Metilacio´n del promotor SOX17 en células tumorales circulantes y

Clinical Chemistry 59:1
270–279 (2013)
Diagnóstico del cáncer
Metilación del promotor SOX17 en células tumorales
circulantes y ADN coincidente de células libres aislados del
plasma de pacientes con cáncer de mama
Maria Chimonidou,1† Areti Strati,1† Nikos Malamos,2 Vasilis Georgoulias,3 y Evi S. Lianidou1*
INTRODUCCIÓN:
La detección de células tumorales circulantes (CTC) y ADN de células libres (ADNcf) en la
sangre periférica de pacientes con tumores sólidos ha
sido ampliamente estudiada para la detección temprana de diseminación metastásica. Evaluamos si
existı́a una asociación entre el origen del ADNcf y las
CTC. Investigamos si el promotor de metilación SRY
(región determinante del sexo Y)-caja 17 (SOX17) en
las CTC estaba asociado con el patrón de metilación de
este gen en ADNcf coincidente aislado del plasma de
los pacientes con cáncer de mama.
METODOS:
Examinamos la metilación de SOX17 en 79
tumores primarios de mama, en 114 muestras coincidentes de ADN aisladas de CTC y ADNcf y en 60 individuos sanos. El ADN aislado se modificó con bisulfito
de sodio y se sometió a PCR especı́fica de la metilación.
RESULTADOS:
Se realizó la metilación del promotor
SOX17 en 68 (86.0%) de 79 tumores primarios de
mama. En las CTC, se realizó la metilación del SOX17
en 19 (34.5%) de 55 pacientes con cáncer de mama
temprano, 27 (45.8%) de 59 pacientes con cáncer metastásico y 1 (4.3%) de 23 individuos sanos, mientras
que en los ADNcf coincidentes, se realizó la metilación
del SOX17 en 19 (34.5%) de 55, 24 (40.7%) de 59 y 1
(2.0%) de 49 de estos mismos grupos, respectivamente.
Hubo una correlación significativa entre la metilación
de SOX17 en ADNcf y CTC en pacientes con cáncer de
mama temprano (P ⫽ 0.008), pero no en pacientes con
metástasis confirmada (P ⫽ 0.283).
CONCLUSIONES: El promotor SOX17 presenta un alto
nivel de metilación en tumores de mama primarios, en
las CTC aisladas de pacientes con cáncer de mama y en
las muestras de ADNcf correspondientes. Nuestros
1
Análisis del Laboratorio de Células Tumorales Circulantes, Laboratorio de
Quı́mica Analı́tica, Departamento de Quı́mica, Universidad de Atenas, Atenas,
Grecia; 2 Unidad de Oncologı́a Médica, Elena Venizelou Hospital, Atenas,
Grecia; 3 Laboratorio de Biologı́a de Células Tumorales, Facultad de Medicina,
Universidad de Creta, Heraklion, Grecia.
* Dirigir la correspondencia a: Laboratory of Analytical Chemistry, Department of
Chemistry, University of Athens, 15771 Atenas, Grecia. Fax ⫹30-210-7274750;
correo electrónico: [email protected].
†
Maria Chimonidou y Areti Strati contribuyeron por igual a este trabajo.
270
hallazgos indican una conexión directa entre la presencia de CTC y ADNcf en pacientes con cáncer de mama
operable, después de la resección quirúrgica del tumor
primario.
© 2013 American Association for Clinical Chemistry
En la década pasada surgió gran cantidad de información que indicaba el potencial uso de las células tumorales circulantes (CTC)4 y los ácidos nucleicos circulantes, tales como el ADN de células libres (ADNcf),
para la exploración del cáncer, la determinación del
pronóstico y el control de la eficacia de tratamientos
contra el cáncer. Las CTC, el ADNcf, el ARNm y los
microARN circulan en la sangre de los pacientes con
cáncer y los cambios en sus concentraciones se han
asociado con la carga tumoral y la progresión maligna
(1–5 ).
Las CTC juegan un papel fundamental en la diseminación metastásica de los carcinomas. Su detección
está asociada con el pronóstico en diversos tipos de
cáncer y su enumeración ha sido esclarecida por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU.
(US Food and Drug Administration) para el seguimiento de pacientes con cáncer de mama, colon y
próstata, a quienes se les han confirmado metástasis (1,
4, 5 ). Con base en estos desarrollos, las CTC se consideran una herramienta diagnóstica nueva y promisoria,
especialmente para pacientes con cáncer en etapa avanzada,enquieneslasCTCpuedenusarsecomouna“biopsia lı́quida”, que permite a los médicos llevar un seguimiento de los cambios del cáncer con el paso del
tiempo y adaptar el tratamiento de forma correspondiente (1 ). Sin embargo, la simple cuantificación de las
CTC no es suficiente. La caracterización molecular de
Recibido para publicación el 21 de junio de 2012; Aceptado para publicación el
23 de agosto de 2012.
