Producción de sueros policlonales para investigación y diagnóstico

Producción de sueros
policlonales para
investigación y diagnóstico
Q.F. Susana Cáceres
Polo Tecnológico de la Facultad de Química
Pando - Canelones
Un poco de historia…
• La producción de sueros de origen animal se inició
a nivel mundial por 1920.
• Inicialmente estaban dirigidos contra toxinas de
origen microbiano (T. diftérica y tetánica) y
posteriormente se aplicaron a la producción de
sueros contra venenos de serpientes y alacranes
(inmunización pasiva).
• Hoy su aplicación se ha extendido a otras áreas
como la investigación y el diagnóstico.
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Los componentes del suero responsables de
esos efectos son los anticuerpos (Ac), también
llamados inmunoglobulinas
Son sustancias de naturaleza glucoproteica
producidas por el sistema inmune de un animal
como respuesta ante el ingreso al organismo de
una sustancia extraña llamada “antígeno”.
La idea de la producción de antisueros es manipular
el sistema inmune del animal de modo de obtener
anticuerpos específicos contra un blanco de
interés.
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Existen diferentes clases de
inmunoglobulinas
Humano
• En la mayoría de los mamíferos están presentes la IgM,
IgG, IgA e IgE.
• En la gallina en lugar de IgG hay IgY (yema de huevo)
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Estructura de los anticuerpos
- Los anticuerpos están constituidos
por la asociación de cuatro cadenas
polipeptídicas unidas entre sí
mediante puentes disulfuro.
- Dos cadenas se denominan pesadas
y las otras dos ligeras.
- La región variable es la zona de
reconocimiento del Ag, cuya
secuencia de aminoácidos es peculiar
de cada anticuerpo.
- La región constante, tiene la misma
secuencia en todos los anticuerpos
de la misma clase.
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¿Qué es un antígeno?
•
Se denomina antígeno a cualquier molécula
que puede ser reconocida por el sistema
inmune de un organismo.
• Inmunógeno: es el antígeno que por sí sólo es
capaz de inducir una respuesta inmune
específica.
Los haptenos son moléculas pequeñas capaces de
reaccionar con los anticuerpos pero no de generarlos por
si mismas.
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Antígenos
Estructuras químicas muy diferentes: proteínas,
lípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, etc.
Pueden ser:
• Nativos: m.o. o proteína purificada a partir de un
preparado mas complejo.
• Recombinantes
• Péptidos sintéticos
¿A que se debe que ciertas moléculas al ser
introducidas en el organismo induzcan respuesta inmune
y otras no?
Depende del tamaño molecular (superior a 10 kDa), de
los grupos químicos activos y de la estructura espacial
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Anticuerpos policlonales
Cuando se inmuniza un animal con un antígeno
y se provoca una respuesta inmune, en el suero
del animal aumenta notablemente la cantidad
de Ac específicos que reconocen el antígeno
empleado.
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Anticuerpos policlonales
Los Ac son producidos por linfocitos B (plasmocitos).
Cada plasmocito producirá moléculas de Ac con una
especificidad característica  en el suero de un animal
inmunizado, se acumulan un número elevado de
diferentes moléculas de Ac específicas en mayor o
menor medida para el antígeno
Como en su síntesis están
involucrados numerosos
clones de linfocitos B se lo
denomina policlonal.
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Teoría de la
selección clonal
ANTIGENO
REPERTORIO
CELULAS B
SELECCION
Proliferación
Diferenciación
Anticuerpos
específicos
PLASMOCITOS
Plasmocitos
CELULAS
B MEMORIA
Células B de
memoria
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Respuesta primaria y secundaria
tiempo
Primera
inoculación
Segunda
inoculación
En este proceso se dan dos eventos fundamentales: cambio de clase
(IgM a IgG por ejemplo) e hipermutaciones que conducen al aumento
de la avidez
Obtención de anticuerpos
policlonales
Obtención de anticuerpos policlonales
Se obtienen administrando el antígeno en animales
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Selección del animal:
Depende de:
- Cantidad de antígeno disponible.
- Cantidad de anticuerpo o antisuero que se necesita
preparar vs instalaciones necesarias para alojarlo.
- Relación filogenética entre las especies de origen del
antígeno y la especie usada para obtener el antisuero.
- Uso que se le dará a los anticuerpos (ELISA, Ac 2º)
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Algunas consideraciones previas…
• Información sobre la toxicidad y/o patogenicidad del
inmunógeno, composición del buffer, pH etc.
• Preparación del antígeno (esterilidad, formolado).
• Evaluar la necesidad del uso de adyuvante y cual.
• Definir vía de inoculación
inmunizaciones (protocolo)
y
cronograma
de
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Vías de inoculación
- Intradérmica (nº sitios y volumen. Sedación)
- Subcutánea
- Intramuscular
- Intraperitoneal (ratón)
- Intravenosa – reservado para inmunógenos particulados
pequeños, bacterias formoladas, en solución salina.
