liposomas encapsulando farmacos anticancerosos y uso de los

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
2 186 484
kNúmero de solicitud: 200002447
kInt. Cl. : A61K 9/127
11 Número de publicación:
21
7
51
ESPAÑA
A61P 35/00
k
12
SOLICITUD DE PATENTE
k
71 Solicitante/s: LIPOTEC, S.A.
k
72 Inventor/es: Parente Dueña, Antonio;
k
74 Agente: Dávila Baz, Angel
22 Fecha de presentación: 10.10.2000
k
Santa Eulàlia, 236-240
08902 L’ Hospitalet de Llobregat, Barcelona, ES
43 Fecha de publicación de la solicitud: 01.05.2003
k
Pons Labiez, Ferran;
Fabra Fres, Angel;
Polo Trasancos, Marı́a Dolores;
Garcés Garcés, Josep y
Reig Isart, Francesca
43 Fecha de publicación del folleto de la solicitud:
01.05.2003
k
A1
k
54 Tı́tulo: Liposomas encapsulando fármacos anticancerosos y uso de los mismos en el tratamiento
de tumores malignos.
k
57 Resumen:
ES 2 186 484 A1
Liposomas encapsulando fármacos anticancerosos y
uso de los mismos en el tratamiento de tumores malignos. Los liposomas están recubiertos por un lipopéptido compuesto por tres subestructuras: un
fragmento lipı́dico, un oligopéptido activo y un oligopéptido espaciador entre los otros dos fragmentos. Aplicable en la administración intravenosa para
el tratamiento de tumores malignos.
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 186 484 A1
DESCRIPCION
Liposomas encapsulando fármacos anticancerosos y uso de los mismos en el tratamiento de tumores
malignos.
5
10
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con la obtención de un sistema de tratamiento anticanceroso capaz de destruir selectivamente las células cancerosas en el interior de un ser vivo si afectar al resto de
células del organismo tratado. Más particularmente, la invención se relaciona con liposomas conteniendo
fármacos anticancerosos de utilidad en el tratamiento antes indicado.
Estado de la técnica
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
El cáncer es una de las enfermedades más importantes de los paı́ses desarrollados y, concretamente,
las metástasis tumorales son la principal causa de mortalidad en pacientes con tumores sólidos malignos.
Consisten en la aparición de un nuevo foco canceroso, a partir de un tumor primario, en otro órgano o
tejido diferente. Este proceso metastásico incluye una serie de etapas secuenciales en las cuales las células
tumorales deben interaccionar con los componentes celulares y los tejidos del huésped. Estas etapas son
como sigue: separación de células tumorales de un tumor primario; invasión del espacio intravascular;
migración por el sistema vascular o linfático hacia otros tejidos: adhesión al endotelio vascular; extravasación e invasión del nuevo tejido; y formación del tumor secundario.
A lo largo de todo este proceso, las células tumorales metastásicas interaccionan con los componentes
de las matrices extracelulares y, concretamente, con las membranas basales, mediante su adhesión a ellas,
provocando su degradación por la acción de enzimas proteolı́ticos producidos por ellas mismas y/o por
las propias células huésped, estimuladas por las células tumorales. Por lo tanto, la modificación de las
propiedades de adhesión celular es un elemento indispensable para la aparición de metástasis, ya que
es un proceso ligado a la liberación de células del tumor inicial, a su migración y a su implantación en
nuevos tejidos.
Las principales moléculas de adhesión que intervienen en esta interacción son las integrinas. Las
integrinas son una familia de glicoproteı́nas transmembranales, formadas por dos cadenas α y β unidas
por fuerzas no covalentes (hidrófobas). Entre otras funciones, las integrinas actúan como receptores de
determinadas proteı́nas de la matriz extracelular, como la Laminina, la Fibronectina, la Vitronectina y
el Colágeno (Ruoslahti, E., Giancotti, F.G., Cancer Cells (1989), 1, 4, 119-126.). Recientemente se ha
demostrado un cambio en la expresión de las integrinas en las células tumorales, de tal forma que aumenta su presencia en este tipo de células (Dedhar, S., Saulmier, R., J. Cell Biol. (1990), 11, 481-489.).
Este aumento es el responsable de la adhesión a la matriz extracelular y de la adquisición de potencial
metastásico.
El principal tratamiento empleado para la eliminación de tumores es la administración de citostáticos
por vı́a endovenosa, especialmente los pertenecientes a la familia de las antraciclinas (Young, R.C., Ozols,
R.F., Myers, C.E., N. Eng. J. Med. (1981), 305, 139-153.). Pero, debido a su falta de selectividad respecto las células tumorales, al desarrollo de resistencias a estos fármacos por parte de las células malignas
y a la diferente respuesta del tumor primario y de las metástasis respecto a su acción, este tipo de terapia suele dar lugar a la aparición de importantes efectos secundarios, algunos de ellos de tipo crónico o
irreversible.
Por lo tanto, el principal objetivo de la quimioterapia actual se centra en conseguir aumentar la eficacia antitumoral y disminuir la toxicidad de estos fármacos. Una manera de conseguirlo podrı́a consistir en
hacer llegar el citostático, en una concentración adecuada, a las células diana, produciendo la destrucción
selectiva del tumor primario o de las metástasis sin que se viera afectada ninguna célula sana. De esta
forma se producirı́a un aumento del ı́ndice terapéutico del fármaco, consiguiéndose terapias más efectivas.
En estos sistemas la droga se incorpora en los espacios acuosos liposomales cuando es hidrofı́lica o
se distribuye entre éstos y las bicapas lipı́dicas cuando presenta una mayor carácter lipofı́lico. Una vez
encapsulada la droga, puede ser administrada al paciente a tratar.
Ha quedado establecido por diversos investigadores que el empleo de liposomas para la administración
de antineoplásicos mejora en muchos casos los métodos tradicionales de administración, ver por ejemplo:
Gabizon et al.: Cancer Res. (1982) 42, 4734-4739 y Van Hossel et al.: Cancer Res. (1984) 44, 36983705.
2
ES 2 186 484 A1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Se ha observado mediante la utilización de diversos modelos animales que la encapsulación de doxorubicina en liposomas reduce significativamente los efectos secundarios de toxicidad, tanto crónicos como
agudos. Ver, a tı́tulo de ejemplo, Rahman et al.: Cancer Res. (1980) 40, 1532-1537, Forssen et al.:
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78, 1873-1877, Olson et al.: Eur. J. Cancer Clin. Oncol. (1982)
18, 167-176, Rahman et al.: Cancer Res. (1985) 45, 796-803 y Gabizon et al.: J. Natl. Cancer Inst.
(1986) 77, 459-467. Adicionalmente, otros indicadores de toxicidad, tales como la alopecia, pérdida de
peso, náuseas, vómitos, y ası́ como la necrosis dermal producida por extravasación pueden ser reducidos
de una forma significativa por la administración de doxorubicina en liposomas. Forssen et al.: Cancer
Treat. Rep. (1983) 67, 481-484; ver además las referencias citadas anteriormente en este párrafo.
