2.0Test ELISA para Ab B. Brucella AniGen

Test ELISA para Anticuerpos de B. Brucella
■ Recolección y Almacenamiento de Muestras
2.0 Test ELISA para Ab B. Brucella AniGen
■ Explicación del Test
La brucellosis bovina es una enfermedad bacteriana altamente contagiosa, casi exclusivamente causada por Brucella abortus, la cual es la
causante de aborto de estado tardío y de infertilidad en el ganado. De la enfermedad también resulta una zoonosis grave que causa fiebre
ondulante (Brucelosis) en humanos.
El 2.0 Test ELISA para Ab B. Brucella AniGen es un Ensayo Inmunosorbente Indirecto Ligado a Enzima para la detección cualitativa de
anticuerpos contra la Brucella abortus en plasma, suero o leche.
El Test ELISA Anigen para Anticuerpos de B. Brucella contiene una microplaca pre-cubierta con antígeno de B. Brucella en el pozo. Durante la
primera incubación, si hay presencia de anticuerpos contra la Brucella en la muestra objeto del test, se ligan a los antígenos en el pozo.
Después de la incubación, se extrae la totalidad del material no ligado mediante aspiración y lavado. El conjugado HRP que se agrega
subsiguientemente forma un complejo con los anticuerpos de Brucella. El material no ligado se extrae por aspiración y lavado antes de la
adición de una solución substrato. La actividad enzimática residual que se halla en el pozo será entonces directamente proporcional a la
concentración de anticuerpos anti-Brucella en las muestras, lo que se evidencia por la incubación de la fase sólida con una solución substrato.
La reacción se detiene con la adición de la solución de parada. La lectura colorimétrica se efectúa usando un espectrofotómetro a 450nm con
una longitud de onda de referencia a 620nm.
Los antígenos de Brucella abortus, especialmente seleccionados, se utilizan como material de captura en el test, lo cual permite que el Test
ELISA Anigen para Anticuerpos de B. Brucella identifique a los anticuerpos en las muestras con un alto grado de exactitud.
■ Materiales Suministrados (480 pozos/Kit)
El 2.0 Test ELISA para Ab B. Brucella AniGen contiene los siguientes ítems para realizar la prueba:
1) Placa de microensayo recubierto con LPS de Brucella Abortus 1119-3 (1): 5 placas (96 pozos/placa), configurados en 12 tiras de 1 x 8.
2) Suero de Control Negativo (2): 1 vials (4.0ml/vial) de suero bovino normal tratado con calcio. Se agrega Sodium Azida (Azida de Sodio)
(0.01%) como preservativo.
3) Suero de Control Positivo alto (3): 1 vials (4.0ml/vial) de suero bovino positivo alto de Anti-B. Brucella tratado con calcio. Se agrega Sodium
azide (0.01%) como preservativo.
4) Suero de Control Positivo bajo(4): 1 vials(4.0ml/vial) de suero bovino positivo bajo de Anti-B. Brucella tratado con calcio. Se agrega Sodium
azide (0.01%) como preservativo.
5) Leche de Control Negativo (5): 1 vials (4.0ml/vial) de leche normal. Se agrega Azida de Sodio (0.01%) como preservativo.
6) Leche de Control Positivo (6): 1 vials (4.0ml/vial) de leche bovina positiva de Anti- B. Brucella. Se agrega Sodium azide (0.01%) como
preservativo.
7) Diluyente de muestra concentrado 5X (7): 1 frasco (125mL/frasco) de buffer fosfato salino, Azida de sodio (0.01%) como preservativo.
8) Solución de Lavado (concentración 10X) (8): 2 frascos (250 ml/frasco) de PBS-Tween 20. Preservativo: Timerosal (0.01%).
Nota: Antes de usarse, tome un contenido de un frasco y complete hasta llenar 1.000 ml con agua destilada. Vuelva a suspender, en
presencia de cristales no disueltos, la solución colocando el frasco a 37º C por varios minutos.
9) Conjugado-Enzima (concentración 101X) (9): 1 vial (1.2ml/vial) de anticuerpos anti-bovino IgG–HRP.
Preservativo: Proclin (al 0.06%).
10) Diluyente-conjugado de enzima (10): 1 vial (80ml/vial) de búfer fosfato salino.
Preservativo: Proclin (0.06%)
11) Sustrato (11): 1 frasco (60 ml/vial) de peroxido de hidrogeno and de tetrametil benzidina (TMB)
12) Solución de parada (12): 1 frasco de (80 ml/frasco) de Ácido sulfúrico 1N. Listo para usar.
13) Sellante de la placa adhesiva: 10EA
14) Instrucciones de Uso
■ Precauciones
Para obtener resultados reproducibles, siga las siguientes reglas.
1) Exclusivamente para uso de diagnóstico in Vitro.
2) No mezcle reactivos de diferentes lotes.
3) Use recipientes de vidrio completamente limpios, libres de contaminación de iones metálicos o de sustancias oxidantes.
4) Use guantes desechables al manipular material potencialmente infeccioso y al realizar la prueba.
