metodo de entrega de agentes a celulas diana.

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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kInt. Cl. : A61K 45/00
11 Número de publicación:
2 113 088
6
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ESPAÑA
A61K 49/00
A61K 39/44
A61K 47/48
C07K 16/46
C07H 21/00
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 94907165.8
kFecha de presentación : 07.01.94
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 679 093
kFecha de publicación de la solicitud: 02.11.95
T3
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k
54 Tı́tulo: Método de entrega de agentes a células diana.
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73 Titular/es: Creative Biomolecules, Inc.
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72 Inventor/es: George, Andrew J.T.;
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74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto
30 Prioridad: 08.01.93 US 2324
35 South Street
Hopkinton Massachusetts 01478, US
The Government of the United States of
America as represented by the Secretary
of the Department of Health and Human
Services
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
ES 2 113 088 T3
16.04.98
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
16.04.98
Aviso:
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k
Segal, David M. y
Huston, James S.
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 113 088 T3
DESCRIPCION
Fundamentos de la invención
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Las células citotóxicas expresan receptores especı́ficos en sus superficies, por los cuales aquéllas distinguen células alteradas o extrañas de las células autólogas normales. Estos receptores forman uniones
múltiples con estructuras existentes en las superficies de las células diana, que conducen a conjugados
estables entre las células citotóxicas y las células diana. Cada célula citotóxica suministra entonces un
“golpe letal” a su célula diana conjugada y se desprende de ella, dejando una célula diana moribunda
y una célula citotóxica que está libre para localizar y destruir otra diana. (Segal, D.M. et al., Cancer
Invest. 6(1): 83-92 (1988); Segal, D.M. et al., Mol. Immunol. 25: 1099-1103 (1988)).
Recientemente, se ha desarrollado un método por el cual el sistema natural de reconocimiento de las
células citotóxicas puede ser manipulado artificialmente, dando lugar a células citotóxicas de cualquier
especificidad deseada, con inclusión de especificidad contra células tumorales (Segal, D.M. et al., Patente
de EE.UU. N◦ 4.676.980; Karpovsky B., et al., J. Exp. Med., 160: 1686-1701 (1984); Pérez, P., et al., Nature, 316: 354-356 (1985)). El método para bombardear de nuevo deliberadamente las células citotóxicas
emplea anticuerpos heterobiespecı́ficos reticulados, en los cuales un anticuerpo está dirigido contra el receptor existente en la célula citotóxica que está implicada en la lisis, mientras que el segundo anticuerpo
está dirigido contra una estructura de la célula diana, por ejemplo, un antı́geno tumoral. Al enlazar el
receptor relevante existente en la célula citotóxica directamente a la célula diana, los anticuerpos heterobiespecı́ficos reticulados promueven la formación de conjugados efector:diana y envı́an una señal a la
célula citotóxica para suministrar un golpe letal. Pueden producirse hetero-agregados de anticuerpos por
reticulación quı́mica, o por fusión de dos células de hibridoma. (Segal, D.M. et al., en: Biological Therapy
of Cancer Updates Vol. 2, V.T. DeVita, S. Hellman y S.A. Rosenberg, compiladores J.B. Lippincott Co.,
Filadelfia, pp. 1-12 (1992)).
En los últimos años, se ha puesto mucho interés en el redireccionamiento de células citotóxicas para
destruir células neoplásticas o infectadas por virus no deseadas. Una manera común de hacer esto consiste
en utilizar un anticuerpo biespecı́fico con especificidad dual para un antı́geno existente en la célula diana
y una molécula excitadora existente en la célula efectora (tal como CD3 en las células T). Anticuerpos
biespecı́ficos de este tipo están siendo utilizados en cierto número de ensayos clı́nicos para direccionar
células T contra tumores (Segal, D.M. y Wunderlich, J.R., Cancer Investigation 6: 83-92 (1988)).
El concepto de las células efectoras redireccionadas para el tratamiento de condiciones patológicas,
tales como el cáncer, ofrece algunas ventajas sobre la inmunoterapia convencional, no direccionada. Sin
embargo, la selección inmune de las células diana sobre las células normales es todavı́a problemática.
Puede conseguirse una selectividad incrementada por combinación de formas de terapia, tales como radiación y/o quimioterapia en asociación con la inmunoterapia. Sin embargo, estas terapias suplementarias
están acompañadas a menudo por efectos secundarios graves. Además, para alcanzar las células cancerosas diana, estos grandes anticuerpos reticulados tienen que penetrar suficientemente en el tejido sólido
del tumor para fijarse a la célula diana tumoral.
Adicionalmente, se han observado en pruebas clı́nicas respuestas inmunes del huésped a los xenoanticuerpos (es decir, anticuerpos producidos en especies distintas que el huésped que sufre el tratamiento).
Estas respuestas podrı́an destruir la especificidad antitumoral de las células efectoras redireccionadas.
Además, el aclaramiento de anticuerpos reticulados no combinados de este tamaño, ası́ como el aclaramiento de los anticuerpos después de la fijación, es también un problema.
Por último, las células efectoras redireccionadas pueden perder sus receptores tumorales adquiridos
artificialmente (los anticuerpos heterobiespecı́ficos) por interacción con células tumorales, por división
de las células efectoras, por endocitosis, por enzimas proteolı́ticas extracelulares, o por desprendimiento
natural. La actividad antitumor en el huésped puede mantenerse por tratamientos repetidos con células
efectoras y anticuerpos de direccionamiento. Sin embargo, la producción de grandes cantidades de anticuerpos heterobiespecı́ficos con la especificidad necesaria para interaccionar con la diana propuesta tal
como los antı́genos tumorales de la superficie celular es costosa y consume mucho tiempo. Por ello, serı́a
ventajoso poder producir grandes cantidades de anticuerpos biespecı́ficos de calidad clı́nica, para uso con
muchos antı́genos tumorales o marcadores de la superficie celular diferentes para tratamiento repetido.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a la materia objeto de las reivindicaciones. En esta memoria se describen métodos para suministrar agentes a células diana. Las células diana están modificadas por una
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o más proteı́nas de fijación monoespecı́ficas reactivas con uno o más marcadores de la superficie de las
células diana existentes naturalmente. La proteı́na de fijación monoespecı́fica reactiva con el marcador
de la superficie celular se marca con un identificador, se fusiona, o se marca con un resto quı́mico que es
reconocido por, y se fija a, un sitio existente en un anticuerpo multivalente, que fija también un agente a
suministrar. El agente se fija al anticuerpo multivalente, el cual se fija también, a su vez, a una proteı́na
de fijación monoespecı́fica marcada con un identificador que se fija a un marcador de la superficie celular
en una célula diana. De este modo, el agente se suministra, o se dirige directamente, a las células diana.
La expresión resto quı́mico, como se utiliza en esta memoria, incluye un péptido fusionado
genéticamente o acoplado de otro modo, uno o más péptidos dentro de la secuencia de una proteı́na de
fijación mono- o biespecı́fica, un péptido modificado con posterioridad a la traducción o quı́micamente,
un sustituyente quı́mico tal como biotina, incorporado en la proteı́na, o cualquier aminoácido no natural
incorporado en la proteı́na de fijación. El resto quı́mico incluye también cualquier proteı́na o partes de
la misma, o cualquier péptido que comprenda una secuencia de aminoácidos que es reactiva con un sitio
de reconocimiento, con inclusión de un enlazador que conecta regiones variables de un fragmento Sv
monocatenario (sFv) o proteı́na de fusión de sFv, o un epı́tope de la proteı́na de fijación monoespecı́fica.
El término selectividad, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere al reconocimiento de células
diana, en oposición a las células no diana, o normales. El término especificidad, tal como se utiliza en
esta memoria, se refiere al reconocimiento de componentes singulares de la superficie celular, tales como
antı́genos o receptores, por una molécula de fijación. El sitio de reconocimiento se refiere a la parte de
una molécula de fijación que es reactiva con, se asocia con, o se fija a un resto quı́mico. El sitio reconocido
puede ser un sitio de fijación en una proteı́na, un epı́tope continuo o discontinuo de una proteı́na, o un
péptido o sustituyente quı́mico añadido quı́mica o bioquı́micamente.
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El huésped puede ser un huésped mamı́fero, con inclusión de seres humanos, animales domésticos (p.ej.
perros, gatos, caballos), ratones o ratas. La expresión proteı́na de fijación monoespecı́fica tiene por objeto
abarcar fragmentos de proteı́nas de fijación tales como los fragmentos Fab y F(ab)2 , proteı́nas de fusión de
Fab (Better, M., Horwitz, A.H., Meth. Enzymol. 178: 476-496 (1989), proteı́nas Fv monocatenarias (sFv)
(a las que se hace también referencia en esta memoria como anticuerpos monocatenarios), proteı́nas de
fusión Fv monocatenarias, proteı́nas de anticuerpos quiméricos (p.ej., proteı́nas de anticuerpos recombinantes derivadas de células de transfectoma (Shin, S.-U. y Morrision, S.L., Meth. Enzymol. 178: 459-476
(1989); Love, T.W., et al., Meth. Enzymol. 178: 515-527 (1989)), proteı́nas monocatenarias quiméricas
y otras proteı́nas de fusión monocatenarias análogas a Fv, tales como receptores monocatenarios de las
células T. La proteı́na de fijación monoespecı́fica preferida es un anticuerpo monocatenario. La expresión
proteı́na de fijación monoespecı́fica tiene por objeto también abarcar mezclas de más de una proteı́na de
fijación monoespecı́fica reactiva con componentes de la superficie celular existentes naturalmente (p.ej.,
un cóctel de tipos diferentes de proteı́nas de fijación monoespecı́ficas reactivas con varios epı́topes de la
superficie celular diferentes).
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La expresión anticuerpo multivalente tiene por objeto abarcar cualquier anticuerpo multivalente con
inclusión de anticuerpos policlonales o monoclonales (p.ej., IgG o IgM), anticuerpos enteros heterobiespecı́ficos reticulados, fragmentos biológicamente funcionales reticulados de los mismos (policlonales o
monoclonales) (p.ej. fragmentos Fab), anticuerpos quiméricos que comprenden proteı́nas de más de una
especie, anticuerpos monocatenarios biespecı́ficos, análogos de anticuerpos monocatenarios quiméricos
y moléculas de IgG homodı́meras. Estas proteı́nas anticuerpos multivalentes pueden producirse por
métodos conocidos de laboratorio.
En una realización preferida, la proteı́na de fijación monoespecı́fica que se fija al marcador de la superficie de la célula diana es un anticuerpo monocatenario (sFv); el resto quı́mico es un identificador peptı́dico
(p.ej. una secuencia de aminoácidos); y el anticuerpo multivalente es un anticuerpo heterobiespecı́fico
que se fija al identificador peptı́dico del sFv y se fija también a un agente que debe ser suministrado a la
célula diana, tal como una célula efectora.
En otra realización, el método de suministro, o direccionamiento, de agentes a una célula diana utiliza
una mezcla, o cóctel, de proteı́nas de fijación monoespecı́ficas. Este cóctel contiene varios tipos diferentes de proteı́nas de fijación monoespecı́ficas, siendo cada tipo de proteı́na de fijación especı́fico para un
marcador, epı́tope, o antı́geno diferente de la superficie celular, existente en la célula diana. Ası́ pues,
debido a que cada clase de célula diana tiene su propio perfil singular de componentes de la superficie
celular, la célula diana puede estar modificada con mayor especificidad que con las proteı́nas de fijación
monoespecı́ficas para un solo componente individual de la superficie.
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La presente invención encuentra utilidad en un método de inmunoterapia en un huésped, por el cual
las células diana se destruyen con selectividad mejorada utilizando agentes citotóxicos dirigidos contra
las células diana. Este método de inmunoterapia implica dos conceptos: la modificación especı́fica de la
célula diana con proteı́nas de fijación monoespecı́ficas marcadas con restos quı́micos y el direccionamiento
de agentes citotóxicos a las células diana modificadas.