Asimismo, ha quedado establecido en diversos modelos tumorales que esta significativa reducción de
la toxicidad no se produce a expensas de una disminución de la eficacia antitumoral. Además de las referencias reseñadas anteriormente, ver Rahman et al.: Chemoter. Pharmacol. (1986) 16, 22-27, Gabizon
et al.: Cancer Res. (1983) 43, 4730-4735 y Br. J. Cancer (1985) 51, 681-689, Mayhew et al.: J. Natl.
Cancer Inst. (1987) 78, 707-713, Forssen et al.: Cancer Res. (1983) 43, 546-550, y Storm et al.: Cancer
Res. (1987) 47, 3366-3372.
Dada la incidencia y las especiales caracterı́sticas de las metástasis cancerosas, la terapia antimetastásica es uno de los campos en los que más esfuerzo se ha invertido para la búsqueda de nuevas
alternativas a los tratamientos convencionales. Por sus mecanismos de acción, su alta eficacia demostrada y su elevada toxicidad, las antraciclinas son la familia de citostáticos más estudiada en el campo de
la encapsulación de fármacos en sistemas de liberación controlada como son los liposomas, lo que puede
apreciarse al considerar el número de patentes que han ido apareciendo sobre este tema, de las que un
80 % del total de las existentes para liposomas son aplicadas a citostáticos.
La primera generación de liposomas conteniendo antraciclinas correspondı́a a vesı́culas formadas por
PC, PG y colesterol, en cuyo espacio interno acuoso se encapsulaba la droga. Estos liposomas mostraron
una disminución de la toxicidad del fármaco, aunque su actividad antitumoral no fue superior a la de la
droga libre, únicamente mejoraron la actividad de la droga en el caso de modelos tumorales en los que
las células metastásicas se difunden por el hı́gado, órgano más accesible a los liposomas, pero no cuando
el crecimiento tumoral es local (Mayhew, E., Rustum, Y., Biol. Cell. (1983), 47, 81-86.). Además,
debido a su rápida captación por parte de los macrófagos del retı́culo endoplasmático, su permanencia en
el organismo después de la inyección intravenosa se reducı́a a unas pocas horas. Por eso, y a pesar de los
intensos estudios llevados a cabo, no habı́a ninguna formulación que satisfaciera las expectativas puestas inicialmente en los liposomas como transportadores de citostáticos. Fue durante los años 80 cuando
la situación cambió con la aparición de las primeras publicaciones en las que se describı́an liposomas
que presentaban glicolı́pidos (Allen, T.M., Hansen, C., Rutledge, J., Biochim. Biophys. Acta (1989),
981, 27-35.; Mori, A., Klivanov, A.L., Torchilin, V.P., Huang, L., FEBS Lett. (1991), 284, 263-266) o
polı́meros hidrófilos como el polietilenglicol (PEG) (Blume, G., Cevc, C., Biochim. Biophys. Acta (1990),
1029, 91-97; Allen, T.M., Hansen, C., Martin, F., Redemann, C., Yau-Young, A., Biochim. Biophys.
Acta (1991), 1066, 29-36.) en su superficie con el fin de aumentar su tiempo de circulación en sangre,
obteniéndose los llamados “liposomas de segunda generación” o “liposomas estéricamente estabilizados”
(“Stealth liposomes”). Parece ser que este efecto estabilizante del PEG y los glicolı́pidos se debe a sus
propiedades hidrófilas que evitan que se formen agregados en la superficie del liposoma y permiten que
no sea reconocido como ligando de ningún receptor celular ni de ninguna proteı́na plasmática. Además,
su presencia en la superficie de los liposomas ejerce un efecto estérico, ya que dificulta la acción de las opsoninas y de otras proteı́nas de la sangre, y disminuye la accesibilidad de los receptores de los macrófagos
a los grupos fosfato de los fosfolı́pidos, lo que se traduce en un aumento del tiempo de circulación en
sangre.
Posteriormente algunos autores encontraron que se podı́an mejorar las caracterı́sticas de estabilidad
y eficacia de estos liposomas mediante la incorporación de aditivos inhibidores de la peroxidación lipı́dica
como la vitamina E acetato, el BHT o los derivados de los cromanos (EP-0274174, WO-8500968, WO9202208 y US-5605703).
A pesar de que estas formas galénicas presentan una serie de ventajas claras respecto a las formas
convencionales, queda pendiente la posibilidad de direccionar las vesı́culas a células diana a fin de mejorar
la efectividad con menores dosis de droga y de eliminar o reducir efectos secundarios.
La idea base es incorporar a la superficie del liposoma algún ente quı́mico susceptible de ser reconocido
3
ES 2 186 484 A1
selectivamente por las células diana. El éxito en el direccionamiento de los liposomas hacia las células
diana reside en la elección adecuada de la molécula vector.
5
10
15
El proceso de selección de alguna estructura quı́mica capaz de direccionar los liposomas a células
tumorales no es en absoluto trivial, pues concretamente en el caso de las células tumorales existe una
gran diversidad de proteı́nas localizadas en la membrana ası́ como de antı́genos y receptores de superficie
que varı́an según la potencia metastásica, la actividad proliferativa y el tejido de que se trate, de tal
forma que, aunque podrı́an ser utilizados como base para seleccionar estructuras de reconocimiento, en
la práctica la elección no es inmediata. Por otra parte, en muchos casos la situación real es que las
células tumorales y/o proliferantes presentan como hecho diferencial la sobreexpresión de determinadas
estructuras respecto a las células normales.
Los conocimientos acumulados hasta el momento indican que los procesos de adhesión y las proteı́nas
involucradas juegan un papel primordial en la evolución del proceso metastásico y de la vascularización
necesaria para la proliferación celular.
De entre las proteı́nas más involucradas en estos mecanismos, la Laminina ha resultado ser una buena
candidata para el direccionamiento de los liposomas, ya que se ha demostrado de manera concluyente
que sus receptores se hallan sobreexpresados en las células tumorales.
20
25
La Laminina es el componente mayoritario de la membrana basal de las células después del colágeno.
Se trata de una glicoproteı́na formada por 3 cadenas polipeptı́dicas: α (440 kDa), β (200 kDa) y γ (220
kDa), que se disponen en forma de cruz, con dos brazos cortos y uno largo. Las uniones entre las cadenas
son por puentes disulfuro y por interacciones de tipo no covalente, formando una molécula asimétrica en
la que se localizan dominios estructurales diferentes.
Las células presentan diferentes receptores especı́ficos de membrana que reconocen secuencias peptı́dicas y/o dominios funcionales de la molécula de la Laminina. Estos receptores se pueden clasificar en
dos grupos: integrinas y no-integrinas.
30
35
40
Las integrinas están constituidas por dos cadenas polipeptı́dicas transmembrana, α y β, asociadas
no covalentemente. Estas moléculas son los receptores a través de los que las células se adhieren a los
componentes de la matriz extracelular. Algunas de ellas también intervienen en el reconocimiento célulacélula. Cada una reconoce secuencias peptı́dicas especı́ficas que están presentes en las moléculas de la
matriz, como por ejemplo la Laminina.
Entre los receptores de tipo no-integrina, el más estudiado es el receptor de 67 kDa para la Laminina,
y ha sido aislado e identificado a partir de diversos tejidos celulares, entre ellos los carcinomas. Además,
se ha comprobado que las células tumorales metastásicas expresan en su superficie celular más receptores
para la Laminina que las células normales, por lo que se podrı́a considerar este receptor como un marcador de la progresión tumoral y como indicador de la agresividad de muchos tipos de tumores.
