadena una serie de eventos de señalización intracelular,
entre ellos la fosforilación
de diferentes proteínas
que conllevan a la
proliferación celular y a la generación de células efectoras, la afinidad con que
un péptido se une a la molécula del CMH tiene influencia sobre la calidad y
cantidad de señal que recibe un linfocito T por su TCR y que, dependiendo de
la naturaleza de esta señal se genera un patrón Th1 o Th2 (Rugeles, 2004)
Para que el
LT
se active de forma optima en respuesta a un Ag, el
reconocimiento de complejos CMH/péptido por el TCR debe estar acompañado
por una segunda señal. Esta señal proporcionada por las moléculas
coestimuladoras, presentes en la célula presentadora de antìgenos (CPA), son
indispensables para aumentar la fuerza de la señal, entre estas moléculas
están: CD80, CD86, CD28, CTLA4 ,ICOS ,OX40L, OX40, LFA-1, ICAM
(Rugeles, 2004)
5.1.2 Células presentadoras de antígeno
(CPA)
Las CPA son
indispensables para la activación del LT; proporcionan la primera señal de
17
activación
por medio del CMH-péptido y la segunda señal gracias a las
moléculas
coestimuladoras.
Adicionalmente
se
ha
encontrado
que
dependiendo del tipo de CPA que activa al LT CD4+, ocurre la diferenciación
de la respuesta de estas células hacia un patrón Th1 o Th2 (Rugeles, 2004)
Células dendríticas
Las células dendríticas (CD) son consideradas
las CPA más eficientes y por lo tanto constituyen las principales centinelas del
sistema inmune. Se pueden diferenciar dos tipos de precursores de CD en
circulación: células dendríticas mieloides (CDM) y células dendríticas
plasmocitoides (CDP), también conocidas como CD1 y CD2 respectivamente.
Estos dos tipos de CD, parecen ejercer diversas formas de control que influyen
en la diferenciación del LT CD4+. Inicialmente estudios in vitro sugirieron que
los LT CD4+ vírgenes al interactuar con las CDM secretan grandes cantidades
de IFNγ y bajos niveles de IL4, IL5 e IL 10; en contraste los LT CD4+ al
interactuar con CDP secretan bajas cantidades de IFNγ y grandes cantidades
de IL4, IL5 e IL 10; si embargo, la asociación de CD1 con patrón Th1 y de CD2
con patrón Th2 no ha sido consistente en todos los estudios realizados.
(Rugeles, 2004)
El hecho de que el mismo linaje de CD tenga la capacidad de polarizar la
respuesta sea hacia un patrón Th1 o Th2 permite que se induzca la respuesta
adecuada de acuerdo a las circunstancias en que se haya desarrollado el
proceso de activación del LT. Evidencia reciente señala que el grado de
maduración y de activación de la célula CD y la naturaleza de la señal que
indujo su maduración es fundamental en el papel que estas células pueden
tener en el proceso de diferenciación de los LT. Las células CD inmaduras, en
particular las CD1, secretan grandes cantidades de IL12, citoquina que induce
el desarrollo de células Th1. la maduración de estas células se caracteriza por
una perdida gradual en la capacidad de producir esta citoquina lo que
favorecería el desarrollo del patrón Th2, esto claramente indica que las CD
pueden tener un efecto o fusión diferente en el proceso de especialización de la
respuesta inmune dependiendo de su estado de maduración. (Rugeles, 2004)
18
Linfocitos B
Los LB, aunque de una manera menos eficiente, tienen la capacidad de
presentar Ag a los LT. Diferentes estudios han mostrado que la inmunización
con Ag proteicos en ausencia de LB, induce la activación de células Th1.
Consistente con estos resultados, estudios in Vitro han mostrado que las
clonas Th2 son estimuladas por los LB, mientras que las clones Th1 son
activadas óptimamente por macrófagos (Rugeles, 2004
5.2 CITOCINAS
5.2.1 Historia de las citocinas
La idea de que factores celulares pueden
controlar actividades biológicas fue sugerida, en principio,
por los
experimentos de Rich y Levis en 1932, en los años 60, la demostración de que
factores
celulares solubles, generados in Vitro en el medio de cultivo de
linfocitos sensibilizados incubados con antìgeno, eran mitogénicos para los
linfocitos y podían causar la inhibición de la migración de los macrófagos,
sugirió que determinados mediadores moleculares estaban involucrados en la
respuesta celular inmune. En la década de los 70, apareció el termino linfocina,
para describir un largo número de actividades biológicas producidas por el
medio de cultivo de linfocitos. El desarrollo de los avances técnicos de los 80,
permitió la caracterización bioquímica de estos factores. (Rugeles, 2004)
Si bien las células T y los macrófagos son los productores más importantes,
parece evidente que otras células también
pueden producirlas, por ello el
término linfocina fue ampliado al de citocina. Además las citocinas no son solo
importantes en la respuesta inmune, sino también en otros procesos
fisiológicos incluyendo la reproducción. (Rugeles, 2004)
19
5.2.2 Citocinas involucradas en la polarización de la respuesta del
linfocito CD4+
Se considera el microambiente de citocinas como el principal factor inductor de
la polarizaciòn de la respuesta de LT CD4+. Inicialmente se identificaron las
citocinas IFNγ e IL-12 como las principales inductoras de Th1, mientras que el
perfil Th2 es inducido por la I-L4. sin embargo, evidencia reciente sugiere que
otras citocinas como la IL-18, IL-23 y la IL-27 determinan de manera importante
el desarrollo del patrón Th1. Estudios in Vitro e in vivo han demostrado que el
tiempo que transcurre entre la activación y la diferenciación de las clonas Th0
en alguno de los fenotipos efectores es muy corto, por tanto para que las
citocinas tengan influencia en el desarrollo de un fenotipo particular de
respuesta inmune se requiere que estas moléculas estén presentes durante el
proceso de presentación antigénica a los LT. (Rugeles, 2004)
IL12 es una citoquina inmunoreguladora, producida principalmente por