El método de inmunoterapia descrito en esta memoria, comprende administrar a un huésped una
proteı́na de fijación monoespecı́fica que se fija a uno o más marcadores de la superficie celular existentes
naturalmente y “modifica” de este modo la célula diana. La proteı́na de fijación monoespecı́fica está marcada con un resto quı́mico de identificación, tal como un péptido. Subsiguientemente a la modificación de
la célula diana, se administra al huésped un anticuerpo multivalente que se fija a la célula diana marcada
con el resto quı́mico de identificación y se fija también a un agente citotóxico. Alternativamente, agentes
citotóxicos tales como linfocitos T citotóxicos (CTLs) pueden revestirse con anticuerpos multivalentes in
vitro y los CTL’s redireccionados (es decir, dirigidos a la célula diana para su suministro) se administran
después del primer paso de modificación de la célula diana. Debido a que la proteı́na de fijación monoespecı́fica marcada con un identificador es menor que un anticuerpo heterobiespecı́fico entero intacto, el
identificador no fijado es aclarado de la circulación mucho más rápidamente que el anticuerpo biespecı́fico
de mayor tamaño. Esto reduce notablemente el ruido de fondo, la fijación inespecı́fica, y los niveles en
suero de la proteı́na de fijación monoespecı́fica marcada con un identificador. Ası́, el agente citotóxico
destruye la célula diana con selectividad incrementada, sobre la base de la modificación singular de la
célula diana con la proteı́na de fijación monoespecı́fica que contiene el identificador.
En otra realización, la afinidad de fijación entre la proteı́na de fijación monoespecı́fica marcada con el
identificador peptı́dico (o marcada con un resto quı́mico de identificación) y el anticuerpo multivalente se
altera o disminuye (es decir, se reduce a un valor menor que la afinidad de fijación normal). El direccionamiento eficaz con esta afinidad de fijación disminuida aprovecha la ventaja de los contactos multi-sitio
entre los anticuerpos multivalentes fijados a CTL y la célula diana modificada, y de este modo, da como
resultado una interacción más especı́fica entre el agente a suministrar y la célula diana. Por ejemplo,
la afinidad de fijación disminuida entre la célula diana modificada y el anticuerpo multivalente evita un
direccionamiento débil de un solo sitio y favorece acusadamente la fijación del agente citotóxico a la
célula diana con la selectividad mejorada de interacción multi-sitio. La afinidad de fijación disminuida
puede lograrse por mutación de la secuencia de aminoácidos del identificador peptı́dico (o estructura del
resto quı́mico) o la secuencia del anticuerpo multivalente, de tal manera que la afinidad del anticuerpo
multivalente para el identificador peptı́dico resulte disminuida.
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La utilidad de las proteı́nas de fijación que tienen dos sitios de fijación independientes de selectividad
diferente para el tratamiento o el control de tumores, células infectadas por virus, bacterias y otros estados
patógenos ha sido reconocida. (Segal, D.M. y Snider, D.P., Chem. Immunol., 47: 179-213 (1989); (Segal,
D.M., et al., en: Biological Therapy of Cancer Updates Vol. 2, V.T. DeVita, S. Hellman y S.A. Rosenberg,
compiladores J.B. Lippincott Co., Filadelfia, pp. 1-12 (1992)). Sin embargo, los anticuerpos biespecı́ficos
convencionales (p.ej. anticuerpos reticulados) son demasiado grandes para penetrar fácilmente en los tumores sólidos. Ası́ pues, un enfoque de inmunoterapia que utiliza una proteı́na de fijación monoespecı́fica
con un anticuerpo multivalente presenta numerosas ventajas.
Beneficios adicionales se deducen de la incorporación de epı́topes estandarizados en regiones de fijación
de antı́geno que están direccionadas a componentes especı́ficos de la superficie en las células diana. Estas
regiones de direccionamiento separadas son ventajosas debido a que tienen tı́picamente menor tamaño
que el anticuerpo heterobiespecı́fico, cuya fijación servirá para localizar o “fijar” las regiones de fijación
de antı́geno in situ para mejorar la localización de la diana.
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La proteı́na de fijación monoespecı́fica tiene una capacidad singular para penetrar en los tumores
sólidos y ser aclarada rápidamente de la circulación si no está localizada en un sitio diana. Ası́ pues,
estas proteı́nas son extremadamente adecuadas para inmunoterapia de tumores. La proteı́na de fijación
monoespecı́fica muestra también una fijación no selectiva y una disposición no deseada insignificantes en
los órganos, tales como el riñón (Yakota, T. et al., Cancer Res. 52: 3402-3408 (1992)). Debido a su
pequeño tamaño, usualmente de peso molecular menor que 52.000 y preferiblemente un peso molecular
menor que 30.000, la proteı́na de fijación monoespecı́fica es menos inmunógena y, por consiguiente, tiene
menos probabilidad de causar una reacción inmune en el huésped durante el curso de la terapia. Debido
también a su pequeño tamaño, la proteı́na de fijación monoespecı́fica es menos susceptible de proteólisis.
Ası́ pues, la proteı́na de fijación monoespecı́fica es razonablemente un reactivo más estable.
Adicionalmente, cualquier proteı́na de fijación monoespecı́fica puede construirse con un resto quı́mico
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distintivo que es reconocido por el anticuerpo multivalente. Ası́, puede construirse un anticuerpo multivalente genérico que fija un identificador peptı́dico distintivo en un sitio de fijación de y un agente a
suministrar en el segundo sitio de fijación, para uso universal en cualquier número de situaciones inmunoterapéuticas. Adicionalmente, los métodos de inmunoterapia descritos en esta memoria pueden
direccionar deliberadamente cualquier cosa que sea reconocida por los sitios de fijación multivalentes no
peptı́dicos. Ası́ pues, puede direccionarse deliberadamente un linfocito citotóxico, un radioisótopo, un
agente de formación de imagen o un fármaco letal para destruir la célula diana. La misma proteı́na de
fijación monoespecı́fica marcada con el identificador peptı́dico puede ensayarse o utilizarse para regı́menes
de terapia diferentes sin re-elaborar la estructura de la proteı́na de fijación monoespecı́fica o el protocolo
de producción. Además, dado que la proteı́na de fijación monoespecı́fica marcada con el identificador
peptı́dico no es tóxica por sı́ misma, la ventana terapéutica para una inmunoterapia de combinación de
dos etapas deberı́a ser mucho mayor que la que serı́a posible para una administración simple de inmunoconjugado tóxico. (Bosslet, P., et al., Cancer Treat. Rev., 17: 355-356 (1990); Bosslet, P., et al., Br. J.
Cancer, 63: 681-686 (1991)).
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Adicionalmente, una ventaja singular de este método de inmunoterapia es que el mismo permite el
direccionamiento multi-sitio basado en cócteles de proteı́nas de fijación monoespecı́ficas marcadas con
restos quı́micos. Por ejemplo, un cóctel puede comprender una mezcla de proteı́nas sFv, teniendo cada
sFv un resto quı́mico estandarizado común a la mezcla de proteı́nas sFv, pero proteı́nas sFv diferentes
pueden fijarse a antı́genos distintos en el tumor o en otras células diana. Podrı́an ser necesarias interacciones multi-sitio si se eligen anticuerpos con constantes de fijación bajas para asociación con el resto
quı́mico. Alternativamente, puede alcanzarse una constante de fijación menor que la normal utilizando
una secuencia de identificador peptı́dico truncada, o mutada de cualquier otro modo. Por debajo de cierta
afinidad umbral, p.ej., Ka, intrı́nseca = 103 M−1 , el agente citotóxico dirigido a la célula serı́a incapaz
de fijarse eficazmente por uno o incluso dos contactos, pero con números mayores de interacciones, la
fijación multi-sitio puede ser muy fuerte. De este modo se forma un conjugado diana:efector muy estable.
Adicionalmente, la selectividad del agente citotóxico dirigido a la célula se aumenta por el direccionamiento multi-sitio. Un problema muy importante de la inmunoterapia del cáncer es el escape de variantes,
o la pérdida de epı́topes de superficie en las células cancerosas debida a mutaciones. George, A.J.T., et al.,
International Rev. Immunol., 4:271-310 (1989). El problema se minimiza por el uso de la inmunoterapia
de direccionamiento multi-sitio como se describe en esta memoria. Por ejemplo, si una célula tumoral
tiene cuatro epı́topes singulares como dianas, pero solamente se bombardea un epı́tope, y dicho epı́tope
se pierde por mutación, queda excluido el tratamiento con éxito utilizando una inmunoterapia de una
sola diana que está direccionada al epı́tope perdido. En cambio, con el direccionamiento multi-sitio, que
podrı́a estar direccionado a los cuatro epı́topes, si se pierde un sólo epı́tope, el tratamiento puede ser
todavı́a satisfactorio debido a que están disponibles los tres epı́topes restantes para direccionamiento del
agente terapéutico.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una representación esquemática de un método de inmunoterapia que utiliza proteı́nas de
fijación monoespecı́ficas y anticuerpos multivalentes.
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La Figura 2 es una representación esquemática del método de producción de la proteı́na U7.6 sFv. El
paso (1) muestra la unión de los productos VH y VL de PCR para producir el gen U7.6 sFv, y
el paso (2) muestra la combinación del gen U7.6 sFv y el vector de expresión pHEN1 para dar el
plásmido pHEN1-U7.6.
La Figura 3A es la secuencia de ADN (SEQ ID NO:1) de la región VH de U7.6 sFv con su secuencia de
aminoácidos predicha (SEQ ID NO:2).
La Figura 3B es la secuencia de ADN (SEQ ID NO:3) de la región VL de U7.6 sFv con su secuencia de
aminoácidos predicha (SEQ ID NO:4).
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La Figura 4 representa los resultados de la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y
las transferencias Western de U7.6 sFv durante la producción y la purificación.
La Figura 5 es una representación gráfica del análisis por tamaños de U7.6 sFv renaturalizado (perfil
superior) y datos de transferencia de puntos que muestran la absorción especı́fica a DNP-lisinaSepharose (paneles inferiores).
La Figura 6 describe los resultados de la fijación de U7.6 sFv a células modificadas con TNP, medida
por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
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La Figura 7 muestra los resultados de la fijación relativa de U7.6 sFv y Fab a células B6MC1 revestidas
con TNP.
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La Figura 8 muestra los resultados de la inhibición de la fijación de U7.6 Fab y U7.6 sFv a células
modificadas con TNP por el hapteno libre de DNP.
La Figura 9 muestra los resultados de la inhibición de la fijación de U7.6 Fab a células modificadas con
= U7.6 a 13,9 nm).
TNP por U7.6 sFv ( = U7.6 a 125 nm, • = U7.6 a 41,7 nm,
La Figura 10 muestra los resultados de la fijación de OKT9 sFv a las células K562.
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La Figura 11 muestra los resultados del direccionamiento de la lisis utilizando U7.6 sFv.
La Figura 12 muestra los resultados de la lisis de células L transfectadas con TNP-TFR por células T
humanas activadas.
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La Figura 13 es una representación esquemática de la fijación multi-sitio de linfocitos T citotóxicos a
células diana modificadas con proteı́nas de fusión Fv monocatenarias múltiples.
Descripción detallada de la invención
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En esta memoria se describen métodos de suministro o direccionamiento de agentes a células diana.
La célula diana está modificada por una o más proteı́nas de fijación monoespecı́ficas reactivas con uno
o más marcadores de la superficie de las células diana existentes naturalmente. La proteı́na de fijación
monoespecı́fica reactiva con el marcador de la superficie celular se marca con un identificador, se fusiona
a, o se marca con un resto quı́mico que es reconocido por, y se fija a, un sitio de un anticuerpo multivalente, que se fija también a un agente que debe suministrarse. De este modo, el agente se suministra a la
célula diana o se direcciona hacia la misma.
Especı́ficamente, una proteı́na de fijación monoespecı́fica unida a un marcador de la superficie celular
se marca con un identificador, o con un resto quı́mico que sirve como contacto, o señal, para asociación
con un sitio de reconocimiento en un anticuerpo multivalente. Este anticuerpo multivalente fija también
un agente que debe suministrarse, o dirigirse, a la célula diana, en otro sitio de fijación. De este modo, el
agente se suministra a la célula diana mediante la asociación del sitio de reconocimiento en el anticuerpo
multivalente y el resto quı́mico de la célula diana modificada.