La Laminina presenta diversas actividades metastásicas, como son:
45
- causar la adhesión, el crecimiento y la extensión celulares;
- estimular la diferenciación de células epiteliales y tumorales;
- provocarla migración celular;
50
55
- facilitar la malignidad de las células tumorales por su presencia en la superficie, lo que hace aumentar
su invasividad y su actividad metastásica.
Determinados estudios han demostrado que las diferentes funciones de la Laminina están mediatizadas por secuencias peptı́dicas especı́ficas presentes en la molécula de la Laminina, como son: la secuencia
de cinco aminoácidos SIKVAVS, que se encuentra situada en el fragmento PA22-2 de la cadena α de la
Laminina. Concretamente, la zona más activa de esta región es el pentapéptido SIKVAVS.
Resumen de la invención
60
Actualmente los estudios sobre liposomas están encaminados a su direccionamiento o “targeting”
hacia las células tumorales mediante la incorporación en la superficie de las vesı́culas de ligandos, como
pueden ser anticuerpos, péptidos y proteı́nas, capaces de reconocer y de unirse especı́ficamente a este tipo
4
ES 2 186 484 A1
de células (Allen, T.M., Austin, G.A., Chonn, A., Lin, L., Lee, K.C., Biochim. Biophys. Acta (1991),
1061, 56-63.).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Por tanto, el objeto de la presente invención consiste en una nueva aplicación para drogas anticancerosas encapsuladas en liposomas, que presentan como caracterı́stica principal el estar recubiertos por
lipopéptidos procedentes de la estructura de las lamininas -especialmente la secuencia SIKVAVS- de
forma que los liposomas ası́ preparados muestran una elevada selectividad hacia las células tumorales,
aumentando de esta forma la eficacia de la droga anticancerosa encapsulada.
Significado de las abreviaturas usadas en la invención
DXR:
PC:
PL:
PG:
CHOL:
CROM:
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
Lam2M:
Lain9:
Lam9Cys:
Lam9Cys-b-Ala
AG-10:
(E8)-2-4G:
mir:
DOX:
Doxorubicina
Fosfatidilcolina
Fosfolı́pidos de huevo hidrogenados
Fosfatidilglicerol
Colesterol
Cromano-6
Ala
Cys
Asp
Glu
Phe
Gly
His
Ile
Lys
Leu
Met
Asn
Pro
Gln
Arg
Ser
Thr
Val
Trp
Tyr
miristoil-PEGAD
miristoil-YESIKVAVS
miristoil-CYESIKVAVS
miristoil-AAAAACYESIKVAVS
GYSRARKEAASIKVAVSARKE
NPWHSIYITRFG
miristoil
Doxorubicina
Alanina
Cisteı́na
Acido aspártico
Acido glutámico
Fenilalanina
Glicina
Histidina
Isoleucina
Lisina
Leucina
Metionina
Asparragina
Prolina
Glutamina
Arginina
Serina
Treonina
Valina
Triptófano
Tirosina
Descripción detallada de la invención
55
60
La presente invención está relacionada con la preparación y uso de liposomas conteniendo drogas
anticancerosas.
Los liposomas de la presente invención presentan como caracterı́stica principal el estar recubiertos
por fragmentos de péptidos derivatizados hidrofóbicamente (lipopéptidos recubrientes) de forma que los
liposomas ası́ preparados presentan una elevada selectividad (“targeting”) hacia las células tumorales,
aumentando de esta forma la eficacia de la droga anticancerosa encapsulada.
Sorprendentemente se comprobó que los lipopéptidos recubrientes activos in vitro antes de incorporarlos en liposomas, perdı́an totalmente su capacidad de direccionamiento al incorporarlos en liposomas, por
5
ES 2 186 484 A1
lo que, según la invención, se diseñaron unos espaciadores peptı́dicos que, intercalados entre la secuencia
activa y la cadena lipófila del lipopéptido recubriente, sorprendentemente, permitı́an el mantenimiento
de la actividad direccionadora de la secuencia peptı́dica activa.
5
De este modo, la estructura del lipopéptido recubriente (péptido derivatizado hidrofóbicamente) es
como sigue:
10
15
20
25
Por tanto, el objeto de la presente invención reside en la preparación y uso de liposomas conteniendo
drogas anticancerosas, que en su superficie presentan fragmentos peptı́dicos derivatizados de la Laminina (lipopéptidos recubrientes), compuestos de los siguientes tres bloques estructurales: un fragmento
lipı́dico, un oligopéptido activo y un oligopéptido espaciador entre los otros fragmentos.
Los fragmentos lipı́dicos son ácidos grasos de longitud de cadena carbonada entre C6 y C20. Más
concretamente decanoil, miristoil y estearoil.
El fragmento espaciador consiste en oligopéptidos sin actividad sobre la Laminina de una longitud
comprendida entre cinco y diez residuos de aminoácidos. Más concretamente con una longitud de siete a
nueve residuos de aminoácidos, y más concretamente las secuencias AAAAACYE, SSAAACYE y RKERKECYE.
La secuencia activa consiste en el oligopéptido SIKVAVS.
30
35
40
Los lı́pidos formadores de liposomas son ampliamente conocidos. Generalmente se incluyen fosfolı́pidos, con carga neta neutra y/o negativa, y un esterol, como el colesterol. La elección de los lı́pidos
se realiza en base a las necesidades respecto al tamaño liposomal final, a la droga a encapsular y a la
estabilidad que se desee para la preparación. Usualmente, el mayor componente lipı́dico de los liposomas
es la fosfatidilcolina (PC). Las PCs difieren entre si en la longitud y grado de saturación de sus cadenas
acı́licas, y pueden ser aisladas de fuentes naturales o sintetizadas. La inclusión de un fosfolı́pido cargado
negativamente favorece a la estabilidad de la solución liposomal previniendo la agregación espontánea de
los liposomas.
Los fosfolı́pidos con carga negativa más utilizados son el fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilserina (PS)
y el fosfatidilinositol (PI), entre otros. La proporción utilizada, de fosfolı́pido neutro a fosfolı́pido con
carga negativa va desde un 10:2 a 10:10 respectivamente. La inclusión de colesterol generalmente favorece
la estabilidad de los liposomas haciendo disminuir la permeabilidad de la membrana a iones y pequeñas
moléculas polares, y asimismo, reduce la capacidad de penetración de una serie de proteı́nas entre las
bicapas que podrı́an determinar un mayor desorden en las mismas. Tı́picamente, la proporción de colesterol utilizada va del 0 al 50 % del total de lı́pidos.
45
Opcionalmente, los liposomas objeto de la presente invención, pueden contener aditivos que permitan
mejorar sus caracterı́sticas de estabilidad o reducir la toxicidad de la droga encapsulada. Por ejemplo, se
pueden citar los inhibidores de la oxidación lipı́dica como los descritos en las patentes US 5605703, EP
0274174, WO-8500968 o WO-9202208.