4
Abreviaturas no estándar: CTC, células tumorales circulantes; ADNcf, ADN de
células libres; SOX, gen de la caja del grupo de alta movilidad relacionado con
SRY; FFPE, fijado en formalina e incluido en parafina; MSP, PCR especı́fica de
metilación; ADNg, ADN genómico; EpCAM, molécula de adhesión celular
epitelial; SB, bisulfito de sodio; LNA, ácido nucleico bloqueado; Cq, ciclo de
cuantificación.
Metilación del promotor SOX17 en células circulantes y ADN coincidente de células libres
las CTC es absolutamente necesaria para ayudar a
conocer mejor la biologı́a de las metástasis y permitirnos identificar a los pacientes que se beneficiarán con el
tratamiento dirigido (6 ).
El ADNcf circula a mayores concentraciones en el
plasma de pacientes con cáncer (7 ). La identificación
de este ADN como de origen tumoral, estimuló la
búsqueda de marcadores de ADN tumorales amplificables en la sangre de los pacientes (8 ). Numerosos equipos se han centrado en el desarrollo de ensayos
analı́ticamente sensibles que permitan la detección
especı́fica de una célula tumoral única o pequeñas cantidades de ADNcf especı́fico del tumor en la sangre
periférica (1–5 ). La detección de alteraciones del ADN
especı́fico del tumor, tales como mutaciones (9 ) y la
metilación (10, 11 ) en ADNcf, proporciona una fuente
de ADN para el análisis genético menos invasiva y de
más fácil acceso que las biopsias de tumores. Diversos
estudios han descrito la metilación de los genes supresores de tumores en muestras de suero o plasma y en los
correspondientes tumores de mamá primarios, aunque
la metilación de ADN no se detectó en el plasma ni en el
suero de donantes sanos (10 ). En los sueros previos al
tratamiento de las pacientes con cáncer de mama, la
metilación de ADN de genes particulares, especialmente el miembro 1 de la familia con dominio de asociación a Ras (RalGDS/AF-6) (RASSF1, también conocido como RASSF1A)5 y el gen adenomatoso poliposis
coli (APC), está asociada en forma independiente con
una respuesta deficiente y un mayor riesgo relativo de
muerte, y es un indicador más eficaz que los parámetros de pronóstico estándar (11 ). El ADNcf está presente en el plasma o el suero de pacientes con cáncer y
su patrón de metilación se parece al del ADN del tumor
primario (12 ).
Por lo tanto, la sangre puede ser un depósito para
la obtención de ADN de diferentes fuentes, que incluye
CTC, ADNcf y depósitos micrometastásicos ocultos en
órganos secundarios. La combinación de estos análisis
de ADN con la detección de CTC puede proporcionar
información adicional para la estadificación molecular
de los tumores y el control de la progresión del tumor
(2 ). En 2009 se informó una relación entre la aparición
de CTC y ADNcf en la sangre de pacientes con cáncer
de próstata (13 ). Sin embargo, en ese estudio se demostró esta relación mediante el uso de marcadores y
métodos que difieren de los que informamos aquı́ y
todavı́a no se ha estudiado en pacientes con cáncer de
próstata para ver si hay una conexión entre la presencia
5
Genes humanos: RASSF1A, miembro 1 de la familia con dominio de asociación
a Ras (RalGDS/AF-6); APC, gen adenomatoso poliposis coli; CST6, cistatina E/M;
SOX17, SRY (región determinante del sexo Y)-caja 17; BRMS1, supresor de la
metástasis del cáncer de mama 1; KRT19, queratina 19.
de ADNcf y CTC en los mismos pacientes, detectada
con el mismo marcador y los mismos métodos.
La metilación de los promotores de genes supresores de tumor cistatina E/M (CST6) y SRY (genes de la
región determinante del sexo Y) caja 17 (SOX17) y el
gen supresor de la metástasis del cáncer de mama, supresor de metástasis 1 (BRMS1) se realiza en CTC aisladas de la sangre periférica de pacientes con cáncer de
mama (14 ). El SOX17, un miembro de la familia de la
caja del grupo de alta movilidad relacionado con SRY
(SOX) de los factores de transcripción; se conserva en
muchas especies y desempeña roles fundamentales en
la regulación del desarrollo y la función de células precursoras o células madre, por lo menos parcialmente a
través de la represión de la vı́a canónica de señalización
Wnt/␤-catenina (15, 16 ). El análisis global de la hipermetilación de islas CpG y la expresión genética en
lı́neas celulares de cáncer colorrectal ha demostrado
que el silenciador génico SOX17 está asociado con la
hipermetilación de ADN (17 ) y el SOX17 desempeña
un rol supresor de tumores a través de la supresión de la
señalización Wnt (18 ).
En este estudio, evaluamos si existı́a una asociación entre los orı́genes del ADNcf y las CTC. También
investigamos si la metilación del promotor SOX17 en
las CTC estaba asociada con el patrón de metilación de
este gen en el ADNcf coincidente aislado del plasma de
pacientes con cáncer de mama.