Adyuvantes
- Se emplean para mejorar la respuesta inmune.
- Forman depósitos en los sitios de inyección liberando
lentamente el antígeno en forma sostenida.
- Activan macrófagos y linfocitos T colaboradores.
Ejemplos: ACF (Adyuvante completo de Freund)
AIF
Fosfato o hidróxido de aluminio
Preparados comerciales
Se trata de evitar el uso de ACF pues genera una
respuesta inflamatoria crónica, de no haber otra opción
se inyecta en varios puntos en muy pequeños volúmenes.
Su uso se limita a la primera inmunización.
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Sangrías
• Antes de comenzar el protocolo de inmunización se
realiza una sangría (pre-inmune) para determinar el
estatus de los animales con respecto al inmunógeno.
• En conejos se sangra por punción de la vena central de la
oreja.
• El volumen de sangre que se extrae nunca es > al 15% de
la volemia (1% del peso corporal) (1 sangría al mes).
• En caso de sangrías a blanco estas se realizan bajo
anestesia
Caso especial, la gallina, donde se recogen los huevos
y de la yema se purifican las Igs
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Según la aplicación se puede requerir
pasos posteriores de purificación
Separar el
suero
Purificación
de Ac por
cromatografía
de afinidad
Ac
específicos
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Marcado
Para poder utilizar la reacción Ag-Ac en un
inmunoensayo, a veces debe buscarse una forma de
hacer evidente esa reacción.
Coloides
metálicos
Complejos de Ru
Látex
Fluoróforo
Marcado
Enzimas
Radioisótopos
Hematíes
Partículas de
colorante
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Control de calidad del suero
policlonal
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Diferentes técnicas según el antígeno
y la aplicación posterior.
•
•
•
•
ELISA
Western blot
Aglutinación directa
Inmunodifusión
ELiSA
Conj. Anti
IgG conejo
E
Ag
E
Sustrato
Señal
Ac en
suero
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Inmunoblot
Las proteínas separadas por SDS-PAGE se transfieren
mediante una corriente eléctrica a una membrana de
nitrocelulosa.
Sobre ella se aplican los mismos pasos de un ELISA
(incubación con el suero policlonal, incubación con el
conjugado y revelado con un sustrato que precipite)
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Aglutinación directa
La interacción entre un antígeno particulado y
anticuerpos presentes en el suero inmune (antisuero)
provoca la formación de un complejo macroscópico en
forma de red visible a simple vista.
Aplicaciones: Antisueros contra Ag
celular (bacterias, hematies, etc)
de superficie
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Inmunodifusión: Método de Ouchterlony
Agar
gelificado con orificios equidistantes donde se
siembran soluciones de Ag o Ac, se dejan difundir y si el Ac
reconoce el Ag se forman bandas de precipitación de
inmunocomplejos.
• Resultado: bandas de identidad, no
identidad o identidad parcial.
• La posición de la banda puede variar
de acuerdo a las [ ] de ambos
reactantes.
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Aplicaciones
Los anticuerpos sirven como reactivos biológicos
que se usan de rutina en muchas ensayos que se
aplican tanto en el laboratorio clínico como en
control de calidad, seguimiento de procesos e
investigación
Gran especificidad
extraordinaria capacidad
para discriminar
estructuras
antigénicamente
similares
Aplicaciones
Detección de moléculas mediante un inmunoensayo
cuali o cuantitativo
Inmunoensayo: técnica analítica que usa la
reacción antígeno-anticuerpo como medio para
generar un resultado perceptible.
• Enzimoinmunoensayo (ELISA)
• Western blot
• Aglutinación
• Inmunofluorescencia
• Inmunohistoquímica
• Inmunocromatografía
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ELISA
Permite determinar la concentración de un Ag o Ac
mediante el uso de uno de ellos en fase sólida
detectándose la formación del complejo Ag-Ac
mediante un trazador enzimático (conjugado).
El Ac de captura y el conjugado
pueden ser el mismo Ac uno unido
a enzima y el otro no
El conjugado es un Ac producido en
otra especie distinta a la de la
muestra
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Aglutinación de partículas de látex
Partículas
sensibilizadas
con el Ac
Ag en muestra
Reacción de
aglutinación
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Inmunofluorescencia e
inmunohistoquímica
Conjugado anti- IgG
humana a fluoresceína
Diagnóstico de Lupus
cutáneo
Tinción inmuno-histoquímica
con anticuerpo antiTreponema pallidum
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Inmunocromatografía
• Técnica rápida y
sencilla que no
requiere reactivos ni
instrumentación
adicional
• Ej. Test de embarazo, determinación cualitativa de
Aflatoxinas (límite de detección de 4 ppb).
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