50
Los fármacos anticancerosos que se pueden encapsular en los liposomas de la presente invención incluyen, pero no de forma limitativa:
Análogos de la mostaza nitrogenada como la Ciclofosfamida; el Melfalan; la Ifosfamida; o la Trofosfamida;
55
Etileniminas como la Tiotepa;
Nitrosoureas como la Carmustina;
60
Agentes alquilantes como la Temozolomida; o la Dacarbazida;
Antimetabolitos Análogos del Acido Fólico como el Metotrexato o el Raltitrexed;
6
ES 2 186 484 A1
Análogos de Purinas como la Tioguanina, la Cladribina o la Fludarabina;
Análogos de Pirimidinas como el Fluorouracilo, el Tegafur o la Gemcitabina;
5
Alcaloides de la Vinca y Análogos como la Vinblastina, la Vincristina, o la Vinorelbina;
Derivados de Podofilotoxina como el Etoposido, los Taxanos, el Docetaxel o el Paclitaxel;
Antraciclinas y similares como la Doxorubicina, la Epirubicina, la Idarubicina o la Mitoxantrona;
10
Otros Antibióticos Citotóxicos como la Bleomicina, o la Mitomicina;
Compuestos de Platino como el Cisplatino, el Carboplatino o el Oxaliplatino;
15
Anticuerpos Monoclonales como el Rituximab;
Otros Agentes Antineoplasicos como la Pentostatina, la Miltefosina, la Estramustina, el Topotecan, el
Irinotecan, o la Bicalutamida.
20
De acuerdo con lo descrito anteriormente, los liposomas de la presente invención presentan las siguientes caracterı́sticas:
a) Una concentración lipı́dica entre 1 y 100 mg/ml, y preferiblemente alrededor de 10 mg/ml.
25
b) Los lı́pidos componentes son fosfolı́pidos, tanto de origen natural como sintético, y colesterol.
c) La proporción de colesterol, con respecto a la cantidad de lı́pidos totales, está entre el 0 y el 50 %,
de preferencia entre el 35 y 50 %.
30
d) Los fosfolı́pidos presentes son fosfatidilcolina, que no presenta carga neta, y opcionalmente otro
fosfolı́pido cargado negativamente, de preferencia el fosfatidilglicerol.
e) La relación del fosfolı́pido neutro al cargado negativamente está comprendida entre el 10:2 y 10:10
y de preferencia entre 10:7 y 10:10, respectivamente.
35
40
f) Opcionalmente los liposomas pueden contener otros aditivos como por ejemplo inhibidores de la
oxidación lipı́dica como los descritos en las patentes US 5605703, EP 0274174, WO-8500968 o
WO-9202208.
g) La concentración de péptido osciları́a entre 0,1 y 1 mg/mL y preferiblemente alrededor de 0,5
mg/mL.
h) Los liposomas se forman en una solución acuosa, tamponada o no, fisiológicamente isotónica. Por
ejemplo, NaCl 0,9 %.
45
i) El tamaño de los liposomas será en cualquier caso inferior a 500 nm, de preferencia inferior a 300
nm y más especı́ficamente entre 50 nm y 250 nm.
Preparación de los liposomas e incorporación del fármaco
50
55
Un método preferido es el que presentaron Bangham et al. en el que se obtienen liposomas multilamelares (MLVs) de tamaño heterogéneo. En este método, los lı́pidos formadores se disuelven en un disolvente
orgánico adecuado que posteriormente es eliminado por rotaevaporación bajo vacı́o. La pelı́cula lipı́dica
formada se somete a hidratación con un medio acuoso adecuado conteniendo el fármaco, mediante agitación manual o mecánica. La suspensión heterogénea de MLVs se somete a cualquiera de las técnicas
conocidas de reducción y homogeneización de tamaños. Por ejemplo, dos procedimientos preferidos son
la sonicación con sonda de titanio para obtener liposomas SUVs y la extrusión a través de filtros de
policarbonato de la solución de MLVs para obtener liposomas VETs.
Preparación de los fragmentos peptı́dicos
60
La sı́ntesis de los péptidos se llevó a cabo siguiendo el método en fase sólida de Merrificid (1962) con
estrategia Fmoc/tBu.
7
ES 2 186 484 A1
Incorporación del lipopéptido
5
Los lipopéptidos utilizados eran acil-oligopéptidos, siendo de preferencia el grupo acilo cadenas hidrocarbonadas saturadas lineales de longitud C6 a C20, preferentemente el grupo decanoil, el miristoil o el
estearoil. Los lipopéptidos, se mezclaron con el resto de componentes que constituirı́an los liposomas o
bien, se incorporaron a los liposomas mediante la incubación a 60◦C de estos lipopéptidos y las vesı́culas,
ya que al estar las bicapas en estado de gel permiten la incorporación de la parte hidrófoba de estos
derivados en su interior. En ambos casos, la zona hidrófoba de los derivados debiera quedar formando
parte de la bicapa, mientras que la secuencia peptı́dica quedarı́a hacia el exterior hidrófilo.
10
A tı́tulo ilustrativo pero no limitativo del procedimiento de obtención detallado en la presente patente,
se describen a continuación algunos ejemplos prácticos.
Ejemplo 1
15
Sı́ntesis de los péptidos activos con extremo carboxı́lico
La sı́ntesis de péptidos derivados de la Laminina se llevó a cabo siguiendo el método en fase sólida de
Merrifield (1962) con estrategia Fmoc/tBu.
20
Para la obtención de una secuencia con extremo carboxı́lico se empleó como soporte sólido de sı́ntesis
una resina Wang con un grado de funcionalización de 0.72 meq/g de resina a la cual se le realizó el
tratamiento descrito en la tabla siguiente:
TABLA 1
25
Protocolo de lavado de la peptidil-resina
Paso
Reactivo
Repeticiones
Tiempo
1
DMEF
3 veces
1 minuto
2
Diclorometano (DCM)
3 veces
1 minuto
3
Alcohol tert-amı́lico
3 veces
1 minuto
4
Eter
hasta sequedad
—
30
35
40
45
50
En general, se partió de 1 gramo de resina Wang en una jeringa con filtro acoplada a un sistema
de vacı́o, y se infló con dimetilformamida (DMF) durante 30 minutos. Paralelamente, en un pesafiltros,
se pesó la cantidad necesaria del primer Fmoc-aminoácido y se disolvió en DMF, añadiéndose a esta
disolución los reactivos de acoplamiento 4-dimetilaminopiridina (4-DMAP) y diisopropilcarbodiimida
(DIPCDI) (0.3:1, molar). Todos los reactivos se emplearon en un exceso de 5 veces respecto a la cantidad necesaria para completar la reacción. A continuación se añadió esta mezcla a la resina previamente
escurrida y se dejó la reacción durante 2 horas, a T ambiente y con agitación ocasional. Transcurrido
este tiempo se lavó la resina con diferentes disolventes hasta dejarla completamente seca.
Finalmente, se valoró la cantidad de aminoácido unida. En los casos en que la reacción no fue completa se volvieron a añadir los reactivos, en una cantidad correspondiente a la mitad de la cantidad inicial
empleada, y se dejaron reaccionar durante 2 horas más, repitiéndose después el mismo proceso de secado
de la resina y la cuantificación del aminoácido incorporado.
55
La unión del resto de Fmoc-aminoácidos se realizó a través de sucesivas etapas de desprotección del
grupo amino y de formación del enlace amida.