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Las células diana de la presente invención incluyen cualquier célula en un huésped mamı́fero que es
indeseable y precisa ser eliminada, controlada, atacada y/o destruida funcionalmente o de otro modo.
En particular, las células diana pueden ser células tumorales, células infectadas por bacterias, células
infectadas por virus, o células autoinmunes.
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Las células diana tienen componentes de la superficie celular, o marcadores, existentes naturalmente.
Estos marcadores superficiales incluyen receptores especı́ficos, tales como el receptor de la hormona estimulante de los melanocitos (MSH) expresado en células de melanoma, o antı́genos selectivos, tales como
el antı́geno Ca 125 del cáncer humano expresado en células de carcinoma ovárico. Los marcadores de
la superficie celular pueden incluir también las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad
(MHC I o MHC II) y las células infectadas con virus expresan frecuentemente antı́genos vı́ricos en sus
superficies. Considerados en su conjunto, los componentes de la superficie de una célula presentan un
perfil de marcadores superficiales exclusivo de dicho tipo particular de célula.
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Los marcadores de la superficie celular pueden utilizarse para dirigir agentes, tales como agentes de
formación de imágenes, otros anticuerpos y agentes citotóxicos, tales como fármacos o células efectoras
citotóxicas, que deban suministrarse a la célula. Agentes citotóxicos pueden incluir fármacos citotóxicos
y radionucleótidos eficaces en terapia quı́mica o de radiación. Por ejemplo, se puede diseñar un fármaco
para fijarse a un receptor de la superficie celular y bloquear la fijación de ligandos, o puede fijarse
especı́ficamente un anticuerpo a una célula diana por la vı́a de un marcador de la superficie celular,
señalizando con ello a modo de una bandera la célula diana para las células que median la citotoxicidad
celular dependiente de los anticuerpos. Sin embargo, los fármacos y anticuerpos dirigidos hacia los marcadores de la superficie celular existentes naturalmente pueden no ser totalmente selectivos para la célula
diana, dando como resultado la destrucción de células normales junto con las malignas.
Como se describe en esta memoria, una célula diana se modifica para mejorar la fijación selectiva a
dicha célula diana de los agentes citotóxicos dirigidos contra la misma. Una célula diana se modifica por
una o más proteı́nas de fijación monoespecı́ficas reactivas con (fijadas a) uno o más de los marcadores de
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la superficie celular existentes naturalmente. La proteı́na de fijación monoespecı́fica puede ser un fragmento de proteı́na de fijación tal como un fragmento de anticuerpo Fab, Fab’, o F(ab)’2 , que se prepara
por métodos convencionales de laboratorio. Las proteı́nas de fijación monoespecı́ficas pueden ser también
proteı́nas de fusión Fv monocatenarias (sFv), anticuerpos monocatenarios, análogos de proteı́nas monocatenarias quiméricas y otras proteı́nas de fusión monocatenarias, tales como receptores de las células
T monocatenarios. En una realización preferida, la proteı́na de fijación monoespecı́fica reactiva con el
marcador de la superficie de la célula diana es un anticuerpo monocatenario. La Figura 1 es una representación esquemática de una célula diana modificada por anticuerpos monocatenarios marcados con un
identificador peptı́dico. Fijado al identificador peptı́dico se encuentra un anticuerpo heterobiespecı́fico,
que fija también un linfocito T citotóxico.
Un sFv es un constructo monocatenario elaborado por ingenierı́a genética de la porción Fv de una
molécula de anticuerpo, u otra molécula receptora de la superfamilia Ig. La construcción de moléculas
de anticuerpos monocatenarios se describe en Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:
5879-5883 (1988), Huston, J.S., et al., Meth. Enzymol. 203: 46-88 (1991) y Huston, et al., patente de
EE.UU. N◦ 5.091.513. El sFv contiene dos dominios de región variable enlazados uno a otro por un espaciador peptı́dico flexible. Estas moléculas sFv contienen toda la información requerida para determinar la
especificidad antigénica, careciendo de la región constante que define las funciones efectoras, tales como
interacciones con el receptor Fcγ que fija las células efectoras citotóxicas. El pequeño tamaño de estas
moléculas (25-30 kD) mejora muchas de sus propiedades farmacocinéticas, aumentando la penetración en
los tejidos sólidos, disminuyendo la semi-vida en la circulación y reduciendo la inmunogenicidad. (Yakota,
T. et al., Cancer Res. 52: 3402-3408 (1991); Milenic, D.E., et al., Cancer Res., 51:6363-6371 (1991)). El
anticuerpo monocatenario fijado al marcador de la superficie celular se marca con un identificador, o con
un resto quı́mico que sirve como contacto, o señal, para asociación con un sitio de reconocimiento en un
anticuerpo multivalente y, de este modo, dirige el anticuerpo multivalente para fijarse a la célula diana.
En una realización preferida, el resto quı́mico es un identificador peptı́dico que comprende una secuencia
de aminoácidos corta, tal como la secuencia peptı́dica EQKLISEEDLN del intensificador myc del resto
de 11 aminoácidos (SEQ ID NO:5) en una proteı́na Fv monocatenaria.
Han sido producidas proteı́nas Fv monocatenarias por células eucariotas y procariotas, y en lisados
exentos de células. Los sistemas de expresión procariotas ofrecen muchas ventajas en términos de facilidad de manipulación, rendimientos elevados y coste reducido. Sin embargo, la mayorı́a de los sistemas
de expresión bacterianos producen las proteı́nas recombinantes en cuerpos de inclusión insolubles, que
requieren protocolos de replegado complicados para obtener proteı́na activa. Un enfoque alternativo consiste en dirigir la proteı́na al espacio periplásmico de bacterias Gram-negativas, en el cual cierto número
de proteı́nas bacterianas pueden ayudar al replegado y la oxidación de la proteı́na recién sintetizada.
Sistemas de expresión periplásmicos de este tipo han sido utilizados para la producción de proteı́nas sFv.
(Glockshuber, et al., Biochemistry 29: 1362-1367 (1990)).
En algunos casos, las proteı́nas sFv se aı́slan del material periplásmico, mientras que en otros puede
encontrarse material soluble en el medio de crecimiento, debido probablemente a la liberación de la sFv
del periplasma después de la ruptura de la pared exterior de la célula bacteriana.
Los Ejemplos 1 y 2 siguientes, describen en detalle la producción de dos proteı́nas sFv marcadas con
un identificador peptı́dico en el periplasma bacteriano, una de ellas dirigida contra el hapteno dinitrofenol
(DNP) y la otra contra el receptor transferrina. Utilizando la sFv anti-DNP como sistema modelo, pueden
construirse proteı́nas de fusión monocatenarias adicionales con especificidad para otros componentes de
la superficie celular. Asimismo, como se describe en el Ejemplo 1, estas proteı́nas sFv pueden purificarse
en una forma activa, sin necesidad de grandes cantidades de antı́geno para la purificación por afinidad.
Los Ejemplos 3 y 4 siguientes, demuestran que la sFv se fija especı́ficamente a las células diana y, cuando
están unidas a un anticuerpo anti-CD3, son útiles para dirigir las células T citotóxicas a fin de destruir
las células diana.
Se construyó una proteı́na sFv marcada con un identificador peptı́dico, U7.6 sFv, especı́fica para el
hapteno DNP, como se describe en detalle en el Ejemplo 1. Una representación esquemática de los pasos
de PCR y de clonación se presenta en la Figura 2. Resumidamente, las regiones V del anticuerpo U7.6
anti-DNP se multiplicaron por PCR y se clonaron originalmente como una sFv. El análisis de la secuencia
de las regiones V demostró que los dominios VL y VH pertenecı́an a las familias de la región VKVI y
VHII, respectivamente. La Figura 3A representa la secuencia de ADN del dominio VH (SEQ ID NO:1),
con su secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO:2), y la Figura 3B representa la secuencia de
ADN del dominio VL (SEQ ID NO:3) y su secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO:4). Los
iniciadores que se utilizaron originalmente para multiplicar las regiones V del ADNc se diseñaron para
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reasociarse a regiones V de las familias VK IV o VI y VH I y II. Los iniciadores diseñados para otras
familias de la región V no multiplicaban el ADNc de U7.6 (con la excepción de un iniciador basado en la
familia VK Vb, que puede multiplicar una cadena kappa reordenada de modo aberrante producida por
la pareja de fusión derivada de MOPC 21 utilizada para producir el hibridoma).
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Con objeto de ensayar la posibilidad de utilización del empalme de genes por técnicas de extensión
con solapamiento para construir una sFv marcada con un identificador peptı́dico, se produjo de nuevo
el constructo antes de la clonación al vector de expresión pHEN 1. Este método permite construir
rápidamente una sFv completa por dos tandas secuenciales de multiplicación por la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR)(Figura 2, paso 1), seguido por clonación directa al vector de expresión (Figura 2,
paso 2). Este método tiene una ventaja adicional en el sentido de que no es necesario introducir ningún
sitio de restricción entre los dos dominios de la región V. El nuevo constructo U7.6 sFv se clonó a pHEN
1 entre la secuencia conductora PelB y un identificador peptı́dico.
Para la producción de sFv, se dejaron crecer bacterias que albergaban pHEN 1 U7.6 y se indujeron
con IPTG. Pudo aislarse cierta cantidad de sFv activa (100-500 µg/l) directamente a partir del sobrenadante de cultivo por adsorción a perlas de DNP-Sepharose, y elución con hapteno (Figura 4, pista 5). Sin
embargo, la mayor parte del material sFv se encontró asociado con las bacterias en una forma insoluble.
Para aumentar el rendimiento de sFv se lisaron las bacterias, se solubilizó la proteı́na, y se dejo renaturalizar luego por diálisis contra un tampón (Figura 4, pista 3). El anticuerpo sFv se purificó luego por
afinidad (Figura 4, pista 4). Este procedimiento que se basa en las bacterias para formar enlaces disulfuro
en el espacio periplásmico, dio reproduciblemente altos rendimientos de sFv. En un experimento tı́pico,
se obtuvo un total de 4,5 mg de sFv activa por litro de cultivo.
La sFv de fijación de DNP se aisló por afinidad y cromatografı́a de exclusión de tamaños, como se
describe en el Ejemplo 1. Con objeto de determinar la actividad de las diversas fracciones recogidas de
la columna, se incubaron partes alı́cuotas con perlas de DNP en presencia o ausencia de hapteno DNP
libre, como se describe también en el Ejemplo 1. Las perlas se separaron luego por centrifugación y los
sobrenadantes se ensayaron en cuanto a la presencia de sFv por transferencia de puntos con el anticuerpo
anti-péptido. Como se muestra en la Figura 5, las perlas de DNP-Sepharose separaban selectivamente
la proteı́na monómera (pista B). Esta separación era bloqueada por el hapteno DNP 1 mM (pista C) lo
que demostraba que era especı́fica. Como se muestra en la Figura 5, la mayor parte del constructo U7.6
sFv activo y adsorbible reside en el pico monómero, y la mayor parte, si no la totalidad, de la proteı́na
monómera es activa. Ası́ pues, la cromatografı́a de exclusión de tamaños proporciona un método relativamente sencillo para separar la sFv activa de la inactiva.
La capacidad del constructo U7.6 sFv para fijarse a las superficies celulares se ensayó por análisis
FACS, como se describe en el Ejemplo 3, utilizando Mycl 9E10.2 marcado con FITC para detectar la
sFv. Como se muestra en la Figura 6, el constructo U7.6 sFv se fija a las células B6MC1 revestidas con
TNP, pero no a las células B6MC1 solas. Adicionalmente, tanto U7.6 sFv como un Fab derivado de U7.6
IgG se fijaban a las células TNP B6MC1 a concentraciones similares, como se muestra en la Figura 7.
