ANEXOS PREPARACION DE SOLUCIONES Y MEDIOS

Regeneración De Blastómeros De Trucha Arco Iris Oncorhynchus Mykiss,
Walbaum 1792 (Pisces : Salmonidae) . Flores Garrido, Karin Margot
TESIS UNMSM
ANEXOS
PREPARACION DE SOLUCIONES Y MEDIOS
A) SOLUCIÓN SALINA 1%
Se disuelven 100 g de sal yodada por cada 10 litros de agua de estanque a utilizar.
B) SOLUCIÓN RINGER MODIFICADA PARA PECES
Se disuelven 6.5g de cloruro de sodio, 0.25g de cloruro de potasio, 0.2g de
bicarbonato de sodio y 0.3g de bicloruro de sodio por cada litro de agua destilada estéril.
Fijar el pH a 7.4 y esterilizar por filtración con membrana 0.45µm. Conservar a temperatura
ambiente (Harvey y Ashwood-Smith, 1982).
C) PREPARACIÓN DE LA VITAMINA A
Se prepara 200ml de solución concentrada de vitamina A de 53.3 UI/ml. Remover
bien con bagueta y pasar por papel filtro No. 2. Esterilizar con filtro de membrana de
0.45µm, guardar en frasco de vidrio forrado con papel aluminio a temperatura ambiente.
Cada 0.344µg de vitamina A equivale a 106 UI (Merck, 1999/2000). Un mililitro de la
solución de 53.3UI/ml de vitamina A llevado a 20ml de volumen de cultivo se convertirá
en 2.6 UI/ml, 0.5ml en 1.3 UI/ml y 0.25 ml en 0.6UI/ml.
D) RESUSPENSIÓN DEL MEDIO LEIBOVITZ L-15
Por cada litro de medio Leibovitz L-15 resuspendido en agua bidestilada estéril se
adicionan 100mg de sulfato de estreptomicina, 60 mg de bencilpenicilina y 1.2g de
bicarbonato de sodio. Filtrar con membrana de 0.45µm y guardar entre 2 y 8°C (Patiño y
Thomas, 1990). La fórmula del medio Leibovitz L-15 es:
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Sales inorgánicas
CaCl2 (anhidro)
KCl
KH2 PO4
MgCl2 (anhidro)
MgSO4 (anhidro)
NaCl
Na2 HPO4
Otros componentes
D(+)Galactosa
Rojo fenol
Piruvato de sodio
Aminoácidos
L-Alanina
L-Arginina
L-Asparragina
L-Cisteína
L-Glutamina
Glicina
L-Histidina
L-Isoleucina
L-Leucina
L-Lisina
L-Metionina
L-Fenilalanina
L-Serina
L-Treonina
L-Triptofano
L-Tirosina
L-Valina
Vitaminas
D-Ca Pantotenato
Cloruro de colina
Ácido fólico
i-Inositol
Niacinamida
Piridoxina HCl
Riboflavina-5’- fosfato, 2H2 O
Tiamina monofosfato
mg/l
140.00
400.00
60.00
94.00
98.00
8000.00
190.00
900.00
10.00
550.00
225.00
500.00
250.00
120.00
300.00
200.00
250.00
125.00
125.00
75.00
75.00
125.00
200.00
300.00
20.00
300.00
100.00
1.00
1.00
1.00
2.00
1.00
1.00
0.10
1.00
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TABLAS
TABLA 1
ESTANDARIZACIÓN DEL TIEMPO DE SEDACIÓN
No. DE
REPETICIONES
PESO (g)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
TOTAL
PROMEDIO
1800
2000
3200
2500
2200
2900
3100
3500
2400
3000
2300
1900
3300
2800
2400
2000
3100
2900
2250
3000
2300
1900
2750
3200
2600
2100
2400
2600
2500
3200
78100
2603.3
CLOROBUTANOL (600mg/l)
TIEMPO DE
TIEMPO DE
EXPOSICION (seg)
RECUPERACION (seg)
29
170
32
180
45
260
37
210
35
195
42
240
44
250
49
270
36
200
43
240
35
200
30
180
47
260
40