60
Ası́, para la eliminación del grupo amino-protector Fmoc se trató la peptidil-resina con
DMF/piperidina 20 % una vez durante 1 minuto, repitiéndose el tratamiento una segunda vez durante 5
minutos. Después se eliminó la piperidina con varios lavados con DMF y se hizo el ensayo de ninhidrina
para comprobar la completa eliminación del grupo Fmoc (coloración azul). En algunos casos la desprotección se llevó a cabo con el reactivo 1,8-diazabiciclo [5.4.0.]-undec7-eno (DBU), utilizado en la mezcla
DMF/piperidina/DBU (48:2:2, v/v/v) mediante un único tratamiento de la resina durante 7 minutos.
8
ES 2 186 484 A1
Al cabo de este tiempo se lavó la resina varias veces con DMF y se hizo el ensayo de ninhidrina igual que
en el caso anterior.
5
Una vez desprotegida la peptidil-resina se le añadieron el Fmoc-aminoácido correspondiente y los
reactivos de acoplamiento. Según la dificultad que presentara la secuencia sintetizada se utilizaron dos
combinaciones diferentes de reactivos:
• HOBt y DIPCDI, en relación 1:1 molar con el Fmoc-aminoácido.
10
• HOBt, DIEA y 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TBTU), en la
relación 1:2:1 molar.
Todos los reactivos se emplearon en un exceso de 2.5 veces respecto a la cantidad necesaria.
15
20
25
En ambos casos, la reacción se dejó durante 1 hora, controlándose el final mediante el ensayo de
ninhidrina por la desaparición de los grupos amino libres (coloración amarilla). Cuando la reacción no
fue completa, se dejó la mezcla en contacto con la resina durante 1 hora más, volviéndose a repetir el
ensayo de ninhidrina. En el caso de que todavı́a quedarán grupos amino libres en la resina, ésta se lavó
con DMF varias veces y se volvieron a añadir los reactivos en la mitad de la cantidad inicial empleada.
En algunas ocasiones, y a pesar de repetirse la reacción, se produjeron acoplamientos incompletos. Para
poder continuar la sı́ntesis sin que se formaran cadenas anómalas fue necesario bloquear las cadenas incompletas mediante la acetilación de los grupos amino que todavı́a quedaban libres. Para ello se trató la
resina con 2 mequivalentes de anhı́drido acético y 1 mequivalente de 4-DMAP por cada mequivalente de
peptidil-resina durante 30 minutos. A continuación se lavó con DMF y se hizo un ensayo de ninhidrina
para comprobar la total desaparición de los grupos amino (coloración amarilla).
El ensayo de ninhidrina se sustituyó por el test del cloranilo en el caso de la detección de grupos
amino secundarios de aminoácidos como la prolina, ya que la ninhidrina no reacciona con dichos grupos.
30
Ejemplo 2
Sı́ntesis de los péptidos con extremo amino terminal
35
40
45
50
Los péptidos con extremo carboxamida se obtuvieron a partir de la resina p-metilbenzihidril amina
(MBHA). Esta resina necesita un tratamiento inicial especial que consiste en varios lavados con una
mezcla ácida de DCM/TFA 40 %, dejándose finalmente en contacto con la resina durante 20 minutos.
Después, para eliminar el ácido, se lavó con DCM 5 veces durante 1 minuto cada vez, y para neutralizarla
se trató la resina con la mezcla básica DCM/diisopropiletilamina (DIEA) 5 %, hasta que se comprobó
que el pH de la resina era básico. Por último, para eliminar la DIEA, se lavó varias veces con DCM.
Seguidamente, se llevó a cabo el acoplamiento del espaciador ácido p-[(R,S)-alfa[1-(9H-fluoren-9-e)metoxifomamido]-2,4-dimetoxibencil] -fenoxiacético (AM), protegido con el grupo Fmoc, que es el que
proporciona el extremo amida a la secuencia. Para ello se pesó el Fmoc-AM en un exceso de 1.5 veces
respecto a la cantidad necesaria, y se adicionó a la resina junto con los reactivos hidroxibenzotriazol
(HOBt) y DIPCDI (1:1, molar), también en exceso, dejándose la reacción durante 90 minutos. El final de
la reacción se determinó mediante el test de Kaiser o ensayo de ninhidrina, controlándose la desaparición
de grupos amino libres de la resina. En el caso de que no se hubiera unido todo el espaciador, se volvió
a repetir la reacción empleándose la mitad de la cantidad inicial de reactivos utilizada. Una vez unido
todo el espaciador, la resina se lavó varias veces con DMF para eliminar el exceso de reactivos.
La unión del resto de Fmoc-aminoácidos se realizó a través de sucesivas etapas de desprotección del
grupo amino y de formación del enlace amida tal como se describe en el Ejemplo 1.
Ejemplo 3
55
Desprotección y desanclaje del péptido
Para la desprotección de la secuencia peptı́dica libre se eliminó, en primer lugar, el grupo Fmoc: del
extremo amino-terminal siguiéndose protocolo de la tabla siguiente:
60
9
ES 2 186 484 A1
TABLA 2
Protocolo de desprotección y desanclaje del péptido
5
10
Paso
Reactivo
Repeticiones
Tiempo
1
DMF
3 veces
1 minuto
2
DMF/piperidina 20 %
1 vez
1 minuto
3
DMF/piperidina 20 %
1 vez
5 minutos
4
DMT
3 veces
1 minuto
5
DCM
3 veces
1 minuto
6
Alcohol tert-amı́lico
3 veces
1 minuto
7
Eter
hasta sequedad
—
15
20
25
30
35
40
En algunas sı́ntesis se sustituyó la DMF/piperidina 20 % por la mezcla DMF/piperidina/DBU (48:2:2,
v/v/v), que se dejó en contacto con la peptidil-resina durante 7 minutos.
Seguidamente se desancló el péptido de la resina y se eliminaron los grupos protectores de las cadenas
funcionales de los aminoácidos, en una misma etapa. Para ello se prepararon varias mezclas del ácido TFA
con diferentes capturadores o “scavengers” como anisol, tioanisol, fenol, mercaptoetanol, y agua, según
los grupos protectores presentes en las secuencias peptı́dicas. Se pesó una alı́cuota de la peptidil-resina
en una jeringa con filtro acoplada a un sistema de vacı́o y se le añadió la mezcla ácida de capturadores,
dejándose en contacto con la resina de 2 a 3 horas, a temperatura ambiente y con agitación eventual.
Transcurrido este tiempo se filtró y se lavó la resina 3 veces con TFA, recogiéndose los filtrados y los
lavados en un tubo. En primer lugar se evaporó el TFA con nitrógeno y después se añadió éter dietı́lico
frı́o, apareciendo un precipitado blanco (péptido libre). El precipitado se centrifugó a 3000 rpm durante
5 minutos, decantándose el sobrenadante y repitiéndose el proceso 5 veces más. Finalmente se eliminaron
las trazas de éter del sólido con nitrógeno, se redisolvió en agua o acético al 10 %, según la solubilidad
del péptido, y se liofilizó para obtener el crudo peptı́dico libre totalmente seco.
Ejemplo 4
Derivatización hidrófoba de las secuencias peptı́dicas en fase sólida
45
50
55
Los ácidos grasos se acoplaron a las secuencias de la misma forma que los Fmoc-aminoácidos, mediante la formación de un enlace amida con el grupo carboxı́lico del ácido graso.