monocitos, macrófagos y CD, cuya expresión depende de factores como el
factor de respuesta al interferón 1 (IRF-1), al igual que de otros miembros de
esta familia de factores de transcripción. (Rugeles, 2004)
Estudios iniciales que examinaban la influencia de las citocinas en la
diferenciación de la respuesta de LT CD4+ resaltaron la importancia de la IL-12
en el desarrollo de clonas Th1, sin embargo, existe evidencia tanto in Vitro
como in vivo que muestran el desarrollo de clonas Th1, aun en ausencia de IL12. se ha propuesto que la IL-12 puede no ser requisito indispensable para
iniciar el proceso de diferenciación de clonas Th1. (Rugeles, 2004)
IFN-γ es una citoquina pleiotrópica que juega un papel esencial tanto en la
respuesta inmune innata como en la adquirida. Las células NK, NKT, LT CD8+
son las principales fuentes de
esta citocina, aunque otras células como
macrófagos, LB e inclusive LT vírgenes pueden llegar a ser fuente importante
en ciertos procesos infecciosos. El papel esencial de esta citocina es la
20
activación de macrófagos: aumenta su capacidad de fagocitar, regula
positivamente la expresión del CMH clase I y II, aumenta la producción de IL-12
(Rugeles, 2004)
IL-18 es una citocina que es miembro de la familia de IL-1 y es producida
principalmente por macrófagos y CD. Esta citocina no es esencial para el
proceso de diferenciación Th1 pero si tiene un efecto en el desarrollo de células
efectoras Th1 ya que optimiza la producción de IFN-γ, favoreciendo las
respuestas inflamatorias. (Rugeles, 2004)
IL-23 es secretada principalmente por CD activadas y tiene funciones muy
similares a la IL-12. Esta citocina no esta involucrada en el proceso inicial de
diferenciación de clonas Th1 pero si participa en mantener la producción de
IFN-γ en las etapas posteriores al desarrollo del LT (Rugeles, 2004)
IL-27 . Esta citocina es producida principalmente por células como monocitos,
macrófagos y CD, comparte varias características de la IL-12 y la IL-18. induce
la diferenciación
y proliferación
de células efectoras Th1 al actuar
sinergicamente con la IL-12 para potenciar la producción de IFN-γ, (Rugeles,
2004)
IL-4 es producida por las células NKT, basófilos y mastocitos, durante la fase
temprana de la respuesta inmune y por células Th2 diferenciadas, es una
citocina clave en el proceso de diferenciación de células Th2. (Rugeles, 2004)
IL-10 es sintetizada principalmente por macrófagos y su función primordial es
regular negativamente la función de estas células fagocíticas; durante la
respuesta inmune, la IL-10 actúa como regulador negativo, permitiendo que
una vez se haya erradicado el Ag, las células del sistema inmune vuelvan a un
estado de reposo. La regulación negativa ocurre mediante la inhibición de la
producción de citocinas por parte del macrófago, particularmente de IL-12,
TNF-α e IFN-γ, lo cual conduce a que se inhiba la expresión de moléculas
21
coestimuladoras y del CMH. Por esta razón aunque se ha reportado que esta
citocina promueve el desarrollo de un patrón Th2, su papel parece estar mas
dirigido a suprimir el desarrollo de clonas Th1. (Rugeles, 2004)
5.2.3 Patrón de citocinas Th1 y Th2 Las citocinas han sido divididas según
la familia inmune de células
provocan, los linfocitos T
principales
que las origina
y en los efectos que ellas
CD4+ CD3+ o células
T-ayudadoras son las
células inmunes productoras de citocinas y se subdividen en
poblaciones T-ayudadoras 1 (Th1) y células T ayudadoras 2 (Th2) según el
perfil de citocinas producido. Las células Th2 selectivamente producen IL-4, IL5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13, estas están
involucradas en el desarrollo de
inmunidad humoral contra patógenos extracelulares pero pueden inhibir varias
funciones de células fagocíticas. (Ho, 2001 Rezaei, 2002 Laird 2003 Kwak,
2003)
En contraste las células Th1 producen
interferón -γ ( IFNγ ), interleukina 2 (
IL-2 ) y factor de necrosis tumoral- β ( TNF β), (, Rezaei, 2002, Laird 2003), en
otros estudios se ha encontrado factor de necrosis tumoral α ( TNFα),.(Kwak,
2003) estas citocinas están involucradas
en la respuesta inmune mediada
por células ((Ho, 2001, , Rezaei, 2002, Laird, 2003)
Las
células T–ayudadoras 0 (Th0); son las células precursoras y
convertirse a células
Th1 o Th2 y producen citocinas
como el
pueden
factor de
necrosis tumoral α (TNF α) y factor estimulante de colonias monocìtico
granulocìtico (GM-CSF) ( Laird, 2003)
Una familia extensa de citocinas son pro-inflamatorias, como la IL-1, TNFα, IL6 y el factor inhibitorio de leucemia (LIF); éstos son
producidas
por los
macrófagos y están envueltos en los eventos de inflamación asociados con el
daño y reparación de los tejidos. Se conoce que estas citocinas también son
producidas por otras células diferentes al sistema inmune como son células del
epitelio , células del estroma del endometrio , células de la decidua y células
22
del citotrofoblasto de la placenta y esto es importante porque las citocinas
tienen un papel potencial en el fracaso de la reproducción, como las células
T-ayudadoras son una población pequeña de células dentro del endometrio
secretor y en el tejido de la placenta durante el primer trimestre de embarazo,
no pueden ser la fuente principal de citocinas presentes en la unión feto –
placenta. ( Laird, 2003)
5.3 ABORT0 RECURRENTE
El aborto recurrente es definido como la pérdida de tres o más
embarazos
consecutivos durante el primer trimestre de embarazo, antes de la semana 20
de gestación, este afecta
aproximadamente 2% de la población, en edad
reproductiva (Regan, 2000, Rezaei, 2002, Kwak, 2003)). Algunos estudios
incluyen a las mujeres con sólo dos abortos. ( Li, 2002)
El aborto espontáneo es la causa más común de falla en el embarazo y
corresponde a un 20% de los abortos detectados. El riesgo de un siguiente