Materiales y métodos
PACIENTES Y MUESTRAS
Evaluamos la metilación del promotor SOX17 mediante PCR especı́fica de metilación en tiempo real (MSP)
en tejidos de cáncer primario de mama fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE), CTC aisladas de
sangre periférica de pacientes con cáncer de mama,
ADNcf aislado del plasma correspondiente de los mismos pacientes con cáncer de mama y muestras de una
población control. Todos los participantes del estudio
firmaron un consentimiento informado para participar en el estudio, el cual fue aprobado por los comités
cientı́ficos y de ética de nuestras instituciones.
Para los tejidos FFPE del cáncer de mama primario, obtuvimos un total de 79 muestras de carcinoma
mamario FFPE de pacientes con cáncer de mama operable y 15 muestras de tejido mamario FFPE no canceroso que se usaron como controles de tejido mamario
normal (8 tejidos histológicamente normales adyacentes a los tumores y 7 especı́menes histológicamente libres de cáncer de una mamoplastı́a de reducción). Asimismo, se incluyeron 9 fibroadenomas mamarios
como un grupo separado de tumores benignos.
Para las CTC aisladas de la sangre periférica de
pacientes con cáncer de mama, obtuvimos un total de
Clinical Chemistry 59:1 (2013) 271
114 muestras de sangre periférica de 55 pacientes con
cáncer de mama operable y 59 pacientes con metástasis
confirmadas. Para el aislamiento de las CTC, se obtuvo
sangre periférica (20 mL obtenida en EDTA) en el
punto medio de obtención de la muestra por punción
venosa como se describió previamente (14 ).
Para el ADNcf aislado del plasma correspondiente de
los mismos pacientes con cáncer de mama, se obtuvo un
total de 114 muestras coincidentes del plasma en EDTA,
de los mismos pacientes que los mencionados anteriormente. Para el aislamiento de ADNcf, se utilizó plasma de
la sangre obtenida en EDTA (200 ␮L).
Finalmente, para la población control, se obtuvo
sangre periférica de 60 individuos sanos. Para 12 de
estos individuos se dispuso tanto de las muestras de
plasma como de la fracción de CTC.
AISLAMIENTO DE ADN DE FFPE DE CÁNCER MAMARIO PRIMARIO
Se utilizaron secciones de tejidos de 10 ␮m con ⬎80%
de células tumorales para la extracción de ADN y MSP.
Se usó la lı́nea celular de cáncer de mama MCF-7 como
un control positivo en reacciones de MSP para la detección de metilación del promotor SOX17. El ADN
genómico (ADNg) de las células FFPE y MCF-7 se aisló
con el kit High Pure PCR Template Preparation Kit
(Roche) como se describió previamente (19 ). La concentración de ADN se determinó en el espectrofotómetro
Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Technologies).
SELECCIÓN INMUNOMAGNÉTICA POSITIVA DE CTC
Se aislaron las CTC de 20 mL de sangre periférica como
se describió con anterioridad (14, 20 ). Más especı́ficamente, después de la dilución de la sangre periférica
con 20 mL de PBS (pH 7.3) se obtuvieron células
mononucleares de sangre periférica por medio de centrifugación en gradiente de densidad mediante el uso
de Ficoll-Paque TM PLUS (GE Healthcare, BioSciences AB) a 670 g durante 30 min a temperatura
ambiente. Se retiraron las células de la interfaz, se lavaron dos veces con 40 mL de PBS estéril (pH 7.3, 4 °C)
a 530 g durante 10 min. y luego se suspendieron nuevamente en 10 mL de PBS. Se tiñeron las células con
azul tripán y se contaron en un hemocitómetro. Para
enriquecer las células epiteliales se utilizaron perlas de
captura recubiertas inmunomagnéticas Ber-EP4
[molécula de adhesión celular antiepitelial (EpCAM)]
(Dynabeads® Epithelial Enrich, Invitrogen).
solución amortiguadora (Ambion) de almacenamiento de ARN y se almacenó a ⫺70 °C hasta su
utilización. La concentración de ARN se determinó por
medio de lecturas de absorbancia a 260 nm con el espectrofotómetro Nanodrop-1000 (NanoDrop Technologies). Se aisló el ARNm del total de ARN con el kit
de purificación de ARNm (Dynabeads mRNA Purification Kit, Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La sı́ntesis de ADNc se realizó con el
kit ARN-a-ADN de Alta Capacidad (High-Capacity
RNA-to-cDNA Kit, AppliedBiosystems) y se usó para
estudios de expresión de queratina 19 (KRT19, también conocida como CK-19) en las CTC, como se describió anteriormente (21 ).
EXTRACCIÓN DE ADN DE LAS CTC
Se extrajo el ADNg de las CTC como se describió anteriormente (14 ). Luego de la extracción de la fase acuosa
de Trizol, se precipitó el ADN (de la interfaz) al agregar
150 ␮L de etanol al 100%. Se mezclaron las muestras
por inversión y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 2 a 3 min; a continuación, el ADN se
sedimentó por centrifugación (2000 g, 5 min, 4 °C) y se
lavó dos veces en una solución con 0.1mol/L de citrato
de sodio en etanol al 10% (500 ␮L). Después de cada
lavado, el sedimento de ADN se almacenó en la solución de lavado durante 30 minutos a temperatura ambiente, con mezcla en forma periódica y centrifugado
(2000 g, 5 min, 4 °C). Después de estos dos lavados, el
sedimento de ADN se suspendió en 1 mL de etanol al
75%, que se mantuvo durante 10 a 20 minutos a temperatura ambiente, con mezcla en forma periódica y
centrifugado (2000 g, 5 min, 4 °C). Luego, el ADNg
aislado se secó al aire durante 15 minutos y se disolvió
en 50 ␮L de 8 mmol/LNaOH. La concentración de
ADN se determinó en el espectrofotómetro Nanodrop
ND-1000.