Con objeto de comparar las eficiencias de fijación relativas de U7.6 sFv y U7.6 Fab, se comparó la
capacidad del hapteno DNP para inhibir la fijación de las dos moléculas. Como se muestra en la Figura
8, la fijación tanto de Fab como de sFv era inhibida por el hapteno DNP en un grado comparable, encontrándose el punto de inhibición del 50% aproximadamente para hapteno 10−8 M.
La fijación del U7.6 podı́a inhibirse por la presencia de U7.6 sFv (Figura 9). Cuando las concentraciones de las dos especies eran equimolares, la fijación del U7.6 Fab era aproximadamente semi-máxima,
lo que sugerı́a que sFv y Fab tienen afinidades similares para el TNP en la superficie celular.
Con objeto de demostrar que el método de producción de sFv es aplicable de un modo más general,
se fabricó un constructo en pHEN 1 que contenı́a una versión de sFv del anticuerpo OKT9, como se
describe en el Ejemplo 2. Este anticuerpo reacciona con el receptor de transferrina humano. Además de
los dominios VL y VH unidos por el mismo enlazador ((Gly)4Ser)3 utilizado en U7.6 sFv, se insertó una
secuencia de hexahistidina entre el dominio VH y el identificador peptı́dico, para permitir la purificación
por cromatografı́a de afinidad de metales. El constructo OKT9 sFv se indujo y solubilizó en guanidina
como en el caso de U7.6 sFv, y la sFv se adsorbió sobre perlas de Ni2+ -NTA seguido por elución con
imidazol. El material purificado se replegó luego por diálisis y se fraccionó en una columna Superdex 75.
Las fracciones correspondientes al pico monómero se recogieron y ensayaron por análisis FACS respecto
a fijación a las células K562. Como se muestra en la Figura 10, OKT9 sFv se fijaba fuertemente a las
células K562, que expresan niveles elevados del receptor transferrina, y esta fijación podı́a ser inhibida
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por OKT9 IgG. Estos resultados fueron confirmados por análisis FACS de células L murinas transfectadas
con el gen para el receptor de transferrina humano. Al contrario que el U7.6 sFv, no pudo detectarse
cantidad alguna de OKT9 sFv en el medio de cultivo después de la inducción.
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La presente invención se refiere también a un método de inmunoterapia en un huésped en el cual
se destruyen las células diana con selectividad mejorada utilizando agentes citotóxicos dirigidos contra
las células diana. Este método de inmunoterapia implica dos conceptos: la modificación especı́fica de la
célula diana con una proteı́na de fijación monoespecı́fica marcada con un resto quı́mico, y el direccionamiento de agentes citotóxicos a la célula diana modificada con selectividad mejorada.
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El método de inmunoterapia que se describe en esta memoria, comprende administrar a un huésped
una proteı́na de fijación monoespecı́fica que se fija a uno o más marcadores de la superficie celular existentes naturalmente y, de este modo, modifica la célula diana. Subsiguientemente a la modificación de la
célula diana, se administra al huésped un anticuerpo multivalente que se fija a la célula diana modificada
y a un agente citotóxico. Alternativamente, el agente puede complejarse con el anticuerpo multivalente
antes de la administración al huésped. De este modo, el agente citotóxico se suministra a la célula diana
y destruye la célula diana con selectividad mejorada.
En una realización preferida, este método de inmunodireccionamiento utiliza una combinación de
anticuerpos monocatenarios y anticuerpos biespecı́ficos heterorreticulados, en el cual la célula diana se
modifica por uno o más tipos de anticuerpos monocatenarios que son especı́ficos para uno o más identificadores de la superficie celular. Estos anticuerpos monocatenarios están marcados con un identificador
peptı́dico o un resto quı́mico que es reconocido por un anticuerpo heterobiespecı́fico, que fija también un
agente citotóxico. De este modo, los agentes citotóxicos se suministran a la célula diana por anticuerpos
heterobiespecı́ficos que se fijan al anticuerpo monocatenario marcado con un identificador peptı́dico (o
con un resto quı́mico de identificación) de manera selectiva.
En otras realizaciones, el anticuerpo multivalente es un Fab, Fab’ o sFv biespecı́fico. El anticuerpo
multivalente puede ser también un fragmento heterobiespecı́fico (Fab’)2 , o una molécula homodı́mera
(IgG)2 (Caron, P.C., et al., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992)) o un anticuerpo IgM.
Inversamente, la célula diana puede modificarse con una proteı́na de fijación biespecı́fica, tal como
una sFv biespecı́fica, o un análogo de proteı́na quimérica monocatenaria, y un anticuerpo multivalente
puede modificarse con un resto quı́mico. De este modo, el agente citotóxico está dirigido para fijarse a
la célula diana a través de la asociación del sitio de reconocimiento en la proteı́na de fijación biespecı́fica
que modifica la célula diana y el resto quı́mico del anticuerpo multivalente que fija el agente citotóxico.
Por ejemplo, la célula diana puede modificarse con un análogo de proteı́na monocatenaria quimérica
(Solicitud de Patente de EE.UU. N◦ 07/881.109). El análogo quimérico de proteı́na puede tener un sitio de fijación que reconoce los marcadores de la superficie celular existentes naturalmente en la célula
diana y un segundo sitio de fijación que reconoce un resto quı́mico asociado con un segundo anticuerpo
multivalente, tal como un anticuerpo heterobiespecı́fico, que fija un linfocito citotóxico. De este modo, el
linfocito citotóxico es suministrado a la célula diana.
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Alternativamente, el resto quı́mico de identificación de la proteı́na de fijación monoespecı́fica puede
ser biotina, que es reactiva con un anticuerpo anti-CD3 identificado con estreptavidina, que fija también
un linfocito citotóxico. De este modo, el CTL es suministrado a la célula diana por la asociación biotinaestreptavidina.
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El sitio de fijación de antı́geno completo puede obtenerse por métodos recombinantes a partir de anticuerpos monoclonales o genotecas combinatorias, y puede corresponder al fragmento Fab bicatenario de
50 kD o fragmentos Fab’ afines, el fragmento Fv bicatenario de 25 kD, o el fragmento Fv monocatenario
de 26-27 kD. En algunos casos, los fragmentos bicatenarios (e.j., el fragmento Fab) pueden aislarse por
digestión enzimática de una preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales, pero el Fv monocatenario (sFv) no está presente en la naturaleza y únicamente puede producirse por técnicas de ingenierı́a
de proteı́nas. Todas estas especies son de tamaño más pequeño y mucho más rápidas en su biodistribución
que los monómeros o dı́meros de IgG, con semi-vidas de aclaramiento tı́picas de varios dı́as para IgG. Las
propiedades farmacocinéticas varı́an en relación con el tamaño molecular, de tal modo que las semi-vidas
de distribución para estas proteı́nas de fijación monovalentes pueden abarcar un intervalo que va desde
minutos a varias horas para un fragmento Fab y hasta menos de una hora para un fragmento Fv monocatenario. Adicionalmente, se ha demostrado una penetración notablemente mejorada en los tumores para
un fragmento Fv monocatenario en comparación con la penetración de la IgG entera correspondiente
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(Yakota, T. et al., Cancer Res., 52: 3402-3408 (1992)).
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Ası́ pues, como se describe en esta memoria, este método de inmunoterapia aprovecha la ventaja de las
proteı́nas de fijación de tamaño reducido para direccionamiento primario a la célula diana, p.ej. a células
malignas en el interior de un tumor sólido. Fusionadas, o conjugadas, o intrı́nsecas a estas proteı́nas
de fijación se encuentran dianas secundarias (p.ej. una secuencia peptı́dica u otro resto quı́mico) de tal
manera que las dianas secundarias, o identificadores, son reconocidos por un anticuerpo multivalente
(p.ej., un anticuerpo heterobiespecı́fico). El anticuerpo multivalente reconoce también especı́ficamente, y
se fija fuertemente a epı́topes de un agente citotóxico o partes del mismo, o a marcadores de la superficie
celular de células particulares tales como linfocitos citotóxicos.
En una realización, el agente citotóxico es una célula efectora, tal como un linfocito T citotóxico
(CTL) que se fija al anticuerpo multivalente. Esta fijación puede tener lugar a través de receptores “promotores de lisis” encontrados en la superficie del CTL, tales como el receptor CD3. (Segal, D.M., et al.,
Mol. Immunol. 25: 1099-1103 (1988)). Alternativamente, los marcadores superficiales para las células
efectoras pueden incluir CD16, CD32, CD44 y otros marcadores de la superficie de las células efectoras,
adecuados para direccionamiento. De este modo, se forma un conjugado estable entre la célula diana
y el CTL, y se someten a transducción señales que hacen que el CTL suministre un “golpe letal” a la
célula diana fijada. Por enlace del CTL directamente a la célula diana marcada con un identificador, el
anticuerpo multivalente promueve la formación de conjugados efector:diana y dirige o emite señales al
CTL para suministrar un golpe letal.
Para demostrar que una proteı́na de fijación monoespecı́fica es capaz de mediar la citotoxicidad direccionada, se utilizó un heteroconjugado entre OKT3 (anti-CD3) y Myc-1 9E10.2 (anti-péptido identificador), en combinación con U7.6 sFv para direccionar las células T citotóxicas contra células diana
B6MC1 revestidas con TNP. Como se describe en detalle en el Ejemplo 4, y se muestra en la Figura 11,
esta combinación de inmunomoléculas dirigı́a las células T para lisar las células B6MC1 modificadas con
TNP. Ni el sFv, ni el heteroconjugado, por sı́ mismos, podı́an dirigir la lisis. Como se describe también
en el Ejemplo 4, el direccionamiento podı́a ser inhibido por el hapteno libre. Las células B6MC1 que no
fueron revestidas con TNP no sufrı́an lisis. La lisis dirigida por el anti-TNP U7.6 sFv identificador y el
anticuerpo biespecı́fico anti-péptido identificador x anti-CD3 era comparable, aunque ligeramente menor,
que la observada por un heteroconjugado directo anti-TNP x anti-CD3. Para que se produjera la lisis, la
combinación U7.6 sFv-identificador y anticuerpo heterobiespecı́fico en la célula diana y el epı́tope CD3 en
la célula citotóxica tenı́a que estar puenteada por la interacción entre péptido identificador y anticuerpo
anti-identificador.
La capacidad del sFv para participar en dicha lisis redirigida se confirmó con OKT9 sFv como se
muestra en la figura 12. En combinación con el heteroconjugado anti-péptido x anti-CD3, el OKT9 sFv
era capaz de dirigir la lisis tanto de la célula L murina transfectada con el receptor de transferrina humano
como de las células HUT 102, aunque no de las células B6MC1 que no expresan el receptor de transferrina
humano. De nuevo, tanto la sFv como el heteroconjugado tenı́an que estar presentes para provocar la
citotoxicidad, y la lisis se observó también con U7.6 sFv cuando las dianas se modificaron con TNP.
El método de inmunoterapia descrito en esta memoria puede suministrar selectivamente cualquier
agente que sea reconocido por los sitios de fijación distintos al identificador del compuesto biespecı́fico.
Ası́, es posible dirigir gadolinio polı́mero para formación de imágenes MRI, complejos de radioisótopos,
o fármacos encapsulados a la célula que constituye la diana.
En una realización de la inmunoterapia descrita en esta memoria, la célula diana puede modificarse
por fijación multi-sitio de proteı́nas de fijación monoespecı́ficas marcadas con un identificador peptı́dico.
Por ejemplo, puede administrarse al huésped una mezcla, o cóctel, de anticuerpos monocatenarios. Este
cóctel contiene cierto número de anticuerpos monocatenarios diferentes, cada uno de los cuales es especı́fico para un marcador, o epı́tope, de la superficie celular diferente, existente en la célula diana. De
este modo, dado que cada clase de células diana tiene su propio perfil singular de epı́topes, la célula diana
puede estar señalizada como con una bandera con sFv marcado con un identificador peptı́dico con mayor
especificidad que con un anticuerpo para un epı́tope singular exclusivamente.