aborto después de una pérdida espontánea es cerca del 24% y del 26%
después de 2 abortos y del 32% después de 3 perdidas consecutivas. Las
mujeres que han tenido 3 abortos espontáneos consecutivos, tienen un 68% de
probabilidades de tener un embarazo exitoso según el estudio realizado en el
2001 por Makhseed. (Makhseed, 2001)
La causa de pérdida repetida del embarazo es multifactorial, y puede dividirse
en causas embriológicas ( debido principalmente a un cariotipo embrionario
anormal)
causas maternas , que afectan el endometrio y/o desarrollo de la
placenta (Aplin, 2000) y causa hormonales aunque mas del 60% de los casos
son de causa desconocida. (Kwak, 2003)
Las causas por
defectos maternos incluyen
problemas de coagulación,
enfermedades autoinmunes , desordenes endocrino y endometriales (Regan,
2000).La etiología
del aborto recurrente es en el 50% de los casos
23
desconocida, pero se ha postulado que esta proporción de pérdidas del
embarazo pueden ser debidas a causas inmunes. Es probable que exista más
de una causa
inmunitaria que pueda influir en una respuesta del sistema
inmune de la madre, o el reconocimiento de los antìgenos paternos. El principal
problema es entonces entender la etiología de los mecanismos por los cuales
el feto es protegido por el sistema inmune materno durante el embarazo
normal. ( Laird, 2003)
Existe evidencia considerable de la presencia de un
sistema inmunológico
especializado dentro de la placenta (la decidua) que se sugiere tiene un papel
muy
importante
en
este
proceso
inmunológicas han sido reportadas
(Laird,2003)
Varias
anormalidades
en mujeres con abortos espontáneos
recurrentes de etiología conocida como anormalidades autoinmunes, tales
como
anticuerpos
antifosfolípido
positivo,
anticuerpos
antinucleares,
anticuerpos anti-tiroglobulina y anticuerpos antimicrosomales. (Kwak,. 2003)
Se han propuesto
algunos modelos para el estudio de abortos recurrente
ocurridos muy a menudo durante el primer trimestre, antes de la semana 13
de embarazo, cuando tiene lugar la formación de la placenta , y ha ocurrido
perdida del embarazo (Laird, 2003) Obtener tejido de la placenta en este
momento en el embarazo humano normal no es posible, y por consiguiente
los mecanismos de desarrollo anormal del embarazo son difíciles de estudiar,
por esto se han adoptado varios acercamientos alternativos para estudiar el
papel
de las células inmunes y las moléculas en la etiología del aborto
recurrente. Éstos incluyen el análisis de poblaciones celulares inmunes y
citocinas en:
•
La sangre periférica de mujeres que han sufrido abortos recurrentes,
mujeres en el momento del aborto y mujeres fértiles antes del embarazo
( Raghupathy, 2000, Laird 2003)
24
•
Tejido endometrial obtenido
de mujeres con abortos recurrentes y
mujeres fértiles normales durante el periodo de peri-implantación y en
el estado de no embarazada (Lim, 2000; Von, 2000, Laird 2003)
•
Tejido placentario obtenido en el momento del aborto de mujeres con
historia de abortos recurrentes, de mujeres con aborto espontáneo,
mujeres que llevan a termino el embarazo y mujeres que piden la
terminación del embarazo normal (Lim, 2000; Von, 2000, Laird 2003)
5.4 INMUNOLOGIA EN EL EMBARAZO
5.4.1 Mecanismo de inmunoregulación durante el embarazo Dentro del
contexto de lo propio se han planteado diversas teorías, que apoyan el éxito del
embarazo: un privilegio inmunológico en el útero, inmadurez antigénica del feto,
inmunosupresiòn materna durante el embarazo, diversidad genética de la
población; esta aceptación o rechazo del feto se amplia con el conocimiento
sobre las citocinas, actividad de las células natural killer (NK) y los mecanismos
de tolerancia periférica de células T (Entrican, E., 2002)
5.4.2 Células inmunes La distribución de células inmunes y la producción de
citocinas
durante el embarazo pueden predecir el éxito o la perdida del
embarazo ( Rezaei, 2002).Se ha estudiado la población de leucocitos en la
decidua humana y el endometrio, y se ha encontrado que es diferente a la
sangre periférica, aunque no existe una diferencia particular entre los linfocitos
B, (Laird, 2003)
La población consiste en tres tipos celulares, las células T, macrófagos y
células natural killer (NK), (.Makhseed, 2001; Rezaei, 2002; Laird 2003;) Estas
células NK difieren de la mayoría de células natural killer encontradas en
sangre periférica ya que la mayoría expresan CD56 y CD38 (conocidas como
células natural killer de útero: uNK) pero no expresan los marcadores clásicos
de célula T o célula natural killer CD3, CD4, CD8, CD16 Y CD57; se puede
25
encontrar una pequeña proporción de células uNK que son similares a las NK
de periferia porque tiene una mínima expresión de CD56 ( Laird, 2003)
El número y proporción de cada tipo celular varían a través del ciclo menstrual
y en el inicio del embarazo. Las células T constituyen aproximadamente el
45% de los leucocitos en el endometrio
y aunque sus números absolutos
permanecen constantes a lo largo del ciclo y al inicio del embarazo, el
número relativo y la proporción de células uNT aumenta. Los Macrófagos
representan aproximadamente el 15 ± 20% de leucocitos del endometrio y se
aumentan ligeramente durante la fase secretora del ciclo y al inicio del
embarazo, constituyendo el 20% de los leucocitos en la placenta al inicio del
embarazo. (Laird, 2003)
El número de
células uNK CD56+ muestran el cambio más grande
dependiente del ciclo menstrual, durante la fase proliferativa del ciclo, el
número es aproximadamente igual
al de las células T, pero en la fase
secretora comprende el 70% de los leucocitos del endometrio y su número
aumenta más durante el inicio del embarazo (Laird, 2003 )
5.4.3
Interacción entre el feto y la madre
En mamíferos la interacción
inmunológica entre el embrión y su madre es considerada un aloinjerto exitoso.