Ası́, se pesó una alı́cuota de la peptidil-resina en una jeringa con filtro acoplada a una bomba de vacı́o
y se hinchó con DMF. Seguidamente se realizó la desprotección del grupo Fmoc. Una vez desprotegido,
se añadió, en un exceso de 2.5, el ácido graso utilizado en cada caso junto con los reactivos de sı́ntesis
DPCDI/HOBt o bien, TBTU/DIEA/HOBt, según la secuencia peptı́dica de la que se tratara. El final
de la reacción se determinó, al igual que durante la sı́ntesis, mediante el ensayo de ninhidrina por la
desaparición de grupos amino libres.
Para obtener el derivado hidrófobo libre se trató la peptidil-resina con la misma mezcla ácida de TFA
y capturadores, y en idénticas condiciones empleadas en el desanclaje de la secuencia peptı́dica inicial.
Ejemplo 5
Obtención de liposomas conteniendo Doxorubicina y un lipopéptido recubriendo la superficie del liposoma
60
Inicialmente, y en todos los casos, se prepararon liposomas multilaminares grandes (MLV) siguiendo el
método descrito por Bangham. A partir de éstos, y por, sonicación, se obtuvieron los liposomas pequeños
unilaminares (SUV).
10
ES 2 186 484 A1
Todo el material y las soluciones empleadas eran estériles y se trabajó, durante todo el proceso, bajo
una campana de flujo laminar para mantener la esterilidad.
5
10
15
Los liposomas preparados con los derivados hidrófobos de las dos secuencias activas presentaban en
su composición: fosfatidilcolina (PC), fosfatidilglicerol (PG), colesterol y Cromano-6. Para su obtención
se procedió de la siguiente forma: Ası́, en primer lugar, se prepararon liposomas SUV. Se pesaron la
PC, la PG el colesterol y el Cromano-6, y se disolvieron en cloroformo, evaporándose el disolvente en el
rotavapor para formar una pelı́cula lipı́dica. Las trazas de disolvente que pudieron quedar se eliminaron
mediante liofilización durante 1 hora.
Transcurrido este tiempo, se hidrató la pelı́cula con 1 mL de NaCl 0.9 %, manteniendo el balón en un
baño a 60◦ C durante 1 hora. A los liposomas MLV obtenidos se les añadió 1.2 mL de una solución de
Doxorubicina de concentración igual a 2 mg/mL (2.4 mg). La preparación se dejó en reposo 15 minutos
en un baño a 60◦ C y después se mantuvo el balón en un rotavapor sin vacı́o que giraba lentamente durante
20 minutos.
Para obtener liposomas SUV se sonicaron los MLV en un baño de ultrasonidos durante 8 ciclos de 2
minutos cada uno, separados por intervalos de 5 minutos de reposo en un baño a 60◦ C.
20
La incorporación de los lipopéptidos, se llevó a cabo mezclando una alı́cuota de 200 µL de liposomas,
200 µL de NaCl 0.9 % y 12 µL de una solución del lipopéptido en DMSO (c=10 mg/mL). La mezcla se
dejó en reposo a 60◦ C durante una hora y después a temperatura ambiente 30 minutos más.
25
Alternativamente se prepararon los liposomas incorporando el lipopéptido desde el principio. Ası́
pues, se mezclaron los lı́pidos PC, PG, Chol y Cromano-6, con una alı́cuota del lipopéptido disueltos en
cloroformo/metanol, en la misma relación molar que en el caso anterior. El resto de procedimientos es
idéntico al caso anterior.
30
Finalmente, para eliminar la Doxorubicina no encapsulada y el lipopéptido sin incorporar, se columnó
la muestra en una columna PD-10 (Shephadex G-25). Para ello se equilibró primero la columna con NaCl
0.9 %. Una vez equilibrada se añadió la muestra, que se fue eluyendo también con NaCl 0.9 %, hasta su
salida de la columna. El volumen obtenido de liposomas se enrasó a 2 mL.
35
Siguiendo esta metódica se prepararon los siguientes tipos de liposomas incorporando Doxorubicina:
Composición
Lipı́dica
Conc.
Lı́pidos
Conc.
Fármaco
Lipopéptido recubriente
Conc.
Péptido
Tamaño
Liposomas
PC/PG/Chol/
Crom.
9,91
mg/mL
1,04
mg/mL
Miristico-(A)5 CYESIKVAVS
0,42
mg/mL
160 nm
PC/PG/Chol/
Crom.
14,05mg
/mL
1,5
mg/mL
Miristico-PEAGD
1,1
mg/mL
115 nm
40
45
Ejemplo 6
50
55
Obtención de liposomas conteniendo Paclitaxel y un lipopéptido recubriendo la superficie del liposoma
Inicialmente, y en todos los casos, se prepararon liposomas multilaminares grandes (MLV) siguiendo el
método descrito por Bangham. A partir de éstos, y por, sonicación, se obtuvieron los liposomas pequeños
unilaminares (SUV).
Todo el material y las soluciones empleadas eran estériles y se trabajó, durante todo el proceso, bajo
una campana de flujo laminar para mantener la esterilidad.
60
Los liposomas preparados con los derivados hidrófobos de las secuencias activas presentaban en su
composición: fosfatidilcolina (PC), fosfatidilglicerol (PG) y colesterol. Para su obtención se procedió de
la siguiente forma:
11
ES 2 186 484 A1
Ası́, en primer lugar, se prepararon liposomas SUV. Se pesaron la PC, la PG y el colesterol, y se
disolvieron en cloroformo, evaporándose el disolvente en el rotavapor para formar una pelı́cula lipı́dica.
Las trazas de disolvente que pudieron quedar se eliminaron mediante liofilización durante 1 hora.
5
Transcurrido este tiempo, se hidrató la pelı́cula con 1 mL de NaCl 0.9 %, manteniendo el balón en un
baño a 60◦C durante 1 hora. A los liposomas MLV obtenidos se les añadió 1,2 mL de una solución de
paclitaxel de concentración igual a 0,5 mg/mL (0,6 mg). La preparación se dejó en reposo 15 minutos en
un baño a 60◦C y después se mantuvo el balón en un rotavapor sin vacı́o que giraba lentamente durante
20 minutos.
10
Para obtener liposomas SUV se sonicaron los MLV en un baño de ultrasonidos durante 8 ciclos de 2
minutos cada uno, separados por intervalos de 5 minutos de reposo en un baño a 60◦ C.
15
20
25
La incorporación de los lipopéptidos, se llevó a cabo mezclando una alı́cuota de 200 µL de liposomas,
200 µL de NaCl 0.9 % y 12 µL de una solución del lipopéptido en DMSO (c=10 mg/mL). La mezcla se
dejó en reposo a 60◦ C durante una hora y después a temperatura ambiente 30 minutos más.
Alternativamente se prepararon los liposomas incorporando el lipopéptido desde el principio. Ası́
pues, se mezclaron los lı́pidos PC, PG, y colesterol, con una alı́cuota del lipopéptido disuelto en cloroformo/metanol, en la misma relación molar que en el caso anterior. El resto de procedimientos es idéntico
al caso anterior.