AISLAMIENTO DE ADNcf DEL PLASMA
Se obtuvo 1 ml de sangre periférica y se procesó inmediatamente. Todas las muestras se centrifugaron a
1600 g (10 min), y el plasma se transfirió cuidadosamente a tubos de 2 mL y se almacenó a ⫺20 °C hasta el
aislamiento del ADN. Para la extracción de ADNcf del
plasma (200 ␮L) se utilizó el kit de ácidos nucleicos
(High Pure Viral Nucleic Acid Kit, Roche Diagnostics)
de acuerdo con el protocolo del fabricante.
EXTRACCIÓN DE ARN DE LAS CTC
CONVERSIÓN DEL BISULFITO DE SODIO
Se realizó el aislamiento total de ARN de la fracción de
las CTC mediante el uso de Trizol (Invitrogen) como se
describió previamente (16 ). Todos los pasos de manejo
y preparación del ARN se realizaron en una campana
de flujo laminar en condiciones libres de RNasa. El
ARN aislado de cada fracción se disolvió en 20 ␮L de
Antes de realizar la conversión del bisulfito de sodio
(SB) y los pasos para la reacción de MSP, evaluamos la
integridad del ADNg de todas nuestras muestras
clı́nicas por medio de la amplificación de BRCA1 exón
20 como se describió anteriormente (22 ). Modificamos el ADNg extraı́do de las fracciones de CTC ais-
272 Clinical Chemistry 59:1 (2013)
Metilación del promotor SOX17 en células circulantes y ADN coincidente de células libres
Tabla 1. Secuencias de oligonucleótidos de cebadores SOX17 y sondas LNA que se usaron en este estudio.
Oligonucleótido
Dirección de secuencia 5ⴕ a 3ⴕ
Producto de
PCR, bp
Cebadores y sonda para la MSP de SOX17 en tiempo real
Cebador directo metilado 5⬘–3⬘
-GTTGCGTTAGTCGTTTGCGTTC-
76
Cebador inverso metilado
-AACGAATCCCGTATCCGACG-
76
b
-F-AGTTTATATTATGAAAG⫹ C⫹GTTTAT⫹C⫹G⫹GT-Q
76
Cebador directo 5⬘–3⬘
-CGTTTTTATGGTGTGGGTTAAGGA-
99
Cebador inverso 5⬘–3⬘
-AGCTTGAGTGGGGTTGTAGAATGAT-
99
Sonda metilada especı́fica (modificada con LNA)
Cebadores para SOX17 (metilados y no metilados)
diseñados para ADN convertido con SB
a
b
Número de acceso a SOX17: NT_008183.
Posición de nucleótido modificado con LNA.
ladas y del plasma con SB mediante el kit EZ DNA
Methylation–Gold Kit (Zymo Research). En resumen,
se trató aproximadamente 1 ␮g de ADNg con el reactivo de conversión y se incubó a 98 °C durante 10 min y
64 °C durante 2.5 horas. Las muestras fueron colocadas
en columnas, lavadas, desulfonadas, lavadas nuevamente
y luego eluidas con 10 ␮L de solución amortiguadora de
elución. El ADN convertido con SB se almacenó a ⫺70 °C
hasta su utilización. En cada reacción de SB, se incluyó
agua desionizada y ADN metilado al 100% (metilación de
ADN estándar, Zymo Research) como controles negativos y positivos, respectivamente.
estándar 0% metilado y completamente metilado) y
estándar 100% metilado. Para certificar la calidad del
ADN en la misma región genómica en nuestras muestras convertidas con SB que dieron resultado negativo
en la MSP de tiempo real, diseñamos especı́ficamente
un grupo de cebadores que amplifican por igual a las
secuencias convertidas con SB de SOX17 metiladas y no
metiladas, aproximadamente en la misma región (ver
Fig. 1 en el Suplemento de datos que acompaña la versión online de este artı́culo en http://www.clinchem.
org/content/vol59/issue1).
