19 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Estudios por

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Estudios por Espectroscopia de Fluorescencia
Estudios de Coordinación Metálica Hacia Zinc
En este trabajo se estudió el efecto de la coordinación hacia el ion metálico zinc en
los espectros de emisión de los ligantes 1-6 (Esquema II). Se realizaron una serie de
titulaciones espectrofotométricas a 25 °C y pH=7.2. Este pH se seleccionó por ser el más
cercano al intracelular. Todas las mediciones se realizaron por duplicado y se observó
reproducibilidad en todos los casos.
Al pH seleccionado, los seis ligantes estudiados presentan dos bandas de emisión
características, la de monómero (λ=380 nm) y la de excímero (λ=480 nm). En todos los
casos, excepto para el ligante (dtpa1py)H3 (ver Figura 9 ), tanto la banda de monómero
como la de excímero disminuyeron de intensidad al adicionar zinc (ver Figuras A1-A5). La
disminución de la intensidad de excímero (en %) fue mayor que la de monómero en todos
los casos y alcanzó una reducción de hasta 83.85% para (dtpa1mpy)H3 (ver Figura 10).
Dada
la naturaleza diamagnética del ion zinc, la pérdida de emisión de excímero puede
atribuirse a cambios en la conformación y aumento en la rigidez de las moléculas al
coordinarse al metal, lo que impide la aproximación de las unidades pireno en el estado
excitado. Las curvas de titulación indican estequiometrías de coordinación [M]:[L] de 1:4
para los ligantes que no tienen puente metileno: (edta1py)H2, (dtpa1py)H3 y (ttha1py)H4, y
de 1:2 para los que sí lo contienen: (edta1mpy)H2, (dtpa1mpy)H3 y (ttha1mpy)H4 (ver
Figuras 9 y 10 y A1-A5).
En el caso del ligante (dtpa1py)H3, la adición de zinc provocó una respuesta
radiométrica: aumento de intensidad de la banda de monómero (380 nm) y disminución de
intensidad de la banda de excímero (480 nm) (Figura 9). Este tipo de respuesta presenta
mayores ventajas analíticas que el apagamiento o amortización de la fluorescencia que
19
mostraron el resto de los ligantes, lo que sugiere el potencial de (dtpa1py)H3 para ser
utilizado como sensor radiométrico de zinc intracelular.
Los estudios de UV-Vis confirman la formación de los complejos de zinc en todos
los sistemas estudiados. Los espectros de absorción de los ligantes en su forma libre
muestran las tres bandas de absorción típicas de pireno a 233, 277 y 327 nm.42 En el caso
de los ligantes que contienen el grupo metileno como espaciador (ligantes 4-6), dichas
bandas muestran su estructura vibracional característica. Sin embargo, en los espectros de
los ligantes sin espaciador (1-3) las bandas de absorción aparecen ensanchadas (ver
Figuras A6-A11), lo cual se debe a la formación de dímeros intramoleculares de pireno en
estado basal, como fue reportado previamente para estas moléculas.13 La adición de zinc
provocó en todos los casos disminución de la absorbancia, ligeros desplazamientos hacia el
rojo de las bandas de absorción y la aparición de puntos isosbésticos bien definidos. Solo
en el caso de (dtpa1mpy)H3 se observó además de la disminución de la absorbancia,
ensanchamiento de las bandas en el UV-Vis (ver Figuras A6-A11). Los cambios
observados en los espectros de los ligantes pueden atribuirse a la coordinación de las
moléculas al zinc.