Finalmente, para eliminar el Paclitaxel no encapsulado y el lipopéptido sin incorporar, se columnó la
muestra en una columna PD-10 (Shephadex G-25). Para ello se equilibró primero la columna con NaCl
0.9 %. Una vez equilibrada se añadió la muestra, que se fue eluyendo también con NaCl 0.9 %, hasta su
salida de la columna. El volumen obtenido de liposomas se enrasó a 2 mL.
Siguiendo esta metódica se prepararon los siguientes tipos de liposomas incorporando Paclitaxel:
30
Composición
Lipı́dica
Conc.
Lı́pidos
Conc.
Fármaco
Lipopéptido recubriente
Conc.
Péptido
Tamaño
Liposomas
PC/PG/Chol
8,93
mg/mL
0,26
mg/mL
miristico-(A)5 CYESIKVAVS
0,42
mg/mL
140 nm
PC/PG/Chol
13,5 mg/
mL
0,4
mg/mL
miristico-PEAGD
1,1
mg/mL
105 nm
35
40
Ejemplo 7
Ensayos de adhesión celular
45
50
55
Sobre pocillos (placas de cultivo de tejidos con 96 pocillos de TPP, Suiza) se fijaron disoluciones
de Laminina-1 y de péptidos sintéticos (50 µg/pocillo), los pocillos se secaron a temperatura ambiente
durante toda la noche. Antes de usarlos, los pocillos se lavaron con solución salina tamponada sin iones
calcio ni magnesio. Los restantes radicales libres del poliestireno se bloquearon utilizando disolución al
1 % de BSA.
Se cultivaron y marcaron con 51 Cr células de fibrosarcoma humano HT1080. Las células marcadas se
depositaron (1cpm/pocillo) en los pocillos que contenı́an la Laminina y los péptidos sintéticos.
Después de 30 minutos de incubación a 37◦C, las células no adheridas se eliminaron mediante lavado.
Las células adheridas se lisaron y la radioactividad fue medida. Los porcentajes de adhesión especı́ficos
obtenidos se indican en la Figura 1 adjunta.
Ejemplo 8
60
Inhibición de la adhesión celular a Laminina (molécula completa) in vitro por péptidos de la Laminina
51
Siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo N◦ 1 se adhirieron células HT-1080 marcadas con
Cr, sobre pocillos (0,32 cm2 ) recubiertos de 1 µg de Laminina. Las células adheridas se incubaron con
12
ES 2 186 484 A1
diferentes concentraciones de fragmentos peptı́dicos sintéticos de lamininas. Los resultados obtenidos se
muestran en la Figura 2 adjunta.
Ejemplo 9
5
Efecto antiproliferativo de liposomas de Doxorubicina dirigidos contra receptores especı́ficos de péptidos
de lamininas en células tumorales
10
15
20
El efecto antiproliferativo de la Doxorubicina se analizó siguiendo el método MTT. Células HT1080
procedentes de cultivos exponenciales se sembraron en pocillos de 0,36 cm2 (placas de cultivo de tejidos
con 96 pocillos de TPP, Suiza) a una densidad de 5000 células por pocillo. Un dı́a después, los cultivos
se lavaron e incubaron durante dos horas con liposomas conteniendo doxorubicina. Las diferentes formulaciones de liposomas se ajustaron a la misma concentración de droga y en ensayo se realizó en pocillos
paralelos (incrementando la concentración de doxorubicina desde 0,01 µg/ml hasta 10 µg/ml). Después
de la incubación se lavaron las células cinco veces con PBS e incubadas durante tres dı́as en un medio
completo. Después de este periodo se adicionó a cada pocillo 50 µL de PBS conteniendo 1 mg/ml de
MTT (tetrazolium salt, Sigma) y se incubaron durante cuatro horas más. Los cristales intracelulares
de formazan resultantes de la reducción de la sal de tetrazolio, sólo presentes en las células activas, se
disolvieron en DMSO. El número de células metabólicamente activas se estimó midiendo la absorbancia
de esta disolución de DMSO a 540 nm.
El porcentaje de actividad citostática se calculó según la fórmula (A-B)/Ax100 donde A es la absorbancia en células tumorales incubadas en medio control y B es la absorbancia en células tumorales
incubadas con las preparaciones liposomiales.
25
Los resultados de la citostasis resultante se indican en la Figura 3 adjunta, en donde:
- los resultados representan la media +/- la desviación estándar de tres experimentos independientes
realizados por triplicado;
30
- La IC50 se define como la concentración de droga a la cual sobreviven el 50 % de las células comparado con el control; y
- a) p > 0,05; test t de Student.
35
Ejemplo 10
Biodistribución de Doxorubicina administrada como droga libre o preparación liposomial (PC / PG /
Chol / miristoil - AAAAACYESIKVAVS/Doxorubicina) en animales portadores de tumores
40
Animales: Las experiencias se realizaron en ratones BALB/c desnudos e inmunosuprimidos obtenidos
del área de producción animal de IFFA CREDO Inc. (Lyon, Francia). Los animales se mantuvieron en
cabinas de flujo laminar bajo condiciones libres de patógenos y fueron utilizados cuando tenı́an una edad
de 8 semanas.
45
Condiciones de cultivo celular: Células de fibrosarcoma humano HT1080 se hicieron crecer en medio
Ham F-12 (GIBCO, Grand Island, NY) suplementado con 10 % de suero fetal bovino, piruvato sódico,
aminoácidos no esenciales, L-glutamina, y solución de vitaminas (GIBCO, Grand Island, NY). Los cultivos se mantuvieron en plástico y se incubaron en 5 % CO2 -95 % aire a 37◦C en incubadores humidificados.
La lı́nea celular se examinó para certificar la ausencia de Mycoplasma.
50
55
60
Las células tumorales se recolectaron de los cultivos subconfluentes (50-70 % de confluencia) mediante
tratamiento con tripsina (0,25 %) y EDTA (0,02 %). Las células se lavaron en un medio suplementado
y después se resuspendieron en solución salina balanceada de Hank (HBSS) para su posterior inyección.
Sólo suspensiones monocelulares con una viabilidad superior al 90 % (determinada mediante coloración
con Trypan azul) se utilizaron para los estudios in vivo.
Ensayo de Biodistribución: Células HT-1080 a una concentración de 2x107 células/mL de HBSS se premezclaron con un volumen igual de lı́quido Matrigel (Collaborative Biomedical Products -Bedford, MA-)
10 mg/mL. De la suspensión resultante se inocularon subcutáneamente 0,2 mL en el flanco izquierdo de
los ratones. El crecimiento de los tumores se monitorizó dos veces a la semana. Cuando los tumores
alcanzaron un volumen de 1 cm3 (dı́a 25 después de la inyección de las células), los ratones recibieron
una dosis única intravenosa de Doxorubicina (5 mg/Kg) en forma de preparación liposomial o de droga
13
ES 2 186 484 A1
libre. A tiempos de 30 minutos, 5 horas y 24 horas de la administración de la droga los ratones fueron
sacrificados y se tomaron muestras de tejido tumoral y de plasma. Los resultados obtenidos se muestran
en las Figuras 4 y 5 adjuntas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
14
ES 2 186 484 A1
REIVINDICACIONES
5
1. Liposomas encapsulando fármacos anticancerosos, caracterizados porque están recubiertos por
un lipopéptido compuesto por tres subestructuras (Fig. 3): un fragmento lipı́dico, un oligopéptido activo
y un oligopéptido espaciador entre los otros dos fragmentos.