MSP EN TIEMPO REAL
DISEÑOS DE CEBADOR Y SONDA PARA MSP EN TIEMPO REAL
Para la MSP se requiere un par de cebadores especı́ficos
para ADN metilado y modificado con SB (par M) y un
par especı́fico para ADN no metilado y modificado con
SB (par U) (23 ). En este proyecto, diseñamos un grupo
de cebadores especı́ficos y una sonda de ácido nucleico
integrado a hidrólisis (LNA) para ADN metilado a fin
de distinguir la secuencia metilada del promotor
SOX17. Los grupos de cebadores y la sonda LNA (Tabla
1) se diseñaron mediante simulación por computadora
con el software Primer Premier 5 (PremierBiosoft International) y sintetizaron por Forthnet y TIB Molbiol,
respectivamente. Para una discriminación máxima entre alelos metilados y no metilados, tanto los cebadores
como las sondas incluı́an varias CpGs. Asimismo, los
cebadores y las sondas incluı́an bases T derivadas de
regiones C modificadas, no metiladas, para permitir la
discriminación y amplificación del ADN convertido
del no convertido. Para verificar si podrı́amos detectar
especı́ficamente solo la secuencia metilada, utilizamos
4 controles: ADNg no sometido a conversión con SB
(ADN no convertido), ADN placentario sometido a
conversión con SB (ADN placentario convertido, 0%
metilado), control 1% metilado (mezcla sintética de
Cada reacción se realizó en un volumen total de 10 ␮L.
Se agregó un microlitro de ADN convertido con SB a
una mezcla de reacción de 9 ␮L con 0.1 ␮L de Taq ADN
polimerasa (5 U/␮L de ADN polimerasa; Promega), 2
␮L de la solución amortiguadora de PCR proporcionada (5⫻), 1.0 ␮L de MgCl2 (25 mmol/L), 0.2␮L de
dNTPs (10 mmol/L; Fermentas), 0.3 ␮L de los cebadores directo e inverso (10 ␮mol/L), 0.15 ␮L BSA (10
␮g/␮L) y 1 ␮L de sonda LNA de hidrólisis (3 ␮mol/L).
Finalmente, se agregó agua desionizada a un volumen
final de 10 ␮L. Se utilizaron condiciones de termociclaje similares: 1 ciclo a 95 °C durante 2 min, seguido de
45 ciclos a 95 °C durante 10 s y 63 °C durante 1 min. En
cada recorrido se incluyó ADN convertido con SB del
estándar de metilación de ADN (100%), como un control positivo.
Resultados
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD ANALÍTICAS DE LA MSP EN
TIEMPO REAL
Se evaluó la sensibilidad analı́tica de la MSP en
tiempo real desarrollada para SOX17 mediante mezclas sintéticas basadas en diluciones seriadas de
Clinical Chemistry 59:1 (2013) 273
Cá
Cáncer
d
de mama ttemprano
(N=55)
Cáncer d
Cá
de mama avanzado
d con
metástasis confirmada
(N=59)
IIndividuos
di id
sanos
(N=60)
21 mL de sangre periférica en EDTA
1 mL: separación de plasma
20 mL: Aislamiento de PBMC
mediante centrifugación por
gradiente de densidad (Ficoll)
Aislamiento de ADNcf del plasma (200 mcL)
Selección positiva de CTC mediante
separación inmunomagnética
(EpCAM)
Fracción de CTC
Aislamiento de ARN total (Trizol)
Aislamiento de ADN genómico (Trizol)
Aislamiento de RNAm (oligo-dTbeads)
Conversión con SB del ADN genómico
Síntesis de ADNc
MSP en tiempo real para SOX17
PCR en tiempo real
RTq-PCR para CK-19
Fig. 1. Diagrama esquemático del flujo de trabajo del estudio.
PBMC, células mononucleares de sangre periférica; RT-qPCR, PCR cuantitativa de transcripción inversa.
muestras de control de ADN convertido con SB (0%
y 100% metilado) a varios porcentajes de metilación
(0.1%, 1%, 10%, 25% y 50%). Se usó un microlitro
de estas muestras sintéticas para la reacción de MSP
en tiempo real. El ensayo de MSP en tiempo real
desarrollado para metilación de SOX17 podrı́a detectar en forma especı́fica y confiable la presencia de
la secuencia de SOX17 1% metilado en presencia de
la secuencia SOX17 99% no metilado (Fig. 2A).
Además, obtuvimos una estimación semicuantitativa del estado de metilación de estas muestras a
través de la evaluación de los parámetros del ciclo de
cuantificación (Cq). Los valores del Cq de las mezclas sintéticas con diferentes concentraciones de
secuencias de SOX17 metilado se diferenciaron de
manera que las muestras con un alto nivel de metilación tuvieron valores mucho más bajos del Cq que
las muestras con un nivel de metilación bajo (Fig.
2A). Sin embargo, el método utilizado no fue
completamente cuantitativo. Para validar la especificidad analı́tica de la MSP en tiempo real de SOX17,
inicialmente probamos los cebadores mediante
simulación por computadora y luego en PCR, con
ADNg de placenta humana modificado con SB no
274 Clinical Chemistry 59:1 (2013)
metilado; no se observó amplificación del promotor
SOX17 (no se muestran los datos).