De igual manera, los espectros de excitación monitoreados durante las titulaciones
revelan la formación de los complejos. En las Figuras A12-A17 se muestran espectros de
excitación seleccionados para cada sistema, obtenidos a las dos diferentes longitudes de
onda de emisión: λem=380 nm (monómero) y 480 nm (excímero). Al igual que en el caso
del UV-Vis, la preasociación de las unidades pireno en los ligantes sin espaciador (1-3) se
manifiesta con ensanchamiento de las bandas de los espectros de excitación (Figuras A12,
A14 y A16), respecto como aparecen en los espectros correspondientes a los ligantes con
espaciador metileno (4-6, Figuras A13, A15 y A17), la adición de zinc provocó cambios en
la intensidad de ambos conjuntos de bandas, los cuales correlacionaron con los cambios
observados en los espectros de emisión. En el caso de los sistemas edta1py-Zn y dtpa1pyZn, además de la disminución de intensidad, la coordinación provocó desplazamiento al
rojo de las bandas en los espectros obtenidos a longitud de onda de emisión de excímero
(λem=480 nm).
20
1.2
2 eq
1.0
0 eq
0.8
IE/IM
Intensidad (u.a.)
0.6
0.8
0.4
0.2
0.0
0.6
0 eq
0.4
2 eq
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
[Zn]/[L]
0.2
0.0
400
450
500
550
600
650
 (nm)
Figura 9. Espectros de emisión del ligante (dtpa1py)H3 en presencia de zinc en el intervalo de
razones molares [Zn]/[L]=0.0–2.0.[L]=1x10-7 M, λexc=342 nm, T=25°C, pH=7.2 (buffer MOPS). Recuadro:
Razón de intensidades IE/IM en función de la razón molar [Zn]/[L]. I E= emisión a λ=480 nm; IM= emisión a
λ=380 nm.
1, (edta1py)H2
2, (dtpa1py)H3
1.0
3, (ttha1py)H4
4, (edta1mpy)H2
5, (dtpa1mpy)H3
Intensidad (u.a.)
0.8
6, (ttha1mpy)H4
0.6
0.4
0.2
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
[Zn]/[L]
Figura 10. Intensidad de emisión de excímero de los ligantes 1-6 en función de la razón molar
[Zn]/[L]=1x10-7 M, λexc=342 nm, T=25°C, pH=7.2 (buffer MOPS).
21
Estudios de Coordinación Metálica Hacia Calcio y Magnesio
Para determinar una posible selectividad hacia zinc, se evaluó la respuesta de los
seis ligantes en estudio hacia calcio y magnesio, los cuales son los principales cationes
interferentes a nivel intracelular. Los resultados de las mediciones se describen a
continuación.
La coordinación a calcio o magnesio de los ligantes (ttha1py)H4 y (ttha1mpy)H4
provocó respuestas fluorescentes similares a las observadas por efecto del zinc, esto es,
disminución de la intensidad de emisión tanto de excímero como de monómero (ver
Figuras A18-A21). Esto indica que estos receptores no podrían discriminar entre los tres
metales.
En el caso del ligante (dtpa1py)H3, las respuestas fluorescentes a calcio o magnesio
fueron distintas al efecto radiométrico encontrado por coordinación a zinc (Figura 9).
Como se puede observar en las Figuras A22 y A23 la presencia de calcio o magnesio
provoca disminución de la intensidad de emisión de excímero, sin efecto significativo en la
intensidad de emisión de monómero. Estos resultados indican que el ligante (dtpa1py)H3
puede detectar selectivamente al ion zinc, en presencia de calcio y/o magnesio, con base en
el incremento en la intensidad de emisión de monómero.
Por otra parte, los ligantes (edta1py)H2, (edta1mpy)H2 y (dtpa1mpy)H3, presentaron
respuestas radiométricas al coordinar a calcio: disminución de la intensidad de emisión de
excímero e incremento en la intensidad de emisión de monómero (ver Figuras 11-13). Este
tipo de respuesta no la presentó ninguno de los tres ligantes por coordinación a magnesio.
La unión a este metal provocó, en los tres casos, disminución en la intensidad de emisión
tanto de monómero como de excímero, similar a la coordinación a zinc (ver Figuras A24A26). Estos resultados indican que los ligantes (edta1py)H2, (edta1mpy)H2 y (dtpa1mpy)H3
puede detectar selectivamente al ion calcio, en presencia de zinc y/o magnesio, con base en
el incremento en la intensidad de emisión de monómero.
