Escalado de HPLC a UPLC

HPLC a UPLC
¿Como conseguir una buena transferencia de
métodos?
IV Reunión de Usuarios de Sistemas UPLC
24 Enero 2012, Madrid.
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1
¿Como conseguir una buena
transferencia de métodos?
 Escalado Geométrico
 Escalado Químico
 Herramientas disponibles para facilitar la transferencia
– Columns Selectivity Chart
– Acquity Columns Calculator
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2
Parámetros a Modificar
Dimensiones de columna Acquity UPLC™
Mantener capacidad de separación entre columna HPLC y
columna UPLC
 Capacidad de Separación: Relación entre Longitud y tamaño de
partícula
Columna habitual HPLC 4,6 x 150 mm, 5 µm
Longitud de columna (L) = 150 mm = 150000 µm
Tamaño de partícula (dp)= 5 µm
L = 150000 = 30000
dp
5
 Elegir columna UPLC con la misma relación L/dp que columna
HPLC
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3
Escalado de HPLC a UPLC™
- L/dp constante
5 µm – 150 mm
Inyección = 5,0 µL
Caudal = 0,2 mL/min
Rs (2,3) = 2,28
HPLC
3,5 µm – 100 mm
Inyección = 3,3 µL
Caudal = 0,3 mL/min
Rs (2,3) = 2,32
2,5 µm – 75 mm
Inyección = 2,5 µL
Caudal = 0,5 mL/min
Rs (2,3) = 2,34
UPLC™
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1,7 µm – 50 mm
Inyección = 1,7 µL
Caudal = 0,6 mL/min
Rs (2,3) = 2,29
4
Escalado Geométrico
Método inicial
Temperatura:
Caudal:
Analitos:
30°C
1.50 mL/min
Cafeina (100 µg/mL)
Hidroquinidina (33 µg/mL)
3-Aminobenzofenona (39 µg/mL)
Pesos moleculares:
Diluyente de muestra:
Volumen de inyección:
Detección:
Fase móvil:
Menores de 500
DMSO
10 µL
254 nm
A: 0.05% TFA en agua
B: 0.05% TFA en acetonitrilo
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5
Ejemplo
Características de la Columna inicial
Fase estacionaria:
XTerra® MS C18
Tamaño de partícula (dp):5 µm
Diámetro interno (id): 4,6 mm
Longitud (L):
Cálculo:
150 mm
L
dp
=
150,000 µm
=
5 µm
30,000
Calculamos la relación L/dp como medida de resolución
Con este dato, seleccionamos las dimensiones adecuadas
de la columna de UPLC™
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6
Ejemplo
Resultado Inicial
2
3
Absorbance 254 nm
1
Columna:
4,6 x 150 mm, 5 µm
L/dp = 30.000
Resolución (1,2) = 12
Resolución (2,3) = 28
0
10
20
30
Minutos
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7
Ejemplo
Gradiente inicial
Etapa
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Tiempo
Caudal
%A
%B
Curva
(min)
(mL/min)
Inicial
0
1,5
95
5
*
2
15
1,5
5
95
3
20
1,5
5
95
4
30
1,5
95
5
6
lineal
1
Regeneración
1
Re-equilibrado
8
Ejemplo
Características del Instrumento inicial
 Waters Alliance® 2695 Solvent Manager
– Una única bomba
– Gradiente con mezcla en baja presión
 Waters Alliance® 2695 Sample Manager
 Waters 2487 TUV a 254 nm
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9
Cálculo del volumen de inyección
Cálculo del volumen de inyección
Volumen de columna UPLC
Volumen de inyección inicial X Volumen de columna HPLC
Escalamos el volumen de inyección de 10 µL en una columna
de 4,6 x 150 mm a una columna de 2,1 x 50 mm
2 x 5 cm
3,14
x
(0,105
cm)
10 µL x
=
2
3,14 x (0,23 cm)
x 15 cm
10 µL x 0,17 = 10 µL x 0,068
2,49
= 0,7 µL
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10
Escalado del volumen de inyección
El volumen de inyección debe ser menos del 5% del volumen de la columna.
Intentar por debajo del 1% y determinar experimentalmente si se puede aumentar
según condiciones cromatográficas.
4,6 x 150 mm
2,49 mL
20 µL inyección/2,49 mL = 0,8%
2,1 x 50 mm
0,17 mL
20 µL inyección/0,17 mL = 12%
Si se inyecta demasiado, puede generare una mala forma de pico debido a sobrecarga
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11
Escalado geométrico del flujo
2 col UPLC
π
x
r
Caudal = Caudal inicial x
π x r2 col HPLC
Esta ecuación se reduce a:
d2 Col. UPLC
Caudal = Caudal inicial x 2
d Col HPLC
Escalamos el caudal de 1,5 mL/min en una columna
de 4,6 x 150 mm a una columna de 2,1 x 50 mm
1,5 mL/min X
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2,12
4,62
= 0,31 mL/min
12
Escalado del gradiente inicial
Etapa
Tiempo
(minutos)
Caudal
%A
%
B
Curva
Duración
(min)
Duración
del
gradiente
(cv)
*
0
0
Inicial
0
1,5
95
5
2
15
1,5
5
95
3
20
1,5
5
95
4
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30
1,5
95
5
6
Lineal
1
Regeneración
1
Reequilibrado
15
5
10
13
Duración del gradiente
Expresado en función del volumen de
columna
Etapa 2:
Tiempo de gradiente de 15 min a 1,5 mL/min en una columna de 4,6 x 150 mm
Volumen de gradiente = Caudal x Tiempo = 1,5 mL/min x 15 min = 22.5 mL
Volumen de columna = π x r2 x L = 3,14 x 0,232 x 15 = 2,49 mL