5) El sustrato y la solución de parada deben manipularse con cuidado. Evite el contacto con la piel, ojos, y membranas mucosas.
En caso de accidente, enjuague bien con agua del grifo.
1) [Suero]
· Recolecte la sangre total sin ningún anticoagulante.
· Centrifugue la sangre completa para obtener suero.
2) [Plasma]
· Recolecte la sangre total usando un anticoagulante adecuado.
· Centrifugue la sangre completa para obtener plasma.
3) [Leche]:
-Las muestras de leche deben ser centrifugadas por 15 minutos a 2000G para remover la capa de lipidos
4) Si las muestras no se someten inmediatamente al test, deben refrigerarse a 2 ~ 8°C. Para periodos de almacenamiento mayores de 3 días,
se recomienda congelación.
5) Las muestras que contengan precipitado pueden arrojar resultados inconsistentes. Muestras de este tipo deben clarificarse antes de la
prueba.
■ Preparación de Reactivos:
1) Todos los reactivos deben alcanzar temperatura ambiente (18 - 25 °C) antes de su uso.
2) Conjugado de enzima (concentrada a 101X): El conjugado concentrado de enzima (9) debe diluirse 1:100 con el diluyente de conjugado
de enzima (10) antes de su uso. Ejemplo: Adicione 10μl de conjugado de enzima a 1ml de diluyente de conjugado y mezcle adecuadamente.
3) Diluyente de muestra (Concentración 5X): El diluyente de la muestra concentrada (7) debe ser diluido 1:4 con agua destilada
/desionizada antes de su uso. Ejemplo: agregar 10 ml de diluyente de la muestra a 40 ml de agua destilada y mezclar bien.
4) Solución de lavado (Concentración 10X): La solución de lavado concentrada (8) debe ser diluida 1:9 con agua destilada/desionizada
antes de su uso. Ejemplo: agregar 50ml de solución de lavado a 450ml de agua destilada y mezclar bien. Si hay presencia de cristales sin
disolver, coloque el vial a 37°C por pocos minutos.
5) Solución sustrato: El sustrato A debe ser disuelto 1:1 con el sustrato B antes de su uso.
■ Procedimiento para el Test (procesar por duplicado)
1) Preparación de muestras
[Suero y plasma]
1. Preparación de muestras: Diluya las muestras 1:50 con el diluyente de muestras (Ejemplo: Diluir 10μl de muestra con
500μl de diluyente de muestra). Nota: No diluya los controles
2. Adicione 100μl del control alto positivo SIN DILUIR en tres pozos.
3. Adicione 100μl del control bajo positivo SIN DILUIR en dos pozos.
4. Adicione100μl del control negativo SIN DILUIR en dos pozos.
[Leche]
No diluya. Adicione 100μl de control negativo, control positivo y muestra de leche como es requerido para cada pozo de muestra
2) Adicione 100μl de la muestra DILUIDA en cada pozo.
3) Cubra la microplaca con el sellante adhesivo y mezcle bien en un agitador vibrante. La mezcla es muy importante para obtener
resultados reproducidos.
4) Incubar los pozos a 37°C por 60min.
5) Lavar los pozos 5 veces con 350μl de solución de lavado diluida. Aspirar todo el liquido de los pozos.
6) Adicione 100μl de conjugado de enzima diluido a cada pozo.
7) Cubra la microplaca con sellante adhesivo
8) Incubar los pozos a 37°C por 30min
9) Lavas los pozos 5 veces con 350μl de solución de lavado diluida. Aspirar todo el liquido de los pozos.
10) Adicione 100μl de la solución de sustrato mezclada a cada pozo
11) Incubar los pozos por 15min a temperatura ambiente (18-25°C).
12) Adicione 100μl de solución de parada a cada pozo.
13) Lea la absorbancia de los pozos con un espectrofotómetro dicromático a 450nm con una longitud de onda de referencia a
600nm. La lectura debe completarse dentro de una hora a partir del momento de finalización del ensayo.
■ Interpretación del Test
1) Validación del Test
[Suero y plasma]
· Los valores de DO del control estándar negativo de suero debe estar en el rango (0.000-0.2000)
· Los valores de DO del control estándar positivo alto de suero deben estar por encima de 1.000
· Los valores de DO del control estándar positivo bajo de suero deben estar por encima de 0.500
[Leche]
· Los valores de densidad óptica del control estándar negativo de leche deben estar en el rango de (0.000-0.2000)
· Los valores de DO del control estándar positivo de leche deben estar por encima de 1.000
2) Calculo del valor del porcentaje de positividad (%P)
[Suero y plasma]
%P = DO de la muestra / DO promedio del suero control alto positivo * 100
[Leche]
%P = DO de la muestra / DO promedio del control de leche positivo * 100
3) Interpretación
[Suero y plasma]
Luego de calcular el valor del %P, el valor positivo y negativo debe ser determinado con base en los siguientes criterios de %P
·
Positivo: %P de la muestra ³ 25
·
Negativo: %P de la muestra < 25
[Leche]
Luego de calcular el valor del %P, el valor positivo y negativo debe ser determinado con base en los siguientes criterios de %P
·
Positivo: %P de la muestra ³ 15
·
Negativo: %P de la muestra < 15
4) Ejemplo:
Si la DO de la muestra es 0.859 y el promedio del estándar de suero alto positivo es 2.500, el %P es 34. Esta muestra se considera como
positiva para Brucellosis bovina.