La comunicación entre el limite fetoplacenta y el sistema inmune materno es
esencial para el éxito del embarazo. La supervivencia del feto parece depender
significativamente de la modulación de la respuesta inmune para evitar que
ocúrrale rechazo, teniendo en cuenta que una apropiada reacción inmune
puede también afectar el desarrollo de el limite fetoplacenta. Esto se puede
observar en la respuesta de los LT citotóxicos, su actividad es muy importante
en el rechazo al aloinjerto, y permite la activación de la inmunidad mediada por
células y la producción de citocinas Th1. ( Ho, 2001)
Estudios han demostrado que los linfocitos maternos en la interfase
fetomaterna son activados y producen varias citocinas. De esas citocinas la IL-
26
4 e IL-10 producidas por las células Th2 ayudan a mantener el embarazo,
mientras que citocinas Th1 como el FNT-α y IFN-γ y la IL-2 son perjudiciales
para el desarrollo fetal y causan falla en la reproducción en ratones y humanos
(Ho, 2001)
La unión feto-placenta trae como
consecuencia
que el sistema inmune
materno en el embarazo sea fortalecido por una respuesta de tipo Th2 con
una disminución de la respuesta inmune celular Th1.Se ha observado que las
células T CD56+ CD3+, secretan IL-4, una condición dominante que marca el
predominio de células Th2, importante para el mantenimiento del embarazo
(Ho, 2001)
5.4.4. Paradigma
Th1- Th2
en el embarazo
Estudios en roedores
realizados por Thomas Wegmann durante la década de los 90`s han
proporcionado evidencia de que los embarazos exitosos están asociados con
un perfil de citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-6 IL-10 e IL-13 ) y que las citocinas Th1
(IL-2, IFN-γ y TNF-β ) son perjudiciales para el embarazo, esto permite a el feto
mediar por si mismo el sistema inmune materno, hacia la producción de
citocinas Th2, el cual también influye en el desarrollo del limite fetoplacenta (
Raghupathy, 2000; Ho, 2001; Makhseesd, 2001 )
Se ha demostrado bajo estimulación mitógena de células mononucleares de
sangre periferica ( PBMC) obtenidas en el momento del parto de mujeres con
embarazos normales y de mujeres con historia de abortos recurrentes que la
producción de citocinas Th2 es significativamente más alta en mujeres con
embarazos normales comparado con mujeres abortadoras
En humanos elevadas concentraciones de citocinas Th1 como IL-2 e IFN-γ y la
disminución de las concentraciones de citocinas Th2 como IL-10 han sido
reportadas en abortos espontáneos por la activación antigénica de células
PBMC. La activación de PBMC por antìgenos trofoblàsticos seguido por el
27
análisis de citocinas muestran que mujeres con abortos recurrentes
espontáneos tiene un perfil tipo Th1. (Makhseesd, 2001)
El feto parece no estar atacado por la inmunidad humoral excepto por los
anticuerpos antifosfolìpidos que representan no solo una causa mediada por
anticuerpos para la pérdida del embarazo.
Al contrario La inmunidad celular mediada por células efectoras y/o citocinas
liberadas por ellas, tienen efectos significativamente perjudiciales sobre el
feto. El TNF-α estimula la muerte programada de las células vellosas del
trofoblasto y el IFN -γ aumenta la muerte del trofoblasto mediada por TNF.
Ambas citocinas inhiben el crecimiento de células del trofoblasto in Vitro.
( Raghupathy, 2.000 ).
El aborto espontáneo en humanos a sido asociado con aumento en la
producción de citocinas
IL-2, e IFN-γ y la disminución de IL-10 en células
mononucleares de sangre periférica.
Las células
Th1 inducen
citotoxicidad mediada por células y reacciones
inflamatorias por IL-2, IFN-γ y TNF-β. Las células Th2 son asociadas con la
provisión de células B para la producción de anticuerpos y citocinas Th2, como
IL-4, IL-5, IL-6, e IL-10.
Previamente ha sido demostrado que un perfil de citocinas Th1 a sido asociado
con pérdida del embarazo y las citocinas Th2, cursan con el desarrollo de un
embarazo normal.
Los
diferentes estudios hechos en grupos de abortadoras recurrentes y
embarazos normales, soportan la presencia de citocinas Th2, en el desarrollo
del embarazo, demostrando las presencia de IL-4, IL-6 e IL-10 principalmente y
de INFγ, TNF α e IL-2 en la pérdida del embarazo.( Laird, 2003, Kwak 2003,
Ho, 2001, Makhseesd, 2001.)
28
Para la demostración del aumento o disminución de estos perfiles de citocinas
se han realizado estudios de ellas en:
Células mononucleares de sangre periférica, extracto de células de trofoblasto,
donde se encontró disminución en las concentraciones de IL-6 e IL-10 y
aumento de concentración de IFN-γ ( Laird, 2003, Kwak 2003); en el
sobrenadante de cultivos de células mononucleares obtenidas de mujeres con
aborto recurrente en el momento del aborto ( Kwak 2003), y finalmente en
células autólogas de la placenta con antígenos trofoblásticos. ( Markhseesd,
2001)
Otros estudios han demostrado altas concentraciones de IL-4 e IL-10
producidas por clones de células obtenidas del infiltrado de células de la
decidua de mujeres con embarazo normal. Comparado con mujeres con aborto
espontáneo recurrente. Esto ha demostrado que existe gran cantidad de IL-4
secretada por células maternas en respuesta al estímulo con leucocitos
paternos comparado con otros leucocitos que no están relacionados; esto
sugiere una selección y desviación inmune específica hacía el perfil Th2 en
mujeres con embarazo normal ( Markhseesd, 2001)
Las células mononucleares
tomadas antes del embarazo en mujeres con
aborto recurrente, producen TNF-α e IFN-γ en respuesta a la estimulación con
extractos celulares del trofoblasto, mientras que en mujeres con historia de
reproducción normal producen una respuesta de IL-10 después de una
incubación con extractos de células de trofoblasto. ( Laird, 2003)
En un estudio realizado por Makheed y colaboradores (2001) para determinar
el medio inmunológico, específicamente las citocinas Th1 y Th2 en un grupo
de mujeres abortadoras las cuales fueron agrupadas como: mujeres
abortadoras recurrentes quienes finalmente habían tenido un embarazo exitoso
(RSA-N), mujeres
abortadoras recurrentes que no lograban el éxito del
embarazo (RSA-A) y mujeres con embarazos normales. La concentración de
29
citocinas en estos grupos de mujeres fue estimada a partir de cultivo de PBMC
obtenidas
en el momento del parto o del aborto y estimuladas con
fitohemaglutinina (PHA) y células autologas de la placenta. (Makhseesd, 2001)
La concentración de citocinas en los cultivos fue determinada a las 24 y 96
horas, donde se pudo concluir que el grupo de mujeres RSA-N produce altas
concentraciones de citocinas Th2 comparado con el grupo RSA-A, pero ambos
grupos presentan
concentraciones mas o menos iguales de citocinas Th1,
figura 1a, b,c y d
Figura 1a. Concentración de citocinas Th2 producida por estimulación de
células mononucleares de sangre periférica a las 24 horas de cultivo. IL:
interleucina, First: primer trimestre de embarazo normal, RSA-A: abortadora
recurrente espontánea que no logra un embarazo exitoso, RSA-N abortadora
espontánea recurrente que logra un embarazo normal, N: embarazo normal
Tomado de M.Makhseed, 2001.Human reproductive. Vol 16, No 10 pp 2219 –
2226
30
Figura 1b. Concentración de
citocinas Th2 producida por estimulación
de
células mononucleares de sangre periférica a las 96 horas de cultivo.
Abreviaturas figura 1-a Tomado de M.Makhseed, 2001.Human reproductive.
Vol 16, No 10 pp 2219 – 2226
31
Figura 1c. Concentración de
citocinas Th1 producida por estimulación
de
células mononucleares de sangre periférica a las 24 horas de cultivo.