2. Liposomas encapsulando fármacos anticancerosos, según la reivindicación 1, caracterizados porque el fragmento lipı́dico del lipopéptido recubriente son ácidos grasos de longitud de cadena carbonada
entre C6 y C20.
10
15
20
3. Liposomas encapsulando fármacos anticancerosos, según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizados
porque el fragmento lipı́dico del lipopéptido recubriente es de preferencia decanoil, miristoil, o estearoil.
4. Liposomas encapsulando fármacos anticancerosos, según las reivindicaciones 1 a 3 caracterizados
porque el fragmento de secuencia activa del lipopéptido recubriente es SIKVAVS.
5. Liposomas encapsulando fármacos anticancerosos, según las reivindicaciones 1 a 4 caracterizados porque el oligopéptido espaciador entre el fragmento de secuencia activa y el fragmento lipı́dico del
lipopéptido recubriente es un oligopéptido de una longitud comprendida entre cinco y diez residuos de
aminoácidos.
6. Liposomas encapsulando fármacos anticancerosos, según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizados porque el oligopéptido espaciador entre el fragmento de secuencia activa y el fragmento lipı́dico del
lipopéptido recubriente es una de las siguientes secuencias: AAAAACYE, SSAAACYE o RKERKECYE.
25
30
35
40
7. Liposomas encapsulando fármacos anticancerosos, según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizados
porque la relación de lı́pidos totales formadores de los liposomas a droga está comprendida entre 20:1 y
2:1, y preferiblemente de 10:1.
8. Liposomas encapsulando fármacos anticancerosos, según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizados
porque los lı́pidos componentes de los liposomas son fosfolı́pidos, tanto de origen natural como sintético,
y colesterol.
9. Liposomas encapsulando fármacos anticancerosos, según las reivindicaciones 1 a 8, caracterizados
porque los fosfolı́pidos presentes son de preferencia fosfatidilcolina, que no presenta carga neta, y otro
fosfolı́pido cargado negativamente, de preferencia el fosfatidilglicerol.
10. Liposomas encapsulando fármacos anticancerosos, según las reivindicaciones 1 a 9, caracterizados porque la relación del fosfolı́pido neutro y el cargado negativamente está comprendida entre el 10:2
y 10:10, de preferencia entre 10:7 y 10:10, respectivamente.
11. Liposomas encapsulando fármacos anticancerosos según las reivindicaciones 1 a 10, caracterizados porque la proporción de colesterol, con respecto a la cantidad de lı́pidos totales, está entre el 0 y el
50 %, de preferencia entre el 35 y 50 %.
45
50
55
12. Liposomas encapsulando fármacos anticancerosos, según las reivindicaciones 1 a 11, caracterizados porque opcionalmente pueden contener un aditivo inhibidor de la peroxidación lipı́dica.
13. Liposomas encapsulando fármacos anticancerosos, según las reivindicaciones 1 a 12, caracterizados porque los aditivos inhibidores de la peroxidación lipı́dica son Vitaminas y sus derivados como la
Vitamina E o la Vitamina E acetato, un antioxidante autorizado para uso farmacéutico como el BHT o
un cromano o cromeno, tal como el 3,4-dihidro-2,2-dimetil-6-hidroxi-7-metoxi-2H-1-benzopirano.
14. Liposomas conteniendo fármacos anticancerosos, según las reivindicaciones a 13, caracterizados
porque la proporción de lipopéptido recubriente con respecto a la cantidad de lı́pidos totales está comprendida entre el 0,1 % y el 30 %, de preferencia entre el 1 % y el 15 %.
15. Liposomas conteniendo fármacos anticancerosos, según las reivindicaciones 1 a 14, caracterizados porque presentan un tamaño promedio comprendido entre 50 nm y 250 nm.
60
16. Liposomas según las reivindicaciones 1 a 15, caracterizados porque los fármacos anticancerosos
encapsulados son:
15
ES 2 186 484 A1
Análogos de la mostaza nitrogenada como la Ciclofosfamida; el Melfalan; la Idosfamida; o la Trosfosfamida;
Etileniminas como la Tiotepa;
5
Nitrosoureas como la Carmustina;
Agentes alquilantes como la Temozolomida; o la Dacarbazida;
10
Antimetabolitos Análogos del Acido Fólico como el Metotrexato o el Raltitrexed;
Análogos de Purinas como la Tioguanina, la Cladribina o la Fludarabina;
Análogos de Pirimidinas como el Fluorouracilo, el Tegafur o la Gemcitabina;
15
Alcaloides de la Vinca y Análogos como la Vinblastina, la Vincristina, o la Vinorelbina;
Derivados de Podofilotoxina como el Etoposido, los Taxanos, el Docetaxel o el Paclitaxel;
20
Antraciclinas y similares como la Doxorubicina, la Epirubicina, la Idarubicina o la Mitoxantrona;
Otros Antibióticos Citotóxicos como la Bleomicina, o la Mitomicina;
Compuestos de Platino como el Cisplatino, el Carboplatino o el Oxaliplatino;
25
Anticuerpos Monoclonales como el Rituximab;
Otros Agentes Antineoplasicos como la Pentostatina, la Miltefosina, la Estramustina,
30
el Topotecan, el Irinotecan, o la Bicalutamida.
17. Uso de los liposomas según las reivindicaciones 1 a 16 para la fabricación de un medicamento, en
el cual los liposomas encapsulan fármacos anticancerosos, para la administración intravenosa en humanos
u otros mamı́feros para el tratamiento de tumores malignos.
35
40
45
50
55
60
16
ES 2 186 484 A1
17
ES 2 186 484 A1
18
ES 2 186 484 A1
19
kES 2 186 484
kN. solicitud: 200002447
kFecha de presentación de la solicitud: 10.10.2000
kFecha de prioridad:
OFICINA ESPAÑOLA
DE PATENTES Y MARCAS
11
ESPAÑA
22
21
◦
32
INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA
k
51 Int. Cl.7 :
A61K 9/127, A61P 35/00
DOCUMENTOS RELEVANTES
Categorı́a
Documentos citados
Reivindicaciones
afectadas
A
WO 9816198 A (UNIV EMORY) 23.04.1998, páginas 50-52; ejemplo 10.
1-17
A
WO 8604232 A (COOPER LIPOTECH INC) 31.07.1986, todo el documento.
1-17
A
GRANDT, D.S. et al.: ”Interaction of endothelial cells with a
laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of
angiogenic behavior in vivo”, JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY,
Vol. 153, n◦ 3, 1991, páginas 614-625. Todo el documento.
1-4
Categorı́a de los documentos citados
X: de particular relevancia
O: referido a divulgación no escrita
Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la
P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación
misma categorı́a
A: refleja el estado de la técnica
de la solicitud
E: documento anterior, pero publicado después de la fecha
de presentación de la solicitud
El presente informe ha sido realizado
× para todas las reivindicaciones
Fecha de realización del informe
18.01.2002
para las reivindicaciones n◦ :
Examinador
M. Novoa Sanjurjo
Página
1/1