230
35
200
33
190
43
250
41
235
36
200
42
260
34
200
32
180
40
225
44
250
39
220
32
190
34
200
38
210
38
205
44
250
1149
6550
38.3
218.3
En el análisis estadístico utilizando la Correlación de Pearson, se encontró una correlación
significante entre el tiempo de exposición-Peso del animal, Tiempo de exposición-Tiempo de Recuperación y
Peso-tiempo de recuperación con nivel de significación de 0.01
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TABLA 2
INACTIVACIÓN DEL PLASMA DE TRUCHA
TEMPERATURA (°C)
PP 56 54 52 50 48 46 44 42 40 38 36 34 32 31 30 29 28
T
A
P
B
R
Bu
E
M
N
X
X
PP: Precipitado
T: Total
A: Abundante
P: Parcial
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
B: Bastante
R: Regular
Bu: Bueno
E: Escaso
X
X
M: Mínimo
N: Nulo
TABLA 3
ESTADO DE INACTIVACIÓN DEL SUERO DE TRUCHA
NUMERO DE
REPETICIONES
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
TOTAL
SUERO SIN
INACTIVAR
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
32°C
5
4
2
2
1
3
4
4
4
3
32
SUERO INACTIVO
31°C
30°C
29°C
4
6
1
5
6
1
3
6
0
3
6
0
3
6
0
4
6
0
2
6
1
3
6
0
3
6
0
4
6
0
34
60
3
28°C
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
1
En Prueba ANOVA, se encontró diferencia significativa entre los grupos probados (p<0.000). En las
comparaciones múltiples por Dunnett, los resultados de 30°C en relación a las demás temperaturas probadas
fueron significativamente diferente (p<0.000)
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TABLA 4
EMBRIOTOLERANCIA DE VITAMINA E INSULINA
T1
No. DE REP
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
TOTAL
% VIVOS
C
0
2
3
2
1
0
1
0
0
1
10
16.7
T2
P
0
1
1
2
1
0
0
0
1
1
7
11.7
C
5
4
3
5
5
3
4
5
4
3
41
68.3
P: Muestras problema.
T1
T2
T3
T4
T5
VITAMINA A UI/ml)
2.6
1.3
0.6
2.6
1.3
T3
P
5
3
2
1
4
3
1
2
3
3
27
45.0
C
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
60
100
T4
P
4
2
5
4
6
6
6
6
4
4
47
78.3
C
0
1
3
3
2
1
3
3
1
1
18
45.0
T6
T5
P
0
0
1
1
0
1
2
1
1
1
8
13.3
C
4
3
4
4
3
3
3
2
4
4
34
56.7
P
0
1
3
1
2
3
1
2
3
1
17
28.3
C
6
5
4
5
5
5
6
6
4
5
51
85.0
T7
P
3
4
3
4
3
2
4
5
3
2
33
55.0
C: Muestras control.
INSULINA (UI/ml)
0.7
0.7
0.7
0.4
0.4
C
0
2
3
0
3
3
3
2
2
1
19
60
T8
P
3
0
1
0
1
0
1
2
1
1
10
16.7
C
5
4
5
5
5
4
6
5
5
5
49
81.7
T9
P
4
3
3
3
2
1
3
2
2
2
25
41.7
C
6
6
4
5
5
5
5
4
6
6
52
86.7
P
4
0
3
4
3
3
4
4
4
5
34
56.7
Tn : Tratamientos.
T6
T7
T8
T9
VITAMINA A (UI/ml)
0.6
2.6
1.3
0.6
INSULINA (UI/ml)
0.4
0.2
0.2
0.2
En el Diseño factorial anidado, hay interacción significativa entre muestras (control y problema), dosis de insulina, dosis de vitamina A y muestras-dosis
vitamina A (R2 ajus =0.936). Nivel de significación: 0.01
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TABLA 5
EFECTIVIDAD DE LOS DIFERENTES TIPOS SÉRICOS
R
E
P
SUERO DE MUJER
SUERO DE MUJER NO
SUERO DE TRUCHA
GRÁVIDA
GRÁVIDA
CONTROL PROBLEMA CONTROL PROBLEMA CONTROL PROBLEMA
ENT. %
REG.