Abreviaturas figura 1-a Tomado de M.Makhseed, 2001.Human reproductive.
Vol 16, No 10 pp 2219 – 2226
Figura 1d. Concentración de
citocinas Th1 producida por estimulación
de
células mononucleares de sangre periférica a las 96 horas de cultivo.
Abreviaturas figura 1-a Tomado de M.Makhseed, 2001.Human reproductive.
Vol 16, No 10 pp 2219 – 2226
El estudio realizado con estimulación mitógena indica un aumento del perfil
Th1 en mujeres con amenaza de aborto comparado con mujeres que tienen un
embarazo normal; mientras que estimulación con células de la placenta,
muestra un aumento del perfil Th2 en mujeres con amenaza de aborto quienes
precedieron un embarazo normal, opuesto a las mujeres que finalmente
abortaron, esta conclusión es apoyada por la comparación de la proporción de
citocina Th1:Th2 de la tabla No 1 (Makhseesd, 2001)
32
Tabla 1: Proporción de citocinas Th1:Th2 producidas por células
mononucleares de sangre periférica estimuladas con mitògenos
Proporción
Embarazo
1er trimestre
RSA-N
RSA-A
Th1:Th2
normal
de embarazo
24 horas
6
3
15
195
IL-2:IL-4
6
22
39
150
IL-2:IL-5
0.07
0.05
0.2
0.5
IL-2:IL6
0.7
0.2
2
16
IL-2:IL-10
10
17
41
258
TNFα: IL-4
TNFα: IL-5
10
136
110
198
TNFα:IL-6
0.1
0.3
0.5
0.6
1
1
7
21
11
11
0.1
1
24
65
0.3
4
182
140
0.5
15
TNFα: IL-4
7
2
0.07
0.7
21
8
65
0.2
0.5
96 horas
3
2
0.04
0.06
17
2
1
0.03
0.4
23
25
20
0.4
5
50
TNFα: IL-5
6
10
14
42
TNFα:IL-6
0.2
0.2
.0.4
0.7
2
0.3
4
11
TNFβ: IL-4
27
17
12
51
TNFβ: IL-5
8
10
7
42
TNFβ:IL-6
0.3
0.2
0.2
0.8
3
0.3
2
11
116
35
1
12
67
39
0.9
1
119
73
2
22
176
149
3
38
TNFα: IL-10
IFN: IL-4
IFN:IL-5
IFN: IL-6
IFN:IL-10
IL-2:IL-4
IL-2:IL-5
IL-2:IL6
IL-2:IL-10
TNFα: IL-10
TNFβ: IL-10
IFN: IL-4
IFN:IL-5
IFN: IL-6
IFN:IL-10
Tomado de M.Makhseed, 2001.Human reproductive. Vol 16, No 10 pp 2219 –
2226
33
Es de alta importancia comparar la producción de citocinas de pacientes control
y de pacientes en el mismo estado de gestación , ya que se han encontrado
direfencias estadísticamente significativas en las concentraciones de IL-4, IL-6,
IL-10 e IL-2 en el grupo de mujeres con RSA-A durante el primer trimestre de
embarazo comparado con el grupo control, y esto demuestra que la citocinas
Th1 son producida en mas altas concentraciones por mujeres con historia de
abortos recurrentes espontáneos que mujeres con historia de embarazos
normales durante el primer trimestre.( Raghupathy, 2000) Tabla No.2
Tabla 2 Proporción de
de embarazo normal
inexplicable.
Proporción de
citocina
citocina Th1:Th2 en el primer trimestre
y en mujeres con aborto recurrente
Primer trimestre de
embarazo normal
Aborto
recurrente
espontáneo
24 horas
TNFα: IL-4
3
22
0.05
0.2
8
65
0.2
0.5
17
218
151
0.5
16
203
140
0.5
15
286
TNFα: IL-5
136
198
TNFα:IL-6
0.3
0.6
TNFα: IL-10
1
21
TNFβ: IL-4
1
34
TNFβ: IL-5
9
24
TNFβ:IL-6
0.02
0.08
TNFβ: IL-10
0.08
3
3
2
0.04
0.06
25
20
.04
5
IL-2:IL-4
IL-2:IL-5
IL-2:IL6
IL-2:IL-10
IFN: IL-4
IFN:IL-5
IFN: IL-6
IFN:IL-10
96 horas
IL-2:IL-4
IL-2:IL-5
IL-2:IL6
IL-2:IL-10
34
TNFα: IL-4
67
39
0.9
1
17
178
147
3
38
51
TNFα: IL-5
10
42
TNFα:IL-6
0.2
0.7
TNFα: IL-10
0.3
11
TNFβ: IL-4
17
51
TNFβ: IL-5
10
42
TNFβ:IL-6
0.2
0.7
TNFβ: IL-10
0.3
11
IFN: IL-4
IFN:IL-5
IFN: IL-6
IFN:IL-10
Tomado de Raghupathy,2000 Human Reproductive Vol 25No 3 pp 713 – 718.
Otros estudios han investigado la relación inmune Th1-Th2 por clonas de
células T, específicamente
por la expresión de citocinas
de células T-
ayudadoras CD3+, CD4+ derivados de la decidua de mujeres con abortos
recurrentes y decidua de mujeres que llegan a terminación del embarazo,
también tienen diferencias en la producción de citocinas por Th1 (Kwak, 2003 )
Significativamente bajos niveles de IL-4 e IL-10 fueron producidos por células
CD4+ aisladas de la decidua de mujeres con abortos recurrentes en el
momento del aborto y estimuladas con PMA, y comparados con clones de
células CD4+ aislados de decidua de mujeres que llegaron a término en el
embarazo. La producción de IL-4 por estimulación de clonas de células T
CD8+ también fue significativamente bajo en células de mujeres con abortos
recurrentes comparado con células de mujeres que llegaron a termino con el
embarazo. (Laird 2003 )
Estudios realizados para medir la expresión de citocinas en células T CD3+,
CD3·+/CD8- ( consideradas equivalentes a CD3+/CD4+) o CD3+/CD8+
en
linfocitos de sangre periférica de mujeres con abortos espontáneo recurrente y
mujeres con embarazo normal reflejaron una tendencia de respuesta Th1 por
35
células T que expresaban CD3+/CD8-, pero también
en CD3+/CD8+ en
mujeres con aborto recurrente, lo que sugiere que la proporción de Th1/Th2
en la respuesta inmune es mas importante que la expresión de una sola
citosina (Kwak, 2003 )
Las citocinas actúan localmente
y por consiguiente tiene mas valor
la
concentración medida en la unión feto placenta que las concentraciones en
sangre periférica o medidas antes de la implantación, además se debe tener en
cuenta
que existen interacciones entre las diferentes citocinas y por
consiguiente los niveles de una sola citocina pueden ser la desencadenante de
la respuesta inmune, esto se refleja en las citocinas Th1 y Th2 donde las
concentraciones de cada una de estas citocinas es importante para determinar
la respuesta final (Laird, 2003)
La expresión de mRNA de citocinas Th1 y Th2 en el endometrio de mujeres
fértiles normales y mujeres con aborto recurrente durante la peri-implantación
y las fases del ciclo menstrual también han sido investigado (Lim, 2000). Estos
estudio muestran que pocas mujeres con aborto recurrente tienen niveles
detectables
de IL-6 en su endometrio,
pero niveles
TNFα, IFNγ, IL-2 e IL-12, comparado con
mas detectables de
mujeres fértiles que llegaron a
termino con el embarazo. . (Laird, 2003 )
5.4.5 Citocinas pro inflamatorias
Varios estudios en ratones han hecho
pensar en la importancia de citocinas pro-inflamatorias, principalmente LIF
(factor inhibidor de leucemias) e IL- 11, en el resultado del embarazo exitoso.
