Caracterización de la infección por virus dengue en cultivos

Caracterización de la infección por virus dengue en cultivos primarios de
fibroblastos
Abelardo Tejeda Pérez. Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas y Farmacéuticas
de la Universidad Autónoma de Nayarit, [email protected]. Asesora/s Dra. Leticia
Cedillo Barrón. M.C Paola C. Valenzuela León , Centro de Investigación y Estudios Avanzados
del IPN, [email protected], [email protected].
Planteamiento del problema
El virus del dengue es un virus de la familia Flaviviridae que es transmitido por la
picadura del mosquito hembra Aedes aegypti, el cual se encuentra en zonas
tropicales y sub-tropicales causante de aproximadamente 50 millones de casos al
año. Se tiene mucha información sobre la inmunidad adaptativa, ya que el paciente
con dengue llega por atención médica de 5-6 días después del inicio de la infección.
El virus es transmitido por un vector, el primer contacto con el hospedero es la piel
y por lo tanto debe ser analizado.
Objetivo
Evaluar el grado de infección del virus dengue en fibroblastos dérmicos por medio
de las técnicas de inmunofluorescencia y citometría de flujo.
Metodología
Se utilizaron fibroblastos obtenidos de cultivos primarios los cuales para los ensayos
se mantuvieron a un 80 - 90 % de confluencia en la caja de cultivo , posteriormente
se le realizaron lavados con DPBS y tratamiento con Tripsina para separarlos de
sus cajas y realizar el conteo con azul tripano. Se plaquearon en una caja de 24
pozos a una densidad celular aproximada de 100,000 o 50,000 células/ml en 500
μL de medio suplementado de fibroblastos por pozo dependiendo del ensayo a
realizar y se incubaron 24 horas.
Para evaluar la infección viral en los fibroblastos se empleó la inmunofluorescencia
y la citometría de flujo. Para la inmunofluorescencia primero se colocó un
cubreobjeto en cada pozo a utilizar (8 pozos), para posteriormente agregar las
células he incubar. Se infectaron 2 pozos a 1 MOI durante 3 horas. Después se lavó
con medio y se incubo 24 horas más. Pasada la incubación se lavaron con PBS 1X
y se fijaron las células con Paraformaldehido, tratadas con PBS Tritón gelatina, y
suero de chivo. Se utilizaron los Anticuerpos (Ac) Primarios (1:150) Monoclonal
Clona 21 de Ratón dirigido a la proteína de envoltura de flavivirus y un Ac dirigido
contra la proteína no estructural NS3, un Ac secundario (1:100) monoclonal contra
el Ac primario acoplado a un fluorocromo FITC. Se colocaron los cubreobjetos en
un portaobjeto junto con el Marcador DAPI y se capturaron imágenes en el
microscopio confocal. Para terminar, para el porcentaje de infección se contaron las
células infectadas y las no infectadas en un microscopio de epifluorescencia y se
hicieron cálculos estadísticos.
Para la citometría se plaquearon 10 pozos, esta vez sin cubreobjetos y se incubaron
24 horas. Se establecieron las siguientes condiciones; infectado, no infectado,
isotípo, sin teñir y Mock. Se infectó a 1 MOI y se incubo otras 24 horas. Se
despegaron las células con tripsina y se recolectaron en un tubo diferente por cada
pozo. Las células se fijaron, se permeabilizaron para después realizar un bloqueo
de receptores no específicos con Suero de chivo. Se utilizó un Ac primario (1:150)
dirigido contra la proteína de envoltura y un Ac secundario (1:100) contra el Ac
anterior acoplado a un fluorocromo FITC. Entre cada incubación se realizaron
lavados con PBS 1X. Posteriormente se pasó el contenido a un tubo de citometría
y se le dio lectura en el citómetro.
Para evaluar la progenie viral de los experimentos anteriores se realizó el título del
virus en células BHK-21. Se incubaron 5 días con medio Overlay, se lavaron con
agua corriente, se tiñeron con Naftol Blue Black para evidenciar las placas líticas,
las cuales nos permiten determinar la concentración de partículas viables infectivas.
Conclusión
Se realizaron técnicas que permitieron evaluar el porcentaje de infección en cultivos
primarios de fibroblastos con el virus dengue, derivado de ello se adquirieron
multiples conocimientos en base a tecnicas de cultivo celular, determinacion de la
infecciòn en cultivos celulares, replicación viral y conocimientos sobre las lineas de
investigación que se realizan en el laboratorio.