METILACIÓN SOX17 EN ADN AISLADO DE TUMORES PRIMARIOS
DE MAMA
Cuando se evaluó la metilación del promotor SOX17 en
carcinomas de mama fijados en formalina e incluidos en
parafina (FFPE) de 79 pacientes con diagnóstico de
cáncer de mama operable, se encontró metilación en 68
(86.0%) de 79 muestras (ver Datos complementarios en
lı́nea en la Fig. 1). La metilación del promotor SOX17
también se evaluó en 7 muestras de tejido mamario normal obtenidas mediante mamoplastı́a de reducción, 8
muestras no cancerosas histológicamente probadas de
tejido mamario ubicado alrededor de los tumores de
mama y 9 fibroadenomas mamarios usados como controles de tumores benignos. Se comprobó la metilación
del promotor SOX17 en 2 (25%) de 8 tejidos mamarios
no cancerosos adyacentes a los tumores, ası́ como en 2
(22.2%) de 9 fibroadenomas mamarios y 1 (14.3%) de 7
tejidos de mamoplastı́a de reducción. En total, 3 (20%) de
15 tejidos mamarios no cancerosos FFPE y 2 (22.2%) de 9
tumores mamarios benignos arrojaron resultados positivos de metilación de SOX17.
Metilación del promotor SOX17 en células circulantes y ADN coincidente de células libres
Fig. 2. (A), Sensibilidad y especificidad analı́tica de MSP de tiempo real para SOX17 determinado por el uso de
mezclas sintéticas con ADN metilado convertido con SB al 0%, 1%, 50% y 100%.
(B), MSP en tiempo real para SOX17 realizada con el ADN aislado a partir de la fracción de CTC de (a) donantes sanos, (b)
pacientes con cáncer de mama operable y (c) pacientes con metástasis confirmada.(C), MSP en tiempo real para SOX17
realizada con el ADN aislado a partir del ADN de células libres de (a) donantes sanos, (b) pacientes con cáncer de mama
operable y (c) pacientes con metástasis confirmada. F1, fluorescencia de canal F1.
Clinical Chemistry 59:1 (2013) 275
Fig. 2. Continued.
METILACIÓN DE SOX17 EN ADN AISLADO DE CTC
Se evaluó la metilación del promotor de SOX17 en el
ADN aislado de la facción de CTC EpCAM positiva de
55 pacientes con cáncer de mama operable, 59 pacientes con metástasis confirmada y 23 individuos sanos. Se
observó el SOX17 en 19 (34.5%) de 55 pacientes con
cáncer mamario operable, 27 (45.8%) de 59 de pacientes con metástasis confirmada y 1 (4.3%) de 23 individuos sanos. La amplificación de MSP en tiempo real
de SOX17 en ADN aislado de la fracción CTC de donadores sanos, pacientes con cáncer de mama operable y
pacientes con metástasis confirmadas se muestra en la
Fig. 2B.
METILACIÓN DE SOX17 EN ADNcf
El estado de metilación del promotor SOX17 se evaluó
en el ADNcf aislado del plasma coincidente de los mismos pacientes que los mencionados anteriormente y 49
276 Clinical Chemistry 59:1 (2013)
individuos sanos. La metilación del promotor de
SOX17 se observó en 19 (34.5%) de 55 pacientes con
cáncer de mama operable, 24 (40.7%) de 59 pacientes
con metástasis confirmada y 1 (2.0%) de 49 individuos
sanos. La amplificación de la MSP en tiempo real de
SOX17 en ADN aislado de ADNcf de donadores sanos,
pacientes con cáncer de mama operable y pacientes con
metástasis confirmada se muestra en la Fig. 2C.
COMPARACIÓN Y ASOCIACIÓN DE METILACIÓN DE SOX17 EN
MUESTRAS DE CTC Y ADNcf COINCIDENTES, CON
CARACTERÍSTICAS CLINICAS Y PATOLÓGICAS
En muestras de tejidos de cáncer de mama temprano
hubo una concordancia (Tabla 2) entre la metilación
de SOX17 en el ADNcf y la fracción de CTC para 39
(70.9%) de 55 pacientes (P ⫽ 0.008, prueba ␹2 de Pearson, bilateral). Sin embargo, no hubo concordancia
estadı́sticamente significativa en el grupo de pacientes
Metilación del promotor SOX17 en células circulantes y ADN coincidente de células libres
Tabla 2. Estado de la metilación de SOX17 en ADNcf y fracciones de CTC.
Caracterı́sticas de la muestra
ADNcf
Cáncer de mama operable (n ⫽ 55)
Fracción de CTC
SOX17 metilado
SOX17 metilado
SOX17 no metilado
Total
SOX17 no metilado
Total
11
8
19
8
28
36
19
36
55
SOX17 no metilado
Total
Acuerdo 39/55 (70.9%), P ⫽ 0.008a
Metástasis confirmada (n ⫽ 59)
Fracción de CTC
ADNcf
SOX17 metilado
SOX17 metilado
13
14
27
SOX17 no metilado
11
21
32
Total
24
35
59
Acuerdo 34/59 (57.6%), P ⫽ 0.283
a
Pearson ␹2, bilateral.
con metástasis confirmadas, para lo cual hubo un acuerdo de 34 (57.6%) de 59 pacientes (P⫽ 0.283, prueba ␹2
de Pearson, bilateral). La presencia de metilación de
SOX17 tanto en CTC como en ADNcf no estuvo asociada con ninguna de las caracterı́sticas clı́nicas ni patológicas de los pacientes con cáncer de mama temprano. Solo la ausencia de metilación de SOX17 en el
ADNcf se correlacionó con la ausencia de nódulos linfáticos positivos (ver Datos complementarios en lı́nea
Tabla 1).