Además de la especificidad mejorada, el direccionamiento multi-sitio basado en cócteles de proteı́na de
fijación monoespecı́ficos puede mejorar la fijación selectiva del anticuerpo multivalente a la célula diana
incluso más que con la fijación de un solo sitio. Este método es análogo a la separación selectiva de complejos inmunes a partir de la sangre utilizando proteı́nas de fijación truncadas sobre matrices insolubles
(Huston, J.S., Biophysical J., 62: 87-91 (1992); Patente de EE.UU. N◦ 5.084.398).
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Una meta común de la ingenierı́a de proteı́nas consiste en mejorar la fijación recombinante a una célula
u otra proteı́na. Una estrategia tı́pica implica modificar sitios de fijación de proteı́nas individuales para
aumentar su afinidad para moléculas diana. Sin embargo, el simple aumento de la afinidad de fijación
no siempre aumenta la especificidad de fijación. Puede lograrse una especificidad de fijación significativamente mejorada a partir de interacciones de fijación multi-sitio de afinidad individual baja.
Pueden seleccionarse anticuerpos multivalentes con constantes de fijación bajas (es decir, afinidad
baja) para fijación al identificador de secuencia peptı́dica (o resto quı́mico). Alternativamente, puede lograrse una constante de fijación inferior utilizando secuencias peptı́dicas truncadas, o alteradas (o análogos
del resto quı́mico). De este modo se reduce la afinidad del anticuerpo biespecı́fico, u otra proteı́na de
fijación, por el identificador peptı́dico. Produciendo contactos de un solo sitio con afinidad tan baja
que no pueda formarse ningún complejo de tipo uno-a-uno en condiciones experimentales o clı́nicas, esta
afinidad de fijación reducida favorece notablemente los contactos multi-sitio entre los anticuerpos multivalentes y la célula diana modificada, y con ello, da como resultado una interacción fuerte de especificidad
mejorada entre (es decir, asociación o complejación de) agente citotóxico a la célula diana. Como se
muestra en la Figura 13, una mezcla de anticuerpos monocatenarios marcados con identificador peptı́dico
direcciona los linfocitos citotóxicos a epı́topes distintos (C, D, E, F, y G) en la célula diana por interacciones multi-sitio entre el resto quı́mico (identificador peptı́dico) y el sitio de reconocimiento (parte
de un anticuerpo heterobiespecı́fico que fija el identificador peptı́dico). La disminución de la constante
de asociación intrı́nseca entre los sitios de fijación anti-identificador y el identificador peptı́dico favorece
finalmente la fijación multi-sitio para la mediación de la citotoxicidad direccionada. Esta interacción
multi-sitio facilita también la formación de complejos entre el anticuerpo multivalente y la célula diana.
De este modo, la reducción de la afinidad de fijación de un anticuerpo multivalente para el resto quı́mico
favorece los contactos multi-sitio como base para la formación de complejos entre el anticuerpo multivalente y la célula diana.
Por ejemplo, para un cierto umbral, tal como por debajo de Ka, intrı́nseco = 103 , el agente citotóxico
direccionado (p.ej. un CTL) serı́a incapaz de fijarse productivamente por uno, o incluso dos contactos
en las condiciones de concentración de proteı́na y nivel de células diana presente in vivo en un huésped.
Sin embargo, con interacciones multi-sitio, la fijación puede ser muy fuerte. Tales contactos multi-sitio
se consiguen con un cóctel apropiado de proteı́nas de fijación monoespecı́ficas que se fijan al antı́geno
con una densidad de localización suficiente para permitir contactos múltiples. La selectividad mejorada
puede derivarse de dos efectos. En primer lugar, el efecto de fijación por un cóctel de proteı́nas de fijación monoespecı́ficas marcado con identificador de antı́genos múltiples y distintos existentes en la célula
diana. Este efecto es resultado del perfil particular de epı́topes múltiples en la célula diana que define
más especı́ficamente la célula diana de lo que lo hace un solo epı́tope, que podrı́a estar presente en otras
células distintas a la diana. Las interacciones multi-sitio como base de la formación de complejos para el
direccionamiento eficaz de agentes citotóxicos aprovechan ası́ la ventaja del perfil antigénico de la célula
diana. En segundo lugar el efecto de la densidad superficial de un antı́geno dado sobre la célula diana
puede mejorar la especificidad de fijación, incluso para un solo epı́tope. Ası́, por ejemplo, un tipo de
célula con expresión superficial muy baja de un antı́geno dado podrı́a diferenciarse de una célula maligna
con expresión superficial muy alta del mismo antı́geno, dado que la fijación multivalente favorecerı́a muy
acusadamente la interacción con la célula maligna que posee alta densidad de antı́geno.
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En los últimos años, se ha prestado un interés notable al enfoque del redireccionamiento de las células
citotóxicas para destruir células neoplásticas o infectadas por virus, no deseadas. Una manera común de
hacer esto consiste en utilizar un anticuerpo biespecı́fico con especificidad dual para un antı́geno existente
en la célula diana y una molécula excitadora existente en la célula efectora (tal como CD3 en las células
T).
El método de inmunoterapia descrito en esta memoria presenta cierto número de ventajas sobre otras
formas de inmunoterapia. En primer lugar, puede utilizarse para identificar rápidamente proteı́nas de
fijación monoespecı́ficas, tales como proteı́nas sFv, que pueden ser útiles en el diseño y la construcción
de anticuerpos biespecı́ficos recombinantes. El uso de un identificador peptı́dico, junto con un anticuerpo
biespecı́fico universal capaz de dirigir los agentes citotóxicos para destruir las células diana revestidas con
sFv, permite escrutar las sFv con vistas a localizar aquéllas que poseen las capacidades de direccionamiento óptimas.
En segundo lugar, en cierto número de situaciones clı́nicas, es ventajoso un enfoque indirecto para el
direccionamiento de células efectoras. Dicho enfoque permite el uso de una sFv singular o un cóctel de
sFvs dirigidas contra una gama de epı́topes existentes en las células diana, junto con un solo anticuerpo
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biespecı́fico universal, para mejorar la afinidad y especificidad del complejo diana-célula efectora.
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Adicionalmente, si se hace uso de una proteı́na de fijación monovalente, tal como una proteı́na de
fusión Fab o sFv marcada con un resto quı́mico de identificación, la proteı́na de fusión podrı́a ir seguida
después de un intervalo apropiado con el anticuerpo dı́mero heterobiespecı́fico o tetravalente (IgG)2 que
reconoce las proteı́nas de fijación marcadas con un identificador y reticula dos o más proteı́nas de fijación
entre sı́ en la superficie celular. Esto mejora de manera eficaz la localización de la diana y aumenta la
susceptibilidad de direccionamiento final hacia el tumor.
Por último, si el componente de la superficie de una célula diana, que podrı́a ser reconocido por un
anticuerpo biespecı́fico, se desprende o se secreta, entonces puede fijarse a células efectoras revestidas con
anticuerpo biespecı́fico en sitios distantes del tumor, excitando inadecuadamente la liberación de factores
tóxicos por las células. Esto puede evitarse en el método de inmunoterapia descrito en esta memoria,
dado que es posible administrar primeramente una proteı́na de fijación monoespecı́fica contra el componente de la superficie celular en la célula diana, y permitir luego que cualesquiera complejos solubles
antı́geno-proteı́na de fijación presentes se eliminen por aclaramiento antes de administrar el anticuerpo
biespecı́fico universal. Esto asegurarı́a que las células efectoras se dirigieran solamente contra la proteı́na
de fijación monoespecı́fica fijada en la superficie de la célula diana y, con ello, el suministro de la célula
efectora a la célula diana con selectividad mejorada.
20
La invención se ilustrará con mayor detalle y de modo más especı́fico por los ejemplos siguientes.
Ejemplos
25
Ejemplo 1
Construcción de la proteı́na de fusión monocatenaria marcada con péptido identificador, U7.6 sFv
Lı́neas de células y vectores
30
Se utilizaron las cepas y vectores de E. coli siguientes: XL1 azul (Stratagene, La Jolla, CA), TG1
y HB2151 (obsequio del Dr. G. Winter, LMB, Cambridge, Reino Unido); pBluescript (Stratagene) y
pHEN1 (obsequio del Dr. G. Winter).
35
40
Oligonucleótidos
Los oligonucleótidos utilizados en este estudio se produjeron en un sintetizador automático de ADN
(Applied Biosystems, Foster City, CA), y utilizando “Cartuchos de purificación de oligonucleótidos”
(Applied Biosystems). Las secuencias de oligonucleótidos utilizadas en las reacciones en cadena de la
polimerasa (PCR) se dan en la Tabla (SEQ ID NOS: 6-20).
45
50
(Ver Tabla en página siguiente)
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TABLA
Iniciadores oligonucleotı́dicos utilizados en este estudio
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Multiplicación por PCR de las regiones V y construcción de U7.6 sFv
60
Se preparó ARNm de U7.6, un hibridoma murino que secretaba un anticuerpo anti-dinitrofenol (DNP)
de IgG (obsequio del Dr. Z. Schar, Weizmann Institute, Rehovot, Israel) a partir de las células utilizando
un estuche (kit) de aislamiento de ARNm Fast Track (InVitrogen, San Diego, CA. Se preparó ADNc
a partir del ARNm utilizando transcriptasa inversa MoMuLV (BRL)/Life Technologies, Gaithersburg,
MD) y los iniciadores CH1-Xba y CKN1 para las cadenas pesada y ligera, respectivamente. Se diseñaron
13
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5
10
y utilizaron iniciadores para multiplicar los dominios de la región V para la clonación a pBluescript
constituidos por VK5’ exp y VK3’AL2 (dominio VL) y VH Not y CH Xbas (dominio VH) definidos en
la Tabla 1. El VK’AL2 contiene la secuencia que codifica el enlazador peptı́dico ((Gly)4 Ser)3. Los
dominios de la región V se multiplicaron por 25 ciclos de PCR (1 min a 95◦ C, 1 min a 50◦ C, 1 min a
72◦C) utilizando los iniciadores apropiados y el estuche GeneAmp (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT).
El ADN resultante se extrajo con fenol y cloroformo y se precipitó con etanol, se cortó con las enzimas
de restricción apropiadas, se sometió a electroforesis con gel de agarosa de temperatura de fusión baja al
2% (NuSieve, FMC Bioproducts, Rockland, ME) y se purificó con Geneclean (Bio 101, La Jolla, CA).
El dominio VL se ligó primeramente a pBluescript en los sitios SacI y NotI, y el dominio VH se insertó
subsiguientemente en los sitios NotI y XbaI. La inserción del plásmido resultante pBluescript U7.6) se
secuenció luego utilizando el estuche Sequenase (US Biochemical Corporation, Cleveland, OH).
Clonación del constructo U7.6 sFv en pHEN 1
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35
Se clonó U7.6 sFv en pHEN 1, un vector de expresión bacteriano que utiliza la secuencia conductora
pelB para secreción directa de proteı́nas al espacio periplásmico (Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222:
581-597 (1991)). Con objeto de ensayar la factibilidad de utilización del empalme de genes por el método
de extensión con solapamiento para producir sFv, los autores de la invención rehicieron el constructo utilizando cuatro iniciadores para multiplicar las regiones V de U7.6. Los dos iniciadores “externos” (U7.6
L5’ Sfi y U7.6 H3’ Not) contenı́an sitios de restricción apropiados para inserción en el vector de expresión
pHEN 1. Los iniciadores “superpuestos” (eslabón U7.6 L3’ y eslabón U7.6 H5’) contenı́an secuencias
que se derivaban del péptido enlazador. Estas se diseñaron de modo que fuesen complementarias entre
sı́ para permitir la reasociación subsiguiente de las regiones V multiplicadas. Adicionalmente, dado que
la enzima Taq tiene actividad de adenilación en el terminal 3’, los iniciadores internos se diseñaron de
modo que existiera un residuo T complementario al terminal A llevado por la mayorı́a de los productos
de la PCR. Estos iniciadores se utilizaron para multiplicar las regiones V, utilizando pBluescript U7.6
como molde, y luego 0,1-1 µl del producto se mezcló y multiplicó nuevamente utilizando solamente los
iniciadores externos. El producto de PCR resultante, que contenı́a el constructo de sFv entero, se extrajo
con fenol y cloroformo y se precipitó con etanol antes de ser cortado por las enzimas de restricción SfiI y
NotI.