■ Limitaciones e Interferencias
1) Al efectuar el test, deben observarse estrictamente el procedimiento del test, las precauciones e interpretación de las secciones de
resultados para esta clase de test.
2) Muestras
· Muestras que contienen azida de sodio no afectan el resultado del test.
· Leche: Muestras pasteurizadas (no menos de 10 horas a 60℃) pueden provocar reducción en la reactividad y, por lo tanto, no deben
usarse.
· Suero: Muestras inactivadas por calor (1 hora a 56℃) no alteran el test.
· Plasma: Anticoagulantes como la heparina, EDTA, y citrato no afectan el resultado del test..
· Suero: Muestras hemolizadas deben centrifugarse antes de usarse para evitar la interferencia de sus constituyentes celulares.
· Suero: Los factores reumatoides pueden producir elevada reactividad si están presentes en las muestras.
· Las muestras lipémicas e ictéricas no afectan los resultados del test.
· Este kit de prueba detecta anticuerpos específicos de Brucilla en las muestras de suero y plasma y por lo tanto es útil como un
procedimiento de tamizaje.
· Fallas en la adición de muestras en el procedimiento puede resultar en la generación de falsos negativos. Se debe repetir el ensayo
cuando haya sospecha clínica de infección.
2) Sensibilidad
Suero
Dilución
Resultado
esperado
%P
Interpretación
SPC
SPC
OIEISS
1/16
1/64
1/150
+
+
32.8
7.0
27.0
Pos
Neg
Pos
DO 450 SPC
DO 450 Neg.
2.224
0.051
OIEISS
1/600
8.4
Neg
El 2.0 Test ELISA para Ab B. Brucella AniGen exactamente detecta un baja y alto positivo de la referencia OIE de acuerdo a las directivas
Europeas.
■ Precisión
La precisión ha sido determinada intra-ensayo y entre ensayos sometiendo al test 10 réplicas de 3 muestras: un suero estándar negativo,
suero estándar positivo alto y suero estándar positivo bajo. La C.V(%) de los valores negativos, positivo bajo, y positivo alto no sobrepasaron
el 10% del tiempo.
■ Bibliografía de lecturas sugeridas
1) Maichomi MW, Mugambi TJ. Evaluation of microtitre spin agglutination assay in the diagnosis of bovine brucellosis. East Afr Med J. 1999
Dec;76(12):713.
2) A.p. MacMillan, I.Greser Wilke, V. Moening and L.aa. Mathias. A competition enzyme immunoassay for brucellosis diagnosis. 1990.
(97)83:85.3) Francisco J, Vargas O. Brucellosis in Venezuela. Vet Microbiol. 2002 Dec 20;90 (1-4):39-44.
3) Francisco J, Vargas O. Brucellosis in Venezuela. Vet Microbiol. 2002 Dec 20;90 (1-4:39-44)
4) Oficial Journal of the European Communities. Comisión regaulation(EC) No 535/2002. Annex c. ‘BRUCELLOSIS’ 2002 March, 22; (L80) 2228
5) Manual of diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 5th edition. 2004. Part 2. Chapter 2.3.1 ‘Bovine Brucellosis’
■ Almacenamiento y Estabilidad
1) Almacénese a 2~8°C. Este kit de Test es estable hasta la fecha de vencimiento que aparece impresa en
el empaque y en la etiqueta de cada material /reactivo, siempre que no se haya abierto.
2) Estabilidad de materiales /reactivos, una vez abiertos
Material / reactivo
Estado
Almacenamiento
Solución sustrato
1:1 diluido
2 ~ 8°C
2 ~ 8°C
Solución de lavado diluida
Diluido 1:9
Temp. ambiente
Temp. Ambiente
Diluyente del conjugado de enzima
Diluido 1:100
Contenedor cerrado
Protegido de la luz
Estabilidad
4 horas
3 meses
2 semanas
4 horas
■ Unidad de Empaque: 96 pruebas/kit, 480 pruebas/kit y 960 pruebas/kit
Date Issued : ABRIL 24, 2008 DOC No: 14351-4E Registro ICA: 7408 BV
■ Características de Desempeño
1) Especificidad
El 2.0 Test ELISA para Ab B. Brucella AniGen demostró una especificidad del 100% en 154 muestras de suero bovino individual de un área
sin Brucellosis en Corea.
Producido por Bionote, Inc.
2-9, Seogu-dong, Hwaseong-si Gyeonggi-do, Korea 445-170
Tel : +82 31 211 0516, Fax: +82 31 8003 0618
Web: www.bionote.co.kr