EXPRESIÓN KRT19 Y METILACIÓN DE SOX17 EN CTC Y ADNcf
Evaluamos la expresión KRT19 de ARNm en todas las
fracciones coincidentes de CTC EpCAM positivas aisladas de forma inmunomagnética, debido a que este
marcador epitelial ha sido utilizado ampliamente para
verificar la presencia de CTC (1, 4, 5, 20, 21 ). En cáncer
de mama temprano encontramos 20 (36.4%) de 55
muestras positivas para la expresión KRT19, mientras
que en el grupo de pacientes con metástasis confirmada, 24 (40.7%) de 59 fueron positivas. Con el mismo
procedimiento, ninguna de las 28 muestras individuales sanas mostró resultados positivos para la expresión
KRT19 (20 ). El estado de metilación de SOX17 en las
CTC no se correlacionó con la expresión KRT19 (Tabla
3). En el cáncer de mama temprano, hubo concordancia en 34 (61.8%) de 55 muestras, mientras que en el
grupo de pacientes con metástasis confirmada hubo
concordancia en 30 (50.8%) de 59. Luego, realizamos
la comparación de la expresión de mARN con KRT19
en todas las fracciones de CTC EpCAM positivas aisladas de forma inmunomagnética y la metilación de
SOX17 en el ADNcf correspondiente. La metilación de
SOX17 no se correlacionó con la expresión KRT19 en el
ADNcf (Tabla 3). Más especı́ficamente, en el cáncer de
mama temprano hubo concordancia en 34 (61.8%) de
55 muestras, mientras que en el grupo de pacientes con
metástasis confirmada hubo concordancia en 37
(62.7%) de 59. La metilación de SOX17 y la expresión
KRT19 en la fracción de CTC y la metilación de SOX17
en las muestras correspondientes de ADNcf para cada
paciente en forma individual se muestran en la Fig. 3.
En 6 (10.9%) de 55 casos de cáncer de mama temprano,
todos los marcadores dieron resultados positivos en el
mismo paciente, mientras que en el caso de metástasis
confirmada, 8 (13.6%) de 59 casos dieron resultados
positivos para todos los marcadores del mismo
paciente.
ANÁLISIS
Tanto las CTC como el ADNcf se encuentran bajo intenso análisis como fuentes promisorias de biomarcadores tumorales nuevos. En este estudio, investigamos
la existencia de una conexión directa entre la presencia
de CTC y ADNcf en pacientes con cáncer de mama
operable, cuando ya se habı́a realizado la resección del
tumor primario.
Nuestro grupo demostró anteriormente la importancia pronostica de la detección de CTC en la sangre
periférica de pacientes con cáncer de mama temprano
después de la extirpación quirúrgica del tumor primario, antes y después de la quimioterapia, a través del
marcador molecular epitelial KRT19 (24 –28 ). También demostramos que la detección de CTC después de
la quimioterapia, en pacientes con cáncer de mama,
está asociada con la participación de más de 3 nódulos
linfáticos auxiliares, con un incremento significativo
Clinical Chemistry 59:1 (2013) 277
Tabla 3. Estado de la metilación de SOX17 en ADNcf y CTC con respecto a la expresión KRT19 de ARNm.
Caracterı́sticas de la muestra
KRT19
Cáncer de mama operable (n ⫽ 55)
Estado de la metilación de SOX17 en CTC
SOX17 metilado
KRT19 positiva
KRT19 negativa
Total
9
10
19
SOX17 no metilado
11
25
36
Total
20
35
55
Acuerdo: 34/55 (61.8%), Pa ⫽ 0.218
Estado de la metilación de SOX17 en ADNcf
SOX17 metilado
KRT19 positiva
KRT19 negativa
Total
9
10
19
SOX17 no metilado
11
25
36
Total
20
35
55
Acuerdo: 34/55 (61.8%), P ⫽ 0.218
Metástasis confirmada (n ⫽ 59)
Estado de la metilación de SOX17 en CTC
KRT19 positiva
KRT19 negativa
Total
SOX17 metilado
11
16
27
SOX17 no metilado
13
19
32
Total
24
35
59
Acuerdo: 30/59 (50.8%), P ⫽ 0.993
Estado de la metilación de SOX17 en ADNcf
KRT19 positiva
KRT19 negativa
Total
SOX17 metilado
13
11
24
SOX17 no metilado
11
24
35
Total
24
35
59
Acuerdo: 37/59 (62.7%), P ⫽ 0.081
a
P, Pearson ␹2, bilateral.
de las recaı́das clı́nicas y muertes relacionadas con la
enfermedad (29 ).
Se considera que la liberación de ácidos nucleicos a la
sangre está relacionada con la apoptosis y necrosis de las
células de cáncer en el microambiente del tumor. La secreción también ha sido sugerida como una posible fuente de ADNcf (3 ). En los casos en los que ya se ha realizado la resección del tumor primario, como en el cáncer
de mama operable, las células tumorales que circulan en la
sangre y los depósitos micrometastásicos que están pre-
sentes en sitios distantes, como la médula ósea y el hı́gado,
también pueden contribuir a la liberación del ADNcf.