La implantación no ocurre en ratones knock, aunque se transfieran blastocitos
homocigotos LIF negativos, el resultado de la implantación en ratones salvajes
es normal y permite el desarrollo del embarazo. La producción de LIF, aparece
como un promotor de la tolerancia materno-fetal y se encuentra reducida en
mujeres con perdida del embarazo.. (Laird, 2003, Varuna, 2005)
36
Ratones hembras con una mutación inactiva o nula para el receptor de la IL-11
de la cadena α son fértiles y la implantación de sus blastocitos estimula una
respuesta decidual inicial, sin embargo formas de decidua pequeña resultan
en la subsecuente degradación y perdida del embarazo ( Laird, 2003 )
La familia de la
IL-1
las proteínas (IL-1a, IL-1b e IL-1ra) también son
importantes en el resultado de un embarazo exitoso Los tres componentes
están presente en el endometrio y la unión feto-placenta y han sido
relacionados con las fases iniciales de la implantación ( Laird, 2003)
Recientemente análisis inmunocitoquimicos han sido usados para comparar la
expresión de IL-1a, IL-1b, LIF e IL6 en el endometrio de mujeres con aborto
recurrente y
de
mujeres fértiles normales,
los análisis de secciones de
endometrio obtenidos durante la fase de peri-implantación de ambos grupos
de mujeres, muestra que aunque algunas IL-1a e IL-1b fueron expresadas por
las células del estroma durante el ciclo de no embarazo, las células
del
epitelios fueron la mayor fuente de citocinas endometriales. Los análisis para
LIF e IL6 mostraron una disminución comparados con secciones de mujeres
fértiles normales( Laird, 2003)
5.4.6 Producción de citocinas en la decidua Un estudio ( Piccinni 2001)
mostró una disminución en la producción de LIF por la decidua por clonas
aislados CD4+ y estimulados con PMA y anticuerpos CD3, de mujeres con
aborto recurrente comparados con clones aislados de la decidua de mujeres
que llegaron al final del embarazo, estos resultados sugieren
que LIF de
decidua pueden ser importantes en la prevención del aborto ( Laird, 2003 )
5.4.7 Polimorfismo del gen de las citocinas Varios estudios han demostrado
que el polimorfismo del gen de las citocinas, influye en la producción de estas y
se asocia con la susceptibilidad a ciertas enfermedades inflamatorias e
infecciosas ( Mrak, 2001). Esto ha iniciado el estudio de la presencia del
polimorfismo del gen de las citocinas en poblaciones de mujeres con abortos
37
recurrentes. En particular, varios reportes han mostrado el polimorfismo en los
genes que codifican las proteínas (IL-1a, IL-1b e IL-1ra) de la familia de la IL-1.
( Laird, 2003)
5.4.8 Otras citocinas Estudios en ratones también han sugerido que GM-CSF
y CSF-1 (también conocido como factor macrófago estimulante de colonias, MCSF), son importantes en el éxito del embarazo. La implantación esta
comprometida con CSF-1 de ratones mutantes (op/op) los cuales tienen una
baja posibilidad de
implantación y viabilidad fetal y ambas pueden ser
restauradas con la administración exógeno de CSF-1: La disminución en la
expresión de mRNA de CSF-1 también se ha relacionado en ratones con
perdidas espontáneas e inducidas del embarazo, comparado con ratones
control; la disminución en la producción de CSF-1 por clonas de células CD4+
obtenidos de la decidua durante el aborto de mujeres con abortos recurrentes y
después estimulados con PMA y anticuerpo CD3 y comparados con clonas
CD4+ aislados de la decidua y estimulados de mujeres que llegaron a termino
con el embarazo ( Piccinni, 2001).
Niveles de TGFβ1 en sangre de mujeres con aborto recurrente en el momento
del aborto también han sido reportados como
elevados significativamente,
tomados en el momento del aborto y comparados con los niveles de
embarazos de mujeres normales, en resumen , niveles de TGFβ1 en mujeres
con historia de
varios abortos consecutivos durante el primer trimestre de
embarazo son 3 veces mas alto que en mujeres control ( Ogasawara , 2000).