Duración del gradiente (cv) =
Volumen de gradiente
Volumen de columna
Duración del gradiente = 22,5 mL = 9,03 cv
2,49 mL
Nota: etapa 3 : 5 min = 3,01 cv y etapa 4 : 10 min = 6,02 cv
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14
Escalado del gradiente inicial
Etapa
Tiempo
(min)
Caudal %A %B
Curva
Tiempo de
gradiente
(min)
Duración
del
gradiente
(cv)
Inicial
0
1,5
95
5
*
0
0
2
15
1,5
5
95
6
15
9.03
3
20
1,5
5
95
1
5
3.01
4
30
1,5
95
5
1
10
6.02
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15
Escalado del gradiente inicial
Manteniendo constante la duración del
gradiente (cv)
Etapa 2 en HPLC:
15 min @ 1,5 mL/min con una duración en volúmenes de columna de 9.03 cv
Cálculo de etapa 2 en UPLC:
Se mantiene constante la duración del gradiente en volúmenes de columna 9.03 cv
Volumen de columna UPLC = π x r2 x L = 3,14 x 0,1052 x 5,0 = 0,17 mL
Volumen de gradiente UPLC = duración del gradiente (cv) x Volumen de columna
= 9,03 cv x 0,17 mL = 1,54 mL
Tiempo de gradiente (min) = Volumen de gradiente / Caudal
= 1,54 mL / 0,31 mL/min =
5 min
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16
Escalado del gradiente inicial
Columna de 2,1 x 50 mm
Ajustamos el tiempo manteniendo constante la duración del gradiente
en volúmenes de columna
Etapa
Tiempo
(min)
Caudal*
%
A
%B
Curva
Tiempo
gradiente
(min)
Tiempo de
gradiente
(cv)
Initial
0
0,31
95
5
*
0
0
2
5
0,31
5
95
6
5,0
9,03
3
6,67
0,31
5
95
1
1,67
3,01
4
10
0,31
95
5
1
3,33
6,02
Ajustamos el flujo para una columna de 2,1 x 50 mm manteniendo
constante la velocidad lineal (*Escalado geometrico del flujo)
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17
Curvas de van Deemter (PM<500)
30
5 µm SunFire™ C18
3.5 µm SunFire™ C18
25
HETP (µm)
1.8 µm ACQUITY UPLC® HSS T3
1.7 µm ACQUITY UPLC® BEH C18
20
15
10
5
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Linear Velocity [mm/s]
Diámetro
Caudal de trabajo (mL/min)
4.6 mm
0.70
1.40
2.10
2.80
3.50
4.20
4.90
5.60
6.30
7.00
7.70
8.40
2.1 mm
0.15
0.30
0.45
0.60
0.75
0.90
1.05
1.20
1.35
1.50
1.65
1.80
1.0 mm
0.04
0.07
0.11
0.14
0.18
0.21
0.25
0.28
0.32
0.35
0.39
0.42
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18
Gradiente optimizado
Seleccionamos el flujo en UPLC™ y ajustamos el tiempo manteniendo
constante el número de volúmenes de columna
Etapa
Tiempo
(min)
Inicial
Curva
Tiempo de
gradiente
(min)
Tiempo de
gradiente
(cv)
5
*
0
0
5
95
6
2,61
9,03
0,6
5
95
1
0,87
3,01
0,6
95
5
1
1,74
6,02
Caudal
%
A
%
B
0
0,6
95
2
2,61
0,6
3
3,48
4
5,22
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19
Escalado Químico
 ¿Que condiciona la selectividad de una columna?
– Fase enlazada
– Partícula
– Unión de la fase enlazada
– Endcapping
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20
Fase Enlazada
 Diferentes tipos:
– C18 - C8 – CN – Amide –PFP....
 Diferentes enlaces:
– Trifuncional
– Monofuncional
– Embeeded Group
 Diferentes densidades
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21
Evolución del tamaño de partícula
70’s (inicio)
recubrimiento pelicular no-poroso de 40µm
100 – 500 psi
1.000 platos/metro
Columnas de 1m
70’s (finales)
Partículas Irregulares micro-porosas de 10µm
1000 – 2500 psi
25.000 platos/metro
Columnas de 3,9 x 300 mm
10 min
80’s hasta hoy
Partículas esféricas micro-porosas
de 3.5 – 5 µm
1500 – 4000 psi
50.000 – 80.000 platos/metro
Columnas de 3,9 x 150 – 300 mm
10 min
10 min
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22
Fases Híbridas
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23
Evolución de las partículas
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24
End Capping
CH3
Cl
Si
CH3
CH3
Si
CH3
CH3
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CH3
Es un proceso que implica una
segunda derivatización con
trimetilclorosilano ( C1), que
bloquea los grupos hidroxilo
libres, haciéndolos
inaccesibles a nuestros
analitos
Primera Derivatización C18
Quedan ~ 50% OH
Segunda Derivatización C1
Quedan ~ 40% OH.
25
Waters Selectivity Chart
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26
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27
©2012 Waters Corporation
28
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Rellenos columnas BEH UPLC®
 BEH C18
– Relleno C18 trifuncional
– Primera elección en columna UPLC
– Máxima eficacia y óptima simetría de
picos
 BEH C8
– Relleno C8 trifuncional
– Nuevo proceso de endcapping
– El mayor rango de pH
 BEH Shield RP18
– Relleno monofuncional
– Grupo polar embebido
– Selectividad alternativa
 BEH Phenyl
– Relleno Fenilo trifuncional
– Combinación única de partícula y
ligando
– Amplio rango pH