% ENT. %
REG.
% ENT.
%
REG.
%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2
3
4
2
3
2
4
3
2
1
33.3
50.0
66.7
33.3
50.0
33.3
66.7
50.0
33.3
16.7
0
2
4
1
1
0
1
1
1
1
0.0
33.3
66.6
16.7
16.7
0.0
16.7
16.7
16.7
16.7
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
16.7
0.0
0.0
0.0
16.7
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
5
6
6
6
6
6
6
6
6
6
83.3
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
5
3
4
6
4
4
5
6
5
5
83.3
50.0
66.7
100.0
66.7
66.7
83.3
100.0
83.3
83.3
T
26
43.3
12
20.0
2
3.3
0
0.0
59
98.3
47
78.3
Leyenda:
T: Total.
La Prueba de los efectos entre grupos tratados (sueros de trucha, de mujer grávida y de mujer no
grávida) fueron significativamente diferentes en las muestras control y problema y entre ellos con un nivel de
significancia de 0.01
TABLA 6
VERIFICACIÓN DEL ROL QUE CUMPLE LA VITAMINA SOBRE LA CAPACIDAD REGENERATIVA
No. DE
REPETICIONES
CONTROL
ENTEROS
%
PROBLEMA
REGENERADOS
%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
6
5
6
5
6
6
5
6
4
5
100.0
83.3
100.0
83.3
100.0
100.0
83.3
100.0
66.7
83.3
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
0.0
16.7
0.0
0.0
16.7
16.7
16.7
0.0
0.0
0.0
TOTAL
54
90.0
4
6.7
Elaboración y diseño en formato Pdf, por la Oficina General de Sistemas de Bibliotecas y Biblioteca Central.
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TABLA 7
VERIFICACIÓN DEL ROL QUE CUMPLE EL SUERO SOBRE LA CAPACIDAD REGENERATIVA
No. DE
REPETICIONES
CONTROL
ENTEROS
%
PROBLEMA
REGENERADOS
%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
3
5
4
3
5
4
3
4
5
3
50.0
83.3
66.7
50.0
83.3
66.7
50.0
66.7
83.3
50.0
1
0
0
0
1
2
0
0
0
0
16.7
0.0
0.0
0.0
16.7
33.3
0.0
0.0
0.0
0.0
TOTAL
39
65.0
2
3.3
TABLA 8
VERIFICACIÓN DEL ROL QUE CUMPLE EL MEDIO LEIBOVITZ L-15 SOBRE LA CAPACIDAD
REGENERATIVA
No. DE
REPETICIONES
CONTROL
ENTEROS
%
PROBLEMA
REGENERADOS
%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
16.7
0.0
0.0
0.0
16.7
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
16.7
0.0
0.0
16.7
TOTAL
2
3.3
2
3.3
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TABLA 9
VERIFICACIÓN DEL ROL QUE CUMPLEN LA VITAMINA A Y LA INSULINA SIMULTÁNEAMENTE
SOBRE LA CAPACIDAD REGENERATIVA
No. DE
REPETICIONES
CONTROL
ENTEROS
%
PROBLEMA
REGENERADOS
%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
5
3
6
6
5
5
6
6
5
5
83.3
50.0
100.0
100.0
83.3
83.3
100.0
100.0
83.3
83.3
0
1
0
1
0
0
0
1
0
0
0.0
16.7
0.0
16.7
0.0
0.0
0.0
16.7
0.0
0.0
TOTAL
52
86.7
3
5.0
TABLA 10
VERIFICACIÓN DEL ROL QUE CUMPLE LA INSULINA SOBRE LA CAPACIDAD REGENERATIVA
No. DE
REPETICIONES
CONTROL
ENTEROS
%
PROBLEMA
REGENERADOS
%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
6
6
6
6
5
6
6
5
5
6
100.0
100.0
100.0
100.0
83.3
100.0
100.0
83.3
83.3
100.0
4
3
4
5
0
4
2
4
3
3
66.7
50.0
66.7
83.3
0.0
66.7
33.3
66.7
33.3
33.3
TOTAL
57
95.0
32
53.3
Elaboración y diseño en formato Pdf, por la Oficina General de Sistemas de Bibliotecas y Biblioteca Central.