Como se señaló anteriormente, el ligante (dtpa1py)H3 presentó una respuesta
radiométrica por efecto del zinc, mientras que la coordinación a calcio o magnesio solo
22
provocó disminución de la intensidad de emisión de excímero, sin efecto significativo en la
intensidad de emisión de monómero.
Por otro lado, los ligantes (edta1py)H2, (edta1mpy)H2 y (dtpa1mpy)H3 presentaron
respuesta radiométrica hacia calcio, mientras que la coordinación a magnesio o zinc solo
provocó disminución de la intensidad de emisión, tanto de excímero como de monómero.
Estas respuestas diferenciadas sugieren que (dtpa1py)H3 podría detectar zinc en presencia
de calcio o magnesio y que los ligantes (edta1py)H2, (edta1mpy)H2 y (dtpa1mpy)H3
podrían detectar calcio en presencia de magnesio y/o zinc. Es por ello que se planearon
estudios de competitividad para determinar las selectividades de los ligantes hacia los
diferentes metales.
3.5
1.2
2 eq
3.0
Intensidad (u.a.)
1.0
0 eq
0 eq
IE/IM
2.5
2.0
1.5
1.0
0.8
0.5
2 eq
0.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
[Ca]/[L]
0.6
0.4
0.2
0.0
400
450
500
550
600
650
 (nm)
Figura 11. Espectros de emisión del ligante (edta1py)H2 en presencia de calcio en el intervalo de
razones molares [Ca]/[L]=0.0–2.0. [L]=1x10-6 M, λexc=342 nm, T=25°C, pH=7.2 (buffer MOPS). Recuadro:
Razón de intensidades IE/IM en función de la razón molar [Ca]/[L]. I E=emisión a λ=480 nm; IM=emisión a
λ=380 nm.
23
0.27
2 eq
1.2
0.24
0.21
IE/IM
Intensidad (u.a.)
0 eq
1.0
0.18
0.15
0.8
0.12
0.09
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
[Ca]/[L]
0.6
0.4
0 eq
0.2
2 eq
0.0
400
450
500
550
600
650
 (nm)
Figura 12. Espectros de emisión del ligante (edta1mpy)H2 en presencia de calcio en el intervalo de
razones molares [Ca]/[L]=0.0–2.0. [L]=1x10-6 M, λexc=342 nm, T=25°C, pH=7.2 (buffer MOPS). Recuadro:
Razón de intensidades IE/IM en función de la razón molar [Ca]/[L]. I E=emisión a λ=480 nm; IM=emisión a
λ=380 nm.
Intensidad (u.a.)
1.0
2 eq
0.60
0 eq
0.45
IE/I M
1.2
0.8
0.30
0.15
0.00
0.6
0.0
0.5
0 eq
0.4
1.0
1.5
2.0
[Ca]/[L]
2 eq
0.2
0.0
400
450
500
550
600
650
 (nm)
Figura 13. Espectros de emisión del ligante (dtpa1mpy)H2 en presencia de calcio en el intervalo de
razones molares [Ca]/[L]=0.0–2.0. [L]=1x10-6 M, λexc=342 nm, T=25°C, pH=7.2 (buffer MOPS). Recuadro:
Razón de intensidades IE/IM en función de la razón molar [Ca]/[L]. I E=emisión a λ=480 nm; IM=emisión a
λ=380 nm.
24
En el caso de (dtpa1py)H3, el estudio de competitividad no pudo efectuarse debido a
que en los experimentos preparatorios (ver metodología en Parte Experimental) no se
reprodujo el efecto observado en un inicio, además de que la intensidad de fluorescencia de
la molécula disminuyó significativamente. Esto se atribuyó a la descomposición o
contaminación de la muestra y, dado de que desde un inicio del trabajo se disponía de muy
poca cantidad, se prosiguió a sintetizar de nuevo dicho ligante, el cual al término de este
trabajo se encontraba apenas en la etapa de purificación. Los estudios de competitividad del
resto de los ligantes se llevaron a cabo con éxito y los resultados se muestran a
continuación.