El producto cortado se sometió a electroforesis a través de un gel de agarosa al 2%, se purificó con
Geneclean, y se ligó a pHEN 1. El vector, designado pHEN-U7.6, se sometió luego a electroporación en
E. coli TG1 que se dejaron crecer en placas 2xTY que contenı́an 50 µg/ml de ampicilina y 1% de glucosa.
Producción de la proteı́na sFv
40
45
Para la producción de la proteı́na sFv (VL -enlazador-VH ) es necesario transferir el plásmido a la
cepa HB2151 de E. coli. Se utilizó el origen de replicación del fago en pHEN 1 para producir un fago
que contenı́a ADN monocatenario derivado del plásmido pHEN 1 U7.6. Las células TG1, que llevaban
pHEN 1 U7.6 se dejaron crecer en medio 2xTY que contenı́a ampicilina y glucosa. Dichas células se
infectaron con el fago adyuvante VCS M13 (Stratagene) y se dejaron crecer durante la noche en medio
2xTY que contenı́a ampicilina, kanamicina y glucosa. Los fagos se precipitaron luego del sobrenadante
con 1/5 volúmenes de polietilenglicol 6000 al 20% y NaCl 2,5 M, y se utilizaron para infectar células
HB2151 que se dejaron crecer sobre placas 2xTY + ampicilina + glucosa. Las colonias capaces de producir proteı́nas se identificaron por inducción de pequeños cultivos con IPTG, paso del sedimento de
células sobre SDS-PAGE e identificación de la proteı́na por sondeo de una transferencia Western con el
anticuerpo anti-péptido myc como se describe más adelante.
50
Transferencia Western
55
60
Se separaron las proteı́nas por SDS-PAGE sobre geles al 12,5% utilizando el sistema Phastgel (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) como se describe por los fabricantes. Las proteı́nas se sometieron a transferencia sobre nitrocelulosa utilizando el aparato de transferencia Western Phastgel. Las transferencias
se bloquearon luego en PBS que contenı́a 1% de BSA durante 30 min a la temperatura ambiente, se
lavaron cinco veces en PBS-Tween y se incubaron durante una hora a la temperatura ambiente con PBSTween que contenı́a 2-7 µg/ml del anticuerpo anti-péptido (Mycl 9E10.2) Después de cinco lavados más
con PBS-Tween, las transferencias se incubaron durante 30-60 min adicionales con 0,2 µg/ml de IgG
anti-ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Southern Biotechnology Associates), antes de cinco
lavados finales con PBS-Tween. Las transferencias se revelaron con 0,5 mg/ml de nitroazul-tetrazolio y
0,25 mg/ml de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (Sigma) en NaHCO3 0,1 M y MgCl2 1 mM de pH 9,8.
14
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Inducción y producción de sFv en pHEN U7.6
5
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Las células HB2151 que contenı́an pHEN1 U7.6 se dejaron crecer en medio 2xTY que contenı́a ampicilina y glucosa. Cuando se encontraban en la fase logarı́tmica intermedia, las células se centrifugaron,
se lavaron en caldo LB, y se resuspendieron en medio 2xTY que contenı́a ampicilina e IPTG 1 mM. Las
células se incubaron luego, con agitación mediante sacudidas, a la temperatura ambiente durante una
noche, en las condiciones encontradas en los estudios iniciales, como se ha descrito anteriormente, que
producen el rendimiento máximo de células. Las células se redujeron a un sedimento y se almacenaron a
-20◦C, y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,45 µm.
Preparación de U7.6 sFv a partir del sedimento de células
15
20
25
El sedimento de células se descongeló y se resuspendió en Tris 50 mM frı́o, EDTA 1 mM, KCl 100 mM,
0,1 mM de pH 8,0, y se disgregó con un aparato Bead Beater (Biospec Products, Bartlesville, OK). Se
añadieron perlas de vidrio de 0,1 mm de diámetro y las células se sometieron a pulsos tres veces durante
un minuto, con perı́odos de enfriamiento de un minuto. Después de la lisis, la proteı́na sFv se encontraba
en la fracción insoluble. Después de centrifugación, se recogió ésta en guanidina-HCl 7,5 M y la solución
se clarificó por centrifugación a 25000 g durante 20 min. El material se dializó luego a 40◦C contra Tris
0,1 M, EDTA 2 mM, arginina 0,4 M de pH 8,0, y se recuperó la sFv activa por cromatografı́a de afinidad.
La Figura 4 representa los resultados de la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE)
del U7.6 sFv durante la producción y purificación. Se prepararon las muestras para SDS-PAGE en condiciones reductoras y se hicieron pasar sobre un gel al 12,5%. Los geles se tiñeron con Azul Coomassie o
se sometieron a transferencia sobre nitrocelulosa y se sondaron con el anticuerpo anti-péptido myc. La
pista 1 corresponde al sedimento de células no sometidas a inducción; la pista 2 es el sedimento de células
inducidas; la pista 3 corresponde al material después de la solubilización y diálisis contra arginina; la
pista 4 es U7.6 purificado por afinidad a partir del material replegado; la pista 5 corresponde a U7.6 sFv
purificado por afinidad a partir del sobrenadante de cultivo.
30
Separación por tamaños y purificación por afinidad de U7.6 sFv activo
35
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50
El material de sFv replegado se pasó a lo largo de una columna Superdex 75 de 1,6 x 50 cm (Pharmacia) utilizando un sistema FPLC de Pharmacia en Tris 0,1 M, EDTA 2 mM, arginina 0,4 M, de pH
8,0, a un caudal de 2 ml/minuto.
El perfil de elución en la sFv replegada y los volúmenes de elución de tres proteı́nas de calibración,
citocromo C (13 kD), anhidrasa carbónica humana (29,5 kD) y seroalbúmina bovina (67 kD) se muestran
en la Figura 5. Se recogieron fracciones de 4 ml, y se determinó la actividad por incubación de muestras
de 750 µl con perlas de DNP-Sepharose, en presencia o ausencia de hapteno DNP 1 mM. Las perlas se
redujeron a un sedimento y muestras de 1 mM del sobrenadante se sometieron a transferencia de puntos
sobre nitrocelulosa, y se ensayaron respecto a la presencia de U7.6 sFv utilizando el anticuerpo Mycl
9E10.2. La porción inferior de la Figura 5 muestra los resultados de las transferencias de puntos de las
fracciones ensayadas sin adsorción (pista A), después de adsorción con perlas de DNP-Sepharose (fila B)
o después de la adsorción con perlas de DNP-Sepharose en presencia de hapteno DNP 1 mM (fila C). La
intensidad relativa de las transferencias de puntos se indican por el sı́mbolo en cada caja (+++, intensa;
++, fuerte; +, débil; +/-, dudosa; blanco, negativa).
Como se muestra en la Figura 5 las perlas de DNP-Sepharose separaban selectivamente la proteı́na
monómera (pista B). Esta separación era bloqueada por el hapteno DNP 1 mM (pista C), lo que demostraba que la misma era especı́fica. La gran mayorı́a del U7.6 sFv activo que se fija a DNP-Sepharose reside
por consiguiente en el pico de monómero y la mayor parte, si no la totalidad, de la proteı́na monómera es
activa. Ası́ pues, la cromatografı́a de exclusión de tamaños proporciona un método relativamente sencillo
para separar sFv activo monómero de sFv inactivo.
55
60
Se aisló también U7.6 sFv por cromatografı́a de afinidad utilizando DNP-lisina-Sepharose. Se eluyó
el sFv con ácido DNP--amino-caproico 1 mM, y el hapteno libre se separó subsiguientemente por diálisis
contra un tampón adecuado que contenı́a perlas de Dowex AG 1-X8 (BioRad, Richmond, CA). Cuando
se aplicó sFv purificado por afinidad a una colunma Superdex 75, el mismo se eluı́a en un volumen ligeramente mayor que el predicho por los patrones de tamaño, lo que sugerı́a que la proteı́na se pliega en
una forma compacta pero puede estar exhibiendo una ligera tendencia a la auto-asociación. Sin embargo,
antes de la purificación por afinidad, la mayor parte del U7.6 sFv replegado se eluı́a en el volumen de
15
ES 2 113 088 T3
exclusión, como se demuestra por la transferencia de puntos de las diversas fracciones retiradas de la
columna y sondeo con anticuerpo anti-péptido myc (Figura 5, descrita anteriormente), lo que está de
acuerdo con un grado considerable de formación de agregado en las condiciones de replegado de este
experimento, que enmascara el sFv monómero activo que está presente.
5
Ejemplo 2
Clonación de OKT9 sFv en pHEN 1
10
15
El constructo OKT9 sFv está constituido por los dominios VL y VH unidos por el mismo enlazador
((Gly)4Ser)3 utilizado en el U7.6 sFv. El constructo OKT9 sFv se multiplicó por PCR utilizando los
iniciadores oligonucleotı́dicos OKT9 5’SFI y OKT9 3’his NOT, que contenı́an los sitios de restricción SfiI
y NotI necesarios para la clonación a pHEN 1. Adicionalmente, el iniciador OKT9 3’his NOT contenı́a
una secuencia codificante de seis histidinas. El producto PCR se cortó con las enzimas apropiadas y se
ligó a pHEN 1 como se ha descrito para U7.6 sFv.
Expresión y purificación de OKT9 sFv
20
25
El OKT9 sFv se expresó de la misma manera que U7.6 sFv. El sedimento de células inducidas se
lisó y el material insoluble se disolvió en guanidina 6 M, NaH2 PO4 0,1 M, Tris 10 mM, de pH 8,0. Esta
solución se mezcló luego con perlas de Ni2+-NTA-agarosa (Quiagen, Chatsworth, CA), que fijan la cola
His6, durante 2 horas a 4◦ C. Las perlas se lavaron a fondo con el tampón de guanidina-HCl 6 M, y el
material de sFv se eluyó con imidazol 100 mM. Se dejó renaturalizar el sFv por diálisis contra Tris 0,1
M, EDTA 2 mM, arginina 0,4 M de pH 8,0 y se hizo pasar a lo largo de una colunma Superdex 75 como
se ha descrito para el constructo U7.6 sFv. El material que se eluyó como el sFv monómero se ensayó
luego en cuanto a la presencia de OKT9 sFv.
Ejemplo 3
30
Fijación superficial de sFv
35
La fijación de U7.6 y OKT9 sFv a las células se ensayó por citometrı́a de flujo utilizando células
B6MC1 modificadas con TNP y células K562 que expresan el receptor de transferrina humana reconocido por OKT9. Las células se incubaron con el sFv, se lavaron, y se tiñeron con anticuerpo Mycl 9E10.2
(anti-péptido identificador) marcado con FITC, antes del análisis con un citómetro de flujo FACScan
(Becton Dickinson, Mountain View, CA) con equipo lógico C30. Las células se controlaron en cuanto a
la viabilidad en condiciones de dispersión de la luz tanto directa como lateral, y se midió la fluorescencia
a 488 nm. En el caso de U7.6 se demostró la especificidad por utilización del hapteno DNP, o U7.6 Fab,
para inhibir la fijación del sFv.
40
45
50
La Figura 6, panel B, muestra la fijación de U7.6 sFv a células MC-1 revestidas con TNP. La lı́nea
de puntos se refiere a células teñidas con FITC-anticuerpo anti-péptido exclusivamente; la lı́nea de trazo
continuo se refiere a células preincubadas con U7.6 sFv 125 nM y teñidas luego con el FITC-anti-péptido.
Para comparación, el panel A muestra células teñidas con una FITC-IgG anti-ratón sola (lı́nea de puntos), o con U7.6 Fab, seguido por la FITC-IgG anti-ratón. El panel C muestra que el U7.6 sFv no se
fija a las células MC-1 que no estaban marcadas con TNP. (Las lı́neas de puntos y de trazo continuo son
como en el panel B). El panel D muestra que tanto U7.6 sFv como Fab inhiben la fijación del FITC-U7.6
anticuerpo IgG intacto a las células TNP-MC-1. Los puntos separados a grandes intervalos y las lı́neas
continuas representan células TNP-MC-1 sin teñir y teñidas, respectivamente. Los guiones representan
la tinción de las células TNP-MC-1 por el FITC-U7.6 en presencia de U7.6 Fab 130 nM, y los puntos
poco separados se encuentran en presencia de U7.6 sFv 125 nM.