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TABLA 11
RESUMEN DE LA VERIFICACIÓN DEL ROL DE CADA UNO DE LOS FACTORES
PARTICIPANTES EN EL PROTOCOLO DE REGENERACIÓN
No. DE
REPETICIONES
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
TOTAL
VITAMINA
A
C
P
6
0
5
1
6
0
5
0
6
1
6
1
5
1
6
0
4
0
5
0
54
4
INSULINA
SUERO
C
6
6
6
6
5
6
6
5
5
6
P
4
3
4
5
0
4
2
4
3
3
C
3
5
4
3
5
4
3
4
5
3
P
1
0
0
0
1
2
0
0
0
0
57
32
39
4
MEDIO
LEIBOVITZ
C
P
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
0
0
0
0
1
1
2
2
VIT. A E
INSULINA
C
P
5
0
3
1
6
0
6
1
5
0
5
0
6
0
6
1
5
0
5
0
52
3
Existe interacción significativa entre todos los elementos participantes en un 77% aproximadamente (R=
0.769). Se observó el mismo efecto significativo entre la vitamina A, el suero, el medio Leibovitz y la interacción
vitamina A-insulina, a diferencia de las pruebas en ausencia de insulina, por Prueba de Dunnett con un nivel de
significación de 0.01
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FIGURAS
Fig. 1
ESTANDARIZACIÓN DEL TIEMPO DE INDUCCIÓN DEL ANESTÉSICO
Asociación entre las variables Tiempo de Exposición (TIE_EXP), Peso y Tiempo de Recuperación
(TIE_REC).
TIE_EXP
PESO
TIE_REC
Fig. 2
EXPOSICIÓN TÉRMICA PARA LA INACTIVACIÓN DEL COMPLEMENTO
7
M
E
D
I
A
E
S
T
I
M
A
D
A
5
Estimated Marginal Means
P
M
R
A
O
R
G
M
I
E
N
D
A
IL
O
6
4
3
2
1
0
28.00
29.00
30.00
31.00
32.00
TEMPERATURA
TEMPERAT
Elaboración y diseño en formato Pdf, por la Oficina General de Sistemas de Bibliotecas y Biblioteca Central.
Regeneración De Blastómeros De Trucha Arco Iris Oncorhynchus Mykiss,
Walbaum 1792 (Pisces : Salmonidae) . Flores Garrido, Karin Margot
TESIS UNMSM
Fig. 3
REGENERACIÓN DEL EMBRIÓN POR TIPO DE MUESTRA
6
DOSIS DE
VITAMINA
A (UI/ml)
5
4
3
D-0.6
2
D-1.3
1
D-2.6
0
Control
Problema
TIPO DE MUESTRA
Fig. 4
REGENERACIÓN DEL EMBRIÓN POR DOSIS DE VITAMINA A
6
5
4
PROMEDIO
3
2
1
0
DOSIS 0.6
DOSIS 1.3
VITAMINA A
DOSIS 2.6
CONTROL
PROBLEMA
Elaboración y diseño en formato Pdf, por la Oficina General de Sistemas de Bibliotecas y Biblioteca Central.
Regeneración De Blastómeros De Trucha Arco Iris Oncorhynchus Mykiss,
Walbaum 1792 (Pisces : Salmonidae) . Flores Garrido, Karin Margot
TESIS UNMSM
Fig. 5
GRÁFICO SOBRE LA REGENERACIÓN DEL EMBRIÓN
7
118
116
115
117
6
5
4
151
3
2
RESPUEST
R
E
S
P
U
E
S
T
A
VITAMINA
1
.60
172
0
1.30
2.60
-1
N=
30
30
30
30
30
Control
30
Problema
TIPO DE MUESTRA
Fig. 6
REGENERACIÓN DEL EMBRIÓN VITAMINA-A-INSULINA
6
5
4
3
I-0.20
2
I-0.40
I-0.70
1
0
V-0.6
V-1.30
V-2.60
DOSIS DE VITAMINA A
Elaboración y diseño en formato Pdf, por la Oficina General de Sistemas de Bibliotecas y Biblioteca Central.