BEH HILIC
– Partícula BEH sin funcionalizar
– Relleno para bases muy polares
 BEH Amide
– Relleno trifuncional con grupo amida
– Modo Hilic para ácidos muy polares y
azúcares
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Tipo Ligando
Densidad
Ligando
Carga
Carbono
Endcapping
Rango
pH
Trifuncional C18
3.1 µmol/m2
18%
Proprietary
1-12
Trifuncional C8
3.2 µmol/m2
13%
Proprietary
1-12
Monofuncional Grupo
Polar Embebido
3.3 µmol/m2
17%
TMS
2-11
Trifuncional C6 Fenil
3.0 µmol/m2
15%
Proprietary
1-12
Sin ligando
---
---
---
1-8
Trifuncional Amide
7.5 µmol/m2
12%
None
2-11
30
Rellenos columnas HSS UPLC®
 HSS T3
– Tecnología T3 de enlazado y endcapping
– Mayor retención para compuestos polares

HSS C18
– Alta cobertura, relleno C18 trifuncional
– Universal, relleno C18 de altas
prestaciones
– Proceso de endcapping patentado para
picos óptimos

HSS C18 SB
– SB: Selectividad para Bases
– Sin encapping: selectividades silanólicas
alternativas
– Diseñada para desarrollo de métodos
Densidad
Ligando
Carga
Carbono
Endcapping
Rango
pH
Trifuncional C18
1.6
µmol/m2
11%
Proprietary
2-8
Trifuncional C18
3.2
µmol/m2
15%
Proprietary
1-8
Trifuncional C18
1.6
µmol/m2
8%
None
2-8
– Estable, compatible con RP & NP, química
CN reproducible
Trifuncional
Propilfluorofenil
3.3
µmol/m2
7.5%
None
2-8
– Baja hidrofobicidad y selectividad única
comparada con ligando C18
Monofuncional
Diisopropil Ciano
2.0
µmol/m2
5.5%
None
2-8
 HSS PFP
– Selectividad excepcional para isómeros
posicionales, compuestos halogenados y
compuestos polares