55
La Figura 7 muestra la fijación relativa de U7.6 sFv y Fab a células B6MC1 revestidas con TNP.
Las células modificadas con TNP se incubaron con concentraciones diferentes de U7.6 sFv o de U7.6 Fab
(cuadrados compactos, seguido por el FITC anticuerpo Mycl 9E10.2 o el FITC anticuerpo anti-ratón de
cabra (triángulos compactos). Las células se analizaron luego por FACS y se calculó la intensidad media
de fluorescencia (MFI) de las poblaciones celulares.
60
La Figura 8 muestra la inhibición de la fijación de U7.6 Fab a células B6MC1 modificadas con TNP
por el ácido DNP-amino-caproico. Las células B6MC1 modificadas con TNP se incubaron con U7.6 sFv
(triángulos llenos) o U7.6 Fab (cuadrados llenos) en presencia de concentraciones variables del hapteno
DNP. Las células se tiñeron con un segundo anticuerpo marcado con FITC, y se determinó la intensidad
16
ES 2 113 088 T3
media de fluorescencia (MFI) de cada población de células por análisis FACS.
5
La Figura 9 muestra la inhibición de la fijación de U7.6 Fab a células modificadas con TNP por U7.6
sFv. Las células B6MC1 modificadas con TNP se incubaron con U7.6 Fab 125 nM, 41,7 nM o 13,9 nM,
en presencia de concentraciones variables de U7.6 sFv. Las células se tiñeron con FITC IgG anti-ratón de
cabra, y se determinó la intensidad media de fluorescencia (MFI) por análisis FACS. EL ruido de fondo
de MFI en ausencia de cualquier cantidad de U7.6 Fab era 40.
10
La Figura 10 muestra la fijación de OKT9 sFv a las células K562. Los puntos distanciados se refieren
a células K562 teñidas con FITC-anti-péptido; la lı́nea continua se refiere a OKT9 sFv más FITC-antipéptido. Los puntos densos se refieren a OKT9-sFv más FITC-anti-péptido, pero inhibido con exceso de
anticuerpo OKT9.
Ejemplo 4
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Experimentos de redireccionamiento
Se utilizaron células B6MC1 modificadas con trinitrofenol (TNP) o células no modificadas en un
ensayo de liberación estándar de 51 Cr, junto con células T citotóxicas humanas como efectores, para
demostrar la capacidad del U7.6 sFv para redireccionar la lisis. Las células T de sangre periférica humana se revistieron con anticuerpo heteroconjugado biespecı́fico (0,31 µg/ml de anti-CD3 x anti-péptido
identificador o 0,8 µg/ml de anti-CD3 x anti-DNP) preparado como se describe en Pérez, p. et al., Nature
316: 354-356 (1985). Las células diana (células B6MC1 modificadas con TNP o no modificadas, células
L transfectadas con el receptor de transferrina, o células HUT 102) se marcaron con 51 Cr y se utilizaron
como células diana. Las células (1 x 106 /ml) se incubaron con U7.6 o con OKT9 sFv durante 30 min a
4◦C. Se añadieron luego 10−4 células diana a los pocillos de una placa de microtitulación que contenı́an
números apropiados de células efectoras y, en algunos casos, hapteno DNP libre a una concentración
final de 2,5 x 10−4 M. Las placas se incubaron luego durante 3-4 horas a 37◦ C en 5% de CO2 , y la lisis
especı́fica se determinó como se describe en Pérez, p. et al., Nature 316: 354-356 (1985); Segal, T.M., en
Fc Receptors and the Action of Antibodies, H. Metzger (compilador) American Society for Microbiology,
Washington, D.C., pp. 291-301 (1990)).
Como se muestra en la Figura 11, panel A, se produjo una lisis significativa cuando estaban presentes
tanto U7.6 sFv como el anticuerpo biespecı́fico (anti-CD3 x anti-myc) (triángulo lleno, lı́neas continuas),
se observó un grado mucho menor de lisis en los controles que contenı́an exclusivamente anticuerpo
biespecı́fico (triángulos vacı́os), U7.6 sFv exclusivamente (cuadrados llenos) o U7.6 sFv, anticuerpo biespecı́fico más hapteno DNP 1 mM (triángulos llenos, lı́neas de trazos). Como control positivo (panel B),
se lisaron células TNP-diana por medio de células T humanas en presencia de anticuerpo biespecı́fico
anti-CD3 x anti-DNP (cı́rculos vacı́os), pero no en ausencia total de anticuerpos (triángulos vacı́os) o
cuando estaba presente hapteno DNP 1 mM (cı́rculos vacı́os, lı́neas de trazos). Finalmente, no se observó
lisis alguna cuando las células diana no estaban revestidas con TNP (panel C), bien fuese con ausencia
total de anticuerpos (cuadrados vacı́os), anti-CD3 x anti-DNP (cı́rculos vacı́os) o anti-CD3 x anti-myc
(triángulos llenos).
La Figura 12 muestra los datos resultantes de la lisis de células L transfectadas con TNP-TFR por
células T humanas activadas. Las lı́neas de trazos con cı́rculos llenos corresponden a células efectoras y
células diana sin anticuerpo alguno. Los triángulos llenos se refieren a células más anticuerpo biespecı́fico
anti-CD3 x anti-péptido. Los cuadrados vacı́os se refieren a OKT9 sFv más células y anticuerpo biespecı́fico. Las lı́neas de trazo continuo con cı́rculos llenos se refieren a U7.6-sFv más células y anticuerpo
biespecı́fico. El eje X representa la relación célula efectora:célula diana. El eje Y representa el porcentaje
de lisis especı́fica tal como se midió por la liberación de 51 CR.
Listado de Secuencias
55
A continuación se transmite una copia del “Listado de Secuencias” en forma legible por ordenador
en caso requerido. El procurador del solicitante afirma por la presente que el contenido del “Listado de
Secuencias” en forma de papel y el de la forma legible por ordenador del “Listado de Secuencias” son
idénticos.
Equivalentes
60
Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán comprobar utilizando simplemente experimentación
de rutina, muchos equivalentes de las realizaciones especı́ficas de la invención descritas en esta memoria.
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Listado de secuencias
(1) INFORMACION GENERAL:
5
(i) SOLICITANTE:
(A) DESTINATARIO: Creative BioMolecules
(B) CALLE: 35 South Street
10
(C) CIUDAD: Hopkinton
(D) ESTADO: MA
15
(E) PAIS: Estados Unidos de América
(F) CODIGO POSTAL: 01748
20
(A) DESTINATARIO: National Institute of Health
(B) CALLE: Office of Technology
(C) CIUDAD: Bethesda
25
(D) ESTADO: MD
(E) PAIS: Estados Unidos de América
30
(F) CODIGO POSTAL: 20892
(ii) TITULO DE LA INVENCION: METODOS DE SUMINISTRO DE AGENTES A CELULAS
DIANA
35
(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 20
(iv) DIRECCION DE CORRESPONDENCIA:
(A) DESTINATARIO: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P.C.
40
(B) CALLE: Two Militia Drive
(C) CIUDAD: Lexington
45
(D) ESTADO: MA
(E) PAIS: Estados Unidos de América
(F) CODIGO POSTAL: 02173
50
(v) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
(A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible
55
(B) ORDENADOR: IBM PC compatible
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D) EQUIPO LOGICO: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
60
(vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
18
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(A) NUMERO DE SOLICITUD:
(B) FECHA DE PRESENTACION:
5
(C) CLASIFICACION:
(viii) INFORMACION DE PROCURADOR/AGENTE:
(A) NOMBRE: Brook, David E.
10
(B) NUMERO DE INSCRIPCION: 22.592
(C) REFERENCIA/NUMERO DE EXPEDIENTE: CBM92-02.PCT
15
(ix) INFORMACION DE TELECOMUNICACIONES:
(A) TELEFONO: (617) 981-6240
(B) TELEFAX: (617) 981-9540
20
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:1:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
25
(A) LONGITUD: 360 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CLASE DE CADENA: doble
30
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
35
(ix) CARACTERISTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: CDS
(B) LOCALIZACION: 1..360
40
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
45
50
55
60
19
ES 2 113 088 T3
5
10
15
20
25
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:2:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
30
(A) LONGITUD: 120 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
35
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: proteı́na
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
40
45
50
55
60
20
ES 2 113 088 T3
5
10
15
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:3:
20
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 327 pares de bases
25
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CLASE DE CADENA: doble
(D) TOPOLOGIA: lineal
30
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
(ix) CARACTERISTICAS:
35
(A) NOMBRE/CLAVE: CDS
(B) LOCALIZACION: 1..327
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
40
45
50
55
60
21
ES 2 113 088 T3
5
10
15
20
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:4:
25
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 109 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
30
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: proteı́na
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
35
40
45
50
55
60
22
ES 2 113 088 T3
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:5:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
5
(A) LONGITUD: 11 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGIA: lineal
10
(ii) TIPO DE MOLECULA: proteı́na
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
15
20
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:6:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 32 pares de bases
25
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CLASE DE CADENA: simple
30
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
35
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:7:
40
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 35 pares de bases
45
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CLASE DE CADENA: simple
(D) TOPOLOGIA: lineal
50
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
55
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:8:
60
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 35 pares de bases
23
ES 2 113 088 T3
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CLASE DE CADENA: simple
5
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
10
15
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:9:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 21 pares de bases
20
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CLASE DE CADENA: simple
25
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
30
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:10:
35
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 21 pares de bases
40
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CLASE DE CADENA: simple
(D) TOPOLOGIA: lineal
45
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
50
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:11:
55
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 42 pares de bases
60
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CLASE DE CADENA: simple
24
ES 2 113 088 T3
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
5
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
10
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:12:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
15
(A) LONGITUD: 83 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CLASE DE CADENA: simple
20
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
25
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
30
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:13:
35
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 35 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
40
(C) CLASE DE CADENA: simple
(D) TOPOLOGIA: lineal
45
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
50
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:14:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
55
(A) LONGITUD: 38 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
60
(C) CLASE DE CADENA: simple
(D) TOPOLOGIA: lineal
25
ES 2 113 088 T3
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
5
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:15:
10
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 56 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
15
(C) CLASE DE CADENA: simple
(D) TOPOLOGIA: lineal
20
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
25
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:16:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
30
(A) LONGITUD: 39 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
35
(C) CLASE DE CADENA: simple
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
40
45
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:17:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
50
(A) LONGITUD: 59 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CLASE DE CADENA: simple
55
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
60
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
26
ES 2 113 088 T3
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:18:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
5
(A) LONGITUD: 62 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CLASE DE CADENA: simple
10
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
15
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
20
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:19:
25
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 58 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
30
(C) CLASE DE CADENA: simple
(D) TOPOLOGIA: lineal
35
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
40
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:20:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
45
(A) LONGITUD: 57 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
50
(C) CLASE DE CADENA: simple
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
55
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
60
27
ES 2 113 088 T3
REIVINDICACIONES
5
1. El uso de una proteı́na de fijación monoespecı́fica marcada con un resto quı́mico de identificación
y reactiva con uno o más marcadores de la superficie celular existentes naturalmente en una célula diana,
y un anticuerpo multivalente que tiene un sitio de fijación reactivo con el resto quı́mico y otro sitio
de fijación reactivo con un agente que debe ser suministrado a la célula diana, para la fabricación de
medicamento(s) para uso en terapia o diagnóstico que implica el suministro de un agente a células diana
en un huésped, que comprende los pasos de:
10
(a) administrar al huésped la proteı́na de fijación monoespecı́fica en condiciones por las cuales la
proteı́na de fijación monoespecı́fica se fija a los marcadores de la superficie celular; y
15
(b) administrar al huésped el anticuerpo multivalente en condiciones por las cuales el anticuerpo multivalente se fija a la célula diana marcada con el resto quı́mico de identificación y al agente, suministrando con ello el agente a las células diana.