Regeneración De Blastómeros De Trucha Arco Iris Oncorhynchus Mykiss,
Walbaum 1792 (Pisces : Salmonidae) . Flores Garrido, Karin Margot
TESIS UNMSM
Fig. 7
GRÁFICO SOBRE LA REGENERACIÓN PROMEDIO DEL EMBRIÓN
7
6
5
4
3
3
DOSIS DE
2
RESPUEST
R
E
S
P
U
E
S
T
A
112
VITAMINA
VITAMINA
A (UI/ml)
1
.60
0
1.30
172
2.60
-1
N=
20
20
20
20
.20
20
.40
20
20
20
20
.70
NIV_INSU
DOSIS
DE INSULINA (UI/ml)
Fig. 8
REGENERACIÓN DEL EMBRIÓN BASADO EN LA VITAMINA A PARA LOS DIFERENTES
NIVELES DE INSULINA
6
5
4
Estimated Marginal Means
P
R
O
M
E
D
I
O
3
DOSIS DE
INSULINA
(UI/ml)
INSULINA
2
.20
1
.40
0
.70
.60
1.30
2.60
VITAMINA
DOSIS
DE VITAMINA A (UI/ml)
Elaboración y diseño en formato Pdf, por la Oficina General de Sistemas de Bibliotecas y Biblioteca Central.
Regeneración De Blastómeros De Trucha Arco Iris Oncorhynchus Mykiss,
Walbaum 1792 (Pisces : Salmonidae) . Flores Garrido, Karin Margot
TESIS UNMSM
Fig. 9
REGENERACIÓN DE LOS EMBRIONES BASADO EN LOS DIFERENTES TIPOS DE
MUESTRA POR VITAMINA A
6
5
4
Estimated Marginal Means
P
R
O
M
E
D
I
O
DOSIS DE
VITAMINA
A (UI/ml)
3
VITAMINA
2
.60
1
1.30
0
2.60
Control
Problema
TIPO
DEDE
MUESTRA
TIPO
MUESTRA
Fig. 10
REGENERACIÓN DEL TEJIDO EMBRIONARIO VITAMINA-A-INSULINA
6
TIPO DE
MUESTRA
5
4
3
Control
2
Problema
1
0
D-0.6
D-1.3
D-2.6
DOSIS DE VITAMINA A
Elaboración y diseño en formato Pdf, por la Oficina General de Sistemas de Bibliotecas y Biblioteca Central.
Regeneración De Blastómeros De Trucha Arco Iris Oncorhynchus Mykiss,
Walbaum 1792 (Pisces : Salmonidae) . Flores Garrido, Karin Margot
TESIS UNMSM
Fig. 11
REGENERACIÓN DE LOS EMBRIONES POR TIPO DE SUERO
7
6
5
P
R
O
M
E
D
I
O
Estimated Marginal Means
4
3
2
1
MUESTRA
0
CONTROL
-1
mujer gravida
PROBLEMA
mujer no gravida
trucha
de suero
TIPO DEtipo
SUERO
Fig. 12
REGENERACIÓN DE LOS EMBRIONES POR TIPO DE MUESTRA
7
6
5
4
Estimated Marginal Means
P
R
O
M
E
D
I
O
3
TIPO DE SUERO
2
tipo de suero
1
mujer gravida
0
mujer no gravida
-1
trucha
CONTROL
PROBLEMA
MUESTRA
Elaboración y diseño en formato Pdf, por la Oficina General de Sistemas de Bibliotecas y Biblioteca Central.
Regeneración De Blastómeros De Trucha Arco Iris Oncorhynchus Mykiss,
Walbaum 1792 (Pisces : Salmonidae) . Flores Garrido, Karin Margot
TESIS UNMSM
Fig. 13
IMPORTANCIA DE LOS ELEMENTOS DEL MEDIO
3.5
3.0
2.5
2.0
Estimated Marginal Means
P
R
O
M
E
D
I
O
1.5
1.0
.5
0.0
VIT-A
INSULINA
SUERO
MEDIO
VIT_A-INSULINA
ELEMENTOS DEL MEDIO
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