Fisiología del Sistema Nervioso

TP Hipocampo: Fisiología del Sistema Nervioso
Guía de Trabajos Prácticos
“Estudio de la inhibición di-sináptica en el mismo sentido que la excitación (feed-forward
inhibition) en el hipocampo”
Autor: Dr. Francisco J. Urbano, JTP DFBMC, Área de Neurociencias.
Esquema general
1) Las colaterales de Schaffer son aferentes glutamatérgicos que contactan simultáneamente
interneuronas GABAérgicas de disparo rápido y pirámides de la capa CA1 del Hipocampo.
2) La excitación de las interneuronas GABAérgicas controla la duración y la fase de excitación
de las pirámides.
3) Las propiedades intrínsecas de las interneuronas GABAérgicas (canales de sodio, calcio,
potasio voltaje dependientes) les permiten procesar aferentes sinápticos a altas
frecuencias (40 Hz o mayores)
Introducción
Durante los TP anteriores se describió en profundidad los eventos necesarios para la liberación
del neurotransmisor (ACh) desde la terminal nerviosa de una motoneurona y la subsiguiente
respuesta post-sináptica en la placa neuromuscular de vertebrados. En particular, se hizo énfasis
previamente en la necesaria sincronización temporal de la entrada de Ca 2+ por canales voltajedependientes tras la llegada de un potencial de acción a la terminal, como requisito necesario
para llevarse a cabo la exocitosis de neurotransmisor.
Para el presente TP vamos a usar el hipocampo de ratón, como un modelo de modulación
sináptica más complejo que la unión neuromuscular. El hipocampo es una estructura del sistema
límbico (junto con la amígdala y el giro cingulado) y está implicado en la memoria, motivación y
emoción. La lesión bilateral del hipocampo puede producir amnesia anterógrada severa y cuando
las lesiones del hipocampo se extienden a las regiones adyacentes la severidad de los problemas
de memoria aumentan. La lesión unilateral del
hipocampo da lugar a dificultades de memoria
diferenciales. La lesión del hipocampo izquierdo
altera la memoria verbal y la del derecho la
memoria visual.
La información proveniente de otras áreas del
cerebro entra al circuito del hipocampo por la vía
perforante desde la corteza entorrinal y es
procesada por el circuito trisináptico del
hipocampo (Figura 1, Celulas grano del giro
dentado-CA3-CA1).
Al contrario de lo que sucede en la unión
neuromuscular, la liberación de múltiples tipos
de neurotransmisores (principalmente Glutamato, GABA) no sólo se debe a la entrada de calcio
en las terminales presinápticas, sino que se encuentran
modulados por aferentes sinápticos que controlan
también la célula postsináptica. Es lo que se denomina la
inhibición di-sináptica en el mismo sentido de la
excitación o “feed-forward inhibition” (Figura 2).
Este tipo de inhibición está caracterizada por la
estimulación simultánea de una neurona GABAérgica
(Figura 2, IN) y una pirámide (Fig. 2, CA1 Pyramid) por parte de los mismo aferentes
glutamatérgicos provenientes de las pirámides de CA3 (Fig. 2; Schaffer Collaterals).
La actividad eléctrica resultante de la transmisión excitatoria y su correspondiente “feed-forward
inhibition” en las células piramidales de CA1
puede ser estudiada tanto a nivel de los somas
(Figura 3A,B pyr) como de las dendritas apicales
(situadas en el stratum radiatum, Figura 3A,B rad)
usando electrodos extracelulares. Las señales
obtenidas con electrodos extracelulares se
denominan potenciales de campo o “field
potentials” (Figura 3C). La forma de dichos
potenciales de campo cambia de acuerdo al tipo y
localización
de
los
receptores/canales
transmembrana que se abren durante la
estimulación sináptica (Figura 3C).
Objetivos
Familiarizar a los alumnos con el uso de rodajas de cerebro para el estudio de interacciones
sinápticas excitatorias/inhibitorias en combinación con técnica de registro extracelular.
Evaluar el grado de excitación en el área de registro de acuerdo a la pendiente de los potenciales
de campo.
Desarrollo
Mediciones de potenciales de campo en el stratum radiatum durante la estimulación de las
colaterales de Schaffer usando pulsos pareados de 10 Hz y
40 Hz.
Se evaluarán las pendientes de subida (Figura 4) de las
respuestas de los potenciales de campo en presencia y
ausencia de antagonistas de los receptores de GABA-A
que se sabe median la “feed-forward inhibition” .
Se discutirá el concepto de eficiencia de inhibición a altas y
bajas frecuencias vs. Propiedades intrínsecas de las
interneuoras.
Materiales y Métodos
Se utilizarán ratones macho adultos de la cepa Suiza de 30-40g de peso corporal. Hasta el
momento de su utilización, se los mantiene en el bioterio bajo régimen de 12 horas de luzoscuridad, con agua y alimento balanceado ad libitum.
Se sacrifica a los animales por medio de una sobredosis de anestesia (tribomoetanol al 2% en
H2O biodestilada, 0.3 ml/10g de peso corporal, i.p.) y posterior desangrado. Se remueve el
cerebro en una solución extracelular a 0o C de composición: NaCl, 137; KCl, 5; CaCl2, 2; MgSO4,
1; NaHCO3, 12; NaH2PO4, 1; D-glucosa, 11, saturada con carbógeno (95% O2, 5% CO2). Las
rodajas de hipocampo se van a obtener usando un vibrátomo para cortar de forma coronal el
cerebro en rodajas de 300 micras. Las rodajas se van a dejar en reposo a 35°C durante media
hora, en una camarita que mantiene durante todo el experimento bajo burbujeo constante con
carbógeno.
Registros de potencial de campo
La cámara de registros, sobre la cual se monta la preparación a estudiar, se coloca sobre la
platina del microscopio del sistema de registros eletrofisiológicos de patch-clamp. Se va a utilizar
una técnica convencional de patch-clamp en su modo de fijación de corriente (“current-clamp”).
Los microelectrodos se preparan a partir de capilares de borosilicato de aluminio con
microfilamento (Corming #6030) en un estirador de pipetas marca Brown-Corning y luego son
llenados con la misma solución extracelular de registro. Se ajustan las condiciones del estirador
de pipetas de manera de obtener electrodos de resistencia de entre 0.5 y 2 M.
El microelectrodo de registro se conecta al cabezal de un amplificador Axopatch 700. Como
referencia se usa un electrodo de Ag-AgCl distante, conectado a la solución del baño. El cabezal
del amplificador se halla montado sobre un micromanipulador que permite realizar movimientos
finos del microelectrodo en los tres ejes del espacio. La salida del amplificador se visualizará
usándose el programa clampex 10.3 (Axon Instruments), en una computadora personal.
La estimulación de las colaterales de Schaffer se va a realizar usando unos electrodos de platino
conectados a una unidad de estimulación que nos permitirá controlar la intensidad y la duración
de dichos estímulos.
Las medidas de la pendiente se harán posteriormente al registro usando el programa Calmpfit
10.3 de acuerdo a lo que indicará el JTP de ese turno.