En contraste un incremento de los niveles de TGFβ1 en sangre periférica y
una deficiencia de linfocitos en la decidua,
actividad de TGFβ1
produce una
supresión de la
el cual ha sido reportado en mujeres con abortos
recurrentes( Laird, 2003)
5.5 MOLECULAS CMH
38
5.5.1 Expresión de HLA en células del trofoblasto El reconocimiento de
células extrañas ocurre debido a la expresión de moléculas de CMH sobre la
superficie celular, y el sistema materno inmune debería reconocer las células
del trofoblasto como extrañas debido a que ellas expresan moléculas del CMH
paternas. Las células fetales de las extravellosidades del citotrofoblasto no
expresan las moléculas del CMH clase I clásicas
(HLA-A Y HLA-B) ni
moléculas del CMH clase II. En lugar de eso ellas expresan
moléculas no
clásicas HLA-G y HLA-E, aunque con baja expresión de HLA-C ( Le, 2000,
Van, 2000, Laird, 2003)
La expresión de HLA-G es interesante porque está limitado
únicamente a
células del trofoblasto y es expresado especialmente en las células invasoras
del citotrofoblasto extravelloso, células del endotelio vascular fetal y células
amnióticas, y es exacto al de las células que entran en contacto con el sistema
inmune materno. Distinto a otros genes del HLA, el HLA.G muestra una
completa ausencia de polimorfismo en la secuencia de nucleótidos, al medir
esta proteína
es esencialmente igual en toda la población
y por esto el
sistema inmune no reconoce a las células del trofoblasto como extraño En
contraste la ausencia completa de expresión de CMH clase I por el trofoblasto,
puede exponerlas a un ataque por las células NK ( Laird, 2003)
El papel exacto de la HLA-G en la implantación del embrión y el desarrollo
feto-placenta no es claro, se ha visto que la HLA-g esta involucrada en la
adhesión celular lo que sugiere que esta puede tener un papel del blastocito a
las células epiteliales del endometrio.. esta expresión selectiva por células
extravellosas del trofoblasto, las cuales son altamente invasoras del sistema
arterial uterino y reemplazan las células del endotelio de las paredes de los
vasos sanguíneos sugiriendo que este papel es importante en el control de
invasión del trofoblasto. ( Laird, 2003)
39
La expresión disminuida de HLA-G en el tejido citotrofoblasto extravelloso y
endovascular se ha observado
después del aborto comparado con
citofrofoblasto de embarazos sanos. (Laird, 2003)
5.6 POSIBLES MECANISMOS EN EL FRACASO DEL EMBARAZO
Aunque las diferencias en la expresión de varias células inmunes y citocinas
han sido descritas en mujeres con abortos recurrentes, se han postulado tres
mecanismos que tiene un papel importante en la pérdida de embarazos
recurrente:
•
Aumento en la actividad de las
células
uNK y/o macrófagos,
produciendo un ataque e invasión en las células del trofoblasto
•
Acción directa de las citocinas en las células del trofoblasto
•
Acción directa en la vasculatura
produciendo eventos tromboticos,
resultando en la disminución del flujo sanguíneo ( Laird, 2003)
5.6.1 Activación de células Natural Killer El trofoblasto es resistente a la
muerte por linfocitos T citotóxicos convencionales, a células NK y a
macrófagos. Las citocinas tiene un papel importante en la activación de las
células uNK , entre los receptores de
citocinas en las células uNK se
encuentra el receptor para IL-1, IL-2 y TNF-α. También se ha propuesto que
las citocinas Th1, pueden producir aborto por activación de las células uNK.
Ya que estas proliferan y se activan en presencia de IL-2, (Rezaei, 2002) En
los humanos, la IL-2 ha mostrado in Vitro que puede producir citotoxicidad
contra el trofoblasto por acción de las células uNK. La I-L4 inhibe la expresión
del receptor en células NK de IL2Rα, IL2Rβ e IL2Rγ en la decidua, y esto
previene la reactivación con IL-2 (Laird, 2003 )
Las células uNK humanas producen también
una variedad de
citocinas
incluso CSF-1, TNFα, IFNγ, IL1α, TGF-β, LIF y GM-CSF, sugiriendo que la
función principal de las células uNK activadas es la producción de citocinas
en lugar de la lisis
celular (Loke, 2000) Estas citocinas pueden afectar
40
directamente el crecimiento celular y fusión del trofoblasto, o ellas pueden
causar activación de macrófagos que podrían atacar al trofoblasto. (Laird,
2003 ) Otros estudios en cambio muestran que las Nk aumentan su actividad
citolìtica
durante el embarazo en mujeres con aborto recurrente.( Rezaei,
2002). Otros estudios se refieren a la presencia de células NK activadas en
mujeres con abortos recurrentes como activadoras de células CD3+CD8+, las
cuales se relacionan con la disminución en la producción de citocinas Th2.
(Kwak, 2003)
La incubación de células del uNK con K562 o transfectados de líneas celulares
linfoblásticas B con HLA-G resultan en una producción alterada de citocinas
comparada con la incubación de células no transfectadas, sugiriendo la
interacción
del trofoblasto HLA-G con Kira y KARs sobre las células uNK
pueden alterar la producción de citocinas. La respuesta de esas citocinas
puede ser diferente en mujeres con aborto recurrente y mujeres fértiles
nórmales, resultando en la perdida del embarazo ( Kanai ., 2001; El Rieger .,
2002)
.
5.6.2 Efecto directo de las citocinas en el crecimiento y función celular
del trofoblasto Los receptores incluidos en la producción anormal de varias
citocinas en mujeres con abortos recurrentes incluyen los receptores para IL1, IFN-γ, TNF-α, TGF-β, CSF-1, GM-CSF, LIF, IL-4 e IL-6, presentes en las
células del trofoblasto, mostrando que esas citocinas afectan directamente el
crecimiento y función celular del trofoblasto ( Laird 2003 )
.