2. El uso de la reivindicación 1, en el cual un sitio de fijación del anticuerpo es reactivo con un agente
de formación de imágenes.
20
25
3. El uso de una proteı́na de fijación monoespecı́fica marcada con un resto quı́mico de identificación
y reactiva con uno o más marcadores de la superficie celular existentes naturalmente en una célula diana,
y un anticuerpo multivalente que tiene un sitio de fijación reactivo con el resto quı́mico y otro sitio de
fijación reactivo con un agente citotóxico, para la fabricación de medicamento(s) para uso en terapia o
diagnóstico que implica suministrar un agente citotóxico a células diana en un huésped, que comprende
los pasos de:
(a) administrar al huésped la proteı́na de fijación monoespecı́fica en condiciones por las cuales la
proteı́na de fijación monoespecı́fica se fija a los marcadores de la superficie celular; y
30
(b) administrar al huésped el anticuerpo multivalente en condiciones por las cuales el anticuerpo multivalente se fija a la célula diana marcada con el resto quı́mico de identificación y al agente citotóxico,
suministrando con ello el agente citotóxico a las células diana.
4. El uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el cual:
35
(a) la proteı́na de fijación monoespecı́fica es un fragmento de anticuerpo, p.ej. un Fab; o
(b) la proteı́na de fijación monoespecı́fica es una proteı́na de fusión monocatenaria, p.ej. un anticuerpo
monocatenario; o
40
(c) el resto quı́mico de identificación es el enlazador que conecta las regiones variables de una proteı́na
de fusión monocatenaria; o
(d) el resto quı́mico de identificación es un epı́tope de la proteı́na de fijación monoespecı́fica fijada a la
célula diana.
45
50
55
5. El uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el cual el resto quı́mico de identificación es
un identificador peptı́dico, que comprende p.ej. la secuencia de amino-ácidos (SEQ ID NO:5).
6. El uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el cual la estructura del resto quı́mico está
alterada de una manera tal que se reduce la afinidad de fijación de un anticuerpo multivalente para el
resto quı́mico.
7. El uso de la reivindicación 5, en el cual el identificador peptı́dico comprende una secuencia de
aminoácidos que está alterada de una manera tal que se reduce la afinidad de fijación de un anticuerpo
multivalente para el identificador peptı́dico.
8. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3, en el cual el anticuerpo multivalente es
un anticuerpo heterobiespecı́fico, por ejemplo un fragmento de anticuerpo reticulado, p.ej. un fragmento
Fab.
60
9. El uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el cual el anticuerpo multivalente es una
molécula de IgG homodı́mera.
28
ES 2 113 088 T3
10. El uso de la reivindicación 8, en el cual (a) un sitio de fijación del anticuerpo heterobiespecı́fico
es reactivo con un marcador de la superficie celular en un linfocito citotóxico, y por ejemplo en el cual
un sitio de fijación es reactivo con el marcador de la superficie celular, CD3; o (b) un sitio de fijación del
anticuerpo es reactivo con un producto quı́mico citotóxico.
5
11. El uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el cual la proteı́na de fijación monoespecı́fica
comprende una mezcla de más de un tipo de proteı́na de fijación monoespecı́fica, siendo reactivo cada
tipo de proteı́na de fijación con un marcador diferente de la superficie celular existente en la célula diana.
15
12. El uso de una proteı́na de fijación monoespecı́fica marcada con un resto quı́mico de identificación
y reactiva con uno o más marcadores de la superficie celular existentes naturalmente en una célula diana,
y un anticuerpo multivalente que tiene un sitio de fijación reactivo con el resto quı́mico y otro sitio de
fijación reactivo con un agente de formación de imágenes, para la fabricación de un medicamento destinado
a utilización en terapia o diagnóstico que implica la formación de imágenes de un tejido especı́fico en un
huésped, que comprende los pasos de:
20
(a) administrar a un huésped la proteı́na de fijación monoespecı́fica reactiva con uno o más marcadores
de la superficie celular existentes naturalmente en una célula diana, en condiciones por las cuales
la proteı́na de fijación monoespecı́fica se fija al marcador de la superficie celular, estando marcada
la proteı́na de fijación monoespecı́fica con un resto quı́mico de identificación; y
25
(b) administrar al huésped el anticuerpo multivalente en condiciones por las cuales el anticuerpo multivalente se fija a la célula diana marcada con el resto quı́mico de identificación y al agente de
formación de imágenes, suministrando con ello el agente de formación de imágenes a la célula
diana.
10
30
13. El uso de una proteı́na de fijación biespecı́fica y que tiene un sitio de fijación reactivo con un resto
quı́mico reactivo con uno o más marcadores de la superficie celular existentes naturalmente presentes en
una célula diana, y un anticuerpo multivalente que tiene un sitio de fijación marcado con el resto quı́mico
de identificación y otro sitio de fijación reactivo con un agente, para la fabricación de un medicamento
destinado a utilización en terapia o diagnóstico que implica suministrar un agente a las células diana en
un huésped, que comprende:
(a) administrar la proteı́na de fijación biespecı́fica al huésped; y
35
(b) administrar al huésped el anticuerpo multivalente en condiciones por las cuales el anticuerpo multivalente marcado con un identificador se fija a la proteı́na de fijación biespecı́fica y al agente,
suministrando con ello el agente a la célula diana.
40
14. El uso de la reivindicación 13, en el que la proteı́na de fijación biespecı́fica es una proteı́na de
fusión monocatenaria biespecı́fica, p.ej. un análogo quimérico a proteı́na Fv monocatenaria.
45
15. El uso de una proteı́na de fijación monoespecı́fica marcada con un resto quı́mico de identificación
y reactiva con uno o más marcadores de la superficie celular existentes naturalmente presentes en una
célula diana, y un anticuerpo multivalente que tiene un sitio de fijación reactivo con un agente y otro sitio
de fijación reactivo con el resto quı́mico, para la fabricación de un medicamento destinado a utilización en
terapia o diagnóstico que implica suministrar un agente a las células diana en un huésped, que comprende
los pasos de:
(a) administrar al huésped la proteı́na de fijación monoespecı́fica;
50
(b) proporcionar el anticuerpo multivalente;
55
(c) poner en contacto dicho anticuerpo multivalente con el agente en condiciones por las cuales el agente
se fija al anticuerpo multivalente, dando como resultado un anticuerpo multivalente fijado al agente;
y
(d) administrar al huésped el anticuerpo multivalente fijado al agente en condiciones por las cuales el
anticuerpo multivalente se fija a la célula diana marcada con un resto quı́mico de identificación,
suministrando con ello el agente a la célula diana.
60
16. Un material para uso en terapia o diagnóstico, que comprende:
(a) un agente para suministro a células diana en un huésped;
29
ES 2 113 088 T3
(b) una proteı́na de fijación monoespecı́fica reactiva con uno o más marcadores de la superficie celular
existentes naturalmente presentes en las células diana, en condiciones por las cuales la proteı́na de
fijación monoespecı́fica se fija a los marcadores de la superficie celular, estando marcada la proteı́na
de fijación monoespecı́fica con un resto quı́mico de identificación; y
5
10
(c) un anticuerpo multivalente que tiene un sitio de fijación reactivo con el resto quı́mico y otro sitio de
fijación reactivo con dicho agente, en condiciones por las cuales el anticuerpo multivalente se fija a
la célula diana marcada con un resto quı́mico de identificación y al agente, suministrando con ello
el agente a las células diana.
17. El material de la reivindicación 16, en el que un sitio de fijación del anticuerpo es reactivo con un
agente de formación de imágenes.
18. Un material para uso en terapia citotóxica, que comprende:
15
20
25
(a) un agente citotóxico para suministro a células diana en un huésped;
(b) una proteı́na de fijación monoespecı́fica reactiva con uno o más marcadores de la superficie celular
existentes naturalmente en una célula diana, en condiciones por las cuales la proteı́na de fijación
monoespecı́fica se fija a los marcadores de la superficie celular, estando marcada la proteı́na de
fijación monoespecı́fica con un resto quı́mico de identificación; y
(c) un anticuerpo multivalente que tiene un sitio de fijación reactivo con el resto quı́mico y otro sitio de
fijación reactivo con un agente citotóxico, en condiciones por las cuales el anticuerpo multivalente
se fija a la célula diana marcada con el resto quı́mico de identificación y al agente citotóxico,
suministrando con ello el agente citotóxico a la célula diana.
19. El material de una cualquiera de las reivindicaciones 16, 17 y 18, que tiene las caracterı́sticas
adicionales de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11.
30
35
40
20. Un material para uso en inmunoterapia, que comprende:
(a) una proteı́na de fijación monoespecı́fica reactiva con uno o más marcadores de la superficie celular
existentes naturalmente en una célula diana, en condiciones por las cuales la proteı́na de fijación
monoespecı́fica se fija a los marcadores de la superficie celular, estando marcada la proteı́na de
fijación monoespecı́fica con un resto quı́mico de identificación; y
(b) un anticuerpo multivalente que tiene un sitio de fijación reactivo con un resto quı́mico y otro sitio de
fijación reactivo con un linfocito citotóxico, en condiciones por las cuales el anticuerpo multivalente
se fija a la célula diana marcada con el resto quı́mico de identificación y al linfocito citotóxico,
suministrando con ello el linfocito citotóxico a la célula diana.
21. Un material para uso en la formación de imágenes de un tejido especı́fico en un huésped, que
comprende:
45
50
55
(a) una proteı́na de fijación monoespecı́fica reactiva con uno o más marcadores de la superficie celular
existentes naturalmente en una célula diana, en condiciones por las cuales la proteı́na de fijación
monoespecı́fica se fija al marcador de la superficie celular, estando marcada la proteı́na de fijación
monoespecı́fica con un resto quı́mico de identificación; y
(b) un anticuerpo multivalente que tiene un sitio de fijación reactivo con un resto quı́mico y otro sitio de
fijación reactivo con un agente de formación de imágenes en condiciones por las cuales el anticuerpo
multivalente se fija a la célula diana marcada con el resto quı́mico de identificación y al agente de
formación de imágenes, suministrando con ello el agente de formación de imágenes a la célula diana.
22. Un material para uso en terapia o diagnóstico, que comprende:
(a) un agente para suministro a células diana en un huésped;
60
(b) una proteı́na de fijación biespecı́fica reactiva con uno o más marcadores de la superficie celular
existentes naturalmente presentes en una célula diana, en condiciones por las cuales la proteı́na
de fijación biespecı́fica se fija al marcador de la superficie celular, teniendo la proteı́na de fijación
biespecı́fica un sitio de fijación reactivo con un resto quı́mico; y
30
ES 2 113 088 T3
(c) un anticuerpo multivalente que tiene un sitio de fijación marcado con un resto quı́mico de identificación y otro sitio de fijación reactivo con un agente, en condiciones por las cuales el anticuerpo
multivalente marcado se fija a la proteı́na de fijación biespecı́fica y al agente, suministrando con
ello el agente a la célula diana.
5
23. El material de la reivindicación 22, en el cual la proteı́na de fijación biespecı́fica es una proteı́na
de fusión monocatenaria biespecı́fica, p.ej. un análogo quimérico de proteı́na Fv monocatenaria.
24. Un material para uso en terapia o diagnóstico, que comprende:
10
15
20
(a) un agente para suministro a células diana en un huésped;
(b) una proteı́na de fijación monoespecı́fica reactiva con uno o más marcadores de la superficie celular
existentes naturalmente presentes en una célula diana, en condiciones por las cuales la proteı́na de
fijación monoespecı́fica se fija al marcador de la superficie celular, estando marcada la proteı́na de
fijación monoespecı́fica con un resto quı́mico de identificación; y
(c) un anticuerpo multivalente fijado al agente por un sitio de fijación y que tiene otro sitio de fijación
reactivo con un resto quı́mico, en condiciones por las cuales el anticuerpo multivalente se fija a la
célula diana marcada con el resto quı́mico de identificación, suministrando con ello el agente a la
célula diana.
25
30
35
40
45
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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