Estudio de la selectividad de los ligantes (edta1py)H2, (edta1mpy)H2 y
(dtpa1mpy)H3 hacia calcio. En las Figuras 14 y 15, se muestran los espectros de
emisión de los complejos (edta1py)H2-Mg y (edta1py)H2-Zn, respectivamente, en
presencia de diferentes concentraciones de calcio. Como se puede observar, el ligante
es selectivo a calcio ya que prevalece la respuesta radiométrica mostrada para este
metal aún en presencia de los metales competidores (ver Figura 13). Esta preferencia
por calcio puede estar relacionada con el radio iónico de este catión (0.99 Å), el cual es
mayor que el de zinc o magnesio (0.74 Å y 0.65 Å respectivamente). El arreglo
conformacional de la molécula en el complejo (edta1py)H2-Zn desfavorece la
formación de excímero, pero al mismo tiempo inhibe de procesos de desactivación no
radiativos, lo que resulta en un notable incremento de la intensidad de emisión de
monómero de pireno.
Por otra parte, el efecto de la adición de calcio a los complejos de zinc o magnesio
de los ligantes (edta1mpy)H2 y (dtpa1mpy)H3 fue distinto al observado previamente
(Figuras 12 y 13), esto es, no se mantiene la respuesta radiométrica. En todos los casos,
excepto para el complejo (dtpa1mpy)H3-Zn, se presentó una disminución de la intensidad
de ambas bandas (monómero y excímero) (ver Figuras A27-A29). Este efecto indica que
los ligantes (edta1mpy)H2 y (dtpa1mpy)H3, los cuales presentan cadenas de interconexión
de mayor longitud que (edta1py)H2, no tienen preferencia por calcio. La disminución de la
intensidad de emisión puede deberse a la formación de complejos metálicos mixtos menos
emisivos, o bien, a reacciones de intercambio rápido que cancelan la fluorescencia por vías
25
de desactivación no radiativas. En el caso del complejo (dtpa1mpy)H3-Zn, la adición de
calcio provocó un incremento en la intensidad de emisión en todo el intervalo de longitudes
de onda (ver Figura A30), lo cual sugiere la formación de complejos mixtos más emisivos.
2 eq
4.0
1.2
3.5
3.0
2.5
IE/I M
1.0
0 eq
2.0
Intensidad (u.a.)
1.5
1.0
0 eq
0.8
0.5
0.0
0.0
0.6
2 eq
0.5
1.0
1.5
2.0
[Ca]/[L-Mg]
0.4
0.2
0.0
400
450
500
550
600
650
 (nm)
Figura 14. Espectros de emisión del complejo (edta1py)H2-Mg en presencia de calcio en el intervalo
de razones molares [Ca]/[L]=0.0–2.0. [L-Mg]=1:2, [L]=1x106 M, λexc=342 nm, T=25°C, pH=7.2 (buffer
MOPS). Recuadro: Razón de intensidades IE/IM en función de la razón molar [Ca]/[L-Mg]. IE=emisión a
λ=480 nm; IM=emisión a λ=380 nm.
26
2 eq
4.0
0 eq
1.2
3.5
3.0
0 eq
Intensidad (u.a.)
2.5
IE/I M
2 eq
1.0
2.0
1.5
1.0
0.8
0.5
0.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
[Ca]/[L-Zn]
0.6
0.4
0.2
0.0
400
450
500
550
600
650
 (nm)
Figura 15. Espectros de emisión del complejo (edta1py)H 2-Zn en presencia de calcio en el intervalo
de razones molares [Ca]/[L]=0.0–2.0. [L-Zn]=1:2, [L]=1x106 M, λexc=342 nm, T=25°C, pH=7.2 (buffer
MOPS). Recuadro: Razón de intensidades IE/IM en función de la razón molar [Ca]/[L-Zn]. IE=emisión a
λ=480 nm; IM=emisión a λ=380 nm.
27