Varios estudios han mostrado que
el TNF-α e
IFN-γ pueden inhibir el
crecimiento y actividad metabólica del trofoblasto y estimulan la apoptosis in
vitro (Knofler,2000). El efecto
pro-apoptótico de el TNF-α e IFN-γ
es
totalmente neutralizado por los efectos del factor de crecimiento epidérmico
(EGF) y
parcialmente neutralizado por
el factor básico de crecimiento
fibroblastico ( bFGF), y el factor 1 de crecimiento como la insulina (IGF-1) y el
41
factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), mostrando que el
equilibrio de citocinas es muy importante (Smith., 2002),
5.6.3 La activación de eventos trombóticos Estudios en ratones hembras
embarazadas, a las cuales se les inyecto cada una de las citocinas del perfil
Th1 (IFNγ, TNFα e IL2) significativamente aumentaron la resorción fetal, esto
sugiere que las citocinas Th1 estimulan procesos de inflamación y/o trombosis
en los vasos sanguíneos del útero por activación de células procoagulantes del
endotelio vascular, en contraste las citocinas Th2 inhiben la activación de Th1
por medio de factores producidos por los monocitos ( Kwak ,2003)
Los recientes estudios han sugerido que la forma en que las citocinas Th1
provocan la pérdida del embarazo se encuentra en la vía de regulación de un
nuevo procoiagulante descrito, el fg12. En los ratones, anticuerpos anti-fg12
previenen completamente el aborto espontáneo, reduciendo notablemente los
efectos de TNFα e IFNγ sobre la tasa de abortos, ( Laird, 2003 ). En los
humanos, se ha reportado la expresión aumentada de fg12 en células del
trofoblasto
que
llevan
a
fallas en el embarazo con embriones
cromosómicamente normales pero no en tejidos de trofoblasto de embriones
cromosómicamente anormales.( Knackstedt, 2001). La fg12
convierte la
protrombina a trombina el cual permite la acumulación de fibrina y activación de
leucocitos polimorfonucleares que pueden destruir la vasculatura de la placenta
( Laird, 2003)
5.7 FALLA EN LA IMPLANTACIÓN Y AUMENTO DE Th1
El cambio a Th1 puede ser mediado por células T o presentación
celular
antigénica que efectúa una diferenciación directa de las células, es interesante
notar que linfocitos de mujeres con falla en la implantación , quienes nunca
habían estado embarazadas y no habían estado expuestas a Ag del trofoblasto
o nunca habían tenido historia de abortos, demostraron un aumento en la
expresión de las citocinas Th1, es posible que la síntesis aumentada de
42
citocinas Th1 pueda ser inducida no solamente por Ag de trofoblasto, también
por la producción de Ag no específicos citocinas/quimioquinas en respuesta al
estrés producido por hormonas del endometrio, producto de hiper- estimulación
ovárica o altos niveles no fisiológicos de hormonas sexuales femeninas. (Kwak,
2003)
La incidencia de endometriosis en mujeres sin historia de abortos espontáneos
fue mas alta que mujeres con historia de abortos espontáneos recurrentes
aunque la diferencia no es muy relevante. Mujeres con falla en la implantación
sin historia de abortos espontáneos recurrentes fue comparada con mujeres
con falla en la implantación con historias de abortos espontáneos recurrentes y
control de mujeres fértiles normales, en este estudio se demostró la falla del
embarazo con el cambio a Th1 relacionado con la falla en la implantación
(Kwak, 2003)
5.8 DIAGNOSTICO DE CITOCINAS
La determinación de citocinas Th1, Th2 se puede realizar por pruebas de
Inmunoensayo
enzimático
(ELISA),
usando
kits
de
diferentes
casas
comerciales entre los cuales encontramos los suministrados por Bioscience, el
cual utiliza una prueba de ELISA de captura y un sistema de avidina –biotina
para la detección de IFNγ, IL-2, IL-4, IL-10. El kit trae 4 estándares, de
concentraciones conocidas para cada una de las citocinas mencionadas.
La prueba de ELISA es en este momento una de las técnicas más aplicadas
para la detección de antígenos (ELISA directa) y anticuerpos (ELISA indirecta).
El principio básico es el uso de anticuerpos o antígenos conjugados con una
enzima, que al reaccionar con el sustrato específico generan una reacción de
color cuantificable en espectofótometro a una longitud de onda apropiada. Para
retirar los reactantes no unidos, se realizan pasos de lavado con una solución
como buffer fosfato salino (PBS) a pH 7.2, con un detergente como el tween
20. Dada las variaciones inter e intraensayos que pueden presentarse, es
43
indispensable correr con cada muestra desconocida controles negativos y
positivos que le den validez al ensayo.
El ELISA de captura aumenta la especificidad del ensayo, debido a que en la
fase sólida se fija exclusivamente el anticuerpo correspondiente a la citocina
que queremos cuantificar.
La presencia de estándares nos permite realizar curvas de calibración de
acuerdo a las concentraciones que necesitemos detectar. El laboratorio debe
estandarizar su procedimiento, teniendo en cuenta la población y el material
que va a utilizar para la detección de citocinas.
EL inmunoensayo enzimático (ELISA) de captura, ha sido utilizado para la
detección de Citocinas en suero, sugiriendo la estandarización en cada
laboratorio con el uso de estándares de concentraciones conocidas, de manera
que cada investigador puede determinar los valores normales en la población
escogida y en la muestra biológica utilizada, en este caso el suero.
Las citocinas que se encuentran principalmente alteradas en ARE, son el INFγ,
FNTα, IL-2, IL-4, IL-6 e IL-10. Sería entonces de gran importancia comparar
los perfiles de citocinas TH1 y TH2, en grupos de personas con embarazo
normal y abortadotas recurrentes.
44
6 CONCLUSIONES
Las mujeres que sufren de abortos espontáneos recurrentes, definidos como la
perdida de tres o mas embarazos antes de la semana 20 de gestación se han
asociado con alteraciones en los mecanismos inmunológicos involucrados en la
generación de la tolerancia materno-feta, a anormalidades genéticas,
anatómicas y endocrinas.
Entre las causas inmunológicas varias teorías fueron propuestas:, inmadurez
antigénica
del
feto,
inmunosupresiòn
materna
durante
el
embarazo,
incapacidad materna de inducir la respuesta adecuada de citocinas en el
endometrio ya que existen muchas evidencias de que las citocinas tiene un
papel importante como mediadoras entre el sistema inmune materno y el
sistema reproductivo durante el embarazo. las citocinas pueden facilitar o
impedir el establecimiento y mantenimiento del embarazo normal
por
inmumodulación, esta modulación se ha relacionado con tres tipos de células
como son las células T, macrófagos y células natural killer.
Entre las células T se encuentran las células T- ayudadoras que
principales productoras de citocinas, y
son las
se han vinculado con el embarazo
según el perfil de citocinas producido, hasta el momento las citocinas referidas
a el éxito del embarazo son las citocinas de perfil Th2 principalmente la IL-4,
IL-5, IL6 e IL-10, mientras que las citocinas involucradas con el ARS son las
citocinas de perfil Th1 como la IL-2, TNFα, TNFβ e IFN.
La detección de estas citocinas se puede realizar por medio de una Elisa de
captura
en suero, teniendo estándares de concentración conocida y una
población determinada como son mujeres con embarazos normales y mujeres
con ARS
45
A pesar de la importancia descrita de estos factores humorales en el embarazo,
poco ha sido demostrado en estudios clínicos y en pruebas de laboratorio para
determinar los perfiles y valores de citocinas encontrados en suero, es por esto
que después de tener toda la información aquí dada sobre el papel de las
citocinas en el éxito del embarazo, se lograra realizar un estudio práctico en un
grupo de mujeres con embarazo normal y un grupo de mujeres con aborto
recurrente, para demostrar la causa inmunológica
46
7. RECOMENDACIONES
Como se ha podido observar una de las razones por los cuales se producen
abortos espontáneos recurrentes es de causa inmunológica, específicamente
por alteración en la producción de las citocinas de perfil Th1 y Th2,
recomendaría que se realizaran estudios sobre este perfil para llegar a conocer
los valores normales de citocinas en embarazos normales, para así teniendo
estos datos poder ser utilizados como una herramienta para el diagnóstico de
abortos recurrentes ya que no existen estudios que muestren específicamente
las concentraciones de estas citocina.
47
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