Ciertos estudios previos basados en diferentes marcadores y metodologı́as han demostrado una conexión entre la
presencia de CTC y ADNcf en el cáncer de próstata (13 ).
Sin embargo, se ha demostrado recientemente que los pacientes con cáncer de mama pueden tener diferentes perfiles de expresiones genéticas en las CTC (20 ) y las CTC
individuales presentes en la sangre del mismo paciente
pueden ser muy heterogéneas (30 ).
Fig. 3. Mapa de calor de la metilación del promotor SOX17 y expresión KRT19 en la fracción de CTC y ADNcf en
muestras coincidentes de pacientes con (a) cáncer de mama operable (n ⴝ 55) y (b) metástasis confirmada (n ⴝ 59).
278 Clinical Chemistry 59:1 (2013)
Metilación del promotor SOX17 en células circulantes y ADN coincidente de células libres
Por esta razón, para abordar el tema de si existe
una conexión directa entre la presencia de CTC y
ADNcf en pacientes con cáncer de mama operable, a
quienes ya se les ha realizado la resección del tumor
principal, decidimos utilizar el mismo marcador y la
misma metodologı́a en muestras clı́nicas coincidentes.
Escogimos como marcador al SOX17, uno de los genes
supresores tumorales que se ha demostrado que están
silenciados epigenéticamente en las CTC de pacientes
con cáncer de mama (14 ). Para este estudio informamos nuestros hallazgos de forma cualitativa como
positivos o negativos con relación a la presencia de
secuencias de SOX17 metilado. De acuerdo con nuestro estudio de especificidad analı́tica, los cebadores y
las sondas utilizados solo reconocen secuencias de
SOX17 metilado. No establecimos un lı́mite sobre la
base de este hallazgo e incluso una muestra con un 1%
de metilación se consideró como positiva dado que este
resultado indicó que la muestra incluı́a unas pocas células en las cuales el SOX17 fue epigenéticamente inactivado. Si bien los datos aquı́ presentados indican
cuáles pacientes se consideraron arbitrariamente como
positivos o negativos, no tenemos indicación del porcentaje de metilación del promotor que existı́a en cada
paciente individual ni en diferentes grupos de pacientes, en comparación con el porcentaje de metilación en
pacientes sanos. La presentación de los datos de esta
forma facilita la visualización de las diferencias en niveles de metilación entre individuos sanos y pacientes con
afecciones malignas.
Hemos demostrado que el promotor SOX17 está
altamente metilado en tumores de mama primarios, en
CTC aisladas tanto de pacientes con cáncer mamario
temprano como en aquellos con cáncer de mama con
metástasis confirmada y en las muestras de ADNcf correspondientes. Un hallazgo clave es que la metilación
del promotor SOX17 en las CTC y en el ADNcf coincidente está altamente correlacionada. Este hallazgo
apunta hacia una conexión directa entre la presencia de
CTC y ADNcf en pacientes con cáncer de mama opera-
ble, después de la resección del tumor primario. La importancia de este hallazgo debe evaluarse más adelante,
cuando se conozca la evolución clı́nica de estos pacientes con cáncer de mama temprano. En el grupo de pacientes con metástasis confirmada, no se observó tal
conexión, incluso cuando en varios casos hubo concordancia entre la metilación de SOX17 en CTC y ADNcf.
Este resultado podrı́a deberse al hecho de que en esos
casos las metástasis ya estaba presente y el ADNcf también puede liberarse de células apoptóticas que se escapan del sitio metastásico.
En conclusión, nuestros hallazgos indican por primera vez una conexión directa entre la presencia de
CTC y ADNcf en pacientes con cáncer de mama operable, después de la extirpación quirúrgica del tumor
primario.
Contribuciones de los autores: Todos los autores confirmaron que
han contribuido al contenido intelectual de este documento y han cumplido con los siguientes 3 requerimientos: (a) contribuciones significativas a la concepción y el diseño, la adquisición de datos o el análisis e
interpretación de estos; (b) redacción o revisión del artı́culo en relación
con su contenido intelectual; y (c) aprobación final del artı́culo
publicado.
Declaración de los autores o posibles conflictos de interés: Tras la
presentación del manuscrito, todos los autores completaron el formulario de declaración del autor. Declaraciones o posibles conflictos
de interés:
Empleo o liderazgo: No se declara.
Papel del consultor o asesor: No se declara.
Propiedad de acciones: No se declaran.
Honorarios: No se declara.
Financiamiento de la investigación: E.S. Lianidou, Pograma Synergasia 2009, cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional y Recursos Nacionales (Secretarı́a General de Investigación y
Tecnologı́a en Grecia), código del Proyecto: Onco-Seed Diagnostics.
Testimonio de expertos: No se declara.
Papel del patrocinador: Las organizaciones de financiamiento no
tuvieron ninguna participación en el diseño de estudio, la elección de
los pacientes involucrados, la revisión e interpretación de datos ni en
la preparación o aprobación del manuscrito.
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