HSS CN
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Tipo Ligando
31
Rellenos columnas CSH UPLC®
 CSH C18
— Media/alta cobertura trifuncional C18
— Superior forma pico para productos básicos en
fases móviles de baja fuerza iónica
— Menor retención para bases (vs. BEH C18)

CSH PFP Fluorofenil
— Forma pico excepcional y baja retención para
bases con grandes diferencias en selectividad
— Elevada reproducbilidad

CSH Fenil Hexil
— Excepcional forma de pico para compuestos
básicos
— Selectividad complementaria para compuestos
aromáticos
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Tipo Ligando
Densidad
Ligando
Carga
Carbono
Endcapping
Rango
pH
Trifuncional C18
2.3 µmol/m2
15%
Proprietary
1-11
Trifuncional
Propilfluorofenil
2.3 µmol/m2
10%
None
1-8
Trifuncional C6 Fenil
2.3 µmol/m2
14%
Proprietary
1-11
32
UPLC Columns calculator
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33
Condiciones Cromatográficas HPLC
Condiciones Cromatográficas HPLC :
Columna:
XTerra® MS C18 4,6 x 150 mm, 5 µm
Fase Móvil A:
0,1% TFA en agua
Fase Móvil B:
0,08% TFA en acetonitrilo
Caudal: 1,0 mL/min
Perfil Gradiente: Tiempo
Perfil
(min)
%A
%B curva
0,0
92
8
2,0
92
8
6
32,0
50
50
7
35,0
10
90
6
36,0
92
8
6
41,0
92
8
6
Vol. inyección:
10 µL
Conc. muestra: 100 µg/mL
Temperatura:
40 oC
Detección:
UV @ 330 nm
Velocidad adquisición datos: 5 pts/sec
Constante Tiempo:
1,0
Instrumento:
Módulo Separación Alliance® 2695 con 2996 PDA
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34
Método HPLC original:
Derivados de ácido cafeico en Echinacea
Purpurea
5
0.40
1 2
3
AU
0.30
Pc = 94
0.20
4
0.10
0.00
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
35.00
Minutos
Tiempo Retención Resolución USP
Nombre
1. Acido caftárico
5,71
2. Acido clorogénico
7,07
4,20
3. Cinarina
13,96
21,19
4. Equinacosida
16,54
10,16
5. Acido cicoico
20,32
17,14
©2012 Waters Corporation
35
Opción 1:
Escalado geométrico del gradiente
a la misma velocidad lineal de HPLC
HPLC
Pc = 94
0.40
AU
0.30
Name
caftaric acid
chlorogenic acid
cynarin
echinacoside
cichoic acid
0.20
0.10
Retention
Time
5.71
7.07
13.96
16.54
20.32
USP
Resolution
4.20
21.19
10.16
17.14
0.00
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
Minutes
25.00
30.00
35.00
UPLC™
0.40
Name
caftaric acid
chlorogenic acid
cynarin
echinacoside
cichoric acid
Pc = 99
AU
0.30
0.20
0.10
Retention USP
Time
Resolution
1.99
2.38
4.85
5.93
7.11
3.97
25.00
15.09
19.62
0.00
0.00
2.00
©2012 Waters Corporation
4.00
6.00
Minutos
8.00
10.00
12.00
36
Opción 2:
Escalado geométrico del gradiente
a velocidad lineal de UPLC
HPLC
Pc = 94
0.40
Retention USP
Time
Resolution
Name
caftaric acid
5.71
chlorogenic acid 7.07
cynarin
13.96
echinacoside
16.54
cichoic acid
20.32
AU
0.30
0.20
0.10
4.20
21.19
10.16
17.14
0.00
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
Minutos
25.00
30.00
UPLC™
Pc = 85
0.40
AU
0.30
0.20
0.10
35.00
Name
caftaric acid
chlorogenic acid
cynarin
echinacoside
cichoric acid
Retention
Time
0.71
0.87
1.72
2.06
2.44
USP
Resolution
3.96
22.12
11.40
14.28
0.00
0.00
0.50
©2012 Waters Corporation
1.00
1.50
2.00
Minutos
2.50
3.00
3.50
4.00
37