GUIA DE LABORATORIO PRACTICA 7 CELULAS PROCARIOTAS

GUIA DE LABORATORIO
PRACTICA 7
CELULAS PROCARIOTAS
PROGRAMA DE INGENIERIA PECUARIA
BIOLOGÍA GENERAL
Leidy Diana Ardila Leal
Docente.
INTRODUCCIÓN
Los organismos procariotas son por los organismos más abundantes en la Tierra.
Se pueden encontrar en prácticamente todas partes, incluso en ambientes
extremos, de altas temperatura y de gran variabilidad en disponibilidad de
oxígeno. Aunque quizás se reconozcan más por incluir organismos patógenos
causantes de enfermedades de gran importancia clínica en humanos y animales,
patógenos causantes de desastres agrícolas, la realidad es que obtenemos
beneficios de muchos procariotas y su importancia, médica, ecológica y
económica, es grande. Los organismos procariotas juegan un papel vital en la
productividad y el ciclo de sustancias esenciales para todas las demás formas de
vida. Entre los beneficios económicos que ofrecen estos microorganismos se da
con el uso de bacterias acido-lácticas para fermentar alimentos como por ejemplo
yogurt, queso y mantequilla. Durante la elaboración de la presente práctica se va
a poder entender mejor el alcance de todos los microorganismos en nuestro
ambiente.
OBJETIVO
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Observar la morfología bacteriana y aprender a distinguir los distintos tipos
de agrupaciones que existen.
Realizar una tinción simple de bacterias procedentes de distintas muestras
naturales.
MARCO TEORICO
Los procariotas son aquellos en los que no existe la separación entre núcleo y
citoplasma. Dentro de este grupo se incluyen las bacterias. En general, las células
procariótias son más simples que las eucariotas ya que estas contienen
membranas internas que diferencian órganos celulares (aparato de Golgi, retículo
endoplasmático, vacuolas, etc.) no presentes en las células procariotas. En estas
el citoplasma es continuo y se encuentra lleno de ribosomas encargados de llevar
a cabo la traducción del mensaje genético en proteínas.
Tamaño y morfología de las bacterias.
La forma de las bacterias puede ser esférica (cocos), cilíndrica (bacilos), de coma
(vibrios) o helicoidal (espirilos). La forma de las bacterias viene determinada
principalmente por la estructura de su pared celular y es una de las características
que sirven para identificarlas. Las bacterias pueden presentarse como células
aisladas o formando grupos. Esta característica es también importante para poder
identificarlas. En algunas casos la aparición de las bacterias formando
agrupaciones no es una característica de estas in vivo sino un efecto de ciertas
técnicas de tinción (como en el caso de Staphylococcus sp. que aparece formando
racimos en preparaciones fijadas y teñidas; pero no en muestras vivas).
Las principales formas de agrupamiento de las bacterias son las que se observan
en estreptococos y estreptobacilos (cadenas de cocos o de bacilos, diplococos
(parejas de cocos) sarcinas (agrupaciones en tétradas o en grupos de ocho cocos
dispuestos en forma de cubo).
Figura 1. Tipos de células bacterianas. (A) Bacilos, de morfología alargada; (B)
Cocos, cuya forma es esférica; (C) Espirilos, que como su nombre indica
recuerdan a un sacacorchos
El tamaño de las células bacterianas es variable oscilando entre una micra (μm)
de diámetro y varias decenas de longitud en las especies más grandes. En
cualquier caso, su tamaño es más reducido que el de una célula eucariota típica
Tinciones.
La observación microscópica de bacterias proporciona una cantidad limitada de
información debido a la reducida variabilidad morfológica de estos organismos. La
observación de microorganismos vivos permite obtener información relativa a su
movilidad y a su tamaño. Sin embargo la mayor parte de la información
microscópica deriva del examen de muestras fijadas y teñidas.
La fijación consiste en la precipitación de las proteínas y desecación de las
muestras mediante técnicas físicas o químicas. En la práctica, la fijación se suele
realizar por calor con lo que se consigue la desnaturalización y desecación al
mismo tiempo que se adhiere la muestra al portaobjetos en el que se realizará la
observación.
En la mayoría de los casos, la fijación se realiza en muestras que han sido
extendidas sobre el portaobjetos produciendo lo que se denomina un frotis. Una
vez fijada, la muestra se somete a uno o varios procesos de tinción a fin de revelar
la morfología del microorganismo y algunas de sus características estructurales.
Para realizar la tinción es necesario usar colorantes específicos. Los colorantes se
agrupan en básicos que tiñen especialmente bacterias ya que la membrana de
estas suele tener una cierta carga eléctrica negativa (a este grupo pertenecen la
safranina, fucsina básica, cristal violeta y azul de metileno); y ácidos más
adecuados para teñir células animales en muestras de tejidos infectados. A este
último grupo pertenecen la fucsina ácida, la eosina y el rojo Congo.
Para ciertos tipos de tinciones es necesario aumentar la afinidad del colorante por
el microorganismo (o estructura) utilizando substancias que actúan como
mordientes. Los mordientes también se utilizan para aumentar el grosor de ciertas
estructuras como los flagelos de forma que puedan ser observados al microscopio
cuando se tiñen adecuadamente.
Los principales tipos de tinción que se usan en microbiología clínica son los
siguientes:
Tinción Simple
Permite observar la forma, tamaño y agrupamiento de las bacterias usando un
único colorante.
Tinción Diferencial
Permiten distinguir diferentes tipos de microorganismos en función de sus
características estructurales
Tinción de Gram: es un sistema de dos tinciones simples sucesivas, separadas
por una fase de decoloración selectiva. Permite diferenciar las bacterias que
retienen el primer color (Gram-positivas) de las que no lo retienen (Gramnegativas). Esta diferencia en comportamiento refleja diferencias estructurales y
fisiológicas entre ambos grupos de bacterias.
MATERIALES
Materiales entregados en la practica
Microscopio
Solución salina
Aceite de inmersión
Asas bacteriológicas
Mechero de Bunsen
Set de colorantes de Gram (Cristal
violeta, lugol, alcohol acetona y
safranina)
Azul de metileno
Materiales traidos por el estudiante
Portaobjetos
Cubreobjetos
Goteros
Papel arroz
Especímenes recolectados: 3 cajas de medio
de cultivo con microorganismos.
METODOLOGÍA
Preparación de las muestras para el trabajo en el laboratorio.
Por cada grupo de trabajo se van a utilizar 3 cajas de petri con agar nutritivo o agar
sangre, en su defecto un medio de cultivo para crecimiento de bacterias (en caso de
hacerlo individual, cada persona procede a realizar la toma de especímenes con una sola
caja de Petri en cualquiera de la áreas de recolección, queda a elección del estudiante),
se procederá a realizar muestreo de 3 áreas. Precaución: Si tienes el cabello largo,
recogerlo para mantenerlo lejos de las cajas de Petri, cuando estés trabajando en ello no
olvidar lavar muy bien las manos. Saca las cajas de Petri pero no abras las cajas hasta
que se le indique cada procedimiento.
Caja de Petri 1: Diríjase al sitio de recolección y abra la caja de Petri en un sitio específico
Ej: cocina, patio, baño, entre otros (esta debe ser rotulada para saber el lugar de
recolección de muestras) dejarlo abierto por un periodo máximo de 45 minutos en el sitio
previamente elegido. Cerrarlo envolviendo la caja con cinta tirro (cinta de enmascarar)
para evitar que se vuelva a abrir accidentalmente e incubarlo a temperatura ambiente por
72 horas antes de la práctica (a más tardar el día domingo en las horas de la mañana
deben quedar listos)
Caja de Petri 2: En esta caja se realizara siembra de un líquido, para ello siga el siguiente
procedimiento para hacer la siembra en la placa. Con la ayuda de un hisopo estéril (no
haya tenido contacto previo con otra fuente) se realizara la recolección de una muestra,
para ello sumergir el hisopo en la muestra (ej. Agua estancada, yogurt, tasa del inodoro,
lavaplatos, entre otros) Sin presionar fuertemente la superficie del agar distribuya su
muestra con movimientos de izquierda a derecha sobre la superficie del agar. Sella la
caja de Petri y procede a incubar la inoculación.
Caja de Petri 3: Escoge un objeto de tu casa preferiblemente de uso cotidiano (ej: la
manija de la puerta, el control remoto de la televisión, una moneda, entre otros.). Toma
una caja de Petri y con la ayuda de un hisopo de algodón se va a tomar la muestra con
cuidado de no tocar la punta (algodón) antes de proceder. Limpia tú objeto escogido con
todos los lados de la punta del hisopo volteándolo y retorciendo el hisopo a medida que lo
mueves por la superficie del objeto, después de ello procede a presionar el hisopo sobre
el agar con movimiento de izquierda a derecha. Sella la caja de Petri y procede a incubar
la inoculación.
Forma de incubación de la caja de Petri: una vez terminada la recolección de la muestra
se procede a sellar de modo que la tapa de la caja de Petri quede fija y no se mueva,
luego llévalo a un lugar en donde puedan estar segura de hormigas o de calor intenso y
procede a colocarlo en el respectivo lugar en posición invertida.
Observación macroscópica de las colonias sobre el agar.
Observar las características macroscópicas de la agrupación de los microorganismos
obtenidos en el agar.
Seleccione las agrupaciones que tengan igual característica en cuento a los siguientes
parámetros:
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Tamaño
Forma
Margen o borde
Textura
Altura
Cromogénesis (color de la colonia)
Forma de la colonia: puntiforme (a) (menos de 1mm de diámetro), redonda (b), irregular
(c) o filamentosa (d).
Margen de la colonia: entero (a), curveado (b), ondulado (c), lobulado (d) o filamentoso
(e). La diferencia entre curveado, ondulado o filamentoso estriba en el tipo de curva en el
borde. El lobulado es irregular, el curveado es regular y más apretado, mientras que el
ondulado son curvas más relajadas.
Altura de la colonia: Plana, acuminada, planoconvexa y umbilicada.
Textura de la colonia: lisa (a), concéntrica (b), arrugada (c) o con curvas o contorno (d).
La diferencia entre concéntrica y con curvas es que el diámetro de la concéntrica se va
haciendo más pequeño de forma regular a medida que se sube en la colonia, mientras en
la que tiene curvas el contorno es más irregular.
Metodología para esterilizar un asa bacteriológica
Tomar el asa de inoculación con la mano, de la misma forma que toma el lápiz para
escribir.
Formando un ángulo de 60° con la aguja y la llama de un mechero, pasar la aguja de asa
de arriba hacia abajo (por debajo del mango) y viceversa hasta que tome un color rojo
Chequear la técnica que utilizo teniendo en cuenta la figura
Obtención de preparaciones húmedas o en fresco.
En las preparaciones húmedas, las bacterias muestran pocos detalles morfológicos, sin
embargo se puede utilizar para la determinación de la movilidad. Para ellos tomar una
lámina sobre ella agregar una pequeña gota de agua. Hacer una pequeña emulsión con
una agrupación de microorganismos tomada del medio de cultivo. Cubrir con una laminilla
(Ver. Figura)
Pasos para obtener un frotis bacteriológico a partir de un medio de cultivo solido
•
Observar al Microscopio con objetivos de 10x y 40x. Describa sus observaciones
basados en tamaño, forma y motilidad de las bacterias.
Obtención de frotis microbiológicos.
Los frotis fijados de los microorganismos para su posterior tinción, son de uso universal y
se obtienen a partir o muestras colocadas directamente sobre el portaobjeto o mediante la
emulsión,
Tomar una lámina sobre ella agregar una pequeña gota solución salina. Con la ayuda de
un asa bacteriológica de punta redonda toma una colonia de microorganismos y proceder
a realizar una pequeña extensión delgada y homogénea. Dejar secar al medio ambiente
en posición adecuada, para proceder a adherir la muestra a la lámina portaobjetos una
vez seco el frotis pasar sobre la llama del mechero por 3 - 4 ocasiones según se muestra
en la figura.
Técnica de coloración diferencial Gram.
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Obtener un frotis bacteriológico fijado al calor.
Cubrir la muestra con solución de Cristal violeta por 1 minuto. Lavar con
abundante agua con la ayuda de un frasco lavador
Cubrir la muestra con solución de Lugol de Gram por 1 minuto. Lavar con
abundante agua con la ayuda de un frasco lavador
Decolorar la muestra con solución de Alcohol Acetona por 30 segundos. Lavar con
abundante agua con la ayuda de un frasco lavador
Cubrir la muestra con solución de Fucsina (Safranina) de Gram durante 1 minuto.
Lavar con abundante agua con la ayuda de un frasco lavador
Observar al Microscopio con objetivos de 10x, 40X y 100X (Agregar aceite de
inmersión).
Describa sus observaciones teniendo como parámetros el tamaño, la forma y las
características de tinción.
Interrogante para resolver antes de la práctica
1. ¿Qué es un cultivo de microorganismos puro?
2. Mencione tres técnicas diferentes de tinción diferencial.
3. ¿Qué son los mordientes? ¿En qué casos es necesario su uso?
Interrogantes para resolver después de elaborada la práctica.
1. ¿Observó diferencias entre los ambientes muestreados?
2. ¿Qué tipos de ambientes mostraron más crecimientos de bacterias?
Relaciónelo con las diferentes colonias que pudieron aparecer en las cajas
de Petri.
3. Explique el fundamento de la coloración de Gram. Señale las diferencias
entre bacterias Gram (+) y Gram (-).
4. Si existen microorganismos en el aire, piel, mesada de trabajo y demás
elementos del entorno ¿Qué precauciones debe tomar a la hora de realizar
un procedimiento clínico? Justifíquelo con la importancia que tiene